KR101156797B1 - 재생된 모포를 담지하는 동물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모유두 세포 조제품을 조제하는 방법으로서, 피부 조직으로부터 표피 조직을 제거함으로써 얻은 진피 조직 획분을 콜라겐 처리하여 세포 현탁물을 조제하고, 이어서 그 세포 현탁물을 동결 보존함으로써 모포 상피 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 모유두 세포 및 상피계 세포를 포함하여 이루어지며, 그 모유두 세포 대 상피계 세포의 세포수의 비가 1:10~10:1인 것을 특징으로 하는 모포를 재생하기 위한 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 활성 모유두 세포를 함유하며, 또한 함유하는 상피계 세포가 불활성화된 모유두 세포 조제품을 조제하는 방법, 모포를 재생하기 위한 모유두 세포 및 상피계 세포를 함유하는 조성물, 그것을 이용하여 모포를 재생하는 방법, 나아가서는 그와 같은 방법에 의해 재생된 모포를 담지하는 동물 또는 3차원 피부 모델을 제공한다.
모포는 성숙한 생체로 자기 재생을 거의 한평생을 통하여 반복하는 예외적인 기관이다. 그 자기 재생의 구조를 해명하는 것은, 조직이나 세포 이식에 의한 탈모 치료, 모포나 피지선을 함유하는 자연에 가까운 기능적으로도 우수한 피부 시트의 구축 등, 필요성이 높은 임상 응용으로 연결될 것으로 기대된다. 최근, 줄기세포 연구에 대한 관심의 고조와 함께 모포 상피 줄기세포(상피 세포)의 연구가 급속히 진전되고, 또한 모포 특이적인 간엽계 세포인 모유두 세포에 대해서도 그 성질이 조금씩 밝혀져 왔다. 모유두 세포는 모포의 자기 재생을 위해 모포 상피 줄기세포에 활성화 시그널을 보내는 말하자면 사령탑의 역할을 담당하며, 모포 재구성 평가계에 있어서는 모포 상피 줄기세포와 함께 빼놓을 수 없는 세포라는 것이 분명해지고 있다(Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1999), Vol. 96, pp. 7336-7341).
모포의 재생을 목표로 하여, 동물 모델에서의 모포 재구성 실험이 지금까지 여러 가지 방법으로 이루어지고 있다. 문헌[Weinberg et al., J. Invest. Dermatol.(1993), Vol. 100, pp. 229-236]에는 세포 이식법에 의한 모포 재구성 방법이 기재되어 있다. Weinberg 등의 이식계는 모유두 세포, 신생자 상피계 세포(모포 상피 줄기세포를 포함함) 외에 마우스 3T3 세포가 가해져 복잡한 구성을 갖는다. Weinberg 등의 방법에 따르면 모포 상피 줄기세포를 포함하는 신생자 상피계 세포를 이식계에 가하지 않더라도 모포가 재생한다는 것이다. 그러나, 이것은 모유두 세포 획분으로부터 미분화 상피계 세포(모포 상피 줄기세포)나 모포 원기를 완전히 제거하는 것이 곤란하기 때문에 일어난 현상이라고 생각된다. 그 후, Kishimoto 등(전술)은 모유두 세포의 단리 정제에 처음으로 성공하여, 단리 정제한 모유두 세포를 이용하여, 동물 모델에서의 세포 이식법에 의한 모포 재구성 실험을 행한 결과, 모유두 세포와 상피 세포와의 조합을 포함하는 세포 획분을 이식하면 모포가 재구성되어, 발모가 인정되지만, 모유두 세포 또는 상피 세포 중 어느 것밖에 포함하지 않는 세포 획분을 이식한 경우, 발모가 인정되지 않음을 발견하고 있다.
그러나, Kishimoto 등에 의한 모유두 세포의 정제 방법은, 모유두 세포가 버시칸(콘드로이틴황산프로테오글리칸류)을 특이적으로 발현하는 성질을 갖는 것을 이용하여, 버시칸 유전자에 리포터 유전자를 연결한 DNA를 이용하여 만든 트랜스제닉 마우스 모델에 의해서 버시칸 발현을 지표로 하여, 단리·농축을 하는 것이다. 따라서, 이 방법은 트랜스제닉 마우스의 제작, 셀 소터에 의한 모유두 세포의 순화가 필요하다. 특히, 모포 재구성 방법에 있어서 모포를 실제로 재생시켜, 발모를 일으키게 하기 위해서는 대량의 모유두 세포가 필요하며(예컨대, 1 이식당 500만개의 세포), 그 때문에 이 방법에서는 대량의 트랜스제닉 마우스의 제작, 장시간의 고속 셀 소터의 사용이 필요하여, 경제적으로도, 또 작업 시간, 노동력의 면에서도 문제가 있었다. 모유두 세포의 단리는 예컨대 문헌[Prouty et al., American J. Pathol. (1996) Vol. 148, No. 6, pp. 1871-1885]에도 기재되어 있지만, 원심 분리에 의해 분획을 반복하는 복잡하고, 순도가 낮으며 또한 수량(收量)이 낮은 방법이다.
따라서, 지금까지의 모유두 세포 정제법에서는 단리 정제된 활성 모유두 세포를, 예컨대 이식을 위해 충분한 양으로 획득하는 것이 곤란하여, 모포 재생계에 있어서의 활성 모유두 세포의 역할을 완전히 해명할 수 없었다. 특히, 모포를 재생하는 모포 재구성계에 있어서의 모유두 세포와 상피계 세포의 적절한 비율을 결정하는 것은, 종래 기술에 의한 정제법에서는 사실상 불가능했다.
본 발명의 과제는, 트랜스제닉 마우스를 사용하지 않고, 간단하게 활성 세포 성분으로서 모유두 세포만을 함유하는 모유두 세포 조제품을 조제하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명자는 놀랍게도, 피부 조직으로부터 채취한 진피 조직 획분의 세포 현탁물을 동결 보존하면, 그 현탁물 중에 협잡된 모포 상피 세포가 특이적으로 사멸하여, 모유두 세포는 대부분이 계속해서 활성임을 발견했다. 그 결과, 활성 세포 성분으로서 모유두 세포만을 함유하는 세포 조제품을 얻을 수 있었다. 또한, 이와 같이 하여 얻은 세포 조제품은 활성 세포 성분으로서 모유두 세포만을 함유하기 때문에, 모포를 재생하는 데 유효한 모유두 세포 대 상피계 세포의 비율을 결정하는 데 이용할 수 있다. 그 결과, 본 발명자는 모포의 재생에 최적이라고 여겨지는 모포 재구성계에 있어서의 모유두 세포 대 상피계 세포의 비율을 결정할 수도 있었다.
따라서, 제1 관점에 있어서, 본 발명은 모유두 세포 조제품을 조제하는 방법으로서, 피부 조직으로부터 표피 조직을 제거함으로써 얻은 진피 조직 획분을 콜라겐 처리하여 세포 현탁물을 조제하고, 이어서 그 세포 현탁물을 동결 보존함으로써 모포 상피 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 세포 현탁물의 세포 밀도를 1×105~1×108/ml로 조정하고 나서 동결 보존을 하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 동결 보존은 -80℃ 이하의 온도에서, 예컨대 액체 질소 속에서, 바람직하게는 일주일 이상의 기간에 걸쳐 행한다.
적합한 형태에 있어서, 상기 피부 조직이 마우스, 래트 또는 인간에서 유래하는 것이면 좋다.
다른 관점에서, 본 발명은, 모유두 세포 및 상피계 세포를 포함하여 이루어지며, 이 모유두 세포 대 상피계 세포의 세포수의 비가 1:10~10:1인 것을 특징으로 하는 모포를 재생하기 위한 조성물을 제공한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은, 모유두 세포 및 상피계 세포를 포함하여 이루어지는 모포를 재생하기 위한 조성물로서, 피부 조직으로부터 표피 조직을 제거함으로써 얻은 진피 조직 획분을 콜라겐 처리하여 세포 현탁물을 조제하고, 이어서 그 세포 현탁물을 동결 보존함으로써 모포 상피 세포를 사멸시켜 조제된 모유두 세포 조제품 및 상피계 세포를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 모유두 세포 대 상피계 세포의 세포수의 비가 1:10~10:1인, 모포를 재생하기 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 모유두 세포 대 상피계 세포의 세포수의 비는 1:3~10:1, 더욱 바람직하게는 1:1~10:1, 보다 더욱 바람직하게는 1:1~3:1, 가장 바람직하게는 1:1이다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 이용하여 동물 또는 3차원 피부 모델에 모포를 재생하는 방법 및 이와 같이 하여 모포가 재생된 동물 또는 3차원 피부 모델을 제공한다.
본 발명에 의해, 트랜스제닉 마우스를 사용하지 않고서, 간단하게 활성 세포 성분으로서 모유두 세포만을 함유하는 모유두 세포 조제품을 조제하는 방법이 제공되었다. 이 모유두 세포 조제품은 모포 재생을 위한 이식 수술이나, 모포 재구성의 연구·개발에 이용할 수 있다. 특히, 상기 모유두 세포 조제품에는 활성 상피 줄기세포의 협잡이 없기 때문에, 모포의 재생에 사용하는 활성 모유두 세포와 활성 상피 줄기세포의 세포수의 비율을 정밀하게 조정할 필요가 있고, 또 세포를 대량으로 필요로 하는 상황에 있어서 유리하다.
도 1은 LacZ 및 7-AAD에 기초한 동결 융해 진피 세포 획분의 FACS 해석 결과를 도시한다.
도 2는 CD-49 및 7-AAD에 기초한 동결 융해 진피 세포 획분의 FACS 해석 결과를 도시한다.
도 3은 동결 융해 모유두 세포와 상피계 세포의 혼합 이식에 의한 모포 재생 결과를 도시한다.
도 4는 모유두 세포와 상피계 세포를 이종계(마우스-래트)로 한 경우의 모포 재구성 결과를 도시한다.
도 5는 모유두 세포와 상피계 세포를 이종계(래트-인간)로 한 경우의 모포 재구성의 헥스트(hoechst) 핵 염색 결과를 도시한다.
도 6은 본 발명의 모포 재생계를 3차원 피부 모델에 이식한 경우의 모포 원기 형성을 도시한다.
도 2는 CD-49 및 7-AAD에 기초한 동결 융해 진피 세포 획분의 FACS 해석 결과를 도시한다.
도 3은 동결 융해 모유두 세포와 상피계 세포의 혼합 이식에 의한 모포 재생 결과를 도시한다.
도 4는 모유두 세포와 상피계 세포를 이종계(마우스-래트)로 한 경우의 모포 재구성 결과를 도시한다.
도 5는 모유두 세포와 상피계 세포를 이종계(래트-인간)로 한 경우의 모포 재구성의 헥스트(hoechst) 핵 염색 결과를 도시한다.
도 6은 본 발명의 모포 재생계를 3차원 피부 모델에 이식한 경우의 모포 원기 형성을 도시한다.
본 발명은 모유두 세포 조제품을 조제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 모포를 재생하기 위한 모유두 세포 및 상피계 세포를 함유하는 조성물, 그것을 이용하여 모포를 재생하는 방법, 나아가서는 그와 같은 재생된 모포를 담지하는 동물 또는 3차원 피부 모델을 제공한다.
「모유두 세포」란, 간엽계 세포로서 모포 최저부에 위치하여, 모포의 자기 재생을 위해 모포 상피 줄기세포에 활성화 시그널을 보내는, 말하자면 사령탑의 역할을 담당하고 있는 세포를 말한다. 활성화 모유두 세포만을 함유하는 모유두 세포 조제품은, 예컨대 트랜스제닉 마우스를 사용한 Kishimoto(전술)의 방법으로 조제할 수 있다. 그러나, 수량 등의 점에서 바람직하게는, 예컨대 피부 조직으로부터 표피 조직을 제거함으로써 얻은 진피 조직 획분을 콜라겐 처리하여 세포 현탁물을 조제하고, 이어서 그 세포 현탁물을 동결 보존하여 모포 상피 세포를 사멸시킴으로써 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 동결 보존에 의한 방법은, 구체적으로는 예컨대 다음과 같이 실시할 수 있다.
1. 포유동물의 표피를 준비한다.
2. 이 표피를, 필요하면 단백질 분해 효소 용액, 예컨대 트립신 용액 속에 적당한 시간, 예컨대 하룻밤 정치하고, 그 후 표피 부분을 핀셋 등으로 제거하고, 남은 진피를 콜라게나아제로 처리하여, 세포 현탁액을 조제한다.
3. 필요하면 셀 스트레이너에 의해 현탁액을 여과하고, 정치에 의해 침전물을 제거한다.
4. 세포수를 계측하여, 적당한 세포 밀도, 바람직하게는 1×105~1×108/ml 정도의 세포 밀도에서 동결 보호액으로 재현탁하고, 필요하면 작게 나눠 분주하여, 통상의 세포 보존 방법에 따라서, 동결 보존한다.
5. 적당한 기간 보존한 후, 융해하여 사용한다.
동결 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, -20℃ 이하, 바람직하게는 -50℃ 이하, 보다 바람직하게는 -80℃ 이하의 초저온 냉동 고속에서, 또는 액체 질소 속에서 보존한다. 동결 보존 기간도 특별히 한정되지는 않지만, 상피 세포가 사멸하도록, 예컨대 1일 이상, 바람직하게는 3일 이상, 보다 바람직하게는 일주일 이상의 기간으로 한다. 또한, 액체 질소 속에서 4개월 보존하더라도, 모유두 세포는 계속해서 생존하고 있음이 확인되었다. 동결 보호액으로서는 세포의 보존에 있어서 사용되고 있는 통상의 보존액, 예컨대 셀벵커2 세포 동결 보존액(카탈로그 No. BLC-2)(니혼젠야쿠고교 제조)을 사용할 수 있다.
세포수의 계측은 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예컨대, 세포수의 계측은 혈구 계산반(SLGC사 제조, EOSINOPHIL COUNTER)에 등량의 0.4% 트리판블루 염색액(No. 15250-061, 인비트로젠)으로 희석한 세포 현탁액을 제공하여 혈구 계산반에 부속된 취급 설명서에 기재된 방법에 따라서 산출할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용하는 모유두 세포의 기원이 되는 포유동물의 표피는 모든 포유동물에서 유래하여도 좋으며, 제한 없이, 예컨대 인간, 침팬지, 그 밖의 영장류, 가축 동물, 예컨대 개, 고양이, 토끼, 말, 양, 염소, 소, 돼지, 그 외에 실험용 동물, 예컨대 래트, 마우스, 몰모트, 보다 바람직하게는 누드 마우스, 스키드 마우스, 누드 래트의 표피라도 좋다. 또한, 동물의 계통도 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 모포를 재생하기 위한 조성물에 있어서의 「상피계 세포」는, 피부의 표피 또는 상피의 대부분을 구성하는 세포이며, 진피에 접하는 1층의 기저 세포로부터 생긴다. 마우스를 예로 들면, 상피계 세포로서는 신생자(혹은 태아)에서 유래하는 상피계 세포를 바람직하게 사용할 수 있지만, 성숙한 피부, 예컨대 휴지기 모의 표피 또는 성장기 모의 표피에서 유래하는 세포라도, 켈라치노사이트의 형태로 있는 세포의 배양물이라도 좋다. 이러한 세포는 당업자에게 주지된 방법에 의해 원하는 공여자 동물의 피부로부터 조제할 수 있다.
적합한 형태에 있어서, 상피계 세포는 다음과 같이 하여 조제할 수 있다.
1. 포유동물의 표피를 준비한다.
2. 이 표피를, 필요하면 0.25% 트립신/PBS 속에서 4℃ 하에 하룻밤 정치함으로써 트립신 처리한다.
3. 핀셋 등에 의해 표피 부분만 박리하여, 잘게 자른 후, 적당한 배양액(예컨대 켈라치노사이트용 배양액) 속에서 4℃에서 약 1시간 현탁 처리한다.
4. 이 현탁물을 적당한 기공 크기를 갖는 셀 스트레이너에 통과시키고, 이어서 원심 분리기에 걸어 상피계 세포를 회수한다.
5. 이 세포 조제품을 KGM 혹은 SFM 배지에 원하는 세포 밀도로 현탁하여, 사용 직전까지 빙상에 정치해 둔다.
본 발명의 상피계 세포는 모유두 세포와 마찬가지로, 모든 포유동물, 예컨대 인간, 침팬지, 그 밖의 영장류, 가축 동물, 예컨대 개, 고양이, 토끼, 말, 양, 염소, 소, 돼지, 그 외에 실험용 동물, 예컨대 래트, 마우스, 몰모트, 보다 바람직하게는 누드 마우스, 스키드 마우스, 누드 래트의 표피에서 유래할 수 있다. 또한, 그 표피 부위는 유모(有毛) 부위, 예컨대 두피라도, 무모(無毛) 부위, 예컨대 표피라도 좋다.
본 발명자는, 상기 동결 보존에 의해 획득한, 활성 세포로서 모유두 세포만을 함유하고, 상피계 세포가 사멸된 모유두 세포 조제품을, 모유두 세포가 제외된 활성 상피계 세포만을 함유하는 상피계 세포 조제품과 여러 가지 세포 비율로 혼합하여, 리시피언트 동물에게 이식하여 모포의 재생을 검토한 바, 모유두 세포 대 상피계 세포의 세포수의 비와 모포의 재생과의 사이에 일정한 관계가 있음이 발견되었다. 즉, 모포를 보다 많이 재생시키는 것을 바라는 경우, 활성 모유두 세포 대 활성 상피계 세포의 세포수의 비를 1:3~10:1, 더욱 바람직하게는 1:1~10:1, 보다 더욱 바람직하게는 1:1~3:1, 가장 바람직하게는 1:1로 해야 함을 알아냈다. 바꾸어 말하면, 활성 모유두 세포와 활성 상피계 세포의 비율을 적절하게 조정하여 리시피언트 동물에게 이식하면, 모포의 재생을 조정할 수 있다.
모유두 세포와 상피계 세포와의 조합은 동종계라도, 이종계라도 좋다. 예컨대, 모유두 세포 조제품이 마우스에서 유래하는 경우, 상피계 세포는 마우스에서 유래하거나(동종계), 또는 그 밖의 종, 예컨대 래트, 인간에서 유래하더라도 좋다(이종계). 따라서, 본 발명의 모포를 재생하기 위한 조성물은 예컨대, 모유두 세포 및 상피계 세포가 모두 마우스에서 유래하는 조합, 모두 래트에서 유래하는 조합, 혹은 모두 인간에서 유래하는 조합이라도(이상, 동종), 또는 모유두 세포가 마우스에서 유래하고, 상피계 세포가 래트에서 유래하는 조합, 모유두 세포가 래트에서 유래하고, 상피계 세포가 마우스에서 유래하는 조합, 모유두 세포가 마우스에서 유래하고, 상피계 세포가 인간에서 유래하는 조합, 모유두 세포가 래트에서 유래하고, 상피계 세포가 인간에서 유래하는 조합, 모유두 세포가 인간에서 유래하고, 상피계 세포가 마우스에서 유래하는 조합, 모유두 세포가 인간에서 유래하고, 상피계 세포가 래트에서 유래하는 조합(이상, 이종), 등이라도 좋다.
본 발명에 따른 모포의 재생을 위한 조성물을 리시피언트 동물에게 이식하는 방법은, 그 자체 공지의 이식 방법에 의할 수 있다. 예컨대, 문헌[Weinberg et al, J. Invest. Dermatol. Vol. 100(1993), pp. 229-236]을 참조할 것. 예컨대 누드 마우스에게 이식을 하는 경우, 준비된 세포를 이식 직전~1시간 전에 혼합하고, 원심(9000×g, 10 min.)에 의해 배양액을 제거하여, 50~100 μL 정도의 세포 덩어리로 한 후, 신속하게 누드 마우스의 등부분 피부에 매립한 실리콘제의 돔형 챔버 내에 유입시킨다. 일주일 후에 챔버를 조심스럽게 떼어내고, 또 2주 후에 이식 부위의 모발 형성의 유무를 육안 관찰할 수 있다. 인간을 포함하는 동물에게 발모를 목적으로 이식을 하는 경우도 비슷하게 행할 수 있으며, 적절한 방법은 의사나 수의사에 의해 적절하게 결정될 것이다.
이식은, 예컨대 직경 약 1 cm의 원에 대하여, 모유두 세포가 1×106~108개/cm2, 바람직하게는 1.0~1.5×107개/cm2의 이식량, 보다 바람직하게는 1.27×107개/cm2의 이식량으로 이식되도록 행하는 것이 바람직하다.
상기 조성물을 리시피언트 동물에게 이식하는 경우, 그 이식은 동종 이식, 즉 자기 이식, 동종 동계 이식 혹은 동종 이계 이식이라도, 이종 이식이라도 좋다. 동종 이식의 경우, 모유두 세포 조제품 및 상피계 세포는 모두 리시피언트와 동종이다. 이종 이식에서는, 모유두 세포 조제품 또는 상피계 세포 중 어느 한 쪽이 리시피언트와 이종이며, 다른 쪽이 리시피언트와 동종인 경우와, 쌍방이 리시피언트와 이종인 경우가 있다. 리시피언트 동물로서는 모든 포유동물, 예컨대 인간, 침팬지, 그 밖의 영장류, 가축 동물, 예컨대 개, 고양이, 토끼, 말, 양, 염소, 소, 돼지, 그 외에 실험용 동물, 예컨대 래트, 마우스, 몰모트, 보다 바람직하게는 누드 마우스, 스키드 마우스, 누드 래트를 들 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 조성물을 적당한 리시피언트 동물에게 이식함으로써, 재생 모포를 담지하는 키메라 동물을 제공할 수 있다. 이러한 키메라 동물은, 예컨대 모포의 재생의 기구를 연구·해명하기 위해, 혹은 모포 재생 또는 발모 혹은 탈모에 유효한 약제·생약의 스크리닝을 하기 위한 유력한 동물 모델을 담당할 수 있을 것이다. 리시피언트 동물은, 그 동물에게 이식되는 계에 포함되는 각 세포의 기원에 관계없이, 면역계가 억제된 동물인 것이 바람직하다. 또한 동물종으로서는, 실험 동물로서 사용할 수 있는 것이며, 본 발명의 목적에 따르는 것인 한, 어떠한 동물이라도 좋지만, 바람직하게는, 마우스, 래트 등을 들 수 있다. 이러한 동물 중, 면역계가 억제되어 있는 것으로서는, 마우스를 예로 들면, 누드 마우스와 같이, 흉선 결손과 같은 형질을 갖는 것을 들 수 있다. 또, 본 발명의 목적을 고려하면, 특히 바람직한 리시피언트 동물로서는, 시판되는 누드 마우스(예컨대, Balb-c nu/nu 계통), 스키드 마우스(예컨대, Balb/c-SCID), 누드 래트(예컨대, F344/N Jcl-rnu)를 들 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물을 삼차원 피부 모델에 포함시킴으로써, 재생 모포를 담지하는 삼차원 피부 모델을 제공할 수 있다. 삼차원 피부 모델은 당업자에게 주지된 방법(Exp. Cell Res. Amano S. et al.,(2001), Vol. 271, pp. 249-262)에 의해, 예컨대 하기와 같은 식으로 제작할 수 있다. 삼차원 피부 모델은 모유두 세포를 1×106~108개/cm2, 바람직하게는 1.0~1.5×107개/cm2, 보다 바람직하게는 약 1.27×107개/cm2의 양으로 포함한다.
삼차원 피부 모델 제작 방법
인간 선유아 세포를 0.1% 콜라겐 용액/DMEM/10% FBS에 적당량 분산시켜, 샬레에 분주하고, 즉각 37℃의 CO2 인큐베이터에 정치한다. 겔화한 후, 샬레 벽면 및 바닥면으로부터 겔을 박리하여, 샬레 속에서 부유하게 한다. 콜라겐 겔을 흔들면서 배양하여, 겔을 약 5분의 1로 수축시켜 진피 모델로 한다. 진피 모델을 스테인리스 그리드 위에 놓고, 그 위에 글라스 링을 셋트하여, KGM(표피 세포 배양용 배지)에 분산된 인간 배양 표피 세포(1.0×106 세포수/ml)를 0.4 ml, 글라스 링 내에 주입하여 배양한다. 이 때, 모유두 세포 획분을 동시에 혼합하여 주입한다. 인간 배양 표피 세포의 대체로서 마우스 신생아 표피 세포를 이용할 수도 있다. 샬레 내에 DMEM-KGM-5%FBS+Ca2+의 배지를, 진피 모델의 상부가 공기에 노출될 정도로 넣어 배양하고, 약 일주일 후에 피부 모델을 관찰하여, 모포 원기 형성의 유무와 재현성을 판정한다.
재구성 모포를 담지한 3차원 피부 모델은 상기 재생 모포를 담지하는 키메라 동물과 마찬가지로, 모포의 재생 기구를 연구·해명하거나 발모·탈모에 유효한 약제·생약의 스크리닝에 이용할 수 있다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예
1
진피 세포 획분의 동결 보존에 의해, 상피 세포가 사멸하여, 활성 세포로서 모유두 세포만을 함유하는 세포 조제품을 얻을 수 있음을 확인하기 위해서, 버시칸(Versican) 프로모터 하류에 마커 단백, LacZ의 구조 유전자를 이은 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 마우스(이하 「버시칸-LacZ TG 마우스」)로부터 채취한 피부 조직으로부터 얻어진 세포 획분을 동결 보존하여, 융해한 세포 조제품에 관해서 유세포 분류 해석했다.
(1) 버시칸-LacZ TG 마우스의 진피 세포로부터의 「동결 보존」 모유두 세포 조제품의 조제
(1-1) 버시칸-LacZ TG 마우스로부터 태어난 신생자(생후 4일 이내에 사용) 중, LacZ 양성의 개체를 선별했다. 버시칸-LacZ TG 마우스는, 예컨대 Kishimoto 등(전술)에 기재된 방법에 의해 제작할 수 있다.
(1-2) 각 개체를 에탄올과 인산 완충 생리 식염수(이하 「PBS」)로 세정한 후, 등부분 피부를 박리하여, 0.25% 트립신/PBS 속에서 4℃ 하에 하룻밤 정치했다.
(1-3) 다음날, 핀셋 등으로 표피와 진피를 분리하고, 진피 측을 0.35% 콜라게나아제/DMEM(둘베코 변법 이글 최소 배지. 이하 「DMEM」)에 의해 37℃ 하에서 약 1시간 정도 처리했다.
(1-4) (1-3)의 세포를 정성 들여 현탁 조작한 후, 셀 스트레이너에 통과시키고, 이어서 원심 분리기(900 g, 10분)에 의해서 세포를 모았다.
(1-5) 세포수를 계측하여, 1×105~1×108/ml의 세포 밀도로 세포 동결 보호액(셀벵커2(BLC-2), 니혼젠야쿠고교 제조)으로 재현탁하여, 동결 튜브에 분주하고, 통상의 세포 보존 방법에 따라서, 액체 질소 내에서 보존했다.
(1-6) 약 일주일 후에 융해하여, 이것을 이하의 유세포 분류 해석에 이용했다.
(2) 플루오로 리포터 LacZ 플로우 사이토메트리 해석
실험 재료
·플루오로 리포터 LacZ 유세포 분류 키트(Fluoro Reporter lacZ flow cytometry kits) Molecular Probe사, 카탈로그 No. F-1930(50 반응분)/F-1931(250반응분))
·시약의 준비
반응액 : 키트 중의 FDG 시약(Component A)을 MiliQ수로 1:10으로 희석했다. 1 샘플당 50 μL을 사용했다.
정지액 : 키트 중의 PI 시약(Component D)을 키트 부속의 완충액으로 1:100으로 희석했다. 1 샘플당 0.9 ml를 사용했다. 사용할 때까지 얼음 속에서 4℃로 차게 해 두었다. 염색 매체로서는, 상피 세포를 특이적으로 염색하는 특이 항체인 CD49f 모노클로날 항체(세로테크사 제조, MCA699), 죽은 세포를 특이적으로 염색하는 7-ADD(베크만코울터 제조, PN-IM 3422)를 이용했다.
(2-1) 버시칸-LacZ TG 마우스 유래의 진피 세포의 현탁액을 ~1×107 세포수까지의 세포수로 조정하고, 750 ul의 염색 매체를 가하여, 1.5 ml의 에펜 튜브로 옮겼다.
(2-2) 3000 회전으로 5분간 원심하여, 웃물을 버렸다. 세포 팰릿을 100 μL의 염색 매체에 재현탁했다. 이 현탁물을 37℃의 항온조에서 10분간 예비 항온처리했다.
(2-3) 37℃의 항온조에서 10분간 예비 항온처리해 둔 반응액을 50 μL 가하여, 정확히 1분간, 37℃에서 반응을 했다.
(2-4) 0.9 ml의 정지액을 가하여, 얼음 속에 보존했다.
(2-5) 10분 후에 40 μL의 50 mM PETG(Component B)를 가하여 반응을 완전히 저해했다.
(2-6) 신속하게 FACS로 형광 강도를 측정했다. 유세포 분류기(FACS)의 사용 방법은 메이커의 취급 설명서에 따랐다. FACS의 측정 장치는 예컨대, 베크만·코울터사의 XL-MCL을 이용할 수 있다. 본 키트에 사용되고 있는 형광 색소 Fluorescein(플루오로세인)에 알맞은 검출 설정으로 세포의 형광 강도의 분포를 측정했다.
(3) 해석 결과
LacZ 및 7-AAD에 기초한 FACS 해석은, 동결 융해한 세포 중의 LacZ+ 세포의 대부분이 동결 융해를 거쳐도 생세포임을 보였다(도 1). 따라서, 모유두 세포는 동결 융해에 의해서 사멸하지 않음이 분명하게 되었다. 또한, CD-49 및 7-AAD에 기초한 FACS 해석에서는, CD-490 세포(상피계 세포)의 대부분이 동결 융해된 후, 7-AAD+ 획분(죽은 획분)에 존재하는 것을 보였다(도 2). 따라서, 동결 융해한 세포 조제품 중의 생세포는 LacZ+, CD-49-, 7-AAD-, 즉, 모유두 세포(LacZ+) 또한 비상피계 세포(CD-49-)이며, 또한 생세포(7-AAD-)이다. 이상의 결과를 정리하면, 생세포는 대부분이 상피계 세포가 아니라, 모유두 세포임이 분명하게 되었다. 따라서, 동결 융해에 의해 상피계 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있어, 활성 세포로서 모유두 세포만 포함하는 모유두 세포 조제품을 조제할 수 있음이 분명하게 되었다.
실시예
2
동결 융해 모유두 세포와 상피계 세포의 혼합 이식에 의해 모포 재생을 시도했다.
I. 각종 세포의 조제
(1) 마우스 유래 상피 세포
(1-1) 수술 전날, ICR 계통 마우스의 신생자로부터 각 개체를 에탄올과 인산 완충 생리식염수(이하 「PBS」)로 세정한 후, 등부분 피부를 박리하여, 0.25% 트립신/PBS 속에서 4℃ 하에 하룻밤 정치함으로써 피부를 트립신 처리했다.
(1-2) 핀셋에 의해 표피 부분만 박리하여, 잘게 자른 후, 켈라치노사이트용 배양액(이하 「KGM」) 속에서 4℃에서 약 1시간 현탁 처리했다.
(1-3) 셀 스트레이너에 통과시킨 (1-2)의 현탁물을 원심 분리기(×900 g, 10분)에 걸어 상피계 세포를 회수했다.
(1-4) 리시피언트 동물 1 개체당, 2마리의 신생자 유래에 상당하는 양의 상피계 세포(세포수로서 약 1×107)를 수술에 이용했다. 상당량의 세포를 KGM 혹은 SFM 배지로 현탁하여, 사용 직전까지 빙상에 정치했다. 이것을 「마우스 유래 상피 세포」 조제품으로 한다.
(2) 「사용시 조제」 마우스 유래 진피세포 조제품(비교예)의 조제
(2-1) 수술 전날, ICR 계통 마우스의 신생자로부터 상기 (1-1), (1-2)와 같은 방법에 의해 피부를 트립신 처리했다.
(2-2) 핀셋으로 표피 부분을 박리하고, 남은 진피를 잘게 자른 후, 0.35%의 콜라게나아제를 포함한 적당한 배양액 DMEM+10% FBS 속에서 37℃에서 약 1시간 현탁 처리했다.
(2-3) 셀 스트레이너에 통과시킨 현탁물(2-2)을 원심 분리기에 걸어 진피 세포를 회수했다.
(2-4) 리시피언트 동물 1 개체당, 세포수로서 약 1×107의 진피 세포를 수술에 이용했다. 상당량의 세포를 DMEM+10% FBS 등으로 현탁하여, 사용 직전까지 빙상에 정치했다. 이것을 「사용시 조제」 마우스 유래 진피 세포 조제품으로 한다.
(3) 모유두 세포 획분을 포함하는 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품의 조제
(3-1) 신생자 ICR 계통 마우스 등부분 피부를 박리하여, 표피를 채취했다.
(3-2) 트립신 용액으로 하룻밤 정치하고, 다음날 표피를 핀셋으로 제거하여, 남은 진피를 콜라게나아제로 처리, 세포 현탁액을 조제했다.
(3-3) 셀 스트레이너에 의해 상기 현탁물을 여과하고, 그리고 정치에 의해 침전물을 제거했다.
(3-4) 세포수를 계측하여, 1×105~1×108/ml의 세포 밀도로 동결 보호액으로 재현탁하고, 동결 튜브에 분주하여, 통상의 세포 보존 방법에 따라서, 액체 질소 내에서 보존했다.
(3-5) 약 일주일 후에 융해하여, 이식 실험에 1×107개/이식을 이용했다. 이것을 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품으로 한다.
II. 모포 재구성 방법(동물에의 이식 방법)
상기 마우스 유래 상피 세포 조제품(1-4)을 「사용시 조제」 마우스 유래 진피 세포 조제품(2-4) 또는 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품(3-5)과 혼합했다. 이들 혼합물을 이하의 「재구성 모포 작성 수순」의 「세포 현탁액」으로서 이용했다.
<재구성 모포 작성 수순>
준비물:
리시피언트 동물(Balb-c nu/un 계통 누드 마우스. 5주령 이상),
실리콘제의 직경 1 센티 정도의 돔형 캡(이하 벌브라고 호칭),
마취약,
수술용 가위, 핀셋, 봉합기,
마이크로피펫
세포 현탁액(배양액 DMEM+10% FBS 약 150 μl에 현탁)
<수순>
(i) 누드 마우스를 마취했다.
(ii) 등부분 피부를 직경 1 센티 미만으로 베어냈다.
(iii) 상처 자리에 벌브를 삽입하고, 봉합기로 고정했다.
(iv) 벌브 내에, 세포 현탁액을 피펫을 이용하여 주입했다.
(v) 그대로 약 일주일 사육하여, 벌브를 떼었다.
(vi) 벌브를 떼어낸 후, 1~6주일 후(통상은 2주일 후), 딱지가 떨어진 흔적에, 재구성 모포의 생육을 관찰했다.
모포 재구성 실험의 결과를 이하의 표 1 및 도 3에 도시한다. 「사용시 조제」 마우스 유래 진피 세포 조제품만을 이식한 경우라도 모포 재생이 인정되는 데 대하여, 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품만을 이식한 경우에는 모포 재생은 인정되지 않았다. 이 결과는, Kishimoto 등(전술)의 트랜스제닉 마우스 유래의 진피 세포 획분으로부터 셀 소터에 의해 순화한 모유두 세포를 이용하여 얻어진 결과와 일치하여, 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품에는 활성 세포 성분으로서 모유두 세포만이 포함되어 있음을 실증했다.
| 모유두 세포 획분 | 상피계 세포 획분 | 모포 재생 | (발모수/이식수) |
| 사용시 조제(미동결) | 사용시 조제 | ++ | (4/4) |
| 사용시 조제(미동결) | - | ++ | (4/4) |
| 동결 융해 | 사용시 조제 | ++ | (10/10) |
| 동결 융해 | - | - | (0/10) |
| - | 사용시 조제 | - | (0/10) |
실시예
3
모유두 세포 획분과 상피계 세포 획분의 세포 비율의 모포 재구성 효율에 미치는 영향
「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품과, 실시예 2에 기재한 마우스 유래 상피 세포와 같은 처리에 의해 조제한 래트 신생아 피부 유래 상피계 세포를 각각, O, 1×1O6, 3.3×106, 1×107의 세포수로 조정하여 혼합하고, 전술한 재구성 모포 작성 수순에 의해 누드 마우스 등부분 피부에 이식하여 모포 재구성의 유무를 조사했다. 그 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.
| 모유두 세포 획분 | 상피계 세포 획분 | 모포 재생 |
| 0 | 1.0 x 107 | - |
| 1.0 x 106 | 1.0 x 107 | ± |
| 3.3 x 106 | 1.0 x 107 | + |
| 1.0 x 107 | 1.0 x 107 | +++ |
| 1.0 x 107 | 3.3 x 106 | +++ |
| 1.0 x 107 | 1.0 x 106 | ++ |
| 1.0 x 107 | 0 | - |
표 2의 결과로부터, 모유두 세포와 상피계 세포와의 혼합비가 1:10~10:1의 범위에서 모포의 재생이 인정되고, 1:1~3:1 특히 1:1 정도의 세포 혼합물을 이식했을 때, 모포의 재생이 현저히 생기는 것을 알았다.
실시예
4
상피계 세포를 성숙한 마우스 피부 유래로 한 경우의 모포 재구성
성숙한 마우스 피부 유래(10주령 이후)의 상피계 세포의 조제를, 실시예 2에 기재한 신생아 마우스 유래 상피계 세포의 조제에 준하여 행했다. 성숙 마우스 피부 유래의 상피계 세포로서, 생후 10주령 이후의 마우스의 휴지기 모의 표피로부터 조제한 것(휴지기 모 상피계 세포 함유계)과, 휴지기 모의 피부를 왁스 도포에 의한 제모 처리에 의해 기계적으로 자극하여, 발모를 재촉한 마우스의 표피로부터 조제한 것(성장기 유도모 상피계 세포 함유계)의 2종류를 이용했다. 이들 성숙 마우스 피부 유래 상피계 세포를 각각 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품과 세포수가 1:1이 되도록 혼합하여, 전술한 재구성 모포 작성 수순에 의해 마우스의 등부분에 이식했다. 그 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.
| 모유두 세포 획분 | 상피계 세포 획분 | 모포 재구성 | (원기 형성수/이식수) |
| 마우스 | 마우스 (신생자 유래 배양 세포) |
+ | (2/2) |
| 마우스 | 마우스 (성숙 마우스: 휴지기) |
++ | (3/3) |
| 마우스 | 마우스 (성숙 마우스: 성장기) |
++ | (3/3) |
+++ … 발모가 고밀도로 인정된다
++ … 발모가 인정된다
+ … 이식 조직 내에서 모포 형성이 인정된다
모포 원기의 형성 유무는 이식부 조직으로부터 얇은 절편을 제작하여, 헤마톡실린-에오진 염색 등의 일반 염색을 한 후, 형태 관찰에 의해 표피층의 함몰과 진피 선유아 세포의 표피 함몰부 바로 아래에 있어서의 응집에 의해 판정했다.
이 결과로부터 분명한 바와 같이, 휴지기 모 상피계 세포 함유계, 성장기 유도모 상피계 세포 함유계의 어느 것을 이식한 경우라도, 발모가 인정되었다. 따라서, 상피계 세포는 신생자 표피에 한하지 않고, 성숙 표피, 예컨대 휴지기 모 또는 성장기 모의 표피에 연유되는 경우라도, 모포 재생에 유효하다는 것을 알았다.
실시예
5
모유두 세포와 상피계 세포를 이종계로 한 경우의 모포 재구성
「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품과 래트 신생아 피부 유래 상피계 세포를 각각 약 1×107개 혼합하고, 상술한 재구성 모포 작성 수순에 의해 누드 마우스 등부분 피부에 이식하여 모포 재구성의 유무를 조사했다. 그 결과는 이하의 표 4 및 도 4에도 도시한다.
| 모유두 세포 획분 | 상피계 세포 획분 | 모포 재구성 | (원기 형성수/이식수) |
| 마우스 | 마우스(신생자) | +++ | (12/12) |
| 래트 | 래트(신생자) | +++ | (3/3) |
| 마우스 | 래트(신생자) | +++ | (4/4) |
+++ … 발모가 고밀도로 인정된다
++ … 발모가 인정된다
+ … 이식 조직 내에서 모포 형성이 인정된다.
이 결과로부터 분명한 바와 같이, 모유두 세포와 상피계 세포와의 혼합물이 이종계라도, 동종계와 마찬가지로, 모포를 재생시키는 데 유효하다는 것을 알았다.
실시예
6
상피계 세포를 인간 신생아 포피 유래로 한 경우의 모포 재구성
할례 등에 의해 얻어진 인간 신생아 포피로부터 표피 세포를 조제하고, 동결 보존 마우스 모유두 세포 조제품과 혼합하여, 전술한 재구성 모포 작성 수순에 의해 누드 마우스 등부분 피부에 이식하여 모포 재구계의 유무를 조사했다.
포피 조직은 일반적인 선유아 세포 배양용 배지(DMEM 배지 등) 및 각화 세포 배양용 배지(켈라치노사이트-SFM 배지; 인비트로젠 등) 속에서 냉장 보존함으로써, 3~1주일 정도 보존할 수 있다.
포피 유래 배양 세포는 하기의 방법에 의해 조제했다.
상기 배지 중의 포피 조직(인종을 막론하고 이용할 수 있음)을 PBS(조직 배양용, 칼슘, 마그네슘 프리)에 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항생 물질이 첨가된 용액으로 채워진 페트리 접시 속에서 30분간 반응시켰다. 또한 10분간, 새로운 PBS와 항생 물질로 채워진 페트리 접시로 옮겨, 10분간 반응시켰다. 과잉의 지방 조직을 제거한 후에, 약 1 cm2 정도의 피부 조각으로 재단하여, 디스파아제 용액(고도세이슈 제조 : 농도 1000 U~5000 U) 중에 부유시킨 상태로 4℃, 약 18시간 반응시켰다. 반응한 후, 다시 PBS 용액으로 씻은 후에, 표피 부분을 신중하게 핀셋으로 잡아 떼어냈다. 떼어낸 표피 시트를 5 ml의 0.05% 트립신-0.5 mMEDTA 용액에 현탁하여, 37℃에서 15분간 반응시켰다.
트립신 억제제를 가하여, 반응을 정지한 후, 900 회전으로 10분간 원심하여, 웃물을 버렸다. 10 ml의 켈라치노사이트-SFM 배지(인비트로젠사 제조)에 재현탁하여, 세포수를 계측했다. 약 1×106~107개의 세포를 1회의 이식 실험에 썼다. 이식을 위해, 계대한 배양 표피 세포를 조제하는 경우는, 약 1×106의 표피 세포를 I형 내지는 IV형 콜라겐 용액으로 코팅한 10O mm의 샬레 혹은 75 cm2의 플라스크에 파종하고, 켈라치노사이트-SFM 배지를 이용하여, CO2 항온처리기 내에서 정법에 따라서 배양을 했다. 세포가 콘플루언트에 달한 시점에서, 트립신에 의해 세포를 박리하여, 회수하고, 재차 1×106의 세포 밀도로 조정하여, 필요한 세포수, 계대수가 될 때까지 배양을 계속했다.
상기 이식의 결과도 이하의 표 5에 나타낸다.
| 모유두 세포 획분 | 상피계 세포 획분 | 모포 재구성 | (원기 형성수/이식수) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피) | + | (3/3) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | + | (2/2) |
+ … 이식 조직 내에서 모포 형성이 인정된다
이 결과로부터, 상피계 세포로서 인간에게 유래하는 것을 마우스 모유두 세포와 조합하더라도, 모포의 재생에 유효하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 흥미 깊은 것은, 포피 세포는 모포나 모근을 갖지 않는 피부 부위 유래의 상피계 세포임에도 불구하고, 모유두 세포와 조합함으로써 모포를 재생시켰다. 따라서, 모포를 재생시키는 계에 있어서 모유두 세포와 조합할 수 있는 상피계 세포는, 유모 부위의 피부에 한하지 않고, 무모 부위의 피부에 유래하여도 되는 것도 분명하게 되었다.
실시예
7
상피계 세포를 인간 성인 포피 유래로 한 경우의 모포 재구성
포경 제거 등의 방법시에 얻어진 성인 포피 조직(20세대)으로부터 표피 세포를 조제하여, 동결 보존 마우스 모유두 세포 조정품과 혼합하여, 상술한 재구성 모포 제작 수순에 의해 누드 마우스 등부분 피부에 이식하여 모포 재구성의 유무를 조사했다.
성인 포피 조직은 일반적인 선유아 세포 배양용 배지(DMEM 배지 등) 및 각화 세포 배양 배지(켈라치노사이트-SFM 배지; 인비트로젠사 등) 속에서 냉장 보존함으로써, 일주일 정도 보존할 수 있다.
성인 포피 조직 유래 배양 세포의 조제 방법은 실시예 6의 신생아 포피 유래 배양 세포의 조제 방법에 준하여 행할 수 있다.
상기 이식의 결과를 이하의 표 6에 나타낸다.
| 모유두 세포 획분 | 상피계 세포 획분 | 모포 재구성 | (원기 형성수/이식수) |
| 마우스 | 사람(성인 포피) | + | (1/1) |
| 마우스 | 사람(성인 포피 유래 배양 세포) | + | (4/6) |
+ … 이식 조직 내에서 모포 형성이 인정된다
이 결과로부터, 상피계 세포로서 성인 인간 유래의 것을 마우스 모유두와 조합하더라도 모포의 재생에 유효하다는 것을 알 수 있었다. 이로부터, 모포를 재생시키는 계에 있어서 모유두 세포와 조합할 수 있는 상피계 세포는 발생 과정, 성숙한 조직에 상관없이, 이용할 수 있음이 분명해졌다.
실시예
8
인간 포피 유래 배양 세포의 계대수에 의한 모포 재구성에 미치는 영향
실시예 6 및 7에 있어서, 인간 신생아 혹은 성인 포피 유래의 다른 인종의 상피 세포를 다른 계대수, 배양후에 마우스 모유두와 조합하여, 모포 재구성의 실험에 쓰게 한 경우의, 재구성의 효율에 관해서, 이하의 표 7에 나타낸다.
| 모유두 세포 | 상피계 세포 | 인종 | 계대수 | 모포 재구성 | (원기 형성수/이식수) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피) | 흑인 | 0 | + | (3/3) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | 흑인 | 1 | + | (2/2) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | 흑인 | 2 | + | (3/3) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | 백인 | 1 | + | (1/1) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | 백인 | 2 | + | (1/4) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | 백인 | 3 | - | (0/2) |
| 마우스 | 사람(신생아 포피 유래 배양 세포) | 백인 | 5 | - | (0/2) |
| 마우스 | 사람(성인 포피 유래 배양 세포) | 일본인 | 0 | + | (1/1) |
| 마우스 | 사람(성인 포피 유래 배양 세포) | 일본인 | 1 | + | (2/2) |
| 마우스 | 사람(성인 포피 유래 배양 세포) | 일본인 | 2 | + | (2/4) |
| 마우스 | 사람(성인 포피 유래 배양 세포) | 일본인 | 3 | + | (0/1) |
+ … 이식 조직 내에서 모포 형성이 인정된다
- … 이식 조직 내에서 모포 형성이 인정되지 않는다
이 결과로부터, 상피계 세포로서, 인종에 상관없이, 계대수가 젊을수록, 모포가 재구성되는 것도 분명하게 되었다.
실시예
9
재구성된 모포의 검토
재구성된 모포가 모유두 세포와 상피계 세포와의 조합에 의하여 구성되어 있는지의 여부를 확인하려면, 예컨대 종 특이적인 항체를 이용하는 방법이나 종 특이적인 유전자 배열(인간 Alu 배열 등)을 이용할 수 있다. 가장 간편하게는, 모포 재생을 위한 본 발명에 따른 조성물로서 이종계 조성물을 사용하여(예컨대 모유두 세포를 마우스 유래로 하고, 상피계 세포를 래트 또는 인간 유래로 하거나, 또는 그 반대), 핵 염색에 이용되는 헥스트(Hoechst) #33258 시약(Molecular Probe사)에 의한 염색에 의해서, 이종계의 마우스인 경우는 핵 내에 복수의 도트(점)가 명료하게 관찰되는 데 대하여, 인간, 래트에서는 그것이 인정되지 않음으로써 인해 용이하게 조직학적 관찰에 의해 판별할 수 있다(Miller GJ & Ferrara JA, Stain Technol. 63(1) : 15-21, 1988).
헥스트 #33258 핵 염색법
이식 부위의 조직을 얇게 자른 파라핀 절편을 슬라이드 글라스(4-6 μm이 바람직함)에 얹어, 통상의 탈파라핀 처리하고(크실렌 세정 2회→99.9% 에탄올 세정→80% 에탄올 세정→70% 에탄올 세정→수세), PBS 용액으로 옮겼다(이 상태에서 잠시 놓아 둘 수 있음).
헥스트 #33258(모레큘러-프로브사) 4 mg를 1 mL의 PBS 용액에 용해했다(알루미늄으로 차광). 만들어진 헥스트 #33258 용액 10 μL을 10 ml의 PBS로 희석하여 (1000배 희석, 최종 농도 4 μg/mL), 그 몇 방울을 평치한 슬라이드의 조직 절편 위를 완전히 덮도록 첨가했다. 그 후, 실온에서 차광하면서 15분 반응시켜, 5분간 수세한 후, GVA Mounting Solution(글리세롤계 봉입제, Zymed Lab. 제조, 프나코시 약품 취급)과 커버 글라스로 봉입했다. UV 영역의 여기를 관찰할 수 있는 형광 현미경 하에서 관찰을 했다.
이 방법에 따르면, 마우스 세포의 핵은 밝고, 복수의 도트가 관찰되며, 그 밖의 래트, 인간 세포는 도트가 보이지 않기 때문에, 조직의 기원의 종을 식별할 수 있다.
도 5는 모유두 세포가 마우스에서 유래하고, 상피계 세포가 인간(인간 신생아 포피 유래)에서 유래하는 모포 재구성계를 이식한 경우의 형광 현미경 사진의 결과를, 통상의 조직 염색, 즉 헤마톡실린-에오진(HE) 염색(「염색법의 전부」 의치약출판 주식회사, p2~7, 1988년)한 조직상과의 대비에 있어서 도시한 것이다. 그 도면으로부터, 모포는 모유두 세포(마우스에서 유래하는 밝은 도트를 다수 갖는 부분)와 상피계 세포(인간에서 유래하는 도트를 갖지 않는 부분)의 쌍방으로 구성되는 것이 분명하게 되었다.
실시예
10
3차원 피부 모델에서의 모포 원기 재생
인간 선유아 세포를 0.1% 콜라겐 용액/DMEM/10% FBS에 적당량 분산시켜, 샬레에 분주하고, 즉각 37℃의 CO2 항온처리기에 정치했다. 겔화한 후, 샬레 벽면 및 바닥면으로부터 겔을 박리하여, 샬레 속에서 부유하게 했다. 콜라겐 겔을 흔들면서 배양하여, 겔을 약 5분의 1로 수축시켜 진피 모델로 했다. 진피 모델을 스테인리스 그리드 위에 놓고, 그 위에 글라스 링을 셋트하여, KGM(표피 세포 배양용 배지)에 분산된 인간 배양 표피 세포(1.0×106 세포수/ml)를 O.4 ml 글라스 링 내에 주입하여 배양했다. 이 때, 「동결 보존」 마우스 유래 진피 세포 조제품을 동시에 혼합하여 주입했다. 샬레 내에 DMEM-KGM-5% FBS+Ca2 +의 배지를, 진피 모델의 상부가 공기에 노출되어질 정도로 넣어 배양하고, 약 일주일 후에 피부 모델을 관찰하여, 모포 원기 형성의 유무와 재현성을, 헤마톡실린-에오진 염색 및 상기 헥스트 염색에 의해 판정했다. 그 결과를 도 6에 도시한다.
도 6의 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 모포 재생계를 3차원 피부 모델에 이식하더라도, 모포 원기 형성이 인정되었다.
본 발명에 따른 모포를 재생하기 위한 조성물은 모포 이식이나, 모포 재구성 에 관한 연구·개발에 이용할 수 있다.
Claims (3)
- 피부 조직으로부터 표피 조직을 제거함으로써 얻은 진피 조직 획분을 콜라겐 처리하여 세포 현탁물을 제조하고, 이어서 그 세포 현탁물을 동결보존함으로써 모포 상피 세포를 사멸시켜 제조된 모유두 세포 및 상피계 세포를 포함하며, 여기서 상기 모유두 세포 대 상피계 세포의 세포수의 비가 1:10~10:1인 모포 재생용 조성물을 이용하여 생체외 3차원 인공 피부를 제작함으로써 형성된, 재구성 모포를 담지한 생체외 3차원 인공 피부.
- 제1항에 있어서, 모유두 세포를 1×106~108개/cm2의 양으로 포함하는 것인 생체외 3차원 인공 피부.
- 제1항에 있어서, 모유두 세포를 1.0~1.5×107개/cm2의 양으로 포함하는 것인 생체외 3차원 인공 피부.
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