JP4664205B2 - 骨形成を誘導する組成物および方法 - Google Patents
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Description
本特許出願は、2002年10月15日に出願された米国特許仮出願第60/418,898号、および2003年7月18日に出願された米国特許仮出願第60/ 号(代理人整理番号第021288-001810号)の利益を請求するものであり、これら両出願の開示は本明細書に参照として組入れられる。
骨は、動的組織であり、その構造は有機基質に関連した無機相を含んでいる。成体骨格のホメオスタシスは、骨吸収と骨形成の間の均衡を必要としている。吸収時には、骨表面の特別な細胞は骨組織を溶解し、小さい空洞を形成する。形成時には、別のの細胞が、これらの空洞を新たな骨組織で充填する。骨再構築サイクルの不均衡は、骨喪失を引き起こすことがあり、これは最終的には骨に関連した疾患につながる。骨芽細胞系の細胞(骨芽細胞)は、新たな骨基質の合成および沈着(骨形成)により、骨再構築サイクルの均衡において、重要な役割を果たす。骨芽細胞系の細胞は、間葉系幹細胞(すなわち、間葉細胞の前駆細胞)から分化する。間葉細胞の前駆細胞の骨芽細胞への分化の誤調節は、例えば、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、McCune-Albright症候群、およびパジェット病のような、欠損のある骨芽細胞に関連したいくつかの骨関連疾患を説明することができる(例えば、Olsen et al.、Ann. Rev. Cell Dev. Biol.、16: 191 (2000)参照)。
本発明は、哺乳類細胞の骨芽細胞系の細胞へのin vivoおよびin vitroにおける分化および分化形質転換を誘導するための、新規組成物および方法を提供する。
(式中、R1は、水素、ハロゲンおよび-L-R2を含むが、これらに限定されるものではない官能基であり;
Lは、-O-および-NR3-を含むが、これらに限定されるものではない官能基であり、ここでR3はHであるか、またはR3は、R2およびそれに両方が結合した窒素と一緒に、C1-4アルキルで置換されてもよいヘテロ環を形成してもよく;
R2は、独立して選択され、ならびにハロゲン、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、-N(R2b,R2b)、-SO2N(R2b,R2b)、-C(O)N(R2b,R2b)および-O-アリールを含むが、これらに限定されるものではない官能基である0〜2個のR2a基で置換された、C1-4アルキル、C3-8シクロアルキルおよびC0-2アルキルアリールを含むが、これらに限定されるものではない官能基であるか、またはR2a基が存在しおよびこれらの2個のR2a基が隣接環原子上にある場合、これらは一緒に-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-および-(CH2)3-4-を含むが、これらに限定されるものではない官能基を形成してもよく;
各R2b基は、独立して選択され、ならびに水素およびC1-4アルキルを含むが、これらに限定されるものではない官能基であり;
R4は、0〜2個のR4a基で置換された、C1-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-4アルキルヒドロキシ、C0-2アルキルアリール、およびC1-4アルキルにより置換されてもよいC0-2アルキルヘテロ環を含むが、これらに限定されるものではない官能基であり;
各R4a基は、独立して選択され、ならびに水素、ハロゲン、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、およびアリールを含むが、これらに限定されるものではない官能基であるか、またはR4a基が存在しおよび2個のR4a基が隣接環原子上にある場合、これらは一緒に-O-(CH2)1-2-O-を形成してもよく;
R5は、水素であり、ならびにR6は、ハロゲン、C1-4アルキル、-C(O)-C1-4アルキル、-SO2-N(R2b,R2b)、C1-4アルキルハロ、-O-アリールおよび-N(R7, R8)を含むが、これらに限定されるものではない官能基であるか、またはR5およびR6が隣接環原子上にある場合、これらは一緒に-O-(CH2)1-2-O-を形成してもよく;
R7は、ハロゲン、C1-4アルキル、C1-4アルキルヒドロキシ、アリールおよび-C(O)R7aを含むが、これらに限定されるものではない官能基であり;
R7aは、C1-4アルキル、C1-4アルキルハロ、C3-8シクロアルキルおよびアリールを含むが、これらに限定されるものではない官能基であり;
R8は、HおよびC1-4アルキルを含むが、これらに限定されるものではない官能基であるか、またはR7およびR8はそれらが結合した窒素と一緒に、C1-4アルキルで置換されてもよいヘテロ環を形成してもよい。)。
I.緒言
本発明は、哺乳類細胞の骨芽細胞系の細胞への分化および分化形質転換に関する化合物、組成物および方法を提供する。より詳細に述べると、本発明は、哺乳類細胞から骨芽細胞系の細胞への分化および分化形質転換に有用な式Iの化合物を提供する。一部の態様において、式Iの化合物を含有する組成物が提供される。別の態様において、哺乳類細胞において骨形成を誘導する方法が提供される。骨形成は、本発明の方法に従い、in vivoまたはin vitroにおいて誘導することができる。
特に記さない限りは、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の一般的技術者により通常理解されるものと同じ意味を有する。概して、本明細書において使用される命名法ならびに有機化学および分析化学に関する実験手法は、周知のものであり、および当該技術分野において常用されるものである。
が含まれる。例えば-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3であるように、最大2個のヘテロ原子が連続することができる。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自身または他の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価のラジカルを意味し、例として-CH2-CH2-S-CH2CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-がある。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子は、いずれか一方または両方の鎖末端が占拠されることもできる(例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど)。更に、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基について、連結基の方向は無関係である。
からなる群の一員である。
本発明の化合物は、固相合成または液相合成のいずれかで調製することができる。
1.固相合成
式Iの化合物の固相合成に関連した方法は、実施例Iに加え、2001年10月12日に出願された米国特許出願第60/328,763号、2001年11月20日に出願された米国特許出願第60/331,835号、2002年1月7日に出願された米国特許出願第60/346,480号、2002年1月10日に出願された米国特許出願第60/348,089号、および2002年10月12日に出願された米国特許出願第10/270,030号(代理人整理番号第21288-000340号を有する)に説明されている。
式Iの化合物の液相合成は、当業者に公知の適当な反応条件下での、2,6-ジハロヘテロアリールの、適当な置換基との、第一の置換に関連している。これには、当業者に公知の適当な反応条件下での、適当に置換されたアニリンとの置換が続く。最後に、ヘテロアリールは、当業者に公知の適当な反応条件下での、Pd触媒を使用する、適宜置換されたアミンまたはアリールアルコールとの反応により置換される。固相により式Iの化合物を調製する方法と共に説明されているカルベンまたはホスフィンリガンド、塩基、溶媒およびパラジウム触媒に関する先の考察は、液相による式Iの化合物の調製法に完全に適用可能であり、従ってこれらはここで繰り返される点が注目される。
本発明の組成物は、哺乳類細胞における骨形成を誘導するために使用することができる。哺乳類細胞は、式Iの化合物と接触され、その結果この哺乳類細胞は、骨芽細胞系の細胞に分化する。哺乳類細胞は、in vivoまたはin vitroのいずれかにおいて、式Iの化合物(またはそれらの組成物)と接触される。
式Iの化合物に加えそれらの組成物は、in vivoにおいて骨形成を誘導するために都合良く使用することができる。本発明の化合物および組成物は、個体、例えばヒトのような哺乳類に、哺乳類細胞の骨芽細胞系の細胞への分化の誘導に有効量で投与される。それらの骨形成を誘導する能力を考慮し、式Iの化合物は、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、McCune-Albright症候群、およびパジェット病などの、骨障害および疾患の治療のために使用される。好ましい態様において、本発明の化合物および組成物は、骨粗鬆症を治療するために使用される。好ましい態様において、本発明の化合物および組成物は、骨密度を増加するために使用される。特に好ましい態様において、本発明の化合物および組成物は、骨密度を増大しおよび骨喪失を減少するために使用される。
本発明の組成物は、都合の良いことに、in vitroにおいて骨形成を誘導するために使用することができる。哺乳類細胞はこの組成物と接触され、その結果この哺乳類細胞は骨芽細胞系の細胞へ分化する。
この哺乳類細胞は、幹細胞、典型的には間葉系幹細胞(MSC)、前骨芽細胞、または他の系統の細胞、例えば前脂肪細胞もしくは筋芽細胞であることができる。ヒトおよび動物のMSCを単離および分化する方法は、説明されている(例えば、米国特許第5,942,225号および第5,486,359号;ならびに、Pittenger et al., Science、284:143(1999)を参照のこと)。
哺乳類細胞は、化合物A単独と、または他の増殖因子の存在下で化合物Aと接触して良い。典型的には、追加の増殖因子は、BMP-2、BMP-4、BMP-7またはタンパク質のBMPファミリーの他の一員である。当業者は、化合物Aおよび増殖因子の量は、特定の細胞型の分化の誘導を促進するように調節することができることを理解するであろう。典型的には、細胞と接触される化合物Aの量は、約0.1μM(52ng/ml)〜約50μM(2.6μg/ml)であり、より典型的には約0.25μM〜約35μMであり、更により典型的には約0.5μM〜約25μMであり、なお更に典型的には約0.75μM〜約15μMであり、最も典型的には約1μMである。典型的には細胞と接触されるBMPタンパク質の量は、約1ng/ml〜約400ng/ml、より典型的には約25ng/ml〜約300ng/ml、更により典型的には約50ng/ml〜約200ng/ml、なお更に典型的には約75ng/ml〜約125ng/ml、最も典型的には約100ng/mlである。
In vivoまたはin vitroにおける本発明の組成物の投与後、骨形成の誘導を、骨芽細胞-特異的タンパク質の発現の検出、骨-特異的転写因子の発現の検出、および骨密度の変化の検出により検出することができる。骨芽細胞-特異的タンパク質は、例えばアルカリホスファターゼ(ALP)、I型コラーゲン、オステオカルシン、およびオステオポニンを含む(例えば、Olsen et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.、16: 191 (2000)参照)。典型的には、アルカリホスファターゼの発現が、骨形成の指標として検出される。骨特異性転写因子は、例えば、Cbfa1/Runx2、gsc、Dlx1、Dlx5、Msx1、Cart1、Hoxa1、Hoxa2、Hoxa3、Hoxb1、rae28、Twist、AP-2、Mf1、Pax1、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、およびBrachyuryを含む(例えば、Olsen et al, 2000 supra参照)。典型的には、Cbfa1/Runx2の発現は、骨形成の指標として検出される。
骨芽細胞-特異的タンパク質の発現は、骨芽細胞-特異的タンパク質またはmRNAのレベルを測定することにより検出することができる。特定の骨芽細胞-特異的タンパク質のレベルは、都合の良いことに、特定の骨芽細胞特異的タンパク質またはそれらの断片に選択的に結合する抗体による、免疫組織化学染色、ウェスタンブロット、ELISAなどののような、イムノアッセイを用いて測定することができる。イムノアッセイにおいてタンパク質-特異的抗体を用いるタンパク質の検出は、 当業者に公知である(例えば、Harlow & Lane, 「Antibodies: A Laboratory Manual」(1988), Coligan, 「Current Protocols in Immunology」(1991);Goding, 「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」(2d ed. 1986);および、Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)を参照のこと)。mRNAの測定のためには、増幅、例えば、PCR、LCR、またはハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンハイブリダイゼーション、RNAseプロテクション、ドットブロッティングなどが好ましい。例えば、蛍光的または放射性標識された核酸、放射性または酵素的に標識された抗体などの、直接的または間接的に標識された検出物質を使用し、タンパク質またはmRNAのレベルが検出される。これらのアッセイは、当業者に周知であり、例えば、Ausubelらの著書「Current Protocols in Molecular Biology」(2001)に記載されている。
ALP活性の直接アッセイのために、細胞は、384-ウェルプレートに播種し、適量の式Iの化合物(例えば、化合物A)を単独で、または他の増殖因子(例えば、BMP-4)と共に処理し、その後5%CO2中で37℃でインキュベーションする。適当なインキュベーション時間の後、培地を除去し、溶解緩衝液を各ウェルに添加する。溶解緩衝液中での適当なインキュベーション時間経過後、アルカリホスファターゼ基質溶液(例えば、2'-[2'-ベンゾチアゾイル]-6'-ヒドロキシベンゾチアゾールリン酸(BBTP))を、各ウェルに添加する。室温で適当なインキュベーション時間経過後、プレートを、当該技術分野において公知の方法を用い、プレートリーダーで計測する。
ALPを検出するための細胞の直接の免疫組織化学的染色のために、細胞を、96-ウェルアッセイプレートに適当な密度で播種し、適量の式Iの化合物(例えば、化合物A)と単独で、または他の増殖因子(例えば、BMP-4)と共に適当な時間処理する。その後細胞を、10%ホルマリン溶液中で固定する。固定した細胞を再度洗浄し、当業者に公知の方法を使用し、ALPに特異的な試薬で染色する(例えば、ALPに特異的な抗体または比色測定用ALP基質)(例えば、Harlow & Lane, 1988, supra;Coligan, 1991, supra;Goding, 1986, supra;および、Kohler & Milstein, 1975, supraを参照)。細胞の写真画像を撮影し、ALP陽性細胞を、画像から手作業で計測する。
骨特異的転写因子の発現は、リポーター遺伝子アッセイを用い、検出することができる。これらのアッセイは、当業者に周知であり、および例えばAusebelらの前掲の著書に記されている。骨特異性転写因子Cbfa1/Runx2の発現は、典型的には骨形成を検出するために使用される。Cbfa1/Runx2は、骨芽細胞分化において本質的役割を果たし、Cbfa1/Runx2遺伝子を欠損しているトランスジェニックマウスは、骨形成喪失のために生後すぐに死亡する(例えば、Ducy et al., Cell、89:747(1997)、およびKomori et al., Cell、89:755(1997)参照)。
一過性にトランスフェクションされた細胞によるリポーター遺伝子アッセイについて、細胞は典型的には6-ウェルプレートに、増殖培地2mL中に、密度30,000個細胞/ウェルとなるよう播種し、一晩または適当な時間インキュベーションする。プラスミドDNAは、適当なトランスフェクション試薬を用い、これらの細胞へトランスフェクションする。8時間後、トランスフェクションされた細胞を、96-ウェルアッセイプレート(例えば、Corning)へ播種し、適量の式Iの化合物(例えば、化合物A)で処理する。これらの細胞を4日間インキュベーションし、その後細胞内でのリポーター遺伝子活性を、当業者に公知の方法を用いアッセイする。
安定的にトランスフェクションされた細胞によるリポーター遺伝子アッセイについて、細胞は典型的には6-ウェルプレートに、増殖培地2mL中に、密度30,000個細胞/ウェルとなるよう播種し、一晩または適当な時間インキュベーションする。適量のリポータープラスミドおよび選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターを、適当なトランスフェクション試薬を用い、細胞へ同時トランスフェクションする。適当なインキュベーション時間後、細胞を10cmの培養皿に播種し、適量の抗生物質をこの培養培地へ添加する。新鮮な抗生物質を適当な間隔で添加する。抗生物質耐性コロニーをプールし、安定してトランスフェクションされた細胞を得る。これらのトランスフェクションされた細胞を、96-ウェルアッセイプレート(例えば、Corning)へ播種し、適量の式Iの化合物(例えば、化合物A)で処理する。これらの細胞を4日間インキュベーションし、その後細胞内でのリポーター遺伝子活性を、当業者に公知の方法を用いアッセイする。
骨密度に対する本発明の組成物の作用を評価するために、治療を受けた個体における骨密度のベースライン測定値を得る。骨密度は、式Iの化合物、例えば化合物Aの投与期間中および投与後、適当な間隔で定期的に測定する。骨密度測定の方法および装置は、当業者に周知であり、例えば
に開示されている。
分化された骨芽細胞を、当業者に公知のいずれかの手段により、対象に投与することができる。本発明のひとつの態様において、損なわれていない(intact)固相支持体(例えば、三次元マトリックスまたは平坦な面)上の分化された骨芽細胞を、例えば、外科的移植により対象に投与することができる。あるいは、分化された骨芽細胞は、すなわち、対象への、例えば静脈内、皮下、または腹腔内投与前のプロテアーゼ処理により、このマトリックスから脱着することができる。
下記実施例は、請求された本発明を例証するために提供されるが、限定するものではない。
実施例1:化合物Aの合成および特徴決定
Pd-触媒したカップリングのためのホスフィンリガンドは、Strem Chemicalsから購入した。他の化学物質は全てAldrichから購入した。
PAL-樹脂(1g、1.1mmol)を、DMF(4ml)に懸濁し、およびこの溶液に、4-モルホリノアニリン(196mg、5.5mmol)、酢酸(0.65mL、1.13mmol)およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(720mg、3.4mmol)を添加した。この混合液を、室温で12時間穏やかに攪拌した。次に得られた樹脂を、DMF(10mL, 3回)、メタノール(10mL, 3回)、およびジクロロメタン(10mL, 3回)で洗浄した。その後アニリン結合した樹脂を、1-ブタノール(5mL)中の2,6-ジクロロ-9-シクロヘキシルプリン(598mg, 2.2mmole)およびジイソプロピルエチルアミン(0.5mL, 3mmol)と、80℃で12時間反応した。得られた樹脂を次に先に説明されたように洗浄した。
細胞培養:マウス胚性中胚葉線維芽細胞C3H10T1/2細胞を、10回継代した時点で、ATCCから得た。12回と15回継代の間の細胞を、この実験において使用した。15回を超えて継代した細胞は廃棄した。マウス胚性中胚葉線維芽細胞C3H10T1/2細胞およびマウス前骨芽細胞MC3T3-E1細胞(German collection of microorganisms and cell culturesから入手)を、10%熱失活したFBS(Gibco)、50U/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシン(Gibco)を補充したMEM-α培地(Gibco)において、5%CO2中で、37℃で培養した。細胞が集密度80%となった時点で、これらを1:5に分けた。マウス前脂肪細胞3T3-L1細胞(ATCCから入手)およびマウス筋芽細胞C2C12細胞(ATCCから入手)を、10%熱失活したFBS(Gibco)、50U/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシン(Gibco)を補充したDMEM(Gibco)において、5%CO2中、37℃で培養した。
得られたPCR産物を、Topoクローニングベクター(Invitrogen)に挿入し、増幅し、配列決定した。得られたプラスミドを、制限酵素MluおよびXhoI(New England Biolab)により消化し、1.8kb断片を、pGL3-BVルシフェラーゼリポーターベクター(Promega)のMlu/XhoIクローニング部位に挿入した。一過性のトランスフェクションアッセイのために、細胞を、6-ウェルプレートに、増殖培地2mL中で密度30,000細胞/ウェルとなるように播種した。一晩インキュベーションした後、細胞は集密度80%となった。プラスミドDNA(1μg)は、3μLのFugene 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用い、細胞へトランスフェクションした。8時間後、トランスフェクションされた細胞を、96-ウェルアッセイプレート(Corning)に播種し、組換えヒト骨形成タンパク質4(BMP-4)(Sigma)300ng/mL、1%DMSO(Sigma)または異なる濃度の化合物A(DMSO中に溶解)で処理した。細胞を4日間インキュベーションし、細胞におけるルシフェラーゼ活性を、Bright-Gloルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を製造業者のプロトコールに従って用い、アッセイした。ルミネセンスシグナルを、Acquest AD(Molecular Devices)プレートリーダーにより検出した。MC3T3-E1細胞の低いトランスフェクション効率のために、Cbfa1/Runx2リポーターアッセイを、安定してトランスフェクションされたMC3T3-E1細胞により実行した。一般に、MC3T3-E1細胞を、6-ウェルプレートに、30,000個細胞/ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、リポータープラスミド1μgおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むpCMV-Tag2Bベクター0.2μgを、MC3T3-E1細胞に、3.6μLのFugene 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用い、同時トランスフェクションした。8時間後、トリプシン/EDTA処理により、細胞を剥離し、10cmの培養皿に播種した。細胞が皿に接着した後、200μg/mLのG418(Gibco)を、培養培地に添加した。新鮮なG418を、3日毎に添加した。14日後、ネオマイシン耐性コロニーをプールし、安定してトランスフェクションされたMC3T3-E1細胞を得た。
プリン、ピリミジン、キナゾリン、ピラジン、フタラジン、ピラジンおよびキノキサリン-ベースの足場を持つ約50,000種の化合物のヘテロ環コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングし、骨形成誘導活性を伴う小分子を同定した(例えば、Ding et al., J. Am. Chem. Soc., 124:1594(2002);Gray et al., Science, 281:533(1998);Rosania et al., Nat. Biotechnol., 18:304(2000);および、Rosania et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:4797(1999)を参照のこと)。1種の2,6,9-三置換されたプリンが、ALP酵素アッセイにおいて、有意な活性を有することがわかった。この化合物は、プリン核のC6位にモルホリノアニリン置換基を有するが、これを化合物Aと称した。更なる試験は、化合物AのEC50が、C3H10T1/2細胞において1μMであることを示し;更にこの化合物は、4日間の処理後には、1%DMSO処理と比べ、ALPの50倍より大きい増加につながり、これはALP発現の誘導において、BMP-4よりもより有効であった(図1)。
この試験には、マウス胚性中胚葉線維芽細胞C3H10T1/2細胞を使用した。C3H10T1/2細胞は、MSCのように、様々な間葉細胞に分化し、および骨芽細胞分化の研究のためのモデルシステムとして広範囲に使用されている、多分化能間葉細胞前駆細胞である(例えば、3. Taylor, et al., Cell, 17:771(1979)、およびAubin and Liu, F., PRINCIPLES OF BONE BIOLOGY;Bilezikian, et al. ed.;Academic Press, San Diego: pp.51-67参照)。骨形成タンパク質4(BMP-4)による処理時に、C3H10T1/2細胞は、骨芽細胞へ分化する(例えば、Piccolo, et al., Cell, 86:589(1996)参照)。
C3H10T1/2細胞、3T3-L1、MC-3T3E1細胞、およびC2C12細胞を、DMSO(対照)、BMP-4(300ng/mL)、BMP-4(100ng/mL)および化合物A(1μM)、または1μM、2μM、もしくは10μMの化合物Aで処理した。Cbfa1/Runx2リポーター遺伝子活性を、4日間処理した後、先に実施例2において説明したように測定した。
3T3-L1細胞、C2C12細胞、およびMC-3T3E1細胞を、DMSO(対照)、BMP-4(300ng/mL)、BMP-4(100ng/mL)および化合物A(1μM)、または0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、もしくは10μMの化合物Aで処理した。ALP活性は、処理の4日後に、先に実施例1において説明したように測定した。結果を図3に示す。
C3H10T1/2細胞を、DMSO(a)、300ng/mLのBMP-4(b)、2μMの化合物A(c)、および100ng/mLのBMPおよび1μM化合物A(d)で、4日間処理し、ALP活性を染色した。ALP陽性細胞は赤色に染まり、細胞核は青色に染まった。
3T3-L1前脂肪細胞は、脂肪細胞系統へコミットされた前駆細胞であるが、これは、化合物AおよびBMP-4により処理された場合には、骨芽細胞系へ分化形質転換され得る。化合物Aは、前脂肪細胞においてCbfa1/Runx2発現を誘導し、5μMの最適濃度でALPレベルを9倍に増加するのに対し、BMP-4は、ALP発現を40倍よりも多く誘導する。化合物A(1μM)およびBMP-4(100ng/mL)は一緒に、3T3-L1細胞において、ALP活性を90倍よりも多く誘導する(図2)。同様に、C2C12細胞は、骨格筋系統へとコミットされた前駆細胞であるが、これは、化合物AによりCbfal/Runx2遺伝子を発現するように誘導された(図2)。この知見は、C2C12細胞の骨芽細胞への分化形質転換に、Cbfa1/Runx2の一過性アップレギュレーションは必要であるが、十分ではないという先の報告と一致している(例えば、Lee et al., J. Cell Biochem., 73:114(1999)参照)。
C3H10T1/2細胞は、DMSO(1%)および化合物A(プルモルファミン)(2μM)で、4日間処理した。C2C12細胞は、DMSO(1%)、化合物A(プルモルファミン)(2μM)またはBMP-4(300ng/mL)で、4日間処理した。これらの細胞の形態を、光学顕微鏡下で観察した。化合物Aで処理したマウス胚性中胚葉線維芽細胞C3H10T1/2細胞の形態は、線維芽細胞(長いおよび紡錘形)から骨細胞(小さくおよび丸い)へ変化した。
C3H10T1/2細胞は、DMSO単独(対照);BMP-4単独;および、化合物A単独(2μM)で処理した。アルカリホスファターゼ(ALP)活性を、処理の2、4および6日後に測定した。図4Aに結果を示し、これは、化合物Aが多分化能C3H10T1/2細胞における骨形成の強力なインデューサーであることを明らかにしている。
図5は、化合物Aにより誘導された骨形成の形態および転写解析を図示している。図5Aは、化合物Aは、下記タンパク質の発現を誘導することを示している:アルカリホスファターゼ、I型コラーゲンおよびオステオポニン、これらは全て骨形成が化合物Aにより誘導されることを示している。加えて図5Bは、DNAマイクロアレイ分析を示し、これは化合物Aは、多くの転写因子およびタンパク質の発現を誘導することを示している。
式Iのさらに別の化合物を合成し、先に実施例2に説明したアルカリホスファターゼアッセイおよびCbfa1/Runx2リポーター遺伝子アッセイを用い、骨形成誘導活性について試験した。
Claims (38)
- 式Iの化合物
(式中、R1は、-L-R2であり;
Lは、-O-であり;
R2は、ハロゲン、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、-N(R2b,R2b)、-SO2N(R2b,R2b)、-C(O)N(R2b,R2b)および-O-アリールからなる群より独立して選択される0〜2個のR2a基で置換されたC0-2アルキルアリールであり;該R2aが隣接環原子上にある場合、これらは一緒に-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-および-(CH2)3-4-からなる群より選択される一員を形成してもよく;
各R2b基は、水素およびC1-4アルキルからなる群より独立して選択される一員であり;
R4は、0〜2個のR4a基で置換されたC3-8シクロアルキルであり;
各R4a基は、水素、ハロゲン、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、およびアリールからなる群より独立して選択される一員であり;
R5は、水素であり、ならびにR6は、-N(R7, R8)であり;
R7およびR8はそれらが結合した窒素と一緒に、C1-4アルキルで置換されてもよいヘテロ環を形成する);ならびに
それらの全ての薬学的に許容される塩および水和物。 - R4はシクロヘキシルである、請求項1記載の化合物。
- R5はHであり、およびR6はモルホリンである、請求項1記載の化合物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含有する、骨形成を誘発するための薬学的組成物。
- 骨形成を誘発するために哺乳類細胞と接触させ、これにより該哺乳類細胞を骨芽細胞系の細胞へ分化させるための薬剤の製造のための、請求項1記載の化合物の使用。
- 請求項1記載の化合物が薬学的に許容される担体中にある、請求項11記載の使用。
- 哺乳類細胞が哺乳動物の体内にある、請求項11記載の使用。
- 接触段階が、哺乳動物への化合物の経口投与による、請求項13記載の使用。
- 接触段階が、哺乳類動物の化合物の静脈内投与による、請求項13記載の使用。
- 接触段階が、哺乳動物への化合物の皮下投与による、請求項13記載の使用。
- 接触段階が、哺乳動物への化合物の腹腔内投与による、請求項13記載の使用。
- 哺乳類細胞は幹細胞である、請求項11記載の使用。
- 幹細胞は間葉系幹細胞である、請求項18記載の使用。
- 間葉系幹細胞はマウスから単離される、請求項19記載の使用。
- 間葉系幹細胞はマウスの胚性中胚葉線維芽細胞である、請求項20記載の使用。
- 間葉系幹細胞は霊長類から単離される、請求項19記載の使用。
- 霊長類はヒトである、請求項22記載の使用。
- 哺乳類細胞は骨形成タンパク質4(BMP-4)と更に接触される、請求項11記載の使用。
- 哺乳類細胞は前脂肪細胞である、請求項24記載の使用。
- 哺乳類細胞は筋芽細胞である、請求項24記載の使用。
- 哺乳類細胞は固相支持体に結合されている、請求項11記載の使用。
- 固相支持体は三次元マトリックスである、請求項27記載の使用。
- 固相支持体は平坦な面である、請求項27記載の使用。
- 骨形成を誘発するために哺乳類細胞と接触させ、これにより該哺乳類細胞を骨芽細胞系の細胞へ分化させるための薬剤の製造のための、請求項9記載の化合物の使用。
- 哺乳類細胞が哺乳動物の体内にある、請求項30記載の使用。
- 接触段階が哺乳動物への化合物の経口投与による、請求項30記載の使用。
- 接触段階が哺乳動物への化合物の静脈内投与による、請求項30記載の使用。
- 接触段階が哺乳動物への化合物の皮下投与による、請求項30記載の使用。
- 接触段階が哺乳動物への化合物の腹腔内投与による、請求項30記載の使用。
- 骨障害を治療するために哺乳類細胞と接触させ、これにより該哺乳類細胞を骨芽細胞系の細胞へ分化させるための薬剤の製造のための、請求項1記載の化合物の使用。
- 骨障害が、欠損のある骨芽細胞に関連している、請求項36記載の使用。
- 骨障害は骨粗鬆症である、請求項37記載の使用。
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