CN102911915A - 一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系ctsc-1及其建立方法 - Google Patents

一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系ctsc-1及其建立方法 Download PDF

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张雁
贺姮
张海霞
汪华
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Abstract

本发明提供了一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系的建立方法，为研究人舌部鳞状上皮细胞癌的特性及其治疗药物提供了物质基础。该建立方法包括如下具体步骤：采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19；经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。

Description

一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1及其建立方法
技术领域
本发明涉及人舌部鳞状上皮细胞癌细胞技术领域，具体地，涉及一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1及其建立方法。
背景技术
1.1舌部鳞状上皮细胞癌的发病与预后
舌癌是最常见的口腔鳞状上皮细胞癌，常发生在舌前2/3处。舌癌高发于东南亚，以印度为最高，年发生率达到9.4/100万。近年来研究显示，世界范围内舌癌总发生率逐步提高，而且有年轻化的趋势。由于其发生部位的组织学特点以及舌癌的生物学特性,舌癌使患者舌部运动受限，导致吞咽、说话、进食困难。另外，舌癌易转移,预后较差。
1.2肿瘤干细胞的研究进展
1.2.1肿瘤干细胞理论的提出与发展
传统观念认为，肿瘤是一群由体细胞突变，获得无限增殖能力的细胞组成，但是小鼠致瘤实验和体外克隆形成实验结果表明，并非所有的肿瘤细胞都可以增殖。说明肿瘤不是一个均质的个体，它具有异质性，在组织中存在不同的细胞亚群。肿瘤组织中可能有一部分具有干细胞特性的细胞，这类型细胞被称为肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）。
肿瘤干细胞理论最早在白血病中被证实，1994年Lapidot等通过FACS利用细胞表面标志CD34+CD38-和小鼠致瘤模型中分离出人急性粒细胞白血病(Acutemyeloid leukemia,AML)干细胞，随后，Bonnet等发现只有CD34+/CD38-白血病细胞能在非糖尿病重度联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combinedimmunodeflcient,NOD/SCID)小鼠体内致瘤。2003年，Clarke等第一次将肿瘤干细胞理论运用到实体瘤中，他们在乳腺癌中证实了这个观点，CD44+CD24-/low细胞只需要100个便可以致瘤。之后，研究发现胶质母细胞瘤等脑肿瘤、肝癌、肺癌等癌症中也能分离出肿瘤干细胞，支持了这个学说。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)对肿瘤干细胞做出了定义：肿瘤中具有自我更新能力，并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。它具有三大特性：1、分化能力：肿瘤干细胞在肿瘤中担任形成和分化各类型肿瘤细胞的角色，在肿瘤生长过程中，不断补充所需的各类肿瘤细胞。2、自我更新能力：生成一部分与自己相同的，具有增殖、扩张和分化潜能的细胞，从而维持干细胞的衡定。3、稳态控制能力：调节和平衡肿瘤的分化，根据环境的刺激对肿瘤做出调控。
1.2.2肿瘤干细胞在口腔癌中的研究及其应用
口腔癌同一癌灶组织内包含有不同分化程度、不同阶段的癌细胞。有研究证实，头颈部鳞状上皮细胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潜能和有致瘤能力的癌细胞。肿瘤干细胞大多处于休眠状态，对放、化疗不敏感，是导致手术后肿瘤易复发、耐药强、难治愈的根源，肿瘤干细胞理论的提出可以使治疗的目标从肿瘤整体转移至肿瘤干细胞，提出针对癌细胞和肿瘤干细胞相结合的综合性治疗策略。肿瘤干细胞的研究也为肿瘤的研究带来了一个新的思路。
1.3细胞系的建立
建立肿瘤细胞系是研究肿瘤致关重要的环节。细胞系广泛应用于生物学各个研究领域。它是指直接从生物体的组织中分离培养出细胞，为后续研究提供稳定细胞系的一种方法。细胞系是研究特定细胞的生长、代谢、调控特性，细胞与细胞间相互作用，细胞与基质的相互作用等有效的研究材料。人类的第一株连续细胞系是1951年由George Otto Gey实验室建立的子宫颈癌细胞系（Hela），这株细胞系的建立是人体细胞体外培养的里程碑，Hela细胞推进了细胞、基因、病毒、疫苗等许多研究领域的进程，也加深了人们对肿瘤的认识：发现肿瘤的各种特性、研究肿瘤发生发展的原因和过程、筛选抗癌药物等。除了研究细胞本身的特性和癌症的发生发展外，还应用于遗传、免疫、分化、发育的研究领域。此外，国内外不少企业还可以利用细胞进行生产各种因子、蛋白等。细胞的广泛应用推动了细胞生物学的蓬勃发展。
原代培养主要有机械法和酶消化法。机械法主要是利用物理剪切，直接将组织剪碎，然后将这些组织小块贴壁培养的方法。酶消化法是应用适当的酶裂解组织从而分离出单细胞，直接悬浮或贴壁培养的方法。用于消化的酶主要有：胰蛋白酶、胶原酶、链酶蛋白酶、透明质酸酶等。
鳞状上皮细胞癌细胞系的鉴定有以下几个方面：1、病理切片鉴定：世界卫生组织（WHO，2005）根据细胞和细胞核的多形性、细胞分裂状态、角化程度等将其分为高、中、低三级。高分化鳞癌与正常鳞状上皮类似、角化明显、核分裂相少、细胞和细胞核多形性不明显；中分化鳞癌角化较少见，核分裂相多、细胞多形性明显；低分化鳞癌有大量的核分裂相、细胞多形性明显、角化非常少见；2、细胞形态：一般为多角形上皮样，核质比高，核仁清晰个数较多，细胞排列紧密后呈铺路石样；3、细胞间桥粒连接：相邻细胞之间的膜上有一块圆形区域，负责细胞间的连接、通讯、抵抗外力拉扯，桥粒多见于上皮，皮肤、口腔、食管等处的复层扁平上皮细胞间较多，能被胰蛋白酶、胶原酶及透明质酸酶所破坏，电镜下可见致密斑和中间纤丝，上皮细胞中多是角蛋白丝；4、分子标志：主要是细胞角蛋白（cytokeratin，CK），特异地表达于上皮细胞，是构成上皮细胞内细胞骨架的中间纤丝类蛋白质，共有20种，CK1-9是偏碱性或中性的Ⅱ型角蛋白，CK10-20是偏酸性的Ⅰ型角蛋白，这些角蛋白一般表达于特定的器官或组织，CK8、CK18、CK19常表达于单层上皮。鳞状上皮细胞癌的上述特征为分析新建立的舌部鳞状上皮细胞癌细胞系的生物学特性提供了理论依据。
第一株舌部鳞状上皮细胞癌细胞系建立于1981年，是由日本报道的，这一株细胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我国上海报道建立了一株舌癌Tca8113，1995在我国香港报道建立了一株舌癌细胞系PWH-S1。现存在Americantype culture collection（ATCC）中的舌癌细胞系共有5株，分别为SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世纪80年代的，之后鲜有报道。
不同舌癌细胞的生物学特性会存在差异，这种差异源于患者本身和接受治疗的方法。有些舌癌的分化度低，恶性程度高；有些舌癌的分化度高，恶性程度低。有些患者在术前接受化疗，因此术后所得到的细胞有较高的耐药性。正是这种差异的存在，使我们对舌癌的多样性和复杂性有了更多的认识，而存在差异的舌癌细胞系便成为研究舌癌发生发展的有效体外模型。
发明内容
为此，本发明提供了一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1及其建立方法。
本发明的技术方案如下：中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，包括如下具体步骤：
A）采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；
B）当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；
C）将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19；
D）经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，步骤A的具体方法为：
1）I型胶原包被培养皿室温静止1小时以上，1×PBS洗皿一次，待用；
2）准备培养液，放于37℃恒温水浴锅中温育10分钟；
3)在超净台中取出舌部鳞状上皮细胞癌组织，在酒精中消毒不超过10秒，在1×PBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中；
4）将组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中；
5）置于37℃，5%CO2的培养箱中培养；
6）第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块；
7）视细胞生长情况进行适当换液。
所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，步骤B的具体方法为：
1）弃培养液，用1×PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；
2）加入血清终止消化；
3）吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；
4）离心1000rpm，5分钟；
5）弃上清，加入适量培养液吹打散；
6）将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1在研究治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1在治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1已经在中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)进行保藏。
本发明的有益效果为：本发明建立了中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1，并用该细胞系实现了肿瘤干细胞的富集，为研究人舌部鳞状上皮细胞癌的特性及其治疗药物提供了物质基础。
附图说明
图1、细胞来源患者组织切片H&E染色，光镜下观察原代细胞和CTSC-1传代细胞系的细胞形态。
图2、透射电镜下观察CTSC-1细胞的超微结构图。
图3、琼脂糖凝胶检测正常颊粘膜细胞、CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18、19的mRNA的表达情况；
图4、Western免疫印迹方法检测CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18和E-cadherin的蛋白表达情况。
图5、CTSC-1细胞染色体显示；
图6、随机选择计算了100个分散均匀的CTSC-1细胞染色体后用SSCP统计所得结果；
图7、CTSC-1细胞的细胞生长曲线；
图8、CTSC-1细胞的克隆形成；
图9、CTSC-1细胞小鼠移植瘤组织切片H&E染色；
图10、免疫荧光检测CTSC-1细胞系对CD133，Sox2,Nanog,Oct4,SSEA-1,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的表达；
图11、无血清悬浮培养富集CTSC-1细胞系肿瘤干细胞及其形态学观察；
图12、H&E染色CTSC-1球囊细胞;
图13、CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞对CK8、CK18、CK19的表达；
图14、CTSC-1贴壁细胞和球囊细胞在BME中的克隆形成统计结果;
图15、流式细胞仪检测CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞的干细胞分子标志物表达的对比；
图16、用脂肪诱导培养的方法检测CTSC-1球囊细胞的分化能力结果。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明所述中国人舌癌细胞系CTSC-1的建立方法进一步说明。
一、舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立以及特性鉴定
材料说明：
1 临床标本
本实验所用的口腔组织均取自中山大学附属光华口腔医院手术切除标本。
2 细胞系
本实验所用的舌部鳞状上皮细胞癌CAL27细胞株购自ATCC
3 主要仪器
Figure BDA00002055771600061
Figure BDA00002055771600071
4、主要试剂
Figure BDA00002055771600072
Figure BDA00002055771600081
5 主要溶液以及配方
5.1 细胞培养
1）10×PBS Buffer:NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO411.55g，KH2PO42g，加入约800ml的超纯水，磁力搅拌器充分搅拌溶解，调节pH值至7.4，定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
2）胎牛血清（FBS）：购自Hyclone公司，4℃保存，和培养基配成适当比例。
3）10×Trypsin-EDTA(TE):称取1.25g trypsin，1.00g EDTA溶解于250ml的1×PBS中，过滤除菌，-20℃保存。使用前用1×PBS buffer稀释成适当浓度消化细胞。
4）DMEM/F12（DF）培养基：溶解于1L的超纯水中，调节PH值到7.2，利用蠕动泵和0.22μm滤膜过滤除菌。4℃保存。2×DF分量加倍，水量不变。DF（-）表示不加入Ampicillin和Kanamycin。
5）鼠尾Ⅰ型胶原：原代培养时，用1×PBS稀释成1%的浓度，每个六厘米的皿上加入1.5mL覆盖皿底，室温包被1小时以上。
6）软琼脂：soft agar加超纯水，高温高压灭菌配成0.66%和1.33%。
7）秋水仙素：40μg/mL母液，最终使用浓度为0.2μg/mL。
8）舌癌原代培养液：DF+10%FBS。
5.2 核酸电泳
1）50×TAE电泳Buffer（pH8.5）：在1L的玻璃瓶中加入242g Tris，18.6gNa2EDTA·2H2O，然后加入约800ml的二级水，充分搅拌溶解，再加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加二级水定容至1L，室温保存。使用时以1:50稀释。
2）溴化乙锭（EB）：储存液浓度为10mg/ml，工作浓度为0.5μg/ml。
3）1%琼脂糖电泳凝胶：称取1g琼脂糖（agarose），加入100ml 1×TAE buffer，加热煮沸至琼脂糖完全溶解，冷至50℃左右，加入5μl EB储存液，使终浓度为0.5μg/ml，摇匀后灌制凝胶平板。
5.3 Western免疫印迹
1）蛋白裂解液（RIPA）：
  组分   母液   50ml体系
  50mM Tris pH8.0   1M Tris pH8.0   2.5ml
  150mMNaCl   5M NaCl   1.5ml
  1mM EDTA   0.5M EDTA   0.1ml
  1%Triton x-100   Triton x-100   0.5ml
  0.1%SDS   10%SDS   0.5ml
  0.25%Sodium deoxycholate   Sodium deoxycholate   0.125g
  dd water   Fill up to 500ml   44.9ml
2)蛋白酶抑制剂：EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail药片(Roche，Cat.No.04693159001)；cocktail中包含有Pancreas-extract,Thermolysin(Metalloprotease),Chymotrypsin,Trypsin,Papain等蛋白酶抑制剂。一片药片加1ml1×PBS配成10×cocktail储存液，使用时稀释成1×。
3）蛋白定量：按照GE 2-D Quant Kit说明书进行。
4）1M Tris-HCl(pH6.8):称量121.1g Tris置于1L瓶子中，加入约800ml的二级水，充分搅拌溶解，用溶盐酸调节pH值至6.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
5）1.5M Tris-HCl(pH8.8)：称量181.7g Tris置于1L瓶子中，加入约800ml的二级水，充分搅拌溶解，用溶盐酸调节pH值到8.8，将溶液定容至1L。高温高压灭菌后，室温保存。
6）10%(W/V)过硫酸铵称1.0g过硫酸铵，加入10ml二级水充分溶解，4℃暂时保存。或分装成100μl小份，密封，-20℃保存。
7）5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)称取15.1gTris，94g甘氨酸，5.0g SDS，加二级水定容至1L，室温保存。使用时用二级水稀释成1×缓冲液。
8）5×SDS-PAGE Loading Buffer：在50ml的塑料离心管中加入1.25ml的1M Tris-HCl(pH6.8)，0.5g SDS，25mg溴酚蓝，2.5ml甘油，然后加二级水定容至50ml，稍加热溶解后，小份（1ml/管）分装后，室温保存。使用前每1ml LoadingBuffer加入50μl 2-巯基乙醇或0.25ml的1M DTT，充分混匀，室温保存。
9）5%浓缩胶
Figure BDA00002055771600101
10）10%分离胶
Figure BDA00002055771600102
11）转膜液：2.9g Glycine，5.8g Tris，0.37g SDS，200ml的甲醇，用二级水定容至1L,室温保存。
12）1×TBST buffer：8.8g NaCl，20ml的1M Tris-HCl(pH8.0)，加约800ml的二级水，充分搅拌溶解，用二级水定容至1L，最后加入1.0ml Tween 20后充分混匀，室温保存。
13）封闭液：称取0.5g脱脂奶粉加至10ml TBST buffer中，充分混匀溶解，现配现用。
14）ECL发光液：pierce ECL enhance chemiluminescent westhern blottingsubstrate，购自Thermo，使用前1∶1混合两种液体，现配现用。
5.4 组织化学
1）10%福尔马林液：50mL甲醛溶液（37%-40%）加到450mL1×PBS中，室温保存。
2）4%多聚甲醛（4%PFA）：将20g的paraformaldehyde倒入400mL的1×PBS中，65℃溶解，溶解时每隔10-20分钟摇匀一下，近于完全溶解时，加入40μl的1M NaOH，1×PBS定容至500mL，混匀后降温至室温，4℃保存。
5.5 抗体
Figure BDA00002055771600111
5.6 引物
Human keratin 8（CK8）
Forward TTC CTG GAG CAG CAG AAC AA
Reverse GAG GAC AAA TTC GTT CTC CAT
Human keratin 18（CK18）
Forward TCA GCA GAT TGA GGA GAG CA
Reverse TCT GAC TCA AGG TGC AGC AG
Human keratin 19（CK19）
Forward ATT CTT GGT GCC ACC ATT GA
Reverse TCC TCA TGG TTC TTC TTC AGG
6 方法与结果：
6.1舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立以及形态学观察
6.1.1细胞原代培养以及传代培养
采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养：
1）I型胶原包被培养皿室温静止1小时以上，1×PBS洗皿一次，待用；
2）准备培养液，放于37℃恒温水浴锅中温育10分钟；
3)在超净台中取出组织（中山大学附属光华口腔医院手术切除标本），在酒精中消毒不超过10秒，在1×PBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中；
4）将组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中；
5）置于37℃，5%CO2的培养箱中培养；
6）第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块；
7）视细胞生长情况进行适当换液。
当细胞密度达到约80%的时候进行传代：
1）弃培养液，用1×PBS洗一次，加入胰酶消化；
2）加入血清终止消化；
3）吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；
4）离心1000rpm，5分钟；
5）弃上清，加入适量培养液吹打散；
6）将细胞悬液加入新的培养皿中。
结果分析：
按上述原代培养方法后第5天就有上皮样的细胞从组织块爬出并形成一圈细胞层，但之后一直生长缓慢，且伴随较多成纤维细胞的生长。本研究采取梯度消化和刮除方法除成纤维细胞，直到3个月后才进行第一次传代，细胞一呈克隆性生长，并有累层生长的现象。经历过3次传代后，成纤维细胞的比例逐渐减少，上皮细胞增殖加快，成为纯上皮样的细胞系，命名为CTSC-1细胞。至今，CTSC-1细胞已经传代50次以上，细胞状态稳定。
光镜下，CTSC-1传代细胞的形态如图1所示。光镜下观察，CTSC-1传代细胞是典型的上皮样形态，扁平、多角形，细胞长满培养皿后呈现铺路石状。CTSC-1传代细胞与细胞间联系较密切，呈片状生长。镜下可见一些圆形细胞，为进入分裂期细胞或衰老细胞，核质比高，核仁清晰，数量不一，最多可以达到5-6个。
6.1.2 口腔组织的固定、脱水、包埋、H&E染色程序
1）10%福尔马林或4%PFA固定口腔组织过夜（在一周内要进行包埋）；
2）自动脱水仪上进行脱水：70%乙醇2小时，80%乙醇2小时，95%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，无水乙醇30分钟，无水乙醇2小时，无水乙醇+TO（1:1）30分钟，TO 30分钟，TO 2小时，TO+石蜡（1:1）30分钟，石蜡3小时，石蜡2小时。共12桶，16小时；
3）包埋机上用石蜡进行包埋，在切片机上进行切片；
4)组织60℃脱腊，二甲苯5分钟，二加苯5分钟，无水乙醇1分钟，90%乙醇1分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟，蒸馏水洗4分钟；
5）苏木素液染色1-2分钟，自来水冲洗10分钟，水溶性伊红染色2-3分钟；
6）脱水，透明和封片：把切片加入70%乙醇30秒，80%乙醇30秒，90%乙醇1分钟，无水乙醇1分钟，二甲苯5分钟，最后用中性树脂封片。
光镜下，CTSC-1患者组织细胞的形态如图1所示，口腔组织患者组织切片，可见为鳞状上皮细胞癌，细胞呈大小不等的多角形，有多形性，排列成巢状，周围有基质包绕，核分裂相多，核质比高，多核仁或分叶状，患者组织切片可见肿瘤中心有角化珠，肿瘤侵袭肌肉层，组织中可见淋巴细胞浸润。
6.1.3 CTSC-1细胞超微结构
透射电镜下观察CTSC-1细胞的超微结果如图2所示，可见细胞有小触角状突起，细胞质内可观察到有高尔基体、核糖体、内质网分布，也有少量空泡，细胞核不规则，有1-2个核仁明显。细胞与细胞间的连接没有观察到明显的桥粒，细胞间连接有致密部分（图2箭头所示），但观察到细胞质内排列紧密的纤丝较文献报道的短，可能是癌细胞在体外培养条件下不能形成典型的桥粒，则形成类似于桥粒的连接。
6.1.4 CTSC-1细胞的标志性分子的鉴定
6.1.4.1 正常颊粘膜细胞、CAL27舌癌细胞系、CTSC-1贴壁细胞RNA的提取（按Invitrogen Trizol试剂盒说明书操作）
1）取对数生长期细胞，弃培养液，在培养皿中加入1ml Trizol（6cm皿的细胞量较合适），用移液器吹打至细胞裂解完全，将液体吸至1.5ml无酶离心管中；
2）室温放置5分钟使核酸蛋白复合物完全分离，4℃，12000xg离心10分钟，取上清；
3）每使用1mlTrizol加氯仿0.2ml，剧烈振摇15s，室温静置3min使之分层，4℃，12000xg离心15分钟；
4）将≤50%的上层水相小心转移至另一个1.5ml无酶干净离心管中；
5）每使用1ml Trizol加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟，4℃，12000xg离心10分钟；
6）弃上清，沿壁加入无酶75%乙醇1ml，轻轻混匀；
7）4℃，7500xg离心5分钟，弃上清，将1.5ml离心管倒置，以100μl的微量移液器吸净剩余的乙醇，晾干，沉淀溶于20～40μl的无RNase水中；8）取2μl，用紫外分光光度计（Nanodrop）测定A260nm和A280nm，RNA浓度（μg/ml）=A260nm ×40×稀释倍数；纯度以A260/A280比值表示，达1.8-2.0方能用于实验，－80℃保存备用。
6.1.4.1.2 提取口腔组织RNA
1）称口腔组织50-100mg至1.5ml无酶离心管中，加入1mlTrizol，匀浆器冰上匀浆；或者用液氮研磨碎再加Trizol裂解；
后续步骤同6.1.4.1的2）-8）。
6.1.4.1.3 RT-PCR逆转录反应（按TOYOBO ReverTra Ace-α-试剂盒说明书操作）
1）在PCR反应管中按顺序加入：
总RNA                 1μl(600ng)
10pmol/L Oigo(dT)     5μl
RNase Free H2O        6μl
2）65℃作用5min后冰浴1min，置冰上加入：
Figure BDA00002055771600151
3）设置PCR仪，42℃、60min，99℃、5min，4℃、hold，置-20℃保存备用。
6.1.4.1.4 PCR（按TOYOBO KOD-Plus-试剂盒说明书操作）
1）在PCR管中按顺序加入：
Figure BDA00002055771600152
Figure BDA00002055771600161
2）设置PCR仪，不同引物按各种退火温度等特性设置，PCR产物先用琼脂糖凝胶电泳检测。
琼脂糖凝胶检测正常颊粘膜细胞、CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18、19的mRNA的表达情况，结果如图3所示。
6.1.4.1.5 Western免疫印迹检测CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18的蛋白表达情况。
蛋白提取方法如下：按细胞体积加入5倍细胞体积蛋白裂解液（RAPI），冰上静置裂解60分钟，超声波破碎10分钟；4℃，12000xg离心8分钟；将上清转移进入无酶的1.5mL离心管，加入10×蛋白酶抑制剂至1×，－80℃保存备用；用常规Western免疫印迹方法检测CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18的蛋白表达情况。结果如图4所示。
结果显示，正常颊粘膜上皮细胞、CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞这三种细胞均表达CK8、18、19的mRNA，表达量无明显差异。由于正常颊粘膜上皮细胞较少，未能提出蛋白，故只检测了CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18的蛋白表达情况，结果显示二者均表达，且表达量基本一致。此结果从分子水平证实了CTSC-1细胞系为典型鳞状上皮细胞。
6.1.5 CTSC-1的DNA指纹鉴定
6.1.5.1 短串联重复序列（STR）分析：短串联重复序列（STR）是广泛存在基因组中的DNA串联重读序列，由2-6bp的核心序列组成，通常重复15-30次。生物体基因组中的STR序列是一致的并可以遗传给子代，故可以用STR实验证明本研究培养的细胞是否由其患者来源。将口腔组织取一小块和CTSC-1（第8代）整皿的细胞送至中山大学法医鉴定中心进行分析鉴定。结果如表1所示。
表1 CTSC-1细胞和口腔组织STR结果
  口腔组织   CTSC-1细胞
  D3S1358   15   15
  TH01   7,9   7,9
  D21S11   29   29
  D18S51   14,15   14,15
  Penta_E   15,16   15,16
  D5S818   9,10   9,10
  D13S317   11   11
  D7S820   10,12   10,12
  D16S539   9,10   10
  CSF1PO   10,12   10,12
  Penta_D   9,11   9
  vWA   16,17   16,17
  D8S1179   10,13   10,13
  TPOX   8,11   8,11
  FGA   19,24   24
  Aml   X   X
  D18S1364   16   16
  D12S391   20,21   20,21
  D13S325   19,20   19,20
  D6S1043   11，14   11，14
  D2S1772   19,24   19,24
  D11S2368   18,19   18,19
  D22_GATA198BO5   14,21   14,21
  D8S1132   20,22   20,22
  D7S048   23,24   23,24
*浅灰色格表示数目有变化的基因
本实验分析检测了25个位点，包括一个性染色体位点和24个非性染色体位点。CTSC-1在D16S539,Penta-D,FGA位点上，细胞和组织相比，少了一种重复序列，其余均完全匹配。
6.1.5.2、染色体G显带分析：处于对数生长期的CTSC-1细胞经秋水仙素（0.2μg/mL）处理2小时后，消化细胞，1XPBS重悬后送至中山大学遗传研究中心进行制片，G显带分析染色体情况，再取回，随机选择计算100个分散均匀的CTSC-1细胞染色体后用SSCP统计所得结果。结果图5所示。
6.1.5.3、染色体核型分析：
1）处于对数生长期CTSC-1换入含秋水仙素（0.2μg/mL）的培养液，培养2小时；
2）弃掉上清，1×PBS洗皿一次，弃掉1×PBS，胰蛋白酶消化细胞；
3）FBS终止消化之后，1000rpm离心5分钟，去上清；
4）加入预热37℃的KCL溶液（0.075M）处理30分钟（不同细胞时间不同）；
5）加入1mL固定液（甲醇:醋酸=3:1，现配现用），吹散打匀，1000rpm离心5分钟，弃掉上清，加入新鲜固定液，吹散，作用20-30分钟，再1000rpm离心5分钟，弃上清，加入0.5mL固定液，制成细胞悬液；
6）将细胞悬液在载玻片上方40cm处滴下玻片（泡在30%乙醇液中，4℃冰箱预冷），立即吹散，酒精灯烤干；
7）Gimsa原液:1×PBS=1:9染色20分钟，自来水冲干净。结果如图6所示。
分析图5和6。此结果为随机选择计算了100个分散均匀的染色体后用SSCP统计所得。CTSC-1细胞系的染色体异常，CTSC-1的染色体从47条到80条均有分布，从45到80设定7个区间，结果显示60-64和65-69区间细胞最多，近似于三倍体。G带核型结果在镜下观察，显示不同的细胞染色体基本均是非整倍体，只是条数不同，染色体的交换情况均不同，无法统计统一的染色体交换情况。此结果也显示了肿瘤细胞的染色体不稳定性。
6.2 CTSC-1细胞的生物学特性
6.2.2.1 细胞计数法检测CAL27细胞，CTSC-1细胞的细胞生长曲线和倍增时间。
1）取对数生长期的CAL27细胞，CTSC-1细胞，以3000个/ml/孔的细胞浓度接种于24孔板；
2）每24h计数一次，1%胰酶消化后进行细胞计数，连续计数6天；
3）以每天细胞密度均值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。结果如图7所示。
4）按下述公式计算倍增时间。
TD=t log2/（logNt-logN0）
（TD：倍增时间；t:培养时间：Nt:培养t小时后的细胞数；N0:接种后的细胞数）
分析图7，本实验以CAL27细胞为对照，检测了CTSC-1细胞在第10代和第30代的生长曲线，在DF+5%FBS的培养条件下，CTSC-1细胞的倍增时间是37.52±1.34小时和30.85±0.53小时，在增殖能力方面，短代数持续培养的细胞系没有明显的改变。对照细胞系CAL27的倍增时间为18.11±0.29小时，相比之下，CTSC-1细胞增殖速率较慢，由于CAL27细胞系培养时间较长，受环境影响较大，而CTSC-1细胞培养时间短，可能更接近于肿瘤在体内的生长状况。
6.2.2.2、BME中克隆形成
1）将BME置于冰上，放入4℃冰箱过夜溶化；
2）消化对数生长期CTSC-1细胞，计数，少量DF重悬；
3）将一定数量的CTSC-1细胞加入BME中，注意整个过程都要在冰上，吹打混匀的时候避免产生气泡；
4）种入96孔板的一个孔中，待凝固后，上层加入100μlDF+10%FBS培养液；
5）3天换一次液，连续观察两周。
BME克隆形成结果如图8所示，在有基质存在，DF+10%FBS培养条件的情况下，CTSC-1细胞能形成约40μm克隆，形成率为1.46±0.15%。
6.2.2.3 CTSC-1细胞的致瘤性
BALb/c裸鼠体内成瘤实验
1）消化处于对数生长期的贴壁CTSC-1细胞，重悬浮于1×PBS中；
2）皮下注射到6-8周雌性BalB/C裸鼠的两侧背部，分为1×107,2×106两个数量级组；
43）每周观察一次，测量大小，3个月后处死拍照。
以上动物实验符合赫尔辛基宣言(The Declaration of Helsinki)的要求，并得到中山大学伦理委员会的批准和实验动物中心的认可。
一共注射4只裸鼠，每种细胞系注射两只，一只注射1×107个细胞/100微升，另一只注射2×106个细胞/100微升。致瘤小鼠从细胞注射后开始连续观察生长情况，测量肿瘤直径，3个月后拍照、处死裸鼠、将肿瘤分离出来。
1×107的CTSC-1细胞注射的裸鼠可形成肿瘤未发现肉眼可见的转移灶，没有侵犯。肿瘤颜色偏灰白色，表面布满血管，切开后呈豆腐渣样。
如图9所示，肿瘤切片H&E染色显示，肿瘤为鳞状上皮细胞癌，能观察到角化珠。取部分细胞培养，观察和原来上皮样细胞形态一致，能稳定增殖，扩增后冻存备用。
二、舌部鳞状上皮细胞癌细胞中肿瘤干细胞的富集以及特性鉴定
1材料说明
细胞系和组织主要有CTSC-1细胞系以及细胞来源患者的组织切片，CTSC-1细胞系均由本实验室自行培养所得，组织均取自中山大学附属光华口腔医院手术切除标本。
2主要仪器
  仪器名称   厂家   仪器名称  厂家
  激光共聚焦   Leica   磁力搅拌器  IKA
  透射电镜   日本电子JEM   定量PCR仪  Roche LightCycler 480
  酶标仪   Bio-ted   超速离心机  BeckMan
  蛋白双向系统   GE  其余仪器同第二章
3 主要试剂
BSA   Sigma   尿素   GE
FGF2   Peprotech   CHAPS   GE
TGFβ   Peprotech   IPG缓冲液   GE
ployHEMA   Sigma   多聚赖氨酸   福州迈新
DAB工作液   DAKO   Hoechst33342   Sigma
脂肪诱导液   GIBCO   Verapamil   Sigma
脂肪染色液（苏丹Ⅲ染色液）   厦门迈威   CCK8   Dojindo
一抗抗体稀释液   CST   DAPI   DAKO
  山羊血清   福州迈新   防淬灭封片剂   DAKO
其余试剂同一、舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立以及特性鉴定
4主要溶液以及配方
4.1细胞培养
1）0.7%琼脂糖（agarose）：0.7g琼脂糖加100ml超纯水，高温高压灭菌后使用。
2）无血清肿瘤干细胞培养因子（8F）：专利保密。
3）Trypsin抑制剂(TI):称取1.25g trypsin抑制剂溶解于250ml的1×PBS中，配成10×TI，-20℃保存。使用前用1×PBS buffer稀释成1×TI终止消化细胞。
4)Poly-2-hydroxyethyl methacrylate(polyHEMA):95%酒精配成36mg/mL,4℃冰箱过夜溶解，很粘稠。
其它溶液同一、舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立以及特性鉴定。
4.2 组织免疫化学
1）3%的H2O2/甲醇溶液：20ml 30%的H2O2与180ml甲醇
2）柠檬酸缓冲液：0.01M，pH6.0：1L中含柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g，1L二级水
5抗体
Figure BDA00002055771600211
Figure BDA00002055771600221
6引物
Nanog   Forward：CAAAGGCAAACAACCCACTT
        Reverse：TCTGCTGGAGGCTGAGGTAT
Oct4    Forward：CGACCATCTGCCGCTTTGAG
        Reverse：CCCCCTGTCCCCCATTCCTA
Sox2    Forward：ATGCACCGCTACGACGTGA
        Reverse：CTTTTGCACCCCTCCCATTT
c-kit   Forward：ATGTGGGCAAGACTTCTGCCTA
        Reverse：ATCATGCCAGCTACGATTA
ABCA1   Forward：TCTGGAAAGCTCTGAAGCCG
        Reverse：TGAGTTCCTCCCACATGCCT
ABCB1   Forward：CCCATCATTGCAATAGCAGG
        Reverse：GTTCAAACTTCTGCTCCTGA
ABCC1   Forward：CTTCTGGAGGAATTGGTTGTATAGAAG
        Reverse：GGTAGACCCAGACAAGGATGTTAGA
ABCG1   Forward：ACCGGGGAAAAGTCTGCAAT
        Reverse：TCACCAGCCGACTGTTCTGA
ABCG2   Forward：AGTTCCATGGCACTGGCCATA
        Reverse：TCAGGTAGGCAATTGTGAGG
7、方法与结果
7.1CTSC-1细胞系中有部分细胞表达干细胞分子标记物
7.1.1RT-PCR逆转录方法检测CTSC-1细胞细胞中的Sox2,Nanog,Oct4的mRNA的表达情况
采用与6.1.4.1相同的方法提取CTSC-1细胞的总RNA，并采用与6.1.4.1.3逆转录方法将CTSC-1细胞的总RNA逆转录为CTSC-1细胞的cDNA。检测了CTSC-1细胞中的Sox2,Nanog,Oct4的mRNA的表达情况，结果显示CTSC-1细胞表达Sox2,Nanog,Oct4的mRNA。随后，用Western免疫印迹检测了Sox2的表达情况也证实了其蛋白水平和mRNA表达水平一致。
7.1.2 细胞免疫荧光染色方法检测CTSC-1细胞系对CD133，Sox2,Nanog,Oct4,SSEA-1,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的表达情况
细胞免疫荧光染色方法如下：
1）将干净无菌的盖玻片至于六孔板的每个孔中，Ⅰ型鼠尾胶原包被玻片1小时以上，吸取上清，1×PBS洗2次，待用；
2）消化对数生长期的CTSC-1细胞，重悬后种入有盖玻片的六孔板中；
3)置于二氧化碳培养箱中培养至细胞密度约70%-80%；
4）1×PBS洗玻片2次，用预冷的4%PFA室温固定10分钟；
5）弃固定液，1×PBS洗3次，10分钟/次；
6）滴加含5%BSA的1×PBS与山羊血清封闭液混合（1:1），封闭1小时；
7）吸弃封闭液，滴加适当稀释的一抗，4℃冰箱过夜；
8）吸弃一抗，1×PBS洗3次，10分钟/次；
9）滴加适当稀释的同种属的荧光素标记二抗，室温孵育1-2小时；
10）吸弃二抗，1×PBS洗3次，10分钟/次；
11）用含DAPI的封片剂封片；
12）激光共聚焦显微镜下观察，随机选取3个视野（10×10倍）进行拍照和统计，拍照结果如图10，统计结果显示在表2。
表2免疫荧光检测细胞表达干细胞标志物的统计
  %   CD133   Sox2   Nanog   Oct4   SSEA-1   SSEA-4   TRA-160   TRA-181
  CTSC-1   99.0±0.8   63.8±1.8   <1   36.3±2.6   7.3±1.5   40.2±1.2   4.36±1.0   37.3±1.2
上述实验的结果均提示了细胞中存在肿瘤干细胞，但结果提示CD133在CTSC-1细胞系中所有细胞均表达，故在本实验中不适合用来做舌癌干细胞的marker的筛选，其余的干细胞marker只有部分细胞呈现阳性表达。
7.2 无血清悬浮培养富集CTSC-1细胞系中肿瘤干细胞
消化对数生长期的CTSC-1贴壁细胞，计数，重悬于DF+8F培养液中；种入预先用无菌的0.7%agarose包被的培养皿中。结果发现，在agarose包被皿中，将贴壁细胞用无血清（DF+8F）培养液悬浮培养后，能观察到致密的、边缘整齐的球囊形成，结果如图13。然后，我们确定富集肿瘤干细胞的最佳细胞播种密度，观察1×105、5×105、1×106、2×106、5×106/10cm的五个细胞数量级对富集效率的影响。结果发现在2×106/10cm的数量下，无需加入FGF2或TGF-β等生长因子，CTSC-1细胞形成的球囊大小比较均匀，边缘较整齐，细胞状态良好，故后续培养球囊的条件统一为：DF+8F、0.7%agarose包被10cm皿、2X106个细胞/皿，传代时的培养条件也是如此。
如图11所示，光镜下观察，球囊结构紧致，整体透亮，球囊内不能明确区分细胞与细胞间界限。在培养的同一时间，球囊的大小并不均一，大的直径可以达到100μm以上，小的直径只有30μm左右。如图12所示，H&E染色球囊显示球体致密。计数后种下2×106个细胞，球囊形成后培养7天后，光镜下计算50μm以上的球囊，结果显示CTSC-1细胞能形成约2000细胞，即约为种下细胞数的0.10±0.05%。
图13显示，球囊细胞和贴壁细胞对CK8、CK18、CK19的表达水平没有明显差异，提示肿瘤干细胞在细胞类型上没有明显改变。
7.3 CTSC-1球囊的生物学特性
通过本研究的实验结果，并结合文献报道，认为DF+10%FBS培养的贴壁细胞中含有少量的肿瘤干细胞，而DF+8F悬浮培养的球囊细胞中含有较多的肿瘤干细胞，因此，本研究的实验以贴壁细胞作为参照，对肿瘤干细胞进行一系列分析研究。
7.3.1 CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞的细胞周期的对比分析
利用流式细胞仪进行的细胞周期检测，将细胞分成3类，第一类是处于G0/G1期的细胞，G0期的细胞停止分裂，而G1期的细胞正准备分裂；第二类是S期的细胞，这时期的细胞正在进行染色体的复制；第三类是G2/M期，这时期的细胞已经完成了染色体的加倍。CTSC-1贴壁细胞G0/G1期为72.39±0.87%，CTSC-1球囊细胞G0/G1期为88.7±1.95%，两者相比，球囊中有更多的细胞处于G0/G1期,差异有统计学意义（P＜0.05）。分裂的细胞减少说明，悬浮无血清的培养条件，能使肿瘤干细胞很好的维持干性。
7.3.2 CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞的克隆形成能力的对比
将贴壁细胞和球囊细胞分别消化为单细胞，将单细胞种入BME中，用DF+8F的培养条件，观察在BME中克隆形成的情况。并对克隆形成结果进行统计，如图14所示。
7.3.3 CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞的耐药性的对比
本实验利用CCK8的方法检测CTSC-1球囊和贴壁细胞对5-Fu和DDP两种抗癌药的耐受性。实验分为5-Fu和DDP两个实验组，5-Fu组中，在100μg/mL的浓度时，对CTSC-1贴壁细胞细胞致死率为47.5%,对CTSC-1球囊细胞致死率为21.4%。DDP组中，CTSC-1贴壁细胞半数致死浓度为10μg/mL，CTSC-1球囊细胞半数致死浓度为30μg/mL，对化疗药物的耐受差异具有统计学意义（P<0.01）。结果显示随着化疗药物浓度的升高，细胞存活率都降低，但同一药物浓度作用下，球囊的存活率比贴壁细胞高。证明球囊中耐药细胞含量较高，可能是因为肿瘤干细胞含量高所导致。通过检测ABC家族几个主要的与耐药相关的基因，如ABCA1，ABCB1，ABCC1，ABCG1，ABCG2，的表达情况后发现，球囊的ABCG1比贴壁的细胞的表达上调，提示可能与ABCG1通路相关。
7.3.5 CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞的干细胞分子标志物表达的对比
本研究运用流式检测干细胞标志性分子蛋白的表达，如图15所示，流式细胞仪检测结果显示，CTSC-1球囊细胞Sox2的表达情况比CTSC-1细胞表达上调。而SSEA-1的表达情况是CTSC-1贴壁细胞20.16%阳性，而CTSC-1球囊为56.35%阳性；CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞相比表达上调，差异具有统计学意义。结果提示球囊细胞中高表达Sox2和SSEA-1的细胞比贴壁细胞中的多。
7.3.6 CTSC-1球囊具有一定的分化潜能
具有分化潜能是干细胞的一大特征，所以本实验用两种方法检测了CTSC-1球囊细胞的分化潜能，并与CTSC-1贴壁细胞对照。第一种方法是，把球囊种到能贴壁的培养皿中，加入DF+10%FBS培养液，继续培养，观察到球囊能逐渐分化出和原来贴壁细胞相似的上皮细胞，在培养的第2天，CTSC-1只有约10%-20%的细胞分化成鳞状上皮细胞，在培养第7-10天之后，CTSC-1球囊才全部分化为鳞状上皮细胞。
第二种方法是按上述脂肪诱导培养的方法，检测CTSC-1球囊细胞的分化能力，CTSC-1贴壁细胞做为对照，诱导培养30天后进行脂肪染色，结果如图16所示。贴壁细胞没有明显的形态改变，但是细胞质出现空泡较多。CTSC-1球囊经诱导后，球体中间一部分细胞呈明显的蜂窝状，这些结构处的细胞较圆，较小，细胞质明显带有颗粒，而且这些颗粒可以被脂肪染色液染成橘红色，球体外围游离分化出去的细胞则呈现上皮样，和贴壁细胞类似且细胞的细胞质没有明显的颗粒。越靠近蜂窝状结构的细胞，细胞质中的颗粒越明显，提示CTSC-1球囊的内部有一定量的肿瘤干细胞并成一定的排列形式。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (5)

1.中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
A）采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；
B）当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；
C）将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19；
D）经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
2.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，其特征在于，步骤A的具体方法为：
1）I型胶原包被培养皿室温静止1小时以上，1×PBS 洗皿一次，待用；
2）准备培养液，放于37℃恒温水浴锅中温育10 分钟；
3) 在超净台中取出舌部鳞状上皮细胞癌组织，在酒精中消毒不超过10 秒，在1×PBS 中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中；
4）将组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中；
5）置于37 ℃，5%CO2 的培养箱中培养；
6）第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块；
7）视细胞生长情况进行适当换液。
3.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，其特征在于，步骤B的具体方法为：
1）弃培养液，用1×PBS 洗一次，加入胰蛋白酶消化；
2）加入血清终止消化；
3）吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；
4）离心1000rpm，5分钟；
5）弃上清，加入适量培养液吹打散；
6）将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
4.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1 在研究治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
5.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1 在治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
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