CN112717201A - 卵巢细胞外基质支架和水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵巢细胞外基质支架和水凝胶及其制备方法与应用，属于生物医学和临床医学技术领域。其中，卵巢细胞外基质支架的制备方法为1)卵巢组织的预处理；2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X‑100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；3)灭菌及冻干处理：4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)制备的冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向颗粒物中加入酸液、胃蛋白酶、碱液及缓冲溶液，制得卵巢细胞外基质支架。继续向卵巢细胞外基质支架内加入颗粒细胞及卵泡即制得可植入哺乳动物体内且起到修复卵巢损伤及重建卵巢功能作用的水凝胶材料。该项研究为女性生育力保护提供了新策略。
Description
技术领域
本发明涉及一种卵巢功能保护材料，属于临床医学治疗技术领域，具体地涉及一种卵巢细胞外基质支架和水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
早发性卵巢功能不全、自身免疫性疾病和接受肿瘤治疗等因素，都可能破坏卵巢功能，此外，受遗传、环境、社会心理、生活方式等多因素导致的卵巢早衰现象等都会引起女性身体和心理多方面的健康问题。
然而，卵巢功能受损的女性仍有其他恢复生育力的方式。目前，全球有超过200名通过卵巢移植诞生的婴儿，虽然，卵巢移植的有效性已越来越多地被证实，但对于因肿瘤原发病而进行治疗女性来说，卵巢移植物中可能残留肿瘤细胞，有引起肿瘤复发的可能，严重者导致死亡。如果卵巢移植发生在同种异体之间，供体短缺和免疫抑制治疗也是必须面对的难题。对此，组织工程技术将会是帮助这些女性恢复卵巢内分泌和生育功能的一大希望。组织工程的发展为器官移植提供了新的支架选择。卵巢组织工程倾向于选择自然来源的材料，因为后者与原始组织的成分和结构都更加相似，能够支持细胞生长和分化，有望于恢复卵巢功能。细胞外基质是由细胞分泌于其外的物质组成的，它们反过来会为细胞的生长、迁移和分化提供特异性的信号分子，相当于多种重要生长因子、营养因子和生物活性因子的储存库。从机体中获得自然细胞外基质还能为新生血管提供适宜的环境，以便对于外界的物理或生理改变做出反应。
脱细胞是指将所有细胞成分和核内物质从组织中去除，同时，尽可能减少对细胞外基质中复杂成分、生物学功能、三维超微结构和机械强度的破坏。某些蛋白组分及排布，诸如胶原、蛋白聚糖、层粘连蛋白和纤连蛋白等，对残留细胞外基质的结构起决定性作用。
多种器官脱细胞化方案已被提出，包括心脏、肺脏、肝脏、肾脏、器官、食管、动脉、皮肤和阴道等等。如中国发明专利(申请公布号：CN102861359A，申请公布日：2013-01-09)公开了对心脏、肾脏、肝脏或者肺等的脱细胞处理。
然而目前女性生殖领域的脱细胞化研究非常有限。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种卵巢细胞外基质支架和水凝胶及其制备方法与应用。其中，该卵巢细胞外基质水凝胶材料在完成体外培育后可植入哺乳动物体内，为损伤部位卵巢细胞生长提供良好的生存环境，进一步实现修复受损的卵巢功能的技术目的，为女性生育力保护提供新的策略。
为实现上述目的，本发明公开了一种卵巢细胞外基质支架，它由如下制备方法制得：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)制备的冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液、胃蛋白酶、碱液及缓冲溶液，制得卵巢细胞外基质支架。
进一步地，步骤2)中，所述步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质在双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中分别震荡洗涤2～6次，且每次洗涤均需更换新的洗涤液；
其中，所述脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液为脱氧胆酸钠与曲那通X-100的双蒸水溶液，且所述脱氧胆酸钠与双蒸水间质量体积比为0.5～4％，所述曲那通X-100与双蒸水间体积/体积为0.5～4％；
所述十二烷基硫酸钠溶液为十二烷基硫酸钠的双蒸水溶液，且所述十二烷基硫酸钠与双蒸水间质量体积比为0.1～4％；
所述DNA酶的浓度为0.1～2mg/mL。
进一步地，所述卵巢细胞外基质支架为凝胶状。
与此同时，本发明还公开了一种卵巢细胞外基质支架的制备方法，它包括如下制备步骤：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：取步骤2)处理后中间产物置于消毒液中处理4～6h，再置于真空环境下冻干处理16～24h，获得冻干组织；
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液和胃蛋白酶，室温下搅拌反应2～4天，离心处理，得到卵巢细胞外基质溶液，将所述卵巢细胞外基质溶液置于冰浴中，加入碱液调整pH至7.2～7.4，继续加入磷酸盐缓冲溶液，置于37℃的环境下孵育成胶，即制得呈凝胶状的卵巢细胞外基质支架。
进一步地，步骤1)中，将哺乳动物卵巢门部呈蝶形剪开，分离出卵巢组织皮、髓质，并控制所述卵巢组织皮厚度为0.5～2mm。
进一步地，步骤3)中，所述真空环境为真空度为0.1～0.2mbar，冻干温度为-80～-60℃。
进一步地，步骤4)中，所述胃蛋白酶加入量为每100mg冻干组织颗粒物中加入10～100mg胃蛋白酶。
此外，本发明还公开了一种卵巢细胞外基质水凝胶，它包括上述卵巢细胞外基质支架，还包括位于所述支架内部的颗粒细胞及卵泡。
上述卵巢细胞外基质水凝胶的制备方法包括如下制备步骤：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质由前至后依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：取步骤2)处理后中间产物置于消毒液中处理4～6h，再置于真空环境下冻干处理16～24h，获得冻干组织；
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液和胃蛋白酶，室温下搅拌反应2～4天，离心处理，得到卵巢细胞外基质溶液，将所述卵巢细胞外基质溶液置于冰浴中，加入碱液调整pH至7.2～7.4，继续加入磷酸盐缓冲溶液，置于37℃的环境下孵育成胶，即制得呈凝胶状的卵巢细胞外基质支架；
5)培养包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶：从哺乳动物卵巢中分离出颗粒细胞并置于McCoy 5A培养基中，向所述McCoy 5A培养基中加入所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质支架、胎牛血清、雄激素和青霉素-链霉素混合物，再置于二氧化碳培养箱中培养一段时间；所述McCoy 5A培养基中，所述卵巢细胞外基质支架的体积百分数为10％，所述胎牛血清的体积百分数为10％，所述青霉素-链霉素混合物的体积百分数为0.1％；所述雄激素的浓度为10ng/mL；
6)培养包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：从哺乳动物卵巢中分离出卵泡并置于低黏附细胞培养基内，同时添加所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质支架、胎牛血清、青霉素、链霉素、重组人卵泡刺激素和ITS，培养一段时间；所述低黏附细胞培养基为α-MEM培养基，且所述胎牛血清的体积百分数为10％，所述青霉素和链霉素的总体积百分数为0.1％，所述重组人促卵泡激素在培养基中浓度为10mIU/mL，所述ITS由胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠构成，在培养基中的浓度分别为胰岛素5μg/mL、转铁蛋白5μg/mL和亚硒酸钠5ng/mL；
7)制备包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：取步骤5)所述包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶与步骤6)所述包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶混匀，即制得包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶。
为更好的实现本发明技术目的，本发明还公开了一种卵巢细胞外基质水凝胶在修复卵巢损伤及重建卵巢功能方面中的应用，所述卵巢损伤包括年龄增长带来的卵巢损伤、因遗传或免疫功能缺陷或环境造成的卵巢损伤、医源性卵巢损伤或病理性卵巢损伤中的任意一种。
具体的，本发明优选将所述卵巢细胞外基质水凝胶以注射方式植入哺乳动物体内。
本发明还可以保护一种注射型卵巢细胞外基质水凝胶。
本发明还可以保护一种药盒，它包括上述注射型卵巢细胞外基质水凝胶及使用说明书。
本发明的有益效果主要体现在如下几个方面：
1、本发明设计的制备方法能提取出完整且纯度较高的卵巢细胞外基质支架，该卵巢细胞外基质支架接近于哺乳动物体内原始组织中的细胞微环境，能够为卵巢细胞提供更好的生长环境。
2、本发明制备的包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶材料能以快捷方便的植入方式进入哺乳动物体内，为损伤部位卵巢细胞生长提供良好的生存环境，进一步实现修复受损的卵巢及重建卵巢功能的技术目的，为女性生育力保护提供了新策略。
附图说明
图1为本发明设计的卵巢细胞外基质支架制备过程实物图；
图2为本发明实施例猪卵巢在脱细胞化前后细胞核的染色图；
图3为本发明实施例不同细胞外基质的免疫组织化学表达半定量统计结果图；
图4为本发明实施例扫描电镜下冻干细胞外组织的内视图和外视图；
图5为本发明实施例制备的卵巢细胞外基质水凝胶实物图。
具体实施方式
本发明公开了一种卵巢细胞外基质支架和水凝胶及其制备方法与应用。
其中，所述卵巢细胞外基质支架接近于哺乳动物体内原始组织中的细胞微环境，能够为卵巢细胞提供更好的生长环境。
而包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶材料在完成体外培育后可植入哺乳动物体内，本发明优选注射的方式进入体内，其可能在注射后引起个体抗苗勒氏管激素、雌激素、孕激素较前升高，卵泡刺激素和黄体生成素降低；从而为损伤部位卵巢细胞生长提供良好的生存环境，进一步实现修复受损的卵巢及重建卵巢功能的技术目的，为女性生育力保护提供了新策略。
1、术语的定义和使用
上述“受损的卵巢功能”包括因为年龄、遗传、免疫、医源性、病理性、环境、行为学、社会心理等多种因素造成的损伤，具体的损伤结果包括肿瘤癌症、炎症、闭经、不孕、围绝经期症状等。
上述“重建卵巢功能”包括让患者卵巢恢复正常生理功能，如正常的经期或者正常的生育能力。
上述“颗粒细胞”指代围绕卵母细胞的扁平或立方形细胞，具有内分泌的功能。
上述“卵泡”指代哺乳动物的卵巢中，卵母细胞发生与发育的基本功能单位，呈圆形泡状，位于卵巢皮质。包括始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡。
上述“哺乳动物”包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。优选为人或小鼠或猪。
上述“植入”方式包括但不限于注射方式。
2、实验材料
双蒸水：实验室制备；
脱氧胆酸钠：北京索莱宝科技有限公司，货号：D8330，C24H39O4Na曲那通X-100：MilliporeSigma，货号：TX1568-1；
十二烷基硫酸钠：VWR，货号：VWRV0227，CH3(CH2)11OSO3Na；
过氧乙酸：科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇：西陇科学股份有限公司，货号：1030001-01-01；
胃蛋白酶：Biofroxx，货号：9001-75-6；
McCoy 5A培养基：Sigma-Aldrich，货号：M8403；
α-MEM培养基：Sigma-Aldrich，货号：M4526；
二氧化碳培养箱：Thermo Scientific，货号：HERAcell VIOS 160i；
胎牛血清：Biological Industries，货号：04-010-1；
青霉素：武汉赛维尔科技有限公司，货号：WS8290；
链霉素：武汉赛维尔科技有限公司，货号：G5053；
为更好的解释上述各水凝胶，以下结合具体制备方法进行详细说明。
本发明公开了一种卵巢细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质由前至后依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中震荡洗涤，然后添加DNA酶在温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：取步骤2)处理后中间产物置于消毒液中处理4～6h，再置于真空环境下冻干处理16～24h，获得冻干组织；
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液和胃蛋白酶，室温下搅拌反应2～4天，离心处理，得到卵巢细胞外基质溶液，将所述卵巢细胞外基质溶液置于冰浴中，加入碱液调整pH至7.2～7.4，继续加入磷酸盐缓冲溶液，置于37℃的环境下孵育成胶，即制得卵巢细胞外基质支架。且所述卵巢细胞外基质支架呈凝胶状。
其中，步骤1)中，将哺乳动物卵巢门部呈蝶形剪开，分离出卵巢组织皮、髓质，并控制所述卵巢组织皮厚度为0.5～2mm，具备该厚度的卵巢组织皮可在合适时间及工序内完成后续脱细胞化过程。
同时，本发明可优选采用组织剪去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，优选采用注射器将卵巢组织皮中的卵泡液戳破，释放卵泡液，以提高脱细胞化的效果。
步骤2)中，所述步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质在双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中分别震荡洗涤2～6次，且每次洗涤均需要更换新的洗涤液，采用双蒸水进行多次洗涤的目的是充分地清除残留的卵泡液、淋巴液和血液，采用脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液多次洗涤的目的是溶解并破坏蛋白质结构，且能将碎裂的细胞带出原始组织；且为了保持洗涤液中各成分浓度尽量不变，不建议一次洗涤液从头用到尾；采用十二烷基硫酸钠溶液多次洗涤的目的进一步去除细胞内的核酸、脂质和蛋白质。采用上述洗涤液能有效提高洗涤效果。
具体的，所述氧胆酸钠与曲那通X-100混合液为脱氧胆酸钠与曲那通X-100的双蒸水溶液，其中，所述脱氧胆酸钠与双蒸水间质量体积比为0.5～4％，所述曲那通X-100与双蒸水间体积/体积为0.5～4％；所述十二烷基硫酸钠溶液为十二烷基硫酸钠的双蒸水溶液，且所述十二烷基硫酸钠与双蒸水间质量体积比为0.1～4％；所述DNA酶的浓度为0.1～2mg/mL，具体是将DNA酶溶解至含钙镁的D-Hanks溶液中。
步骤3)中，所述真空环境为真空度为0.1～0.2mbar，冻干温度为-80～-60℃。并且步骤3)中所述消毒液为过氧乙酸的无水乙醇溶液或体积分数为75％的酒精或3％的过氧化氢，且所述过氧乙酸与无水乙醇之间体积比为0.5～2％。
步骤4)中，取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，且粒径不包含零，具备该粒径的颗粒物后续易被消化。其中，所述胃蛋白酶加入量为每100mg冻干组织颗粒物种加入10～100mg胃蛋白酶；且所述酸液优选为浓度为0.01～0.2mol/L的盐酸溶液。
室温下搅拌速度控制为＞300rpm。
所述离心处理的条件优选为控制速度为3000rpm左右，室温下离心处理15min，以去除未消化的冻干组织颗粒物。
所述碱液优选为浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，所述磷酸盐缓冲溶液加入体积量为待处理卵巢细胞外基质溶液体积的10倍以上。
此外，本发明还公开了包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶的制备方法，它在上述制备步骤的基础上，还包括如下制备步骤：
5)培养包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶：从哺乳动物卵巢中分离出颗粒细胞并置于McCoy 5A培养基中，向所述McCoy 5A培养基中加入所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质水凝胶、胎牛血清、雄激素和青霉素-链霉素混合物，再置于二氧化碳培养箱中培养一段时间；
6)培养包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：从哺乳动物卵巢中分离出卵泡并置于低黏附细胞培养基内，同时添加所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质水凝胶、胎牛血清、青霉素、链霉素、重组人促卵泡激素和ITS，培养一段时间；
7)制备包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：取步骤5)所述包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶与步骤6)所述包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶混匀，即制得包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶。
其中，步骤5)中，在所述McCoy 5A培养基中，卵巢细胞外基质水凝胶的体积百分数为10％左右，胎牛血清的体积百分数为10％左右，所述青霉素-链霉素混合物的体积百分数为0.1％左右；所述雄激素的浓度为10ng/mL。
步骤6)中，所述低黏附细胞培养基为α-MEM培养基，且胎牛血清的体积百分数为10％左右，所述青霉素和链霉素合计的体积百分数为0.1％，所述重组人促卵泡激素在培养基中浓度为10mIU/mL，所述ITS由胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠构成，在培养基中的浓度分别为胰岛素5μg/mL、转铁蛋白5μg/mL和亚硒酸钠5ng/mL。
为更好的解释上述制备方法，以下结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例公开了一种包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶的制备方法，它包括如下制备步骤：
1)卵巢组织的预处理：从屠宰场获得动物的猪卵巢组织，将猪卵巢组织皮、髓质分离，释放卵泡液；具体步骤包括：猪卵巢组织在运输途中，置于装有磷酸缓冲盐溶液的容器内，猪卵巢整体放于含有干冰的保存盒中运输至实验室，后续实验在超净工作台内操作，所述超净工作台提前1h用酒精擦拭台面和紫外灯照射。采用组织剪去除猪卵巢周围的脂肪组织，将猪卵巢从卵巢门部呈蝶形剪开，将皮、髓质分离，卵巢皮质厚度控制到1mm，用5mL注射器将皮质中的卵泡液戳破，释放卵泡液，以提高脱细胞化的效果。其中，所述磷酸盐缓冲溶液中包含135mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、1.5mmol/L KH2PO4和8mmol/L K2HPO4。
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质置于双蒸水中，控制水温37℃，在200r/min条件下震荡6h，每3小时更换一次双蒸水，充分地清除残留的卵泡液、淋巴液和血液；充分冲洗后，于-80℃冰箱中过夜；其中，过夜也属于脱细胞化的一部分，低温中水结冰以后体积增大，将细胞胀破，从而进一步增强脱细胞化目的。然后置于脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液中震荡24h，每6h更换一次洗涤液；最后，采用十二烷基硫酸钠溶液继续震荡24h，每6h更换一次洗涤液；
待震荡洗涤干净以后加入DNA酶置于37℃培养基中培养6h，完成脱细胞过程。
3)灭菌及冻干处理：取步骤2)处理后中间产物置于过氧乙酸的无水乙醇中处理6h，再进行冻干处理24h，其中，冻干温度为-80℃，真空度为0.2mbar，获得冻干组织；
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入0.05mol/L的盐酸溶液和胃蛋白酶，所述胃蛋白酶加入量为每100mg冻干组织颗粒物中加入50mg胃蛋白酶；室温下搅拌反应4天，再在离心速度为3000rpm条件下，室温离心处理15min去除未消化的颗粒物，得到卵巢细胞外基质溶液，将所述卵巢细胞外基质溶液置于冰浴中，加入10mol/L的氢氧化钠溶液调整pH至7.2～7.4，继续加入磷酸盐缓冲溶液，置于37℃的环境下孵育成胶，即制得卵巢细胞外基质支架，该卵巢细胞外基质支架在4℃下保存；且所述卵巢细胞外基质支架呈凝胶状。
5)培养包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶：从小鼠卵巢中分离出颗粒细胞并置于McCoy 5A培养基中，向所述McCoy 5A培养基中加入所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质支架、胎牛血清、雄激素和青霉素-链霉素混合物，再置于二氧化碳培养箱中培养一段时间；所述McCoy 5A培养基中，所述卵巢细胞外基质支架的体积百分数为10％，所述胎牛血清的体积百分数为10％，所述青霉素-链霉素混合物的体积百分数为0.1％；所述雄激素的浓度为10ng/mL；
6)培养包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：从1～3周龄小鼠卵巢中分离出卵泡并置于低黏附细胞培养基内，同时添加所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质支架、胎牛血清、青霉素、链霉素、重组人卵泡刺激素和ITS，培养一段时间；所述低黏附细胞培养基为α-MEM培养基，且所述胎牛血清的体积百分数为10％，所述青霉素和链霉素的总体积百分数为0.1％，所述重组人促卵泡激素在培养基中浓度为10mIU/mL，所述ITS由胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠构成，在培养基中的浓度分别为胰岛素5μg/mL、转铁蛋白5μg/mL和亚硒酸钠5ng/mL；
7)制备包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：取步骤5)所述包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶与步骤6)所述包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶混匀，即制得包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶。
结合图1可知脱细胞化的流程，其中，1A为原始的卵巢组织，1B为分离得到的卵巢皮质，1C为分割的卵巢皮质块，1D为脱细胞化处理后的卵巢皮质块。
结合图2，其中图2a为猪卵巢在脱细胞化前细胞核DAPI染色，图2b为苏木素伊红染色，图2c为Masson染色，图2d为阿利新蓝染色；图2e为猪卵巢在脱细胞化后细胞核DAPI染色，图2f为苏木素伊红染色，图2g为Masson染色，图2h为阿利新蓝染色。
结合图3可知本发明设计的脱细胞化方法去除细胞的效率高，免疫原性低，且对原始组织中的细胞外基质蛋白成分均有一定程度的保留，含有必要的结构性蛋白和可溶性银子。
结合图4可知脱细胞化的卵巢结构中不含有细胞和其残留物。
结合图5可知该卵巢细胞外基质冻干粉末可制备成水凝胶的形式，该水凝胶材料可采取注射方式植入哺乳动物体内。
如果将包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶材料原位移植给去势的雌性小鼠，预计2周左右可观察到其动情周期重新开始出现。4周左右时，小鼠每小时血清中抗苗勒氏管激素、雌激素、孕激素上升、卵泡刺激素和黄体生成素下降，其子宫形态以及内膜厚度与正常组无明显差异。经过合笼实验以后，移植水凝胶的小鼠可正常产仔。由此可知，本发明制备的水凝胶材料能够为损伤部位卵巢细胞生长提供良好的生存环境，进一步实现了修复受损的卵巢及重建卵巢功能的技术目的。
以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种卵巢细胞外基质支架，其特征在于，它由如下制备方法制得：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)制备的冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液、胃蛋白酶、碱液及缓冲溶液，制得卵巢细胞外基质支架。
2.根据权利要求1所述卵巢细胞外基质支架，其特征在于，步骤2)中，所述步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质在双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中分别震荡洗涤2～6次，且每次洗涤均需更换新的洗涤液；
其中，所述脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液为脱氧胆酸钠与曲那通X-100的双蒸水溶液，且所述脱氧胆酸钠与双蒸水间质量体积比为0.5～4％，所述曲那通X-100与双蒸水间体积/体积为0.5～4％；
所述十二烷基硫酸钠溶液为十二烷基硫酸钠的双蒸水溶液，且所述十二烷基硫酸钠与双蒸水间质量体积比为0.1～4％；
所述DNA酶的浓度为0.1～2mg/mL。
3.根据权利要求1～2中任意一项所述卵巢细胞外基质支架，其特征在于，所述卵巢细胞外基质支架为凝胶状。
4.一种卵巢细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，它包括如下制备步骤：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：取步骤2)处理后中间产物置于消毒液中处理4～6h，再置于真空环境下冻干处理16～24h，获得冻干组织；
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液和胃蛋白酶，室温下搅拌反应2～4天，离心处理，得到卵巢细胞外基质溶液，将所述卵巢细胞外基质溶液置于冰浴中，加入碱液调整pH至7.2～7.4，继续加入磷酸盐缓冲溶液，置于37℃的环境下孵育成胶，即制得呈凝胶状的卵巢细胞外基质支架。
5.根据权利要求4所述卵巢细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，步骤1)中，将哺乳动物卵巢门部呈蝶形剪开，分离出卵巢组织皮、髓质，并控制所述卵巢组织皮厚度为0.5～2mm。
6.根据权利要求4所述卵巢细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述真空环境为真空度为0.1～0.2mbar，冻干温度为-80～-60℃。
7.根据权利要求4～6中任意一项所述卵巢细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述胃蛋白酶加入量为每100mg冻干组织颗粒物中加入10～100mg胃蛋白酶。
8.一种卵巢细胞外基质水凝胶，其特征在于，它包括权利要求1～3中任意一项所述卵巢细胞外基质支架，还包括位于所述支架内部的颗粒细胞及卵泡。
9.一种卵巢细胞外基质水凝胶的制备方法，其特征在于，它包括如下制备步骤：
1)卵巢组织的预处理：去除哺乳动物卵巢周围的脂肪组织，分离出卵巢组织皮、髓质，并释放卵泡液；
2)多重脱细胞处理：取步骤1)处理好的卵巢组织皮、髓质由前至后依次置于双蒸水、脱氧胆酸钠与曲那通X-100混合液、十二烷基硫酸钠溶液中充分震荡洗涤，然后添加DNA酶置于温度为37℃的培养基中培养4～8h；
3)灭菌及冻干处理：取步骤2)处理后中间产物置于消毒液中处理4～6h，再置于真空环境下冻干处理16～24h，获得冻干组织；
4)制备卵巢细胞外基质支架：取步骤3)所述冻干组织研磨成粒径＜1mm的颗粒物，向所述颗粒物中加入酸液和胃蛋白酶，室温下搅拌反应2～4天，离心处理，得到卵巢细胞外基质溶液，将所述卵巢细胞外基质溶液置于冰浴中，加入碱液调整pH至7.2～7.4，继续加入磷酸盐缓冲溶液，置于37℃的环境下孵育成胶，即制得呈凝胶状的卵巢细胞外基质支架；
5)培养包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶：从哺乳动物卵巢中分离出颗粒细胞并置于McCoy 5A培养基中，向所述McCoy 5A培养基中加入所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质支架、胎牛血清、雄激素和青霉素-链霉素混合物，再置于二氧化碳培养箱中培养一段时间；所述McCoy 5A培养基中，所述卵巢细胞外基质支架的体积百分数为10％，所述胎牛血清的体积百分数为10％，所述青霉素-链霉素混合物的体积百分数为0.1％；所述雄激素的浓度为10ng/mL；
6)培养包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：从哺乳动物卵巢中分离出卵泡并置于低黏附细胞培养基内，同时添加所述步骤4)制备的卵巢细胞外基质支架、胎牛血清、青霉素、链霉素、重组人卵泡刺激素和ITS，培养一段时间；所述低黏附细胞培养基为α-MEM培养基，且所述胎牛血清的体积百分数为10％，所述青霉素和链霉素的总体积百分数为0.1％，所述重组人促卵泡激素在培养基中浓度为10mIU/mL，所述ITS由胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠构成，在培养基中的浓度分别为胰岛素5μg/mL、转铁蛋白5μg/mL和亚硒酸钠5ng/mL；
7)制备包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶：取步骤5)所述包含颗粒细胞的卵巢细胞外基质水凝胶与步骤6)所述包含卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶混匀，即制得包含颗粒细胞及卵泡的卵巢细胞外基质水凝胶。
10.一种卵巢细胞外基质水凝胶在卵巢损伤及重建卵巢功能方面中的应用，其特征在于，所述卵巢损伤包括年龄增长带来的卵巢损伤、因遗传或免疫功能缺陷或环境造成的卵巢损伤、医源性卵巢损伤或病理性卵巢损伤中的任意一种。
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