KR20190007297A

KR20190007297A - 이상 인산 칼슘이 탑재된 탈세포화된 돼지 피부 유래 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법

Info

Publication number: KR20190007297A
Application number: KR1020170088568A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 자 리; 드 류 앤
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-01-22
Also published as: KR102014248B1; US20190015553A1

Abstract

본 발명은 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법에 관한 것으로, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 생체적합성이 우수하고 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수하여, 효과적인 골 재생용 충진제로 사용될 수 있다. 또한, 다공성이 우수하고 상호연결된 구조를 가지며, 온도에 따라 솔-겔의 형태로 변화되는 온도 감응성으로 열 겔화성(thermogelling)을 가져서, 생체내에 이식시 신속한 겔화를 유도하고 골 재생을 촉진할 수 있다.

Description

이상 인산 칼슘이 탑재된 탈세포화된 돼지 피부 유래 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법{A preparation method of injectable extracellular matrix based hydrogel derived from decellularized porcine skin loaded with bi-phasic calcium phosphate}

본 발명은 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하여 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.

골 조직은 인체의 골격을 유지시키는 중요 조직으로 골 조직 재생을 위해서 다양한 재료와 형태의 골 조직 대체용, 재생용 골 이식재가 연구 개발되고 있다. 골 이식재의 경우 골 치유기전에 따라 골 형성 재료, 골 전도성 재료, 골 유도성 재료로 분류할 수 있으며, 골 이식(transplataion)이나 매식(implantation)에 사용되는 이식재에 따라 자가이식, 동종이식, 타종이식 등의 방법을 주로 사용하고 있다.

이중 면역반응을 최소화할 수 있는 방법은 자가이식으로서, 자가골을 이용하여 골 손상부위에 이식을 할 경우 면역반응이 최소화되어 안정적인 골 조직 재생이 가능한 장점이 있다. 그러나, 자가골의 채취로 인한 다른 부위의 2차 골 손실과 회복기간 등의 불편을 가지고 있으며 양이 매우 한정되어 있다는 단점이 있다. 이를 보완하기 위하여 다른 사람의 골을 사용하는 타종이식이 있으나, 이는 자가골과 달리 많은 면역반응을 일으키고, 가격도 매우 비싸다는 단점이 있다. 따라서, 면역반응을 최소화하면서 많은 사람들에게 이용되기 위해 합성골을 제조하여 이식하고자 하는 골 조직공학 연구가 많이 진행되고 있다.

골 조직 공학에 적용하기 위한 지지체는 숙주 조직의 최적화된 조직 형성을 위해 핵심적인 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 이 조건은 세포 친화력, 영양분과 산소가 투과하기 위한 적절한 공극률, 세포 부착 및 분화를 촉진시키기 위한 계면 활성 등을 포함한다. 또한, 이상적으로 지지체는 연속적으로 분해되어 숙주 세포에 의해 대체되어야 한다.

부상, 골 종양, 치주 질환 등으로 인한 골 결손의 치료를 위해 상기와 같은 골 지지체의 임상적 필요성이 세계적으로 증대되고 있다. 또한, 자가골, 동종골, 이종골이 가진 제한된 유용성, 기증자의 사이트 병적 상태(donor site morbidity), 면역거부반응, 감염 등의 문제점을 최소화하기 위한 방법으로 인공골을 이식하여 사용하고 있다. 이와 같은 인공골의 재료로 세라믹, 폴리머 또는 그 혼합물 등과 같은 다양한 생체재료가 테스트되고 있다.

한편, 주입형 하이드로겔은 이식 수술상 장점이 있고, 단순 최소 침습적 주사요법으로 대체될 수 있다. 주입형 조직 공학은 감염의 위험, 흉터 및 고비용을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 외상, 종양 절제술 또는 선천적 결함에서 통상적으로 나타나는 불규칙적인 크기의 결함 부위를 충진하는 데 사용할 수 있으므로 관심을 끌고 있다.

따라서, 본 발명에서는 비침습적 방법에 적용될 수 있고 탈세포화된 돼지 피부와 이상 인산 칼슘 분말을 이용하여 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔이 생체적합성이 우수하고 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 10-2011-0025530호

본 발명의 목적은 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하여 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 포함하는 골 재생용 충진제를 제공하는 것이다.

본 발명자는 동결 건조된 탈세포화(decellularized) 돼지 피부를 펩신을 함유하는 염산 용액으로 분해하여 얻은 세포외 기질이 함유된 균질 용액에 수산화나타륨을 첨가하여 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 기반 하이드로겔을 제조하였으며, 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘을 혼합하여, 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하였으며, 상기 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔이 생체적합성이 우수하고 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 온도에 따라 솔-겔의 형태로 변화되는 온도 감응성으로 생체내에서 겔화되어 골 충진제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서,

본 발명은 돼지 피부를 탈세포화(decellularization)하고 동결 건조하는 단계;

상기 동결 건조된 탈세포화(decellularized) 돼지 피부를 펩신을 함유하는 염산 용액으로 분해하여 세포외 기질 함유 균질 용액을 제조하는 단계;

상기 세포외 기질 함유 균질 용액에 수산화나트륨을 첨가하여 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계; 및

상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하여 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함하는,

생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법은 돼지 피부를 탈세포화(decellularization)하고 동결 건조하는 단계를 포함한다.

본 발명에서는 돼지 피부를 이소프로판올에 녹인 SDS와 triton X-100 (트리톤 X-100)를 이용하여 탈세포한 후, 동결건조하여 사용하였다.

본 발명의 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법은 상기 동결 건조된 탈세포화(decellularized) 돼지 피부를 펩신을 함유하는 염산 용액으로 분해하여 세포외 기질 함유 균질 용액을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 구체적으로, 세포외 기질이 함유된 균질 용액을 수득할 때까지 48시간 동안 동결 건조된 탈세포화 돼지 피부를 0.1 M HCl 1 ml당 펩신 1 mg을 함유하는 염산 용액으로 분해하여, 세포외 기질이 함유된 균질 용액을 얻었다.

본 발명의 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 상기 세포외 기질 함유 균질 용액에 수산화나트륨을 첨가하여 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 구체적으로, 세포외 기질(ECM)이 함유된 균질 용액에 1M NaOH(수산화나트륨)을 첨가하여 pH가 7~8이 되도록 조정하여, ECM 농도가 30% (w/v)인 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 기반 하이드로겔을 제조하였다.

상기 탈세포화된 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)은 원조직의 ECM을 모방하는 복합 ECM 성분을 포함하고, 조직 리모델링과 재생을 위한 생체활성이 뛰어나다. 또한, 탈세포화 기법은 세포막 항원과 핵 성분을 제거하여 면역반응을 최소화함으로써 임상에서 물질이 안전하게 사용될 수 있게 한다.

본 발명의 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법은 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하여 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함한다.

상기 이상 인산 칼슘 (biphasic calcium phosphate, BCP)은 두 종류의 상이한 인산칼슘 상인 난용성인 히알루론산(HA)와 고가용성인 제삼인산칼슘을 상이한 비로 포함하는 혼합물이며, 분해 동역학은 시험관 내(in vitro)와 생체 내(in vivo)에서 조정될 수 있다.

본 발명에서, 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말은 분말은 12~18% (w/v) 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로, 15% (w/v) 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘(biphasic calcium phosphate, BCP) 분말을 15% (w/v) BCP 혼합하여, 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하였다.

본 발명에 따른 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 온도에 따라 솔-겔의 형태로 변화되는 온도 감응성으로, 생체 재료로서 체내에 적용 시 생체 온도에서 겔화되는 특성을 보이는 바, 생체 내에서 겔화될 수 있다.

또한, 상기 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 생분해성 물질이고, 온도변화에 따라서 솔-젤 거동을 보이는 온도 감응성을 갖기 때문에, 솔루션의 상태로 체내에 쉽게 주입이 가능하고 체온에 의하여 빠른 시간 내에 3차원의 젤을 형성할 수 있다.

또한, 기존의 솔-젤 거동을 보이는 온도 감응성 고분자보다 우수한 강도를 가지기 때문에 임플란트 재료, 인공 연골과 같은 조직공학 재료 등 강도를 요하는 여러 가지 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 실제로 신체에 적용 가능이 가능하다.

상기과 같이 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 25℃ 이하에서는 솔(sol)의 형태이고 37℃에서는 겔(gel)의 형태를 지닐 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 생체내에서 주입형 ECM 하이드로겔을 이식한 경우, 토끼의 대퇴골두에서 겔화가 효과적으로 일어난 것을 확인하여, 생체내에서 생체 온도인 37℃에서 효과적으로 겔화가 되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 다공성의 구조를 지닌다.

또한, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔에 첨가된 이상 인산 칼슘 분말의 함량이 증가할수록 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 겔화가 촉진될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔이 다공성 구조를 가지는 것을 확인하였으며, 세포와의 상호결합성이 우수한 것을 확인하였으며, 이상 인산 칼슘 함량이 증가할수록 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 겔화가 촉진되는 것을 확인하였다.

구체적으로, ECM-15% BCP의 경우 생체 내에서 효과적으로 겔화가 이루어졌으나, ECM-10% BCP를 이식한 경우는 생체 내에서 겔화가 이루어지지 않은 것을 확인하여, ECM-10%BCP 하이드로겔의 경우, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔로 적합하지 않은 것을 확인하였다.

또한, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 이식한 후 결함 부위의 골 형성을 확인한 결과 음성 대조군 (33.28 ±13.05)에 비해서 ECM-0%BCP(50.51±15.44)와 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔인 ECM-15%BCP (68.04 ±15.95)에서 골 형성이 더욱 우수한 것을 확인하였으며, 이상 인산 칼슘이 함유되지 않은 ECM-0%BCP에 비해, 이상 인산 칼슘이 함유된 ECM-15%BCP에서 골 형성 효과가 더 우수하였다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 결함의 외곽에서 중심까지 형성된 새로운 골 형성과 함께 호스트 골에 잘 통합된 것을 확인하였다(integrated).

따라서, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 생체적합성이 우수하고 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수하여, 효과적인 골 재생용 충진제로 사용될 수 있다. 또한, 다공성이 우수하고 상호연결된 구조를 가지며 열 겔화성(thermogelling)을 가져서, 생체내에 이식시 신속한 겔화를 유도하고 골 재생을 촉진할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 상기 제조방법에 의해 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 포함하는 골 재생용 충진제를 제공한다.

전술한 바와 같이, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 골 재생 촉진 효과를 가지는 바, 골 재생 충진제로 이용이 가능하다.

도 1은 4℃에서는 액상이고 37℃에서는 겔상인 ECM-0%BCP, ECM-10%BCP 및 ECM-15% BCP의 주입형 하이드로겔을 나타낸다.
도 2는 ECM-0%BCP (A.1-A.2), ECM-10%BCP (B.1-B.2) 및 ECM-15%BCP (C.1-C.2)의 저배율과 고배율 주사전자현미경 사진과, BCP 분말이 첨가된 주입형 ECM의 대표적인 샘플의 EDS 프로파일 (D)을 나타낸다.
도 3은 ECM-0%BCP (B), ECM-10%BCP (C), ECM-15% BCP (D)의 전체 다공률 (%) (A)와 이에 대응되는 크기를 나타낸다.
도 4는 겔화 중 흡광도를 측정하여 분광광도법으로 결정된 ECM-0% BCP, ECM-10% BCP 및 ECM-15%BCP의 혼탁(tubidimetric) 겔화 (A)를 나타낸다. tlag (겔화 지연 시간, B), t1/2 (겔화 반감 시간, C) 및 s (겔화 속도, D) 등 속도 인자는 혼탁 겔화값을 기준으로 계산하였다.
도 5는 24시간 노출 후 1일 및 6일 추출물에 노출된 rBMSC의 세포 생존율 분석 (A)과 7일 후 ECM-0%BCP, ECM-10%BCP 및 ECM-15%BCP에서 배양된 rBMSC 분포 (B)를 나타낸다.
도 6은 토끼의 대퇴골두에 이식할 때 ECM-0%BCP 및 ECM-15% BCP의 겔화를 나타낸다.
도 7은 ECM-0%BCP 및 ECM-15%BCP를 이식한 후에 대퇴골두 결함에서 새로운 골이 형성되는 것을 보여주는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 사진을 나타낸다.
도 8은 4주 후에 토끼의 대퇴골두에 이식된 음성 대조군, ECM-0%BCP 및 ECM-15%BCP에 있어서 골이 형성된 H&E 염색된 조직 절편을 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조

본 발명에서는 탈세포 처리된 돼지 피부에서 유래된 골 재생용 주입형 하이드로겔을 제조하였다.

먼저, 돼지 피부를 구입 후, 깨끗한 물로 헹군 후 표피를 수술용 칼로 얇게 자랐으며, 믹서를 사용하여 표피를 갈아낸 후 물로 세척하여 엉긴 지방을 제거한 후 3500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 지방이 있는 상층은 버리고 가라앉은 표피 층만 사용하였다. 이를 0.25% 트립신 용액에 6시간 동안 37℃에서 반응 시킨 후, 물로 한번 더 헹구었다. 이후, 0.1% SDS를 포함하는 70% 이소프로판올 용액에서 6 시간 동안 37℃에 반응시켰으며, 다음으로, 1% triton X-100 (트리톤 X-100)을 포함하는 70% 이소프로판올 용액에서 12 시간 동안 37℃에 반응시켰다. 상기 1% triton X-100을 포함하는 70% 이소프로판올 용액은 4시간에 한번씩 교체 해 주었다. 이 후, 깨끗한 물로 5번 헹궈준 후, 100% 이소프로판올에서 12시간 37℃에서 교반하면서 반응시켰다. 상기 100% 이소프로판올 용액은 4시간에 한번씩 교체하였다. 이후, 이를 휘발성 냄새가 나지 않을 때까지 물로 헹구었으며, 이를 3일 동안 동결 건조 하여 사용하였다.

다음으로, 균일 용액을 수득할 때까지 48시간 동안 동결 건조된 탈세포화 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 분말을 0.1 M HCl 1 ml당 펩신(시그마) 1 mg이 함유된 염산 용액으로 분해하여 세포외 기질이 함유된 균질 용액을 제조하였다. 상기 세포외 기질 함유 균질 용액에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.4로 조정하여, 최종 농도 30% (w/v) ECM이 되도록 하였다.

또한, 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하여 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하였다. 구체적으로 대조군으로, 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하지 않은 ECM-0%BCP를 제조하였으며, 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔 1 mL에 0.10g의 BCP 분말(10 % w/v BCP 분말)을 첨가한 ECM-10%BCP과 0.15g의 BCP 분말(15% w/v BCP 분말)을 첨가한 ECM-15%BCP를 제조하였다.

실시예 2: 쥐 골수 중간엽 줄기 세포 배양

쥐 골수 중간엽 줄기 세포(rBMSC)는 공지된 방법으로 분리하였다. 쥐(샘타코 바이오, 한국) 대퇴부에서 BMSC의 흡인물을 분리하였으며, 이를 10% 소태아혈청(FBS, 라이프 테크놀로지스)과 1% 페니실린- 스테렙토마이신(PS, 라이프 테크놀로지스)을 첨가한 αMEM(alpha Minimum essential medium, 라이프 테크놀로지스)에서 증폭(expansion)시키고, 37℃, 5% CO2 분위기에서 배양하였다. 3차 계대배양 세포는 추후 실험에서 사용되었다.

실시예 3: 세포독성 분석

실시예 1에서 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 세포독성은 세포 생존율 시험으로 평가하였다. rBMSC를 도말(plating)하고, 세포 생존율 분석 전에 80% 합류(confluency)에 도달할 때까지 성장시켰다. 적합한 배지에 상기 1 ml 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 1일 내지 7일간 배양하여 액상 추출물을 준비하였다. 세포는 트립신 처리하고 24웰 플레이트에 2x104 cells/well의 농도로 도말하였다. 24시간 후, 배양 배지는 액상 추출물로 교체하였다. 그 후, MTT 대사 분석을 통해 생존 세포를 평가하기 전에 세포는 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양되었다.

MTT 시료인 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (시그마 알드리치, 미국) 100 μl을 웰에 첨가하고 4시간 동안 배양하여 자색 포르마잔염을 얻었다. 그 후, 배지와 MTT 용액을 제거하고, DMSO (삼전순약공업 주식회사, 한국)을 웰에 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 배양하여 포르마잔염을 용해하였다. 수득한 자색 포르마잔염을 96웰 플레이트로 옮겼다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 595 nm의 파장에서 웰의 흡광도를 측정하였다. 대사 활성이며 살아있는 세포는 MTT를 자색 포르마잔염으로 환원시켰지만, 죽은 세포는 MTT를 포르마잔으로 변환할 수 없었다. 흡광도가 500-600 nm인 광학 밀도는 생존 세포수와 일치한다.

실시예 4: 형광 이미지 분석 ( Flouresence Imaging)

생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔에 접종(seeding)된 rBMS의 분포와 형태는 F-액틴 염색을 이용하여 평가하였다. 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 25 게이지 바늘을 이용하여 24 웰 플레이트에 샘플 500 ml를 주입하여 준비하였다. 농도가 2x104 cell/ml인 rBMSC 현탁액을 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 표면에 접종하고 1일 내지 7일간 성장시켰다. 배양 배지는 2일마다 교체하였다. 소정의 시간이 지난 후에, 4% 파라포름알데히드로 샘플을 고정하고, 10% 트리톤-X (시그마 알드리치, 미국)에 통과시키고, 인산 완충 식염수 (PBS; 시그마 알드리치, 미국)로 세척하여 남은 triton X-100 (트리톤 X-100)를 제거하고, 1% 소혈청 알부민 (BSA; 시그마 알드리치, 미국)으로 블로킹(blocking)하고, FITC(fluorescein isothiocyanate-conjugated Phalloidin, 시그마 알드리치)으로 염색하여 액틴 필라멘트를 시각화하고, 핵은 Hoechst 33342 (시그마 알드리치)으로 대비 염색하였다. Fluoview FV10i (올림푸스, 일본)를 이용하여 현미경 사진을 촬영하고, FV10i-ASW 3.0 뷰어 소프트웨어로 분석하여 세포 분포를 판단하였다.

실시예 5: 동물과 수술 과정

모든 과정은 대한민국 충청남도 순천향대학교 동물 보호 센터의 가이드라인에 따라 수행되었다. 뉴질랜드 백 토끼 (샘타코, n = 12)는 4주간 3개의 그룹, 즉, 결함(defect)만을 갖는 음성 대조군과 ECM-0%BCP 및 ECM-15%BCP 그룹의 양성 대조군으로 나누었다. 토끼는 이소플루란 (피라말, 미국)을 이용하여 마취하였다. 오른쪽 앞다리를 면도하고 75% 에탄올로 세척한 후 요오드 용액으로 살균하였다. 대퇴골두(femoral head)를 수직으로 절개하였다. 피부를 수축시키고 피하를 절개하여 대퇴골두를 노출시켰다. 조직의 탈수와 히팅(heating)을 방지하기 위해 간헐적으로 식염수 세척을 하면서 트레핀 드릴을 이용하여 6 mm x 5 mm 크기의 결함(defect)을 형성하였다. 결함 부위에 ECM-0%BCP (n = 4) 또는 ECM-15%BCP (n = 4) 를 주입하였으며, 음성 대조군(n-4)은 아무것도 주입하지 않았다. 절개부는 요오드 용액으로 소독한 봉합사로 봉합하였다. 그 후, 동물 실험 개체를 우리에 다시 넣고 먹이와 물을 주면서 회복시켰다. 4주 후, 동물을 희생시키고 주입된 샘플을 추출하여 지지체(scaffold)를 회수하였다.

실시예 6: 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-CT) 평가

추출된 대퇴골두를 절개하고, 파라포름알데히드로 밤새 고정하고, 10분간 흐르는 물로 세척한 후에 파라핀으로 덮었다. 대퇴골두는 1076 mCT 스캐너 (Skyscan)로 스캔하였다. CTan(Skyscan)으로 골부피/조직 부피 (BV/TV)를 계산하고 Seg3D (Scientific Computing and Imaging Institute) 소프트웨어를 이용하여 3차원 복원물(3D reconstructions)을 형성하였다.

실시예 7: 조직학적 관찰

추출된 샘플의 조직 절편을 준비하여 골 형성 정도를 검사하였다. 알콜류로 탈수처리한 5% 질산액을 이용하여 샘플의 칼슘을 제거하고, 자일렌에 침지하고, 절편화할 수 있도록 파라핀에 포매(embedding)하였다. 샘플은 5-mm 절편으로 절개하고 제조사의 프로토콜에 따라 H&E (시그마 알드리치) 염색하고 카메라를 이용하여 올림푸스 명시야 현미경에서 시각화하였다.

실험예 1: 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 분석

실시예 1에서, 펩신 분해(digestion)를 이용하여 돼지 피부에서 유래한 세포외 기질 함유 균질 용액을 제조하였으며, 1M NaOH을 이용하여 용액의 pH를 7.4로 조정하였다. 도 1은 4℃에서는 액상이고 37℃에서는 겔상인 ECM-0%BCP, ECM-10%BCP 및 ECM-15% BCP 하이드로겔을 나타내며, 시료의 열 겔화성(thermogelling property)을 보여준다. 즉, 온도에 따라 솔-겔의 형태로 변화되는 온도 감응성 특징을 가지는 것을 보여준다.

도 2는 ECM-0%BCP (A.1-A.2), ECM-10%BCP (B.1-B.2) 및 ECM-15%BCP (C.1-C.2)의 저배율과 고배율 주사전자현미경 사진과, BCP 분말이 첨가된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 대표적인 샘플의 EDS 프로파일 (D)을 나타낸다.

도 2에서, ECM-0%BCP (A.1), ECM-10%BCP (B.1) 및 ECM-15%BCP (C.1)의 저배율 SEM 사진은 상호 결합성이 우수한 다공성 조직을 보여준다. 고배율 SEM은 ECM-0%BCP의 거친 표면(A.2)과, ECM-10%BCP에 포매된 BCP 분말이 표면을 더욱 거칠게 만드는 것을 보여주고(B.2), 콜라겐 섬유를 포함하는 마이크로기공의 형성은 ECM-15%BCP에서 보다 자명하게 나타났다 (C.2).

EDS 프로파일은 탈세포화 ECM에서 주로 나타나는 탄소, 질소, 인 및 황의 원소 피크와 탄소, 산소 및 인으로 구성되는 BCP 분말의 피크를 보여준다. 이러한 결과는 BCP 분말이 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔에 성공적으로 혼입되었음을 의미한다.

실험예 2: 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 다공도 및 기공크기 분석

도 3은 BCP 분말 증가에 따른 ECM-0%BCP (B), ECM-10%BCP (C) 및 ECM-15%BCP (D) 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 전체 다공도 (A)와 이에 대응되는 기공 크기를 보여준다. 그 결과, BCP 함량이 증가할수록, 다공도는 감소하였으며, 기공크기도 감소하였다.

실험예 3: 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 혼탁 겔화 속도 분석

도 4는 ECM-0% BCP, ECM-10% BCP 및 ECM-15%BCP의 표준화된 혼탁 겔화 속도를 보여주고, 겔화 속도를 계산하였다. 이러한 결과는 겔화가 지연 시간(lag phase) 후에 일어나는 것을 의미한다. BCP 분말의 함량이 증가함에 따라, tlag, t1/2 및 S 등 겔화 속도는 감소하였다. 이러한 결과는 BCP 분말의 첨가에 따라 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 겔화가 촉진되었음을 의미한다.

구체적으로, 4℃에서 37℃ 적용 시, ECM-0%BCP은 솔(sol) 형태에서 겔(gel) 형태로 변화하는 데 15 분 가량 소요되었으며, ECM-10%BCP는 12 분 가량 소요되었으며, ECM-15% BCP는 솔 형태에서 겔 형태로 변화는 데 약 7분 가량 소요되었다(도 4D). 결론적으로, BCP 분말의 함량이 증가할수록 겔화가 촉진되는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 세포독성 평가

도 5에 나타낸 바와 같이, MTT와 형광 이미지 분석을 이용하여 rBMSC 생존능과 분포도를 평가하였다. 1 내지 7일 추출물에 24시간 동안 노출시킨 후 rBMSC의 생존능은 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔이 세포독성과 독성 부산물을 함유하지 않았음을 입증하였다 (도 5A). Hoechst 33342 및 FITC 염색 샘플의 세포 분포는 배양 7일 후 모든 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔에서 필라멘트가 넓게 분포된 rBMSC는 증가하였음을 보여준다.

실험예 5: 골재생능 평가

도 6은 토끼의 대퇴골두에 이식에서 관찰된 ECM-0%BCP 및 ECM-15% BCP의 겔화를 보여주며, 음성 대조군과 달리 생체내에서 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 겔화가 효과적으로 일어난 것을 보여준다. 반면, 실시예 1에서 제조된 ECM-10% BCP를 이식한 경우는, ECM-15% BCP와 달리, 생체 내에서 겔화가 이루어지지 않은 것을 확인하여, ECM-10%BCP 하이드로겔의 경우, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔로 적합하지 않은 것을 확인하였다.

도 7은 이식 4주 후 결함 부위(defect site)에서 새로운 골이 형성된 음성 대조군, ECM-0%BCP 및 ECM-15%BCP의 마이크로 CT(mico-CT) 현미경사진을 보여준다. 골 부피/조직 부피의 정량 분석에 의해 음성 대조군 (33.28 ±13.05)에 비해서 ECM-0%BCP(50.51±15.44)와 ECM-15%BCP (68.04 ±15.95)에서 골 형성이 더욱 우수한 것을 확인하였으며, BCP를 함유하는 ECM-15%BCP에 의해 골 형성 효과가 가장 좋았다.

도 8은 4주 후에 토끼의 대퇴골두에 이식된 음성 대조군, ECM-0%BCP 및 ECM-15%BCP에 있어서 골이 형성된 H&E 염색된 조직 절편을 나타낸다. 그 결과, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 결함의 외곽에서 중심까지 형성된 새로운 골 형성과 함께 호스트 골에 잘 통합된 것을 확인하였다(integrated) (도 8). 또한, 생체내 이식시 모든 샘플에서 부작용이 관찰되지 않았다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

돼지 피부를 탈세포화(decellularization)하고 동결 건조하는 단계;
상기 동결 건조된 탈세포화(decellularized) 돼지 피부를 펩신을 함유하는 염산 용액으로 분해하여 세포외 기질 함유 균질 용액을 제조하는 단계;
상기 세포외 기질 함유 균질 용액에 수산화나트륨을 첨가하여 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계; 및
상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말을 혼합하여 이상 인산 칼슘을 함유하는 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함하는,
생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 온도에 따라 솔-겔의 형태로 변화되는 온도감응성인 것인, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 생체 내에서 겔화되는 것인, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말은 12~18% (w/v) 포함되는 것인, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 세포외 기질 기반 하이드로겔에 이상 인산 칼슘 분말은 15% (w/v) 포함되는 것인, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 다공성 구조를 지니는 것인, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔은 골 재생을 촉진하는 것인, 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔의 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 생체 주입형 세포외 기질 기반 하이드로겔을 포함하는 골 재생용 충진제.