CN115698262A - 用于控制细胞身份的组合物和方法 - Google Patents

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CN115698262A CN202180037221.4A CN202180037221A CN115698262A CN 115698262 A CN115698262 A CN 115698262A CN 202180037221 A CN202180037221 A CN 202180037221A CN 115698262 A CN115698262 A CN 115698262A
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皮埃尔·朱利叶斯·马吉斯特雷蒂
胡安·卡洛斯·伊斯皮苏阿·贝尔蒙特
雷纳·埃尔南德斯·贝尼特斯
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Abstract

提供了调节细胞稳态的组合物和方法。所述组合物包括代谢物(C1代谢物和C1代谢物混合物(C1‑MIM)，用于诱导细胞进入与其稳态不同的状态，例如，进入与处理前的原始状态相比分化程度较低的状态。C1代谢物包括甲硫氨酸、SAM(S‑腺苷蛋氨酸)、苏氨酸、甘氨酸、腐胺和半胱氨酸。代谢物用于补充细胞培养基，因此，还提供了补充有公开的代谢物的细胞培养基(补充MIM的培养基)。该方法包括：使细胞与C1代谢物接触足够长的时间以导致将细胞重编程为与其稳态不同的状态，例如，重编程为具有祖细胞样特征的低分化状态(MIM‑细胞)。分离的MIM细胞及其后代可用于多种应用，包括细胞疗法和组织工程。

Description

用于控制细胞身份的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月30日提交的美国申请号63/002,063的优先权，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明大体涉及用于将真核细胞从其稳态重编程为不同细胞状态的组合物和方法。
背景技术
代谢组学分析揭示了在任何给定时间存在于细胞类型中的特定代谢物的阵列。到目前为止，几乎没有证据表明代谢开关和特定代谢物是否是细胞身份变化的驱动因素。以前的研究侧重于通过使用长期时间点在天尺度上评估细胞状态进展来研究细胞分化的代谢组动力学(Tormos等人，Cell Metab.14,537-544，(2011)；Panopoulos等人，CellRes.22,168-177(2012)；Park等人，Neurosci.Lett.506,50-54(2012),Bracha等人Nat.Chem.Biol.6,202-204(2010)，缺失与(或可能驱动)从一种细胞表型到另一种细胞表型的最早过渡步骤相关的关键代谢变化，并且其可以被调节以控制细胞命运。需要新的方法和组合物来重新编程和控制细胞命运。
本发明的一个目的是提供用于将细胞从其稳态重编程为不同细胞状态的组合物。
本发明的另一个目的是提供将细胞从其稳态重编程为不同细胞状态的方法。
本发明的另一个目的是提供从其原始稳态重编程为不同细胞状态的细胞。
发明内容
提供了用于将细胞从其稳态重编程为不同细胞状态的组合物和方法。在一些实施方案中，组合物和方法用于去分化分化或部分分化的细胞。
在其他实施方案中，组合物和方法用于分化非终末分化的细胞。该组合物包括用于诱导细胞进入与治疗前的原始状态相比分化程度较低的状态的代谢物(C1代谢物和C1代谢物混合物(C1-MIM)。C1代谢物包括甲硫氨酸、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)、苏氨酸、甘氨酸、腐胺和半胱氨酸。代谢物用于补充细胞培养基，因此，还提供了补充有公开的代谢物的细胞培养基(补充有MIM的培养基)。
提供了将细胞从其稳态重编程为不同细胞状态例如，去分化分化或部分分化的细胞的方法。该方法包括在补充MIM的培养基中培养分化的部分分化或未分化的稳态细胞有效改变其稳态的一段时间。在一些优选的实施方案中，补充MIM的培养基包括六种C1代谢物。在一些优选的实施方案中，补充的MIM包括甲硫氨酸、苏氨酸和甘氨酸、腐胺，并且最优选地，不包括血清或包括降低的血清(小于3％)和/或诸如FGF的存活因子。
还公开了用C1代谢物化学重编程的细胞(MIM-细胞)。在一个优选的实施方案中，在补充有有效量的代谢物的MIM补充的细胞培养基中培养后获得细胞，通过将它们的分化状态逆转为分化程度较低的状态和祖细胞样状态来重编程细胞，该分化程度较低的状态和祖细胞样状态的特征在于至少一种成熟细胞标志物的减少和至少一种祖细胞状态特征基因表达的上调。
所公开的MIM细胞可用于细胞疗法和组织工程应用。
附图说明
图1A-1D显示了两种细胞表型之间基因表达早期转变的鉴定。图1A左图，根据鉴定在正常分化过程中两种细胞表型之间的转变的标志物的基因表达谱，选择感兴趣的时间窗的基本原理。在右图上，探究代谢组的实验概述，重点关注从成肌细胞(MB)、神经干细胞(NSC)和间充质干细胞(MSC)分化的中间转录群体，即在原始细胞表型和随后的细胞表型之间跨越定型的中间阶段的群体。图1B-1D显示了MSC向软骨细胞分化(图1B)、NSC向星形胶质细胞分化(图1C)和MB向肌纤维分化(图1D)期间的基因表达谱，表示为相对于时间零的百分比(时间0h＝MSC-，NSC-或MB-状态)。提取总RNA并通过rtPCR检测mRNA水平。用三个管家基因(Actb、Gapdh和Nat1)的几何平均值对基因表达进行归一化，然后相对于对照条件(时间＝0h)进行归一化。表示为±SEM，n≥3。图1E是关于单个代谢物随时间的丰度的识别模式的示意图(上图)。以钟形图案重叠，该图案在时间上与由其各自前体(初始细胞身份)分化而来的中间过渡群体相吻合。图1F是显示除了代谢物水平之外模式相关性的基本原理的图表。中间转录过渡中存在三种代谢物的假设情况。在诱导分化后，出现转录程序的过渡阶段(中心区域)，在该阶段发现了三种假设的代谢物。观察到代谢物2的水平是仅初始转录程序(来自稳定的细胞类型1)失活的结果，尽管代谢物-2高于代谢物-1。相反，代谢物-1和代谢物-3仅在中间过渡期间提高其水平，因此它们应该与该转录过渡具有更大的相关性。图1G是显示MIM处理之前的细胞类型的条形图。图1H显示了Gfap、cMyc和Nestin相对于C1-MIM的每种组分的浓度范围的暴露的相对基因表达。图1I显示响应于CI-MIM的基因表达。图1J显示了作为有/无SAM组合的结果的Gfap基因表达。
图2A表示在源自MB、NSC和MSC的三种不同细胞群中代谢物的相对水平增加的鉴定。代谢物分为4类。空心圆圈表示在诱导分化后6小时显著增加的代谢物(P<0.05)。一个、两个或三个圆圈分别表示一种、两种或三种细胞类型的显著增加。灰色圆圈代表仅在一种细胞类型中增加的代谢物，而在其他两种细胞类型中呈负趋势。代表属于一碳代谢的主要循环。图2B一碳代谢网络。图2C.在三种细胞类型(MB、NSC和MSC)的分化过程中，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相对丰度按比例强度(y轴)归一化。观察到的比例强度是Bradford归一化的，代表指定时间细胞内SAM的相对水平。数据显示为所有值的分布。显示的实验来自每个细胞谱系的n～5个生物重复。图2D在两个稳态之间的身份变化期间与一波的一碳代谢物相关的时间示意图。蓝色箭头表示甲硫氨酸循环，以及该循环的一种关键酶(黄色方块)。注意比例：小时与天。图2E-2G图2E中的MB，图2F中的NSC和图2G中的MSC中的一碳波的Mtr-敲低(Mtr-knockdown)和干扰。在左图中，siRNA-Mtr剂量-反应显示了每种细胞类型中Mtr基因表达的抑制程度。在多能阶段进行的siRNA的转染；一天后测量敲低。在中间图ls上，定量甲硫氨酸的相对水平(受MtT-敲低影响的直接代谢物)。通过荧光法进行定量；点表示在发射/激发(Em/Ex)535/587下测量的绝对值。在右图上，每种细胞类型的多能阶段的标志物的相对基因表达，在诱导分化后(使用选定的siRNA-Mtr浓度)在敲低细胞中测量。通过rtPCR获得的基因表达，并用两个管家基因(Actb和Gapdh)的几何平均值进行归一化；然后将对照条件归一化为100％，以观察抑制或增强的百分比。平均值±SEM，相对于对照，**P<0.01、***P<0.001和n>/＝3时具有统计学意义，其中点代表每个值。图2H在诱导ESC分化为滋养外胚层后(在细胞系Zhbtc4中)对早期状态的甲硫氨酸水平的定量；n～4个技术重复，在*P<0.05、**P<0.01(配对t检验)时显著不同。图2I.在诱导ESC分化为滋养外胚层后(在细胞系Zhbtc4中)对早期状态的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)水平的定量；n～4个技术重复，**P<O.OI、***P<O.OOI(配对t检验)时显著不同。图2J.考虑到总共15170个探针，Promoter2K区域(转录起始位点上游0-2,000bp)的甲基化百分比的比例被七个范围分开。图2K.具有不同的Promoter2K区域甲基化百分比的代表性基因。图2L.在诱导NSC的分化后早期指定基因的相对基因表达。提取总RNA并通过rtPCR检测mRNA水平。在这里，当在同一时间交叉的不同细胞库达到的基因表达的相对水平发生更高变化时，通过rt-PCR间接观察到基因表达的振荡峰。请注意，这种变化是在某个时间专门观察到的；除了使用相同样品评估的其他基因，没有表现出这种变化(参见讨论SI-1e)。基因表达用两个管家基因(Actb和Gapdh)的几何平均值进行归一化，然后相对于对照条件(时间Oh～NSCs)进行归一化。每个点代表一个样品。图2M-P.通过rtPCR对不同细胞类型的主要分化标志物的基因表达—指示—在对照分化培养基(浅灰色条)和具有不同MIM组分组合的处理细胞(黑色条)中。其中：MIM(6)含有甲硫氨酸、甘氨酸、腐胺、半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸；而MIM(4)，前一种组成减去半胱氨酸和减去S-腺苷甲硫氨酸。所有代谢物都旨在为C I网络提供营养，详细信息请参见讨论SI_I f。用三个管家基因(小鼠细胞的Actb、Gapdh和Natl；人诱导的星形胶质细胞的GAPDH、RLPI9和GUS；人成纤维细胞的GAPDH)的几何平均值对表达进行归一化，然后相对于对照条件进行归一化。条形图是平均值±SEM，与对照组相比，**P<0.01或***P<0.001时具有统计学意义；并且n>/＝5，其中点代表每个值。图2Q.具有甲基化百分比低于25％的Promoter2K区域的比较。第一幅图显示了与每个条件相关的RefSeq登录号的重叠。第二至第四幅图，对每种条件(NSC、3小时或24小时)仅显示较少甲基化的基因进行功能富集分析。图2R.具有甲基化百分比高于75％的Promoter2K区域的比较。第一幅图显示了与每个条件相关的RefSeq登录号的重叠。第二至第四幅图，对每种条件(NSC、3小时或24小时)仅显示较多甲基化的基因进行功能富集分析。
图3A显示基于基因归一化表达水平的星形胶质细胞、MIM-星形胶质细胞、NSC和胶质母细胞瘤(GB)的PCA图。通过大量RNAseq(bulk RNAseq)获得转录组图谱；每个样品由单个点表示(n＝3)。图3B.基于正则化对数变换计算的所有样品的欧几里得距离的热图。图3C.星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞之间的DEG的基因集富集分析(GSEA)。图显示了与MIM星形胶质细胞中上调和下调基因相关的前三个富集分布。每个图显示的FDR和归一化富集评分(NES)。图3D.在星形胶质细胞中用MIM处理后鉴定的细胞类型的机器学习预测。根据基于E-检验的自细胞标识符图谱(SciBet)，从发育神经元数据集中预测。
图4A-E.培养对照和MIM处理五天后的代表性图像。比例尺，50llm。(图4A)中的黄色方块代表选定区域的数字放大。放大区域中的箭头显示在MIM处理后具有获得性形态的细胞，位于保持对照形态的细胞中间。图4F-4H和4J.通过rtPCR在对照和用不同MIM组分组合的MIM处理的细胞中获得的相对基因表达。其中：MIM(6)含有甲硫氨酸、甘氨酸、腐胺、半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸；而MIM(4)，前者的组分减去半胱氨酸和减去S-腺苷甲硫氨酸。表达用至少两个管家基因(来自Actb、Gapdh和Natl)的几何平均值进行归一化，然后相对于对照条件进行归一化。红点代表每个值(n::>5)，条形图表示平均值±SEM，其中与对照相比的差异在**P<0.001或***P<0.0001时显著。图4I.通过免疫细胞化学评估的Pax7+细胞的相对表达。上图Pax7+细胞与总MyoD+细胞的百分比。下图Pax7标志物的荧光强度。在这种情况下，MIM6用于血清减少的培养基中。红点代表每个值。条形图是平均值±SEM，其中与对照相比的差异在*P<0.05、**P<0.001、***P<0.0001时显著。图4A-4C和图4F-4I是在指定的小鼠细胞中的实验。图4D、4E和4J在人类细胞中，其中iAstrocytes代表诱导的星形胶质细胞。
图5A.基因本体论(GO)分析来自NSC与星形胶质细胞和星形胶质细胞与MIM处理的星形胶质细胞的差异表达基因的重叠。图5B显示了MIM-星形胶质细胞中的基因表达水平。图5C.每个MIM星形胶质细胞簇中星形胶质细胞标志物的细胞数百分比。图5D.MIM星形胶质细胞中每个簇的GO分析。
图6A-F.基因表达的相关性作为来自每簇单细胞RNA数据和大量RNA数据的倍数变化，图中显示了Pearson相关值。图6G-L.基于星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞之间比对的指定簇(AMO-AMS)中差异表达基因的火山图。表示FOR<O.OS的红点被视为显著的。图6M-Q.与星形胶质细胞相比，与每个MIM星形胶质细胞簇相关的基因本体论生物学术语。使用超几何检验计算的P值和使用Bonferroni校正程序计算的FDR。注意：进行AM1-簇DEG分析，比较星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞，而来自AM2-AMS的每个其他簇(因为它们在星形胶质细胞中没有匹配的簇)与整个星形胶质细胞群(由来自星形胶质细胞的AMO+AM1组成的池)进行比较。
图7A.图的基本原理。计算方法允许整合MIM-星形胶质细胞和NSC scRNAseq数据。按照箭头观察组合图，然后对其进行聚类分析以定义亚群NMO-NM4。从每个簇中，我们分析了保守的基因表达，然后进行基因本体论(GO)分析。图7B-F.GO分析NSC和MIM-星形胶质细胞之间基因的保守表达，包括每个簇的上调和下调基因。注意：在(图7D)中，由于在此特定相似性比较中上调的基因数量很少，因此仅富集下调。图7G-K.在左侧，基于显示在图7A中的NSC和MIM-星形胶质细胞之间的比对的簇NMO-NM4中差异表达基因的火山图，红点表示FOR<0.05被视为显著。在右侧，GO分析了差异表达基因，包括来自每个簇的上调和下调基因。在图7I和7J中，由于上调基因的数量减少，富集仅针对下调基因。在图7K的右侧，来自scRNA数据和大量RNA数据的倍数变化基因表达的Pearson相关性。N＝NSC；M＝MIM-星形胶质细胞、NM整合NSC和MIM-星形胶质细胞。用超几何检验计算的P值；FOR使用Bonferroni校正程序计算。
图8A.根据Nakajima-Koyama等人(2015)考虑的参数，基于大量-RNA seq的FPKM值鉴定神经外胚层、中胚层和内胚层谱系的标志物基因。图8B.根据Panglao DB接口分配MIM星形胶质细胞中存在的细胞类型。图8C.通过scRNAseq轨迹分析表征瞬态细胞状态。使用Monocle的方法识别五个状态和两个分支的轨迹图的方面(Facet)。图8D.识别MIM星形胶质细胞中随伪时间变化的代表性基因。
图9A.在上图中，基因集富集分析(GSEA)显示了MIM-星形胶质细胞中DNA甲基化的分布集(上图)。在下图中，与星形胶质细胞、NSC和胶质母细胞瘤细胞(GB)相比，基于归一化表达值的DNA甲基化相关基因的相应热图。图9B显示了编码与甲基化和去甲基化过程相关的蛋白质的基因的相对表达水平。(a,b)中的数据来自大量转录组学(bulk-transcriptomics)(n～3)。图9C显示组蛋白修饰。每种形式的相对丰度的变化表明从星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞分离的大量组蛋白中的氨基酸残基。条形图代表每种形式的指定肽的相对丰度、来自三个质谱运行的相应测量值的平均值和标准偏差。显示星形胶质细胞和MIM星形胶质细胞之间的所有修饰显著不同。图9D和9F.通过rt-PCR在星形胶质细胞中(对照在时间0小时)和在向细胞中添加Cl-MIM后的连续时间获得的相对基因表达。(图9D)中的Gfap和(图9F)中的Hes5。用两个管家基因(Actb和Gapdh)的几何平均值对表达进行归一化，然后相对于对照条件进行归一化。粉红点代表平均值±SEM，(n：>/＝5)。图9E和9G.来自星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞的ChIP-qPCR(在第5天评估)用于(图9E)中Gfap和(图9F)中Hes5的指定启动子'位点。数据来自qPCR反应集，每个ChIP样品一式三份，用于H3K27上的甲基化。归一化数据(根据输入DNA)表示为每1000个细胞检测到的结合事件(详见方法)。在**P<0.01、***P<0.001时与星形胶质细胞对照显著不同。
图10A-10C是显示在CI-MIM处理后老小脑星形胶质细胞(18.S月龄小鼠)获得的能力的功能测定。图10A显示了神经球形成的能力。对照星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞的明场照片，均暴露于NSCs标准增殖培养基(比例尺～150llm)中24小时。图10B显示与B～MIM-astroCy1es衍生的NSC相比，通过rtPCR在A～MIM-星形胶质细胞中的相对基因表达。图10C显示了在重新分化MIM-星形胶质细胞衍生的-NSC后获得(＝C)的，星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的主要标志物的相对基因表达。用两个管家基因(Actb和Gapdh)的几何平均值对表达进行归一化，然后相对于各自的对照条件进行归一化。点代表每个值，条形图是平均值±SEM。图10D显示MF20阳性细胞相对于通过荧光直接计数获得的GFP表达细胞的百分比；点代表每个值±SEM。图10E显示(j)中成纤维细胞身份基因的相对表达和图10F-H显示基因成纤维细胞身份的相对表达。表达用管家基因CTCF的平均值归一化，然后相对于对照条件BJ-成纤维细胞归一化；除了在(图10G)中，在成纤维细胞中未检测到NEURODI，并且MIM的条件相对于BJ-成纤维细胞+NGN1I2进行归一化。点代表每个值±SEM。*P<0.05、**P<0.005、***P<0.0001时存在显著差异。
发明详述
以前的研究已经使用未捕获初始转录变化的大时间窗口比较了稳定的、定型的细胞状态的代谢组，或在分化过程中跟踪的代谢组变化(Knobloch,等人Cell Rep.20,2144-2155(2017)；Yanes等人，Nat.Chem.Biol.6,411-417(2010)；Peng等人，Science 354,481-484(2016)；Castiglione等人，Sci.Rep.7,15808(2017))。这些研究主要集中在稳态条件上，例如，将干细胞/祖细胞与完全分化的细胞进行比较(Yanes等人，Nat.Chem.Biol.6,411-417(2010)；Wang等人，EMBO J.36,1330-1347(2017)；Panopoulos等人，Cell Res.22,168-177(2012)；Coller,FEBS Lett.593,2817-2839(2019)))。以前的研究已经通过使用长期时间点在天尺度上评估细胞状态进展来研究细胞分化的代谢组动力学(Tormos等人，Cell Metab.14,537-544(2011)；Moussaieff等人，Cell Metab.21,392-402(2015)；Guijas等人，Nat.Biotechnol.36,316-320(2018))。
本文公开的组合物和方法基于检查在三种不同的多能干细胞类型(成肌细胞，MB；神经干细胞，NSC；和间充质干细胞，MSC)中体外细胞分化的早期阶段发生的代谢组学变化进行的研究，揭示了特定代谢物波的存在与驱动向细胞分化所必需的转录程序的过渡有关。这些保守的代谢波可以被改造来逆转细胞的稳态，例如细胞分化，从而被用来诱导细胞可塑性。
I.定义
“培养物”是指在细胞培养基中生长并任选传代的细胞群。细胞培养物可以是原代培养物(例如，尚未传代的培养物)或可以是二次或后续培养物(例如，已经传代培养或传代一次或多次的细胞群)。
“外源”是指源自给定细胞或生物体外部的分子或物质(例如氨基酸)。相反，术语“内源性”是指天然的或起源于给定细胞或生物体的分子或物质。
当提到MIM细胞时，“分离的”或“纯化的”是指化学诱导的神经元至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含污染细胞类型，例如非神经元细胞。分离的MIM-细胞也可以基本上不含可溶的、天然存在的分子。
“神经元样形态”在本文中与“神经元形态”可互换使用，以指神经元的形态特征，例如体细胞/细胞体、树突、轴突和/或突触的存在。
如本文所用，“治疗”和/或“改善”神经退行性或神经障碍或神经元损伤是指减少/减轻与神经退行性或神经障碍或神经元损伤相关的症状。
II.组合物
组合物包括用于诱导细胞从其稳态变化的代谢物和代谢物混合物。“稳态”是指一个细胞保持相同身份的时间(即具有作为该细胞类型特征的新陈代谢和转录程序)。从这个意义上说，稳态的例子是多能性干细胞、多能干细胞和从每个谱系分化的每个细胞亚型。在一个实施方案中，代谢物和代谢物混合物用于诱导细胞进入与治疗前的原始状态相比分化程度较低的状态。在其他实施方案中，代谢物和代谢物混合物用于诱导分化程度较低的细胞例如多能性细胞和多能细胞的分化。代谢物用于补充细胞培养基，因此，还提供了补充有公开的代谢物的细胞培养基。
下面的例子证明了C1代谢物抑制了分化细胞的基因表达表型，成熟细胞标志物的表达减少就证明了这一点。
所公开的组合物还包括化学重编程的细胞，其在补充有代谢物的细胞培养基中培养后获得，补充有有效量的代谢物以通过将细胞的分化状态逆转为分化程度较低的状态来重编程细胞。
A.诱导分化细胞去分化的代谢物
代谢物被公开用于在细胞中诱导C1-代谢物波，以使细胞去分化成祖细胞样状态。用这些代谢物处理完全分化的细胞会导致细胞身份的丧失和向祖细胞样状态的转变。小分子包括甲硫氨酸、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)、s-腺苷高半胱氨酸(SAH)、苏氨酸、2-氨基-3-氧代丁酸、丝氨酸、邻苯二甲酸、谷氨酸、5-氧代脯氨酸、半胱氨酸甘氨酸、甘氨酸、甜菜碱、二甲基甘氨酸、腐胺、亚精胺、精胺、N-乙酰精胺和N-乙酰亚精胺，以及半胱氨酸、半胱氨酸亚磺酸、亚牛磺酸、牛磺酸、胱氨酸、硫代胱氨酸、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、γ-谷氨酰-半胱氨酸、S-甲基谷胱甘肽、S-乳酰谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽(GSG)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、N-乙酰甲硫氨酸、N-乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸砜、N-乙酰牛磺酸、N-甲酰基甲硫氨酸、半胱氨酸S-硫酸盐、甲硫氨酸亚砜、N-乙酰甲硫氨酸亚砜、S-甲基半胱氨酸、磺基-L-丙氨酸、N-乙酰丝氨酸、磷酸丝氨酸、高丝氨酸内酯、磷酸苏氨酸和N-乙酰苏氨酸、4-乙酰氨基丁酸、N-乙酰异腐胺(N-acetyl isoputreanine)、N-二乙酰精胺和N-乙酰腐胺、2-羟基丁酸、3-去磷酸-CoA-谷胱甘肽、二羧乙基谷胱甘肽、CoA-谷胱甘肽、4-羟基-壬烯醛-谷胱甘肽、环状-dGSH和S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)(在此统称为C1-代谢物)。C1代谢物单独或组合使用(即，作为混合物，在本文中，C1-代谢诱导培养基(C1-MIM))以有效量补充基础细胞培养基，以在补充C1-代谢物或C1-MIM的细胞培养基中诱导细胞中的C1-代谢物。
B.补充MIM的培养基
还提供了本文公开的补充有MIM(MIM-补充的培养基)的细胞培养基。补充MIM的培养基是通过将外源C1代谢物引入基础细胞培养基，例如，用于培养分化细胞的市售培养基中获得的。市售的基础培养基的示例可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、极限必需培养基(Minimal Essential Medium)(MEM)、Eagle基础培养基(BME)、罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute Medium)(RPMI)1640、MCDB 131、Click's培养基、McCoy's 5A培养基、培养基199、William's培养基E、昆虫培养基如Grace's培养基、Ham's营养混合物F-10(Ham's F-10)、Ham's F-12、a-极限必需培养基(aMEM)、Glasgow's极限必需培养基(G-MEM)、Iscove's改良杜氏培养基、Neurobasal培养基、DMEMF12和MEMα。本领域普通技术人员可以根据细胞类型容易地选择要补充的细胞培养基。
在一些实施方案中，基础细胞培养基另外补充有血清。然而，在优选的实施方案中，基础细胞培养基不含血清并且进一步补充了细胞存活因子，例如成纤维细胞生长因子2(Fgf2)、神经生长素(neutrophin)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子等，以维持细胞生存。
基础细胞培养基补充有至少两种C1代谢物，并且在优选实施方案中补充有C1-MIM。C1-MIM包括至少3种C1代谢物、4种C1代谢物、5种C1代谢物，例如甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸、腐胺、SAM或甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸、腐胺、半胱氨酸或6种C1代谢物(即，甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸、腐胺、SAM和半胱氨酸、MIM(6)))。在更优选的实施方案中，使用4种C1代谢物，更优选甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸、腐胺(MIM(4))。
SAM的浓度优选不超过2mM，优选不超过1.5mM，更优选不超过0.5mM。因此，SAM优选以0.01-2mM、更优选0.1-1.5mM、最优选0.1-0.5mM的浓度补充到基础细胞培养基中。
甲硫氨酸以0.001-100mM、优选0.025-50mM、最优选0.025-10mM的浓度补充到基础细胞培养基中。
甘氨酸以0.01-100M、优选0.025-50mM、最优选0.025-10mM的浓度补充到基础细胞培养基中。
苏氨酸以0.001-100mM、优选0.025-50mM、最优选0.025-10mM的浓度补充到基础细胞培养基中。
腐胺以0.001-100mM、优选0.025-50mM、最优选0.025-10mM的浓度补充到基础细胞培养基中。
半胱氨酸以0.001-100mM、优选0.025-50mM、最优选0.025-10mM的浓度补充到基础细胞培养基中。
用于补充基础细胞培养基的特别优选的C1-MIM包括MIM(6)或MIM(4)，所述MIM(6)，其中将5种C1代谢物(Gly、Thr、Cys、腐胺和Met)以约2.5至约5mM的浓度，优选5mM(除了SAM以约0.5mM添加)添加到基础细胞培养基(不含/不含血清+FGF2)中；所述MIM(4)，其中将5种C1代谢物(Gly、Thr、Cys、腐胺和Met)以约2.5至约5mM的浓度，优选5mM(除了SAM以约0.5mM添加)添加到基础细胞培养物(不含/不含血清+FGF2)中。
C.待诱导细胞和MIM诱导的细胞
MIM-细胞通过诱导获自任何哺乳动物的细胞获得，例如，获自任何哺乳动物(例如牛、羊、猪、犬、猫、马、灵长类动物)，优选人的部分或完全分化的细胞。来源包括骨髓、成纤维细胞、胎儿组织(例如胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。然而，MIM-细胞可以从其他细胞类型获得，包括但不限于：干细胞、多能干细胞类型、成肌细胞(MB)、神经干细胞(NSC)、间充质干细胞(MSC)、血液来源的细胞、胚胎来源的细胞、皮肤来源的细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞和结缔组织细胞。在优选的实施方案中，MIM-细胞获自化学诱导的成纤维细胞、软骨细胞、神经元和星形胶质细胞。
在其命运中被重新编程的细胞可以从从哺乳动物受试者获得的样品中获得。受试者可以是任何哺乳动物(例如，牛、羊、猪、犬、猫、马、灵长类)，包括人。细胞样品可以从许多不同来源中的任何一种获得，包括例如骨髓、胎儿组织(例如，胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺(β细胞是α、δ、γ和ε细胞，胰岛细胞、γ细胞))、皮肤或任何器官或组织。
可以使用本领域技术人员已知的技术通过分解用作细胞来源的适当器官或组织来分离细胞。例如，组织或器官可以机械分解和/或用消化酶和/或螯合剂处理，以削弱相邻细胞之间的连接，从而可以分散组织以形成单个细胞的悬浮液，而不会出现明显的细胞破裂。酶解可以通过切碎组织并用一种或多种酶处理切碎的组织来完成，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和/或透明质酸酶、DNase、链霉蛋白酶、分散酶等。机械破坏也可以通过许多方法完成，包括但不限于使用研磨机、搅拌机、筛子、均质器、压力盒(pressure cell)或声波器。
MIM细胞与获得它们的细胞(在此为亲代细胞)的不同之处在于，与亲代细胞相比，至少一种成熟细胞标志物的表达降低；在将MIM-细胞与亲代细胞进行比较时，与细胞形态的变化相关联。在优选的实施方案中，MIM细胞不是基因改造的，即，MIM细胞没有通过从细胞中引入或去除遗传元件而改变。
成熟细胞标志物在本文中用于指用于鉴定定型细胞的标志物，并且此类标志物是本领域已知的。本文公开了非限制性实例。神经元特异性标志物包括TUJ1(神经元特异性III类β微管蛋白)、MAP2、NF-H和NeuN。MAP-2是一种神经元特异性细胞骨架蛋白，用作神经元表型的标志物。Izant等人,Proc Natl Acad Sci U S A.,77:4741-5(1980)。NeuN是由Mullen等人，Development，116：201-11(1992)鉴定的神经元特异性核蛋白。成纤维细胞标志基因包括Fap、Des、Slug、Dcn、FSp1、Tgfb1i1、Snail、Collagen1和Twist2。肝细胞标志物包括但不限于白蛋白、细胞色素P450(Cyp)3A4、CYPB6、CYP1A2、CYP2C9和/或CYP2C19；脂肪细胞标志物包括例如脂连蛋白、脂肪酸结合蛋白P4和瘦蛋白。
例如，从星形胶质细胞获得的MIM细胞显示出星形胶质细胞标志物例如胶质纤维酸性蛋白编码基因、Gfap和Cd44(分化簇44)的表达降低；从软骨细胞中获得的MIM细胞显示软骨细胞标志物例如聚集蛋白聚糖、II型胶原蛋白(Col2)的表达降低；从神经元获得的MIM细胞表现出神经元标志物例如Map2和β-III-微管蛋白的表达降低；从成纤维细胞获得的MIM细胞显示成纤维细胞标志物例如I型胶原蛋白α2链编码基因，Col1A2的表达降低。与亲本细胞相比，至少一种成熟细胞标志物的表达降低可以使用本领域已知的方法来确定。在一些实施方案中，MIM-细胞与亲本细胞的不同之处在于至少一种成熟细胞标志物的表达降低高达10％，至少降低了20％，降低了40％，降低了50％，降低了至少60％、70％或80％，并且在一些实施方案中，至少一种成熟细胞标志物的表达降低高达95％。此外，MIM-细胞表达与祖细胞状态相关的基因，例如，cMyc、Ascl1、SOX2、Nestin、CD133和Pax7，并且在一些实施方案中，MIM-细胞不表达Oct4。
D.基于MIM细胞的治疗组合物
可以使用合适的药学上可接受的载体配制MIM-细胞以用于施用、递送或接触受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，细胞简单地悬浮在生理缓冲液中。在其他实施方案中，细胞设置有或结合到支持物(support)结构中。一种策略包括将MIM细胞封装/悬浮在合适的聚合支持物中。支持物结构可以是整体或部分可生物降解的或不可生物降解的。支持物可以由天然或合成聚合物形成。天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸、多糖、藻酸盐和糖胺聚糖。合成聚合物包括聚羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚羟基链烷酸酯如聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚酐、聚氨酯、聚碳酸酯和聚酯。这些可以是植入物、管、网状物或水凝胶的形式。支持物结构可以是松散的织造或非织造网，其中细胞被接种在网中和网上。该结构可以包括固体结构支持物。支持物可以是管，例如用于神经轴突再生的神经管。
例如，细胞可以悬浮在胶原、藻酸盐或
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的水凝胶基质中。神经组织工程中常见的不可生物降解的细胞载体包括硅酮、聚乙烯醇(PVA)和共聚物聚(丙烯腈-共聚-氯乙烯)(P(AN/VC))、聚砜(PSU)和聚(醚砜)(PES))、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚丙烯(PP)。在Wong等人的Int J.Mol Sci.15:10669-10723(2014)中进行了综述。另见Blurton-Jones等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,106(32):13594-9(2009)；Jin等人，J.Cereb.BloodFlow Metab.,30:534-44(2009)；和Lundberg等人，Neuroradiology，51:661-7(2009)。微囊化细胞的移植在本领域中是已知的，并且例如在Balladur等人，Surgery,117:189-94(1995)；和Dixit等人，Cell Transplantation,1:275-79(1992)中公开。包括MIM-细胞的其他治疗组合物在下面的使用方法中进行了描述。
基于MIM-细胞的治疗组合物包括有效量的用于本文公开的方法的MIM-细胞。例如，最初可以施用104-105个细胞的剂量，并监测受试者的效果(例如，细胞的植入、改善的神经功能、受影响区域中的增加的神经元密度)。MIM-细胞的剂量可以在103-107,104-107,105-108,106-109或106-108个细胞的范围内。包括MIM-细胞的药物制剂可以包装或制备成单位剂型。可以将细胞冻干和/或冷冻以延长保质期，并在施用前重新悬浮。在这种形式中，细胞制剂被细分为含有适量活性成分的单位剂量，例如，根据治疗剂的剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂。如果需要，该组合物还可以含有其他相容的治疗剂。
III.制备方法
A.MIM细胞的制备
MIM-细胞可以按照下面示例中概述的方案进行制备，并在此处简要描述。如本文所述分离待诱导的细胞(稳态细胞)并在合适的原代细胞培养基中培养(基于分离细胞的组织来源)。在贴壁条件下接种的细胞培养物保持在它们各自的分化培养基上，直到达到成熟的表型。成熟表型，在此理解为细胞类型在分化培养基(通常为每种细胞类型已知的标准)中维持后获得的细胞类型达到将细胞鉴定为终末分化的标志物(在RNA或蛋白质水平)的表达。例如，神经元的Map2。当培养物达到约80-90％汇合度(confluence)时，去除分化培养基，用PBS洗涤细胞，并将培养基更换为补充有MIM的培养基(如上所述)。在一些实施方案中，补充有MIM的培养基优选不含血清或含有减少的血清(约2％)，并且包括生长因子FGF2(20ng/mL)。MIM细胞可以在补充有MIM的细胞培养基中培养1到5天后收获，但该时间可以根据待处理的细胞类型进行调整(减少或扩大)。
所公开的MIM-细胞不是通过转染亲本细胞以表达Oct4、KLF4、SOX2、C-Myc或NANOG中的任一种获得的。
B.MIM细胞的培养和保存
MIM细胞可以在培养中扩增并储存以供以后回收和使用。一旦建立了细胞培养物，在有或没有组织形成的条件下，在有利于细胞增殖的条件下，通过传代到新鲜培养基中，细胞群在体外进行有丝分裂扩增。这样的培养方法可以包括，例如，在缺乏诱导分化的特定生长因子(例如，IGF、EGF、FGF、VEGF和/或其他生长因子)的培养基中传代细胞。当达到足够的细胞密度时，可以将培养的细胞转移到新鲜培养基中。用于维持神经元细胞的细胞培养基是市售的。
可以根据已知方法将细胞冷冻保存用于储存，例如在Doyle等人(编辑),1995,Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester中描述的那些。例如，可以将细胞以例如，大约4-10x 106个细胞/ml的密度悬浮在“冷冻培养基”中，例如含有15-20％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜(DMSO)的培养基，含或不含5-10％甘油。细胞被分配到玻璃或塑料小瓶中，然后密封并转移到可编程或被动冷冻机的冷冻室中。可凭经验确定最佳冷冻速率。例如，可以使用通过熔化热使温度变化为-1℃/分钟的冷冻程序。一旦含有细胞的小瓶达到-80℃，它们就会被转移到液氮储存区。冷冻保存的细胞可以保存数年。
IV.使用方法
鉴定可产生所需细胞类型或形态的祖细胞样细胞的现成来源对于治疗、组织工程和研究很重要。祖细胞样细胞的可用性将在移植、组织工程、血管生成的调节、血管发生和细胞替代或细胞疗法以及预防某些疾病中非常有用。作为基因疗法方案的一部分，此类细胞也可用于将基因引入受试者。
A.细胞疗法
MIM-细胞的治疗用途包括将诱导的MIM-细胞或其后代移植到个体中以治疗多种病理状态，包括由癌症、创伤、肿瘤、损伤、病毒感染、糖尿病等引起的疾病和病症。根据本领域目前已知的或将来开发的任何方法，治疗可能需要使用细胞产生新组织，以及使用由此产生的组织。可以将细胞植入、注射或以其他方式直接施用于组织损伤部位，从而它们将在体内产生新组织。
去分化的神经元细胞
从神经元来源的分化细胞(本文中，MIM-神经元细胞)获得的MIM-细胞可用于治疗和/或改善有需要的受试者(具有神经元细胞缺陷的个体)的神经退行性或神经系统病症或神经元损伤的方法。在优选的实施方案中，MIM-神经元细胞从自体细胞获得，即供体细胞是自体的。然而，细胞可以从异源细胞中获得。在一个实施方案中，供体细胞从与受体遗传相关的供体获得。在另一个实施方案中，供体细胞从与受体遗传无关的供体获得。如果与受体受试者相比，人MIM-神经元细胞来源于异源(非自体/同种异体)来源，则通常施用伴随的免疫抑制疗法，例如施用免疫抑制剂环孢菌素或FK506。
该方法包括向个体/受试者施用有效量的MIM-神经元细胞，从而治疗和/或改善与神经退行性疾病或神经元损伤相关的症状。在一些实施方案中，将MIM-神经元细胞施用至个体的神经变性或神经元损伤部位，例如，通过使用注射器定位装置注射到损伤部位。根据所治疗的疾病(例如美国专利5,968,829)，MIM神经元细胞可以直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内部位。MIM-神经元细胞可以使用已知的将细胞施用至神经元组织如脑或脊髓的方法施用至有需要的受试者，例如Blurton-Jones等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,106(32):13594-9(2009)；Jin等人，J.Cereb.Blood Flow Metab.,30:534-44(2009)；和Lundberg等人，Neuroradiology，51:661-7(2009)。
与任何治疗一样，治疗过程最好根据受试者的特定特征和选择的治疗类型来确定。治疗可以一次、定期(例如，每两周、每月)或治疗有效的任何适用基础施用于受试者。治疗可以单独施用或与另一种治疗剂组合施用，例如减轻疼痛的药剂或促进神经元功能或生长的药剂。另外的治疗剂可以与MIM-神经元细胞同时、在不同的时间或以完全不同的治疗方案施用(例如，可以根据需要施用MIM-神经元细胞，而另外的治疗剂每天或每周施用)。
施用至患者的MIM神经元细胞的剂量将根据多种因素而变化。例如，与较小的动物相比，有必要向人类提供大得多的剂量。剂量将取决于患者的大小、年龄、性别、体重、病史和状况、其他疗法的使用以及施用频率。然而，本领域普通技术人员可以容易地确定合适的剂量，例如通过初始动物试验，或通过施用相对少量并监测患者的治疗效果。如有必要，可以逐步增加剂量，直到获得所需的结果。通常，以可能小于治疗剂的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量以小的增量增加，直到达到环境下的最佳效果。
需要本文公开的MIM-神经元细胞的个体或受试者包括但不限于患有神经退行性疾病的受试者，所述神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症(MS)和大脑性瘫痪(CP)、齿状核-苍白球萎缩症(DRPLA)、神经元核内透明性包涵体病(NIHID)、路易体痴呆、唐氏综合症，哈-斯病(Hallervorden-Spatz disease)、朊病毒病，嗜银粒性痴呆、皮质基底层变性、拳击手痴呆、弥漫性神经原纤维缠结、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、哈-斯病、雅-克病(Jakob-Creutzfeldt disease)、尼曼-匹克病3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、皮克氏病和齿状-苍白球萎缩症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy)组成的组中。神经元损伤包括但不限于创伤性脑损伤、中风和化学诱发的脑损伤。神经元损伤可能由任何数量的创伤事件引起，例如，在运动、事故或战斗中获得。神经元损伤包括脑震荡、缺血(中风)、出血或挫伤，导致个体神经元受损或严重情况下神经元组织显著丧失。还包括由病原体感染或化学诱导的脑损伤引起的神经元损伤和损失，例如，由于药物、环境因素或药物滥用。
用于诊断神经退行性疾病、神经系统疾病和神经元损伤的方法是本领域已知的(参见，例如，精神疾病诊断和统计手册，第四版(DSM-IV-TR)，美国精神病学协会2000)。通常，医生或神经科医生在对特定个体或患者进行诊断时会考虑许多因素。例如，家族史通常表明存在AD、HD、PD和其他神经退行性疾病的风险。医生还将进行化学测试，以检查正常的血细胞计数、甲状腺功能、肝功能、葡萄糖水平。脊髓液通常作为该测试的一部分进行分析。神经心理学测试也可用于评估记忆力、解决问题的能力、决策能力、注意力、视觉-运动协调性和抽象思维。这些包括空间练习和简单的计算。简易精神状态检查也很常见。
CAT扫描和MRI也可用于排除肿瘤，并可以提供有关大脑退化区域的线索。诸如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像等非侵入性医学成像技术对于脑部疾病的检测特别有用。PET和SPECT成像显示器官和组织的化学功能，而其他成像技术，例如X射线、CT和MRI，则显示结构。PET和SPECT成像的使用对于鉴定和监测脑部疾病的发展变得越来越有用。在某些情况下，使用PET或SPECT成像可以比症状出现早几年检测到神经退行性疾病。一旦个体被诊断为具有神经元细胞缺陷，例如，由神经变性或损伤引起，则可以考虑用本文所述的基于细胞的疗法治疗个体。
糖尿病
糖尿病(DM)是一组代谢性疾病，其中受试者具有高血糖，或者是因为胰腺不能产生足够的胰岛素，或者是因为细胞对产生的胰岛素没有反应。胰岛素治疗的一个有希望的替代方法是向需要胰岛素的患者提供胰岛细胞。Shapiro等人，N Engl J Med.，343(4):230-8(2000)已经证明，β细胞/胰岛的移植为糖尿病患者提供了治疗。尽管有许多胰岛素类型可商购获得，但这些制剂以注射剂的形式提供。通过转分化将胰腺中分化的非β细胞类型转化为β细胞具有恢复葡萄糖稳态的潜力。重要的是，糖尿病胰腺中的非β细胞仍然以正常甚至增加的数量存在，因此代表了替代β细胞的潜在来源。胰腺来源的MIM细胞可以提供胰岛细胞的替代来源，以预防或治疗糖尿病。例如，MIM-细胞可以被分离并分化为胰腺细胞类型并递送至受试者。或者，可以将MIM-细胞递送至受试者的胰腺并在体内分化成胰岛细胞。因此，这些细胞可用于移植以预防或治疗糖尿病的发生。例如，Naziruddin等人的美国专利号8,637,494中公开了在细胞因子暴露后减轻炎症而不影响胰岛细胞的活力和效力的方法。
组织工程
使用本领域已知的方法，MIM-细胞及其后代可用于制造组织工程构建物。组织工程构建体可用于多种目的，包括作为修复或替换受损器官或组织的假体装置。它们也可用作构建体细胞分泌的蛋白质或其他分子的体内递送系统，或通常用作药物递送系统。组织工程构建体也可用作组织功能的体外模型或用作测试各种治疗或药物效果的模型。最常用的用于干细胞移植的生物材料支架在最常用的用于干细胞移植的生物材料支架中进行了综述，其在Willerth,S.M和Sakiyama-Elbert,S.E.，Combining stem cells andbiomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery(2008年7月9日)，StemBook，编辑，The Stem Cell Research Community,StemBook中进行了综述。组织工程技术经常涉及选择合适的培养基质以维持和促进组织生长。一般来说，这些基质应该是三维的，并且应该是可加工的，以形成目的组织所需形状的支架。
美国专利第6,962,814号大体公开了用于生产组织工程化构建体和工程化天然组织的方法。关于具体实例，授予Vacanti等人的美国专利号7,914,579公开了组织工程化韧带和肌腱。美国专利号5,716,404公开了使用与聚合物基质组合植入的分离的肌肉细胞来重建或增大乳房组织的方法和组合物。美国专利号8,728,495公开了使用自体真皮成纤维细胞修复软骨。Duailibi等人的美国公开申请号20090029322公开了使用干细胞形成用于制造牙齿替代物的牙齿组织。美国公开申请号2006/0019326公开了用于治疗颅内动脉瘤的细胞种子组织工程化聚合物。Atala的美国公开申请号2007/0059293公开了可用于替换受损器官例如肾脏、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、膀胱、输尿管和尿道的组织工程化构建体(和制造此类构建体的方法)。
治疗组合物
如本文所公开的C1-代谢物或MIM-细胞的组合可以配制用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以促进细胞稳态的调节，例如体内或体外/离体去分化。其他因子，例如生长因子、诱导分化或去分化的其他因子、分泌产物、免疫调节剂、抗炎剂、退化因子、促进神经支配、血管化或增强淋巴网络的生物活性化合物，以及药物，可以被掺入。
i.C1-代谢物组合物
可以将有效量的C1-代谢物施用于有需要的受试者以调节受试者的细胞稳态。代谢物可以在药学上可接受的载体中给药，或用于补充饮食。合适的口服剂型包括片剂、胶囊、溶液、混悬剂、糖浆和锭剂。片剂可以使用本领域熟知的压缩或模制技术制备。明胶或非明胶胶囊可以使用本领域公知的技术制备成硬胶囊壳或软胶囊壳，其可以包封液体、固体和半固体填充材料。
可以将一种或多种C1化合物和任选的一种或多种另外的活性剂掺入微粒、纳米颗粒或它们的组合中，以提供化合物的释放，例如延迟、延长、立即或脉冲)。化合物的释放通过药物扩散出微粒和/或聚合物颗粒通过水解和/或酶促降解而降解来控制。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。
在水性环境中缓慢溶解并形成凝胶的聚合物，例如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷，也可以适合作为含有药物微粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酸酐、聚(酯酸酐)、聚羟基酸，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物、聚己内酯及其共聚物、以及它们的组合。可以使用本领域已知的方法制备包括一种或多种C1化合物的纳米颗粒和微米颗粒。可以通过已知的药物制剂技术实现将药物包封或掺入载体材料中以产生含有药物的微粒。在以脂肪、蜡或蜡状材料配制的情况下，通常将载体材料加热到其熔化温度以上并添加药物以形成包含悬浮在载体材料中的化合物颗粒、溶解在载体材料中的化合物或其混合物的混合物。随后可以通过几种方法配制微粒，包括但不限于凝结、挤出、喷雾冷却或水分散体的方法。在优选的方法中，将蜡加热到其熔化温度以上，加入化合物，并且随着混合物冷却，在不断搅拌下使熔融的蜡-化合物混合物凝结。或者，可以将熔融的蜡-化合物混合物挤出并滚圆以形成丸粒或珠粒。这些方法在本领域中是已知的。
对于一些载体材料，可能需要使用溶剂蒸发技术来生产含有化合物的微粒。在这种情况下，化合物和载体材料共溶于互溶剂中，随后可以通过多种技术生产微粒，包括但不限于在水或其他适当的介质中形成乳液，喷雾干燥或通过从本体溶液中蒸发掉溶剂并研磨所得材料。
在一些实施方案中，颗粒形式的化合物均匀地分散在水不溶性或缓慢水溶性材料中。为了使组合物中化合物颗粒的尺寸最小化，可以在配制之前将化合物粉末本身研磨以产生细颗粒。制药领域中已知的喷射研磨法可用于此目的。在一些实施方案中，通过将蜡或蜡样物质加热到其熔点以上并在搅拌混合物的同时加入化合物颗粒，将颗粒形式的化合物均匀地分散在蜡或蜡样物质中。在这种情况下，可将药学上可接受的表面活性剂添加到混合物中以促进活性剂(此处为C1化合物)颗粒的分散。
ii.基于MIM细胞的组合物
MIM-细胞可以通过组合物施用于患者，该组合物包括单独的MIM-细胞群或MIM-细胞后代，或在载体或支持结构之上或之中的MIM-细胞群或MIM-细胞后代。在许多实施方案中，将不需要载体。细胞可以通过注射到需要细胞的部位上或注射进需要细胞的部位上被施用。在这些情况下，细胞通常已被洗涤以去除细胞培养基并将悬浮在生理缓冲液中。
在其他实施方案中，细胞设置有或结合到支持物(support)结构上或内。支持物结构可以是网、固体支持物、支架、管、多孔结构和/或水凝胶。支持物结构可以是整体或部分可生物降解的或不可生物降解的。支持物可由天然或合成聚合物、金属如钛、骨或羟基磷灰石或陶瓷形成。天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸、多糖和糖胺聚糖。合成聚合物包括聚羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚羟基链烷酸酯如聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚酐、聚氨酯、聚碳酸酯和聚酯。这些可以是植入物、管、网状物或水凝胶的形式。
固体支持物
支持物结构可以是松散的织造或非织造网，其中细胞被接种在网中和网上。该结构可以包括固体结构支持物。支持物可以是管，例如用于神经轴突再生的神经管。支持物可以是支架或瓣膜。支持物可以是关节假体，例如膝关节或髋关节，或其部分，其具有允许细胞向内生长和/或将细胞接种到多孔结构中的多孔界面。许多其他类型的支持物结构也是可能的。例如，支持物结构可以由海绵、泡沫、珊瑚或具有内部孔的生物相容性无机结构或交织聚合物纤维的网片形成。这些支持物结构可以使用已知方法制备。
支持物结构可以是具有孔状空腔或空隙的可渗透结构，其成形和支撑水凝胶-细胞混合物。例如，支持物结构可以是多孔聚合物网、天然或合成海绵、或由金属或诸如骨或羟基磷灰石等材料形成的支持物结构。支持物结构的孔隙率应使得养分可以扩散到结构中，从而有效地到达内部的细胞，而细胞产生的废物可以扩散到结构之外。
支持物结构可以被成形为与需要新组织的空间相适应。例如，支持物结构可以被成形为与已经被烧伤的皮肤区域或已经丢失的软骨或骨骼部分的形状相一致。取决于制造它的材料，支持物结构可以通过切割、模制、铸造或产生所需形状的任何其他方法来成型。如下所述，支持物结构可以在用细胞接种或填充水凝胶-细胞混合物之前或之后成型。
合适聚合物的一个示例是polyglactin，它是乙交酯和丙交酯的90:10共聚物，并且制造为VICRYLTM编织可吸收缝合线(Ethicon Co.,Somerville,N.J.)。聚合物纤维(如VICRYLTM)可以编织或压缩成毡状聚合物片材，然后可以切割成任何所需的形状。或者，聚合物纤维可以在将它们浇铸成支持物结构所需的形状的模具中被压缩在一起。在一些情况下，可以在聚合物纤维被模制时将额外的聚合物添加到聚合物纤维中，以修改或赋予纤维网额外的结构。例如，可以将聚乳酸溶液添加到该聚乙醇酸纤维网片材中，并且可以将组合模制在一起以形成多孔支持物结构。聚乳酸结合聚乙醇酸纤维的交联，从而涂覆这些单独的纤维并固定模制纤维的形状。聚乳酸也填充在纤维之间的空间中。因此，孔隙率可以根据引入支持物中的聚乳酸的量而变化。将纤维网模制为所需形状所需的压力可以是相当适中的。所需要的只是将纤维保持足够长的时间以使聚乳酸的结合和涂层作用生效。
替代地或另外地，支持物结构可以包括通过本领域已知的技术生产的其他类型的聚合物纤维或聚合物结构。例如，聚合物薄膜可以通过从聚合物溶液中蒸发溶剂来获得。如果聚合物溶液从具有所需形状的凸纹图案的模具中蒸发，则这些薄膜可以浇铸成所需的形状。聚合物凝胶也可以使用本领域已知的压模技术模制成薄的、可渗透的聚合物结构。
水凝胶
在另一个实施方案中，将细胞与水凝胶混合以形成细胞-水凝胶混合物。水凝胶可通过注射或导管施用，或在植入其他支持物结构时施用。交联可以在施用之前、之中或之后发生。
V.试剂盒
提供了包括本文公开的C1-代谢物和/或C1-MIM的试剂盒。C1-代谢物和/或C1-MIM如上所述。这些可以是具有确定浓度的形式，以促进添加到细胞培养基中以产生所需浓度。该试剂盒可以包括根据要诱导的细胞类型提供所需浓度范围和施用时间的说明。该试剂盒还可以包括与C1-代谢物和/或C1-MIM预混合的细胞培养基，用于培养终末或部分分化的细胞，以诱导去分化成低分化状态和祖细胞样状态，其特征在于减少至少一种至少一种成熟细胞标志物和上调至少一种具有祖细胞状态特征的基因的表达。
通过参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
实施例
实施例1两种细胞身份之间的代谢组学变化
材料和方法
动物
ICR小鼠购自杰克逊实验室。所有小鼠实验均经IACUC委员会批准符合监管标准。
试剂
来自Thermo Fisher Scientific：Neurobasal培养基(Cat.21103-049),DMEMF12(Cat.11330-032),DMEM(Cat.11995-040),MEMα(Cat.12571-048),B27(Cat.17504-044)),N2(Cat.17502-048),MEM-非必需氨基酸溶液(Cat.11140050),rhEFG,(Cat.PH G0311),胎牛血清(Cat.16000-044),GlutaMAX(Cat.35050-061)、STEMPro软骨形成分化试剂盒(Cat.A10069)、Pen-Strep(Cat.15140-122)、TrypLE(Cat.12604021)、β巯基乙醇(Cat.31350010)、胰蛋白酶抑制剂(Cat.17075029)、Maxima HMinus cDNASynthesisMaster MIX(Cat.M1662),LDS样品缓冲液(Cat.84788),Lipofectamine 2000(Cat.11668019),F-10Ham's培养基(Cat.11550043)。
来自FISHER Bioreagents：牛血清白蛋白(Cat.9048-46-8),吐温20(Cat.BP337-500)。
来自Ambion by Life Technologies：TRIZOL(Cat.15596018)。来自InnovativeCell Technologies:Accutase(Cat.AT104)。
来自ScienCell：星形胶质细胞生长补充剂(Cat.1852)。来自BD Bioscience：BDMatrigel Matrix(Cat.354234)。来自Joint Protein Central:hFGF2(Cat.BBI-EXP-002)。来自Reagents Direct:Y27632(Cat.53-B85-50).
来自MILTENYI BIOTEC：LDN193189(Cat.130-106-540)、抗GLAST(ACSA-1)微珠试剂盒(Cat.130-095-825)。
来自Stem Cell Technologies：mTeSRTM1(Cat.85850)，抗粘附冲洗液(Cat.07010)。
来自Tocris：SB 431542(Cat.1614)。来自BIORAD：SsoAdvanced Universal SYBR*Green Supermix(Cat.1725274)。
来自QIAGEN：RNeasy Plus Mini试剂盒(Cat.74106)。
来自Sigma-Aldrich：胰蛋白酶(Cat.T4674)、Tritonx100(Cat.T8787)、DTT 50mM(Cat.Y00147)、聚-L-赖氨酸(Cat.150177)、胶原酶/分散酶(Roche，Cat.10269638001)、胰岛素(Cat.I6634),L-甲硫氨酸(Cat.M5308),L-苏氨酸(Cat.T8441),甘氨酸(Cat.G5417),腐胺二盐酸盐(Cat.P5780),L-半胱氨酸(Cat.C7477),L-精氨酸(Cat.A8094),肌酸(Cat.C0780),D-果糖(Cat.F0127),L-组氨酸(Cat.H5659),L-亮氨酸(Cat.L8912),L-缬氨酸(Cat.V0513),牛磺酸(Cat.T8691)。siRNA寡核苷酸名称：SASI_Mm02_00338586/MAT1A、SASI_Mm02_00338586AS/MAT1A、SASI_Mm02_00295461/MTR、SASI_Mm02_00295461AS/MTR。
来自Cayman Chemical：S-腺苷甲硫氨酸甲苯磺酸盐(Cat.16376)、cAMP(Cat.18820)。
来自OZ Biosciences：磁性板(Cat.MF10000)、Combimag(Cat.CM20200)。
来自ABCAM：甲硫氨酸检测试剂盒(荧光检测)(Cat.ab234041)。
来自Cell Biolabs：S-腺苷甲硫氨酸(SAM)ELISA试剂盒(Cat.STA-672)。
来自Vector：DAPI Vectashield(Cat.H 1200)。
来自Neuvitro：聚-D-赖氨酸盖玻片(12毫米和22毫米)(Cat.H-12-1.5-PDL、GG-22-1.5-PDL)。
细胞培养
NSC的原代培养：NSC来源于14.5天的胚胎的小鼠胚胎皮层(阴道栓被认为是0.5天)。将单细胞悬液接种在经过抗粘附溶液处理的培养皿中，希望Neurobasal培养基补充有1X B27和20ng/mL rh-EGF和h-FGF2。原代神经球在培养5-6天后出现，仅在前10代期间使用。NSC的培养物以200,000个细胞/mL接种并维持在标准条件下。
星形胶质细胞培养：
如本文所述，星形胶质细胞源自出生后的皮质组织或在第二次或第三次传代后从解离的神经球分化。对于出生后星形胶质细胞，从P4小鼠幼崽中分离皮质以获得单细胞，并按照Schildge等人51的描述进行铺板。根据制造商的说明，用抗GLAST(ACSA-1)微珠试剂盒对汇合培养物进行分类。为了诱导NSC的分化，将源自神经球的单细胞暴露于星形胶质细胞培养基。在这两种情况下，使用星形胶质细胞分化培养基(DMEM-F12、10％热灭活FBS、1XB27和1X Glutamax)将细胞铺板在预处理的聚-L-赖氨酸板或聚-D-赖氨酸玻璃盖玻片上。每隔一天更换一次培养基，直到第8天，当60个星形胶质细胞达到免疫细胞化学证实的成熟星形胶质细胞表型时。
神经元培养：
从E14.5小鼠大脑的皮层获得初级神经元。在PBS中2％葡萄糖的冷溶液中进行脑解剖。然后，组织被胰蛋白酶消化，将悬浮液转移到40μm细胞过滤器中以获得单细胞悬浮液。用神经元分化培养基(Neurobasal培养基补充有1X B27和1X Glutamax)以每22mm聚-D-赖氨酸盖玻片800,000个细胞的比例铺板细胞。培养物保持在标准条件下。每隔一天更换一半体积的培养基。在以前的研究中52,53，在铺板后每天通过10μMEdU脉冲跟踪存在于原代培养物中的增殖性神经元祖细胞的消失，发现接种后5天，EdU+细胞的百分比降低到基础水平。此时的神经元被认为是有丝分裂后的。
成人脑组织的原代细胞培养：将来自18.5个月大的成年小鼠的小脑分离，胰蛋白酶消化，并将由此衍生的细胞悬液通过70μm细胞过滤器过滤。使用星形胶质细胞分化培养基将细胞接种在涂有聚-L-赖氨酸的72个培养皿中，如星形胶质细胞培养所述。当细胞以1:3的比例达到90-100％的汇合度时，将细胞传代。在第4至15代使用培养物。专门用于再分化实验，将小脑星形胶质细胞暴露于C1-MIM(参见下面的相应部分)3天，然后切换到NSC培养基中1天；最后，使用广泛的分化培养基(Neurobasal，1X B27、1X N2、1X Glutamax、2.5mM牛磺酸和100μM cAMP)，通过用TrypLE回收细胞并将它们重新接种到聚-L-赖氨酸培养皿(用于下游rtPCR分析)或聚-D-赖氨酸盖玻片(用于免疫细胞化学分析)上重新分化。
胶质母细胞瘤培养：
从小鼠多形性成胶质细胞瘤样肿瘤(小鼠ID 005)(Marumoto,等人Nat.Med.15,110–116(2009))获得的肿瘤细胞用于这些实验。细胞在补充有1X N2、20ng/mL rhEGF、20ng/μL FGF2的DMEM中生长。培养物保持在标准条件下。
软骨细胞的原代培养：
如Gosset等人55所述，从5日龄小鼠的股骨和胫骨髁中分离原代软骨细胞，并以7x10^3细胞/cm2的密度培养过夜。软骨细胞培养基含有DMEM加10％热灭活的FBS和1XGlutamax。第二天用新鲜培养基更换培养基。每隔一天给料一次培养物。
MSC细胞系培养和软骨细胞分化：
MSC从Cyagen(OriCell菌株C57BL/6 88小鼠脂肪来源的间充质干细胞)中获得，在
Figure BDA0003956652560000271
培养基中解冻，并使用MSC维持培养基(α-MEM加10％热灭活FBS和1XGlutamax)进行扩增。MSC细胞通过3D培养系统在所需时间内使用
Figure BDA0003956652560000272
软骨形成分化试剂盒分化成软骨细胞(如相应的图例所示)。简而言之，将2.5x 10^6MSC重新悬浮在软骨细胞分化培养基中并在15mL聚丙烯管中沉淀下来，然后松开盖子，将管放在架子上并在标准条件下孵育。每隔一天更换一半的分化培养基。
成肌细胞系培养和分化：
成肌细胞(来自ATCC的C2C12，CRL 1772)在成肌细胞培养基(含20％FBS的DMEM)中培养至约50％的汇合度。根据生长状态使用TrypLE分离细胞进行传代。对于分化，当培养物完全汇合时，用PBS洗涤，上述成肌细胞培养基用肌纤维分化培养基(DMEM，0.5％ FBS)更换。使用IX51倒置100显微镜(Olympus)监测细胞形态。
成肌细胞原代培养。
从5周大的雌性小鼠中分离出原代成肌细胞。将后肢1骨骼肌切碎并在I型胶原酶和分散酶B混合物中消化。用含有20％FBS的F-10Ham培养基停止消化，从碎片中过滤细胞，离心并在未涂层的培养皿上的生长培养基(F-10Ham's培养基、17％ FBS、4ng/mL FGF2和1％青霉素-链霉素)中放置三天，每106天添加5mL生长培养基。然后收集上清液，离心，用0.25％胰蛋白酶消化。洗去胰蛋白酶后，将原代成肌细胞接种在涂有胶原蛋白的培养皿上，每两天更换一次生长培养基。
小鼠胚胎干细胞培养
ZHBTcH4 ESC通过含有胎牛血清和LIF的标准培养基在涂有明胶的板上培养。对于滋养外胚层分化，ZHBTcH4 ESC在2μg/mL Dox存在下培养以抑制Oct-3/4表达27。
人诱导的星形胶质细胞(iAstrocyte)
首先，为了获得神经前体细胞(NPC)，将人iPSC通过accutase解离成单细胞，以20,000个细胞/cm2的密度接种在基质胶涂层板上，并在含有1:100Rock抑制剂的mTESR1培养基中培养过夜。第二天，将培养基换成补充有小分子SB431542 10μM和LDN193189的1μM N2B27培养基(DMEM/F12、1X N2、1X B27、1X Glutamax、1X NEAA、β116巯基乙醇[1:1000]和25μg/mL胰岛素)。每天更换培养基直至第8天，此时撤出SB431542和LDN193189。在第14天，细胞被解离并进一步保持在高密度，在NPC培养基(DMEM/F12、1X N2、1X B27和20ng/ml FGF2)中的基质胶上生长并每周分裂。其次，对于NPC-星形胶质细胞分化，将NPC以15,000个细胞/cm2的密度接种在含有1:100Rock抑制剂的NPC培养基中的基质胶涂层板上。接种后第二天，将NPC培养基换成星形胶质细胞培养基(2％FBS和星形胶质细胞生长补充剂)。每2天向细胞进料一次，持续30天。培养物以90-95％的汇合度进行传代。
人BJ成纤维细胞
BJ皮肤成纤维细胞从ATCC获得并在补充有10％FBS、1X Glutamax和1X MEM-NEAA的DMEM中生长。上述所有细胞培养物均保持在标准孵育条件下：37℃，5％ CO2，128 95％加湿空气。根据台盼蓝和TC10 129自动细胞计数器(BioRad)的要求确定活力和细胞数。
用代谢物诱导培养基(MIM)处理分化的细胞
在贴壁条件下接种的细胞培养物被保存在它们各自的分化培养基上，直到它们达到成熟的表型(由对每种细胞类型特异的标志物的表达定义)。当培养物达到约80-90％汇合时，去除分化培养基，用PBS洗涤细胞两次并用CI-MIM更换培养基。C1-MIM的组成包括多达6种代谢物(所用组合的详细信息在图例中指定)，包括甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸、腐胺、半胱氨酸[5mM]和S-腺苷甲硫氨酸[0.05mM]，它们溶解在补充有1X B27、1X N2的由DMEM-F12和Neurobasal[1:1]组成的基础培养基(BM)中。由于不存在正常的血清浓度(例如，10-20％)，根据细胞类型使用生长因子FGF2(20ng/mL)或降低浓度的血清(在软骨细胞、星形胶质细胞、神经元中添加FGF2；虽然它不支持成肌细胞的活力，但使用2％的血清代替。类似地，在人类成纤维细胞中，血清的减少就足够了，无需添加任何细胞因子来保持存活的培养物)。在所有情况下，来自同一批次的每个细胞培养物，对照培养物也用PBS洗涤，但在整个处理过程中用它们自己的分化培养基保持。每隔一天向这个模式中的细胞喂养一次。每天监测细胞以证明形态的变化。在开始MIM处理后的第5天或更早收集细胞(在图例中的每个特定情况下表示)用于进一步分析，如每个实验方法的图例所示。收集时培养物的活力通过台盼蓝测量，所有存活细胞超过85％的情况都被处理用于下游分析。
转分化实验加C1-MIM处理
为了将BJ成纤维细胞转分化为神经元，第一种细胞类型用含有多西环素诱导型神经原素(Neurogenin)和rTA3的慢病毒转导。转导后两天，将细胞以所需的密度铺板，并用代谢物混合物(MIM4或MIM6)处理5天，然后加入浓度为0.5μg/mL的多西环素以诱导神经原素3天，然后收集细胞用于RNA分析。方法改编自Busskamp等人56。为了将MSC转分化为肌细胞，我们通过在CAG启动子的控制下将MyoD-2A-GFP cDNA插入AAV载体(AAV2反向末端重复载体)中构建了MyoD过表达AAV载体。重组AAV载体用AAV-DJ衣壳假分型，病毒颗粒按照Salk生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)基因转移靶向和治疗核心的程序产生。我们通过向分化培养基(含2％FBS的DMEM)中添加1x10^9GC AAV-MyoD-2A-GFP和代谢物来启动MSC向肌细胞的转分化。对照细胞仅用1x10^9GC AAV-MyoD-2A GFP处理。在分化后第4、6和8天，用4％PFA固定细胞并进行免疫荧光处理。肌细胞被肌球蛋白重链识别，肌球蛋白重链被MF20标记。
免疫细胞化学
对于NSC、星形胶质细胞、神经元或小脑衍生的细胞，将它们接种在聚-D-赖氨酸盖玻片上，用PBS洗涤，并固定在4％PFA中(15分钟)。样品在5％ BSA+0.02％ TritonX100中渗透并封闭1小时；之后，将一抗溶液加入PBS中，样品在湿室中保存过夜。第二天，用PBS+0.2％吐温20洗涤样品，并用PBS中的二抗溶液孵育1小时。DAPI-Vectashield用于安装样品。对于成肌细胞，固定后，用5％山羊血清、2％175BSA、0.2％Triton X-100和0.1％叠氮化钠的PBS封闭细胞至少1小时；然后将样品与一抗孵育过夜。用PBS洗涤后，将样品与相应的二抗和DAPI在室温下孵育45分钟。使用Zeiss LSM 710激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)获取图像。出于量化目的，从每个样品中获得的至少五张图片，根据DAPI细胞核鉴定的总细胞数计算每个标志物阳性的细胞百分比。图像用NIH ImageJ软件处理。使用的一抗包括SIGMA的抗-β-III-微管蛋白(Cat.T2200)、Abcam的抗-GFAP(Cat.ab4674)、Millipore的抗巢蛋白(MAB353)、DSHB的抗Pax7和抗MF20(Cat.AB_528428和AB_2147781)，Santa Cruz的抗MyoD(Cat.sc-377460)，Cell Signaling的抗Ki67(Cat.12202)，Alexa-Fluor568和488(Cat.A10042、A21134、A11039和A21206)。
通过rt-PCR进行RNA分离和基因表达分析
根据制造商的方案，使用RNeasy Plus Mini试剂盒QIAGEN在指定时间点从培养皿上生长的细胞中分离总RNA，包括使用DNAseI的DNA去除步骤。使用NanoDrop分光光度计(Nanodrop Technologies)评估RNA的量和纯度；使用MaximaTMH Minus cDNA SynthesisMaster Mix，使用至少500ng的总RNA通过逆转录合成cDNA。使用SsoAdvancedTM Universal
Figure BDA0003956652560000302
Green Supermix在CFX384热循环仪(Bio-Rad)上进行的以下qPCR中使用了2.5-10ngcDNA。结果被归一化为至少193个参考基因(β-肌动蛋白、RPL38、GAPDH、Gus、CTCF和Nat1，按图指定)，在一组常见的管家基因中选择它们的稳定性。引物由NCBI/Primer-BLAST引物设计工具设计(表1)。使用2ΔCt 57对结果进行统计分析。结果相对于实验对照的表达值表示。
表1研究中使用的引物列表(除非注明“人”，序列针对小鼠)
Figure BDA0003956652560000301
Figure BDA0003956652560000311
Figure BDA0003956652560000321
敲低实验
根据提供者的说明制备Mtr和Mat1a的小干扰RNA(siRNA)。简而言之，将寡核苷酸在无RNA酶的水中调节至100μM浓度。然后，使用磁转染法(具有Combimag的Lipofectamine)转染在贴壁条件下(在6孔板上)铺板的细胞，并以1mL/孔缩放体积，持续24小时。然后根据实验需要进行收集或分化，如图所示。
甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的相对测量
收集在各自条件下(如图所示)处理的细胞(每个技术重复至少250,000 207个细胞)。将沉淀(Pellet)速冻并储存在LN2罐中直至加工。我们根据试剂盒的制造商说明书裂解和处理细胞沉淀，用于甲硫氨酸定量(甲硫氨酸检测试剂盒，荧光法，Em/Ex：535/587)或SAM定量(S210腺苷甲硫氨酸ELISA试剂盒，比色法，450nm)。
代谢组分析
样品收集：
根据作为NSC、MSC和成肌细胞所需的时间或在它们各自的分化条件期间收集细胞和培养基，以获得指纹(细胞内)和足迹(细胞外)读数。每个样品均来自通过Eppendorf微量管标度测量的100μL质量体积的细胞沉淀。在指定时间后，通过将细胞置于冰床上来停止细胞代谢，在冰床上进行细胞收集。从孔中刮下细胞，在4℃下以300g x 5分钟离心，将沉淀在LN2中快速冷冻，直到
Figure BDA0003956652560000331
公司进一步处理。
在
Figure BDA0003956652560000332
处理样品：简而言之，将样品均质化并进行甲醇萃取，然后分成等分试样，通过超高效液相色谱/质谱(UHPLC/MS)以阳性(两种方法)和阴性(两种方法)模式进行分析。然后通过离子特征与参考库化学标准品的自动比较来识别代谢物，然后进行质量控制的目视检查58。对于统计分析和数据显示，假设任何缺失值都低于检测限。在ArrayStudio(Omicsoft)或“R”中进行统计测试以比较实验组之间的数据；P<0.05被认为是显著的，0.05<P<0.10为有趋势。还计算了错误发现率(Q值)的估计值，以考虑通常发生在基于代谢组学的研究中的多重比较，其中q<0.05用作结果高置信度的指示。
代谢组学模式的测定：
代谢物的相对细胞内丰度被估计为换算的强度(Scaled Intensity)，其中每个值在考虑之前由Bradford蛋白质浓度归一化(n＝5个生物重复)。然后，根据为每种细胞类型确定的收集时间(数据不显示)将每个条件下5个生物复制的换算强度的计算平均值(在轴“y”上)相对于连续的时间尺度(在轴“x”上)进行绘制。通过循环模式分类策略(RecurrentPattern Classification Strategy)根据固定参数对图表进行分类和排序。
富集分析：使用238
Figure BDA0003956652560000341
(www.metaboanalyst.ca)的富集分析工具进行分析，其中我们仅使用239人类代谢组数据库(HMDB ID)识别的代谢物，库路径相关代谢物集240(SMPDB)59)。
热图、层次聚类分析(HCA)、K-means聚类分析和轮廓分析(Silhouette analysis)：
使用的数据对应于来自5个生物学重复的每种代谢物的Bradford归一化中值换算值。如前所述，这些分析是使用MeV软件进行的60。对于代谢物谱的聚类分析，在R中执行k-means算法。简而言之，使用轮廓方法分析每个细胞样品的归一化代谢物值以确定最佳聚类(cluster)数。然后，使用最佳聚类数执行K-means算法，以根据代谢物表达水平的模式对代谢物进行分组。
凹凸图分析。对每种代谢物的Bradford归一化中值换算值的平均值进行分析，以分析每个时间点代谢途径的普遍性。根据
Figure BDA0003956652560000342
数据库提供的超级途径的子途径，根据汇总值分析前20条富集代谢途径。这些图表是使用Excel、GraphPad Prism 8软件、RAW图形软件和Adobe Illustrator获得的。
大量(Bulk)RNA测序
总RNA来源于细胞培养物，并按照制造商的方案使用1mL TRIZOL提取。使用Synergy H1-Biotek测量RNA浓度。使用TapeStation RNA系统(Agilent)确定RNA完整性。使用Illumina TruSeq试剂盒(Cat.20020594)制备cDNA。样品在HiSeq 4000(Illumina)上以单端100bp的形式以生物学一式三份运行。Illumina读数由FastQC质量控制(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)处理，使用Cutadapt工具61修剪衔接头序列，然后使用HISAT2 2.1.062将剩余读数映射到相应的参考小鼠基因组(mm10)。我们使用HTSeq-count(www huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html)从映射读取中量化基因表达，该HTSeq-count获得每个基因映射读取的整数计数。Cufflinks v2.2.1用于获取FPKM表达值，使用库大小分布的自动估计和序列组成偏差校正63。使用R包DESeq2版本1.22.264基于整数计数数据鉴定差异表达的基因，其通过使用负二项分布对计数数据建模来确定268DE，如下所示：首先，计算大小因子以考虑不同样品中的读取总数。其次，为每个基因确定分散参数，它解释了样品之间的生物变异。第三，负二项分布用于拟合每个基因的计数。P值是根据wald检验计算的。使用BenjaminiHochberg程序计算针对多个测试调整的P值，该程序控制错误发现率(FDR<0.05)。火山图基于bcbioRNAseq R包65。对于差异mRNA基因列表，我们使用ToppGene Suite66和基因集富集分析(GSEA)软件36,37测试了每个基因是否在生物过程和分子功能方面都富集了GO术语。对于ToppGene，与与总基因群相关的功能注释术语相比，只有那些与各种差异表达基因集相关的功能注释术语被聚类，这些术语被显著富集(Bonferroni校正，p<0.01)。对于GSEA，我们考虑基于FDR-q值低于0.25的NES的功能富集。
scRNA测序
通过胰蛋白酶消化收获细胞培养物来收集单细胞悬浮液。将细胞洗涤到4℃ PBS中，并通过在4℃下以300g、5分钟旋转来沉淀。该洗涤步骤再重复两次或更多次。最后一次洗涤后，将200μL冷PBS添加到1x10^6个细胞中。对于细胞固定67，滴加800μL甲醇，将样品在-20℃下孵育30分钟，然后在80℃下储存直至进一步处理。固定细胞在冰上平衡5分钟，并在4℃下以1,000g沉淀5分钟。小心去除上清液，将细胞以约1000个细胞/毫升重悬于3X SSC缓冲液中的0.04％BSA、1mM 289DTT、0.2U/mL Rnase抑制剂中。根据制造商的方案，在10x基因组学系统上对细胞进行290个单细胞测序。CellRanger v3.0.2软件用于将读数与星形胶质细胞、MIM-星形胶质细胞和NSC(神经干细胞)数据集的10x Genomics预构建的mm10参考基因组对齐，使用多路分解的默认设置以生成特征条形码矩阵。R包Seurat v3.1.168用于读取和分析特征条码矩阵，步骤如下：首先，我们根据质量控制矩阵图过滤具有独特特征计数的细胞，过滤后，我们具有星形胶质细胞9055个细胞，MIM-星形胶质细胞14911个细胞和NSC8985个细胞；然后，使用默认设置使用NormalizeData函数对UMI计数进行归一化。Seurat的RunUMAP函数用于进行非线性降维和聚类，分辨率设置为0.2。通过Seurat整合分析比对星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞之间或MIM-星形胶质细胞和NSC之间的聚类中差异表达的基因或保守标志物。详细地说，FindIntegrationAnchors函数首先用于基于规范相关分析鉴定代表具有相似生物状态的细胞的锚点；然后，按照Seurat程序包一步一步地进行(所有细胞的)整合分析。对于差异表达的基因，研究使用ToppGene Suite66测试了每个基因是否在生物过程和分子功能方面都富集了GO术语。对于单细胞和大量RNAseq之间的Pearson相关性分析，从匹配比较中考虑了基因表达倍数变化值(logFC)。例如，来自比较NSC与MIM星形胶质细胞的差异表达基因需要：(a)差异表达基因倍数变化值logFC，来自scRNAseq中的聚类比较(如NM4，它比较单细胞数据中的NSC和MIM-星形胶质细胞)，和(b)差异表达基因倍数变化值logFC，来自在(a)中鉴定的基因(即，在NSC和MIM-星形胶质细胞之间)但源自大量RNAseq。对于细胞鉴定分析，从MIM星形胶质细胞的数据集(具有14911个细胞)中提取单细胞转录组。然后，将MIM-星形胶质细胞单细胞转录组应用于http://scibet.cancer-pku.cn/中列出的目的细胞图谱，按照Scibet提供的步骤预测或分类每个聚类中的细胞类型69。最后，对获得的细胞类型进行汇总，其细胞类型预测准确性的概率高于0.8。根据先前针对OSKM处理的星形胶质细胞公开的评估方法，计算了第二个分类系统42。此外，分析了已公开的脑细胞常规基因标志物的基因表达水平，以评估代谢物处理的星形胶质细胞的细胞类型。对于轨迹分析，从MIM-星形胶质细胞的数据集中提取单细胞转录组，并使用如所示的Monocle70,71包进行分析。
使用简并代表性亚硫酸氢盐测序进行甲基化分析
在相应图中所示的时间收集NSC和正在分化的NSC。简而言之，将细胞分离并用10mL冷冻PBS洗涤，然后通过在800g、4℃下离心回收。细胞沉淀(超过5x10^5个细胞)直接在干冰上冷冻并储存在-80℃。下游过程包括gDNA分离、定量、消化、衔接头连接、亚硫酸氢盐329转换、文库生成、下一代测序(使用Illumina平台)和数据分析330由Active Motif,Inc.进行。
组蛋白修饰的量化
从细胞沉淀中酸提取大量组蛋白，丙酰化，并进行胰蛋白酶消化。将组蛋白肽重新悬浮在水中的0.1％TFA中用于质谱分析。在直接与UltiMate3000Dionex纳米液相色谱系统耦合的三重四极杆(QqQ)质谱仪(Thermo Fisher Scientific TSQ Quantiva)上分析样品。对未修饰的和各种修饰的组蛋白肽进行了靶向分析。对于每个样品，整个过程重复三次。使用Savitzky-Golay平滑在Skyline中导入和分析数据。每个修饰都表示为总修饰池的百分比。从组蛋白提取到分析的340过程由Active Motif,Inc.进行。
染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR
使用30μg染色质和4μg H3K27me3抗体(Active Motif，344Cat.39155)进行ChIP反应。随后的qPCR使用一个阳性对照引物对和阴性对照346引物对进行，所述阳性对照引物对针对组蛋白标志物，在目的区域在类似测定(Gapdh，Hoxc10)中运行良好，所述阴性对照346引物对扩增活性基因Actb的启动子区域。对于每个ChIP样品，PCR反应设置一式三份。每个qPCR板还包含输入DNA和用于归一化的标准曲线。归一化数据表示为每1000个细胞检测到的结合事件。从染色质提取到分析的整个过程由Active Motif,Inc.进行。
统计分析
所有数据均显示为平均值±标准差。或S.E.M，如每个附图所示。使用GraphPadPrism软件进行统计。使用双尾t-检验或单因素ANOVA分析两组之间的比较，然后酌情使用Bonferroni或Turkey的事后检验。代谢组分析的统计数据是在Metabolon门户软件(www.portal.metablon.com/en)下获得的。对于转录组分析，使用R软件(R版本3.5.1)进行统计，有关这些分析的其他详细信息在其各自的方法部分中。对于所有实验，P≤0.05的值被认为具有统计学意义。没有使用统计方法来预先确定样品量。实验不是随机的。研究人员在一些但不是所有的实验中是盲法的。
补充信息SI_2
Figure BDA0003956652560000371
的扩展方法
数据集包括已知身份的化合物。在对Bradford蛋白质浓度进行归一化后，对数转换和缺失值(如果有的话)用每种化合物的最小观察值进行填补(imputation)，ANOVA对比和Welch的双样品t检验用于鉴定实验组之间显著不同的生化物质。通过单因素ANOVA分析鉴定了表现出显著组效应的生化物质。
计算错误发现率(q值)的估计值，以考虑在基于代谢组学的研究中通常发生的多重比较。例如，在分析200种化合物时，我们预计会随机看到大约10种满足p≤0.05截止值的化合物。q值描述错误发现率；低q值(q<0.10)表示结果的置信度高。虽然较高的q值表明置信度降低，但并不一定排除结果的显著性。在确定结果是否值得进一步审查时，可能会考虑其他证据。此类证据可能包括a)在研究的另一个维度中的重要性，b)包含在与高度重要的化合物的共同途径中，或c)与其他重要的化合物位于相似功能的生化家族中。有关在
Figure BDA0003956652560000381
执行的程序的进一步说明，请参阅附录。
Metabolon平台附录
样品获取：收到后，对样品进行盘点并立即储存在-80℃。收到的每个样品都被加入Metabolon LIMS系统，并由LIMS分配一个唯一标识符，该标识符仅与原始来源标识符相关联。此标识符用于跟踪所有样品处理、任务、结果等。LIMS系统跟踪样品(和所有衍生的等分试样)。创建新任务时，LIMS会自动为任何样品的所有部分分配其自己的唯一标识符；还跟踪了这些样品的关系。在处理之前，所有样品都保持在-80℃。
样品制备：使用Hamilton Company的自动化MicroLab
Figure BDA0003956652560000382
系统制备样品。出于QC目的，在提取过程的第一步之前添加了几种回收标准。为了去除蛋白质，解离与蛋白质结合或捕获在沉淀蛋白质基质中的小分子，并回收化学上不同的代谢物，用甲醇在剧烈摇动下沉淀蛋白质2分钟(Glen Mills GenoGrinder 2000)，然后离心。将得到的提取物分成五个部分：两个用于通过两种单独的反相(RP)/UPLC-MS/MS方法进行分析，采用正离子模式电喷雾电离(ESI)，一个用于通过RP/UPLC-MS/MS进行分析，采用负离子模式ESI，1个用于HILIC/UPLC-MS/MS分析，采用负离子模式ESI，以及1个样品留作备份。将样品短暂放置在
Figure BDA0003956652560000392
(Zymark)上以去除有机溶剂。在准备分析之前，样品提取物在氮气下储存过夜。
QA/QC:与实验样品一起分析了几种类型的对照：通过抽取少量每个实验样品(或者，使用特征良好的人体血浆池)生成的混合矩阵样品，作为整个数据集的技术重复；提取的水样作为工艺空白；并且将精心挑选的不干扰内源性化合物测量的QC标准混合物加标到每个分析的样品中，以实现仪器性能监测和辅助色谱校准。表2和表3(如下)描述了这些QC样品和标准品。通过计算在注入质谱仪之前添加到每个样品中的标准品的中值相对标准偏差(RSD)来确定仪器变异性。通过计算100％合并基质样品中存在的所有内源性代谢物(即非仪器标准品)的RSD中值来确定总体工艺变异性。实验样品在平台上随机运行，QC样品在进样之间均匀分布。
表2 Metabolon QC样品说明
Figure BDA0003956652560000391
表3 Metabolon QC标准品
类型 描述 目的
RS 回收标准品 评估变异性并验证提取和仪器的性能。
IS 内部标准品 评估仪器的变异性和性能。
超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)：所有方法均使用Waters ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精确质谱仪，与加热电喷雾电离(HESI-II)源和Orbitrap质量分析仪连接，以35,000质量分辨率运行。将样品提取物干燥，然后在与四种方法均兼容的溶剂中复溶。每种复溶溶剂都含有一系列固定浓度的标准品，以确保进样和色谱的一致性。使用酸性正离子条件分析一个等分试样，并针对更亲水的化合物进行色谱优化。在该方法中，使用含有0.05％全氟戊酸(PFPA)和0.1％甲酸(FA)的水和甲醇，从C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1x100mm,1.7μm)梯度洗脱提取物。另一个等分试样也使用酸性正离子条件进行分析；然而，它针对更疏水的化合物进行了色谱优化。在该方法中，使用甲醇、乙腈、水、0.05％ PFPA和0.01％ FA从相同的上述C18柱中梯度洗脱提取物，并在总体较高的有机物含量下操作。使用单独的专用C18色谱柱，使用基本负离子优化条件分析另一个等分试样。使用甲醇和水从色谱柱上梯度洗脱碱性提取物，但使用pH 8的6.5mM碳酸氢铵。在从HILIC柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1x150 mm,1.7μm)洗脱后，使用由水和乙腈和10mM甲酸铵组成的梯度，pH 10.8，通过负电离分析第四个等分试样。MS分析使用动态排除在MS和数据相关的MSn扫描之间交替进行。多个方法之间的扫描范围略有不同，但覆盖了70-1000m/z。原始数据文件按如下所述进行存档和提取。
生物信息学：信息学系统由四个主要组件组成：实验室信息管理系统(LIMS)、数据提取和峰鉴定软件、用于QC和化合物鉴定的数据处理工具，以及供数据分析师使用的一系列信息解释和可视化工具。这些信息学组件的硬件和软件基础是LAN骨干网和运行Oracle10.2.0.1企业版的数据库服务器。
LIMS:Metabolon LIMS系统的目的是通过一个安全、易于使用和高度专业化的系统实现完全可审计的实验室自动化。Metabolon LIMS系统的范围包括样品获取、样品制备和仪器分析和报告以及高级数据分析。所有后续的软件系统都以LIMS数据结构为基础。它已经过修改，以利用内部信息提取和数据可视化系统以及第三方仪器和数据分析软件并与之交互。
数据提取和化合物鉴定：使用Metabolon的硬件和软件对原始数据进行提取、峰鉴定和QC处理。这些系统建立在利用Microsoft.NET技术的Web服务平台上，该平台在聚类中的高性能应用服务器和光纤通道存储阵列上运行，以提供主动故障切换和负载平衡。通过与纯化的标准品或重复出现的未知实体的库条目进行比较来鉴定化合物。Metabolon维护一个基于经证实的标准品的库，其中包含库中所有分子的保留时间/指数(RI)、质荷比(m/z)和色谱数据(包括MS/MS光谱数据)。此外，生化鉴定基于三个标准：建议鉴定的窄RI窗口内的保留指数、与库的精确质量匹配+/-10ppm，以及实验数据与真实标准之间的MS/MS正向和反向分数。MS/MS分数基于实验光谱中存在的离子与库光谱中存在的离子的比较。虽然基于这些因素之一，这些分子之间可能存在相似之处，但可以利用所有三个数据点来区分和区别生化物质。超过3300种商业上可用的纯化标准化合物已被获得并注册到LIMS中，以便在所有平台上进行分析，以确定它们的分析特性。已经为结构上未命名的生化物质创建了额外的质谱条目，这些生化物质已根据它们的重复性质(色谱和质谱)而被鉴定。这些化合物有可能通过未来获得匹配的纯化标准或通过经典结构分析来鉴定。
策展(Curation)：进行了各种策展程序，以确保提供高质量的数据集用于统计分析和数据解释。QC和策展过程旨在确保准确和一致地鉴定真正的化学实体，并去除那些代表系统伪影、错误分配和背景噪音的实体。Metabolon数据分析师使用专有的可视化和解释软件来确认各种样品之间峰鉴定的一致性。为每个样品检查每个化合物的库匹配，并在必要时进行校正。
代谢物量化和数据归一化：使用曲线下面积对峰进行量化。对于跨越多天的研究，执行数据归一化步骤以校正仪器日间调整差异导致的变化。本质上，通过将中位数登记为等于一(1.00)并对每个数据点按比例归一化(称为“块校正”)在运行日块中校正每种化合物。对于不需要超过一天分析的研究，除了数据可视化的目的，没有归一化是必要的。在某些情况下，生化数据可能已经被归一化为一个额外的因素(例如，细胞计数、通过Bradford测定法确定的总蛋白、渗透压等)，以解释由于存在于每个样品中的物质数量的差异而导致的代谢物水平的差异。
补充信息SI_4
关于C1-MIM混合物浓度定制的表现(manifest)
在第二代和第四代之间，在成熟星形胶质细胞的原代培养物中进行混合物定制。这些细胞在传代前至少保持培养8天。我们在开始实验之前通过免疫细胞化学证实了Gfap的表达(图1G)。我们在无血清培养基(基础培养基，BM)中测试了不同浓度的单个代谢物。BM含有等量的DMEM-F12和Neurobasal，以及1X的补充物N2和B27。添加了有关特定分子的注释。毫摩尔浓度的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对星形胶质细胞是致命的，这与该代谢物相比其他代谢物通常发现的较低生理浓度一致。
半胱氨酸对氧化高度敏感，表现为白色片状沉淀，为此制备了溶解在ddH2O中的高浓度原液[2500mM]，pH为微酸性(5.5-6)。我们证实，在用含有半胱氨酸稀释溶液的混合物处理之前和之后，体外维持的细胞的pH值始终接近7.4。
仅出于定制目的，我们观察了Gfap、cMyc和Nestin的相对基因表达相对于C1-MIM每种成分的浓度范围的暴露(图1H)。Gfap表达是参考性状，因为它是星形胶质细胞的主要标志物。Nestin和cMyc与前体阶段或神经干/祖细胞更相关。仅以观察趋势以选择适当浓度为目标进行此基因表达的跟踪，即与对照相比，不致死且对基因表达有明显效果。
因为加入了生长因子FGF2来提高存活率，我们也做了不同浓度FGF2的曲线；值得注意的是，选择的20ng/mL浓度不会抑Gfap，较低的浓度甚至会增强Gfap的表达(这种效果不同于C1-MIM混合物抑制Gfap表达的整体效果)。
因为单独的代谢物在从低到高的浓度范围内表现出类似的效果，所以我们随后测试了组合效应。正如我们推测潜在的最佳结果可能来自对成熟标志物的抑制，我们观察Gfap和Cd44作为参考。我们测试了1mM、2.5mM和5mM的所有元素的混合物，但SAM除外，SAM分别以0.1mM、0.25mM和0.5mM提供(即，与其他代谢物相比，浓度低10倍)。这种混合物代表了具有6种代谢物的C1-MIM_6(图1I)。正如所观察到的，尽管1mM的范围与腐胺或苏氨酸等单独的代谢物抑制了Gfap，但当它们组合添加时，协同结果并没有抑制Gfap，甚至增强了Cd44的表达。从这些读数中，我们为所有代谢物选择了5mM的浓度，除了以0.5mM添加的SAM。我们评估了6种代谢物的C1-MIM与消除SAM(高浓度致死成分)和半胱氨酸(具有较高氧化敏感性的成分，但也是唯一以剂量方式增强Gfap表达的成分)。该混合物代表具有4种代谢物的C1-MIM_4。对于星形胶质细胞，不含SAM或半胱氨酸的组合对Gfap标志物的抑制作用更大(图1J)。然而，我们决定在其他细胞的实验中测试这两种组合。
我们还观察到，当应用于来自不同来源(来自胚胎、出生后或成人脑，如图1I-J中观察到的Gfap抑制)的成熟星形胶质细胞时，C1-MIM效应的幅度不同。最后，我们评估了添加与C1代谢无关的代谢物(包括精氨酸、肌酸、果糖、组氨酸、亮氨酸和缬氨酸)的干扰条件(scramble condition)作为6种代谢物的干扰混合物(以5mM添加)(即，与C1-MIM相似的浓度)的效果(数据未显示)。干扰-混合物(Scramble-cocktail)并没有降低Gfap的表达。
结果
开创性的代谢组学分析表明，不同的细胞类型显示出独特的代谢特征。这些研究主要集中在稳态条件，例如干细胞/祖细胞和完全分化细胞之间的比较2,8,9。这些实验设计可能会错过与(或可能驱动)从一种细胞表型到另一种细胞表型的最早过渡步骤相关的关键代谢变化。在这里，在三种不同的多能干细胞类型(成肌细胞(MB)、神经干细胞(NSC)和间充质干细胞(MSC))中检查了体外细胞分化早期发生的代谢组学变化，并揭示了与驱动细胞分化所必需的转录程序过渡相关的特定代谢物波的存在。重要的是，本文的研究表明，这一波中的代谢物会在成熟分化的细胞上诱导一个可塑性窗口，使它们能够改变其身份。总之，这些结果有助于阐明代谢组在细胞分化早期的作用，并揭示代谢物诱导细胞可塑性和重新编程细胞命运的必要性和充分性。
多能干细胞诱导分化后的即时代谢反应
为了鉴定细胞分化早期阶段的代谢组学特征，三种成熟的分化模型：1)MB分化为肌纤维，2)NSC分化为星形胶质细胞，3)MSC分化为软骨细胞被选择和研究。MB、NSC和MSC的代谢组在其初始稳态期间进行了分析，然后在细胞分化诱导后的关键时间点进行了分析，特别是当原始细胞开始失去转录祖细胞特征并获得早期分化标志物时(图1A；见下文讨论SI-1a)。测量了每个祖细胞的选定标志物和分化衍生物(肌纤维、星形胶质细胞和软骨细胞)的最早标志物的表达变化。对于MB和NSC，早在分化诱导后1-3小时就观察到基因表达的变化，在6-12小时后检测到分化的特征性标志物。对于MSC，标志物的变化在24小时后更为明显(图1B-D)。因此，3-12小时的时间窗被认为是MB和NSC分化的中间转录阶段；而对于MSC，此窗口跨越6-36小时。此外，MB中的大量转录组观察证实了在这个早期窗口中代谢基因的上调(数据未显示)。因此，基于基因表达分析，选择时间来分析参与细胞开始分化的过渡阶段的代谢组。然后使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)平台对中间转录阶段的600多种代谢物进行全面鉴定和定量。评估了每种已鉴定代谢物的丰度变化，并使用层次聚类分析和主成分分析(PCA)计算样品之间的相似性(数据未显示)。虽然每个祖细胞的代谢组与其分化的对应物分离良好，但乍一看，中间阶段时间点的数据似乎散布在不同群体中，没有可见的模式(数据未显示)。因此，观察到个体代谢物动力学。开发了一种策略，通过跟踪它们随时间的相对平均丰度来关联循环模式(recurrent pattern)。对于正在分化的每种细胞类型(MB、NSC和MSC)，循环模式策略将不随时间变化的代谢物与丰度显示累积、减少、U形或波形模式的代谢物分开(图1E)。波形模式将其表达水平主要在中间转录阶段增加的代谢物分组(数据未显示)。这些波形代谢物是令人感兴趣的，因为它们代表了负责驱动两个不同细胞身份之间的过渡阶段的潜在候选物(参见下面的讨论SI-1b)。重要的是，从表现出波动样丰度模式的代谢物的富集分析显示，与其他丰度模式相比，所有三细胞类型的共性更多(数据未显示)。尽管不同细胞系统之间的初始代谢组学谱、转录特征、培养基和分化时间过程存在差异，但这种相似性仍然存在。此外，有监督的K-means聚类分析被用作根据代谢物水平对代谢物进行分组的替代策略。对于每个谱系，一个聚类显示出与循环模式分析相似的结果(数据未显示)。总之，对单个代谢物的丰度模式进行了分析，并确定了细胞分化早期代谢途径的潜在变化，这与细胞身份中转录变化的紧急情况一致。
一碳代谢波与分化细胞的早期转录变化相吻合
来自循环模式策略和K-means聚类的观察结果表明，在不同细胞类型的早期和中间转录阶段存在甲硫氨酸相关途径。支持这些观察，在波形模式代谢物富集的交叉点(代表过渡)，而不是在减少或累积模式富集(代表稳态)的交叉点的细胞类型之间发现了更多的共性(数据未显示)。在所有探究的细胞谱系中，甲硫氨酸和精胺-亚精胺代谢是早期波形-模式交叉点所独有的。甲硫氨酸参与途径的复杂相互作用，并与一碳(C1)代谢网络中的精胺-亚精胺代谢相关联22。(图2A；图2B)。因此，我们探究了分化诱导后3-6小时C1代谢物的变化。
例如，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，C1代谢的核心产物24,25，在测试细胞类型的中间阶段全局地增加(图2C)。总体而言，在所有分析的细胞类型中，在过渡期观察到与C1代谢相关的代谢物增加(图2B；数据未显示)。甲硫氨酸代谢与胚胎干细胞(ESC)的稳态有关26；但是，它目前与源自ESC的过渡状态无关。这些结果表明，在分化事件的早期过渡阶段，一碳代谢物可能会增加，甚至达到比正常ESC状态下表征更高的水平。为了证实这一假设，使用了ZHBTc4 ESCs，一个表征良好的细胞系或有效的滋养外胚层分化27。结果表明，在整个滋养外胚层分化的过渡阶段，甲硫氨酸和SAM的相对水平有所增加(图2H-I；讨论SI-1d)。总之，结果表明保守的C1波与这里研究的所有细胞类型的身份变化的开始一致(图2D)。如果这种C1波对于细胞身份转换是必不可少的，它的破坏可能会导致稳态维持和预防或延迟细胞身份变化。为了确定这种必要性，在三种多能细胞模型(MB、NSC和MSC)中，催化高半胱氨酸产生甲硫氨酸的酶甲硫氨酸合酶(MTR)被敲除；然后，诱导它们的分化。这种干预降低了甲硫氨酸水平，并引起了每种细胞类型中选择的多能性标志物的增加，而此时这些标志物在正常分化条件下高度降低(图2E-G，图1B-D)。总之，这些结果证明了C1波是进行正常细胞分化所必需的。在分化开始后的过渡阶段，一碳代谢物的增加可能与它们参与甲基化反应有关24。因此，甲基化谱应该具有与转录阶段重叠的基本重组。因此，进行简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)以探究分化开始时NSC中甲基化谱的动态(数据未显示)。随着分化的进行，观察到甲基化增加(图2J)。从总共鉴定的15170个启动子中，我们考虑了甲基化低于25％和高于75％的位点，以比较NSC稳态和诱导分化后的条件(3小时和24小时)。接下来，我们检测了每种条件下仅具有低甲基化或高甲基化的基因，并进行了功能富集分析。结果表明，在NSC稳态期间，细胞周期相关基因座的甲基化低于25％，但在诱导分化后仅3小时，主要差异发生在与转录调控和甲基化相关的位点(图2L-M)。值得注意的是，除了甲基化酶(例如，SET和EZH2)和谱系区分符(specifier)(例如，Notch和Hes5)外，与NSC状态或分化后24小时相比，与一碳相关的关键基因座在3小时发生差异甲基化(图2K)。因此，一碳代谢物可用性的短暂增加可以作为用于反应的代谢供体的来源，一方面导致维持原始细胞身份所需的基因沉默，另一方面导致激活通过表观遗传调控的细胞谱系区分符。与转录组水平相比，在过渡状态下对代谢组学和甲基组学水平的探究较少。分化NSC的转录动力学的数学模型表明，处于过渡状态的细胞在选择的基因中表现出振荡表达峰28-30。例如，在NSC中，Notch/Hes5信号传导控制分化31，32，Hes5在过渡阶段具有表达的振荡峰29。我们在我们的NSC分化模型(讨论SI-1e)中证实了Hes5振荡。此外，我们观察到参与一碳网络的Mat1a和Odc1酶可能具有类似的行为(图2L；讨论SI-1e)。因此，不仅基因表达的水平，而且基因表达的短期动态都携带了细胞状态过渡的基本信息。总之，鉴定出的代谢物波在时间上与甲基学组和转录动力学重叠，这可能代表细胞可能更容易受到信号影响的状态，从而为它们提供了执行细胞命运决定的能力。
一碳代谢物重编程分化细胞的基因表达和表型
在上述部分中，我们证明了当细胞退出其稳定状态并进入分化过程时会发生保守的C1波。为了确定人工补充C1代谢物在多大程度上促进表型转化(即重编程细胞身份)，我们用关键的C1代谢物(即甲硫氨酸、SAM、苏氨酸、甘氨酸、腐胺和半胱氨酸)处理分化的稳态细胞(数据未显示)。有关培养基和代谢组合物的详细信息，请参阅讨论SI-1f和SI_4。我们通过在不含血清或减少血清并补充C1代谢物组合物的培养基中培养几种类型的分化细胞，部分模拟了C1代谢物波。我们将这些混合物称为C1-代谢物诱导培养基(C1-MIM)。培养基中补充了成纤维细胞生长因子2(FGF2)以仅在完全血清消除的情况下维持细胞存活(因为这将在48小时后诱导细胞死亡)33,34。血清减少(或消除)以及FGF2在基础培养基中的单独作用作为对照(SI_4)进行了评估。作为质量控制，我们确认所有裂解用于下游分析的细胞样品在收集时具有至少85％的细胞活力。向分化的小鼠细胞(包括软骨细胞、星形胶质细胞、神经元和肌纤维)或分化的人类细胞(成纤维细胞和星形胶质细胞)中添加C1-MIM会导致形态变化和成熟细胞标志物表达持续下降(图2M-P；图4A-E)。我们从未检测到多能性基因Oct4的表达，但我们观察到一些与它们各自的祖细胞状态相关的基因的表达增加(图4F-J)。总的来说，这些结果表明，用C1代谢物处理通过减少与分化细胞类型相关的标志物和诱导其各自祖细胞状态的基因特征来改变细胞身份，进一步支持一碳代谢物在诱导过渡态中的作用。
一碳代谢物的补充诱导前体样状态
我们利用我们的NSC/星形胶质细胞模型来确定C1-MIM暴露对分化细胞的分子和表型影响。除了NSC、星形胶质细胞和C1-MIM处理的星形胶质细胞(MIM星形胶质细胞)外，我们还在这个比较中包括胶质母细胞瘤细胞(GB)作为对照，因为癌细胞依赖于C1代谢35。大量RNA测序(RNAseq)分析表明，MIM星形胶质细胞与亲本星形胶质细胞相比与NSC更相似，并且与GB样品分离得很远，如在PCA和欧几里德距离图(Euclidean-distance map)中观察到的那样(图3a-b)。此外，对NSC、星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞之间差异表达基因(DEG)的比较表明，67.7％的C1-MIM下调基因在星形胶质细胞中高表达，在NSC中下调。此外，由C1-MIM上调的61％的基因在NSC中高度表达(数据未显示)。然后，我们利用基因集富集分析(GSEA)36,37、K-means聚类和基因本体论(GO)分析，深入了解C1-MIM的生物学效应。通过GSEA，我们获得了由C1-MIM上调和下调的前20个基因集。大多数基因集上调(20个富集中的13个)与细胞周期相关，这是一个参与细胞命运规范和重编程的众所周知的参数。与胶原形成过程相关的基因集下调。对胶原蛋白的影响可以解释这些细胞表现出的形态变化(图3C；数据未显示)。正交地，k-means聚类分析显示与GSEA一致的结果(495个与细胞周期相关的基因和524个与细胞结构和运动相关的基因分别在MIM星形胶质细胞中上调和下调)(数据未显示；SI_7)。最后，我们分析了在C1-MIM-星形胶质细胞、NSC和星形胶质细胞之间的比较中鉴定的DEG之间的重叠程度。DEG重叠的GO分析显示C1-MIM处理：1)调节参与代谢过程的基因，2)调节参与细胞周期的基因，以及3)产生类似于NSCs但神经发生能力可能较低的细胞群(数据未显示；图5A；讨论SI-1g)。大量转录组分析鉴定了群体水平的基本C1-MIM效应，但它们可以掩盖单个细胞的差异反应。因此，我们使用10x Genomics单细胞平台分析了9000–14,000个单细胞的转录组。MIM-星形胶质细胞i中的基因表达、每个聚类中星形胶质细胞标志物的细胞数百分比和每个聚类的GO分析在图5B-D中。为了给我们的结论提供稳健性，我们证实了星形胶质细胞和NSC特异性标志物的表达水平在scRNAseq和大量-RNAseq数据集之间一致，计算相关系数(图6A-F；讨论SI-1h)。统一流形逼近和投影(UMAP)分析显示星形胶质细胞分为两个聚类，而MIM-星形胶质细胞和NSC分别以相同的分辨率(r＝0.2)分为五个和四个聚类(数据未显示)。这种分离可能意味着MIM处理诱导细胞状态的异质性，如NSC39,40中存在的细胞状态(数据未显示)。为了鉴定1)MIM-星形胶质细胞和亲本星形胶质细胞或2)MIM-星形胶质细胞和NSC之间的这些潜在共享细胞状态，我们进行了Seurat的整合分析(数据未显示)。这种整合鉴定了不同数据集中的锚点，这些数据集代表基于规范相关分析共享生物状态的细胞41。整合分析揭示了比我们独立的UMAP观察更清晰的C1-MIM处理效果。对于1)MIM-星形胶质细胞和亲本星形胶质细胞的整合，聚类AM0代表大多数星形胶质细胞(97.3％)。该聚类在MIM-星形胶质细胞中减少到6.7％(即，只有6.7％的星形胶质细胞不受C1-MIM的影响)。相比之下，聚类AM1代表2.86％的星形胶质细胞和32.51％的MIM-星形胶质细胞。聚类AM2-AM5仅在MIM-星形胶质细胞中被鉴定，表明它们在C1-MIM处理下比未处理的星形胶质细胞获得了更多可鉴定的状态(数据未显示)。然后，我们通过聚类比较分析了星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞之间的DEG，以深入了解C1-MIM的生物学效应(图6G-G)。在聚类AM0中，DEG很少，大多数下调基因是星形胶质细胞标志物。聚类AM1包括一个群体，其中星形胶质细胞标志物如Gfap和Aqp4低水平表达，而NSC前体基因如Hes5和Ascl1高水平表达。其余聚类的基因本体分析得出结论，参与细胞周期的基因与这些新的C1-MIM驱动表型的获得有关。相比之下，对于2)MIM-星形胶质细胞和NSC整合，群体表现出非常相似的聚类模式(数据未显示；图7A-F)。尽管有这些相似之处，但还是出现了一些差异(图7G-K；讨论SI-1i)。值得注意的是，与其他聚类相比，聚类NM4的细胞数量和DEG均有所增加。该聚类在NSC中受到限制，但在MIM星形胶质细胞中强烈增强，表明C1-MIM处理后特征增强(数据未显示)。此外，聚类NM4的DEG在功能上与细胞周期的调节相关(图7K)。有趣的是，MIM星形胶质细胞与四因子重编程的星形胶质细胞42共享这种细胞周期特征，这与以下认识一致，即细胞周期的调节是细胞命运规范和重编程过程中对细胞状态变化的立即反应之一38,43(数据未显示；讨论SI-1j)。MIM-星形胶质细胞与NSC的相似性高于其亲代星形胶质细胞；尽管如此，MIM细胞仍然显示出与NSC的差异。因此，我们基于细胞图谱SciBet和Panglao DB对它们的身份进行了表征。两个训练数据集的结果均证实MIM星形胶质细胞保持其神经外胚层身份(图8A)并支持与放射状胶质细胞和神经上皮细胞兼容的异质性。尽管如此，它们仍然保留了一小部分星形胶质细胞的身份(图3D；图8B)。因此，在MIM星形胶质细胞中观察到的不同细胞聚类可以反映在该细胞谱系中具有不同定型水平的异质群体(讨论SI-1k)。细胞之间基因表达的差异可能是由于对外部C1 MIM刺激物的动态反应所致。因此，我们进行了轨迹分析以解决跨细胞的这种动态响应。该分析揭示了MIM细胞在伪时间内发生的转录重组，即，不是将MIM细胞分成聚类，而是沿着代表处理依赖性变化进展的连续路径计算分配细胞44。我们发现MIM星形胶质细胞位于五个瞬态状态，其中两个潜在的决策点通过分支轨迹显示。分支-1差异表达基因主要与核糖体活性和线粒体翻译过程相关，而分支-2差异表达基因与细胞周期功能相关(数据未显示；图8C-D；讨论SI-1l)。C1-MIM对细胞周期的影响可以概括成人大脑中天然NSC激活所见的细胞轨迹。NSC激活的这一轨迹始于被认为是室管膜星形胶质细胞亚型的细胞，这些细胞在连续阶段差异上调细胞周期基因以产生成神经细胞群39。因此，C1MIM处理将终末分化细胞转变为中间祖细胞样状态，可能与激活的成人NSC具有相似的机制。
一碳代谢物增加组蛋白乙酰化并重新配置甲基化模式
一种碳代谢参与甲基化是有据可查的6,24。我们在最近的转录组数据和其他分析中探究了甲基化相关的C1-MIM效应，包括组蛋白修饰的鉴定，以及目的基因启动子处的蛋白质-DNA相互作用。首先，在转录组水平上，GSEA揭示了前20组上调基因之一，与MIM星形胶质细胞中的DNA甲基化功能相关(图9A)。我们还检查了众所周知的组蛋白修饰基因的表达水平。我们发现，与去甲基化相关基因相比，MIM星形胶质细胞优先表现出甲基化相关基因表达增加(图9B)。接下来，通过质谱，我们测量了C1-MIM处理诱导的组蛋白修饰相对丰度的变化。我们确定了星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞之间不同的27个组蛋白修饰标记(包括乙酰化、甲基化和未标记的组蛋白)。大多数组蛋白乙酰化标记在nMIM星形胶质细胞中比在星形胶质细胞中更丰富，这意味着C1-MIM处理诱导的染色质结构更加松弛。而组蛋白甲基化标记，取决于位点，影响转录激活和抑制两者(图9C)。因此，我们详细考虑了这些甲基化标记的位点。MIM星形胶质细胞中的大多数组蛋白甲基化标记发生在组蛋白-3K27和K36中，它们分别是甲基转移酶Ezh2和Set的靶标。此外，根据基因表达读数，C1-MIM导致Ezh2的上调高于Set基因(图9C；另见SI_1m，有关Suv39h的注释)。因此，H3K27甲基化产生的抑制性标记成为探究机制见解的理想候选者。最后，通过Gfap启动子中H3K27的染色质免疫沉淀，我们得出结论，MIM星形胶质细胞中Gfap表达的丧失可能与H3K27甲基化的增加有关。相反，Hes5表达的增加可能依赖于相应启动子中抑制标记的减少(图9D-G)。有趣的是，先前的研究表明，由Ezh2酶介导的H3K27甲基化在代谢基因的多能ESC中具有优先富集，并且它可能在设置导致代谢重编程的转录开关中起重要作用45。总之，结果证明307C1-MIM增加了参与甲基化反应的酶的表达，重组了组蛋白修饰的景观，并通过增加乙酰化标记来促进染色质的松弛状态。
补充一碳代谢物对细胞身份转变的适用性
最后，我们用细胞命运开关挑战了C1-MIM的适用性。天然NSC的一个属性是形成神经球的能力。为了在功能上表征C1-MIM是否可以重现(recapitulate)这种表型，我们从1.5岁小鼠大脑的非神经源性区域中分离出小脑细胞，并将它们暴露于C1-MIM。然后将这些MIM星形胶质细胞和未处理的对照转换为NSC培养基。与未经处理的星形胶质细胞不同，MIM星形胶质细胞在24小时内产生神经球样结构(图10A)。这些MIM-星形胶质细胞衍生的神经球含有Nestin+和Ki67+细胞，它们是获得NSC样特征的指标(数据未显示)。此外，暴露于广泛分化培养基的MIM星形胶质细胞衍生的NSC，表达神经元和少突胶质细胞的标志物，以及Gfap和其他星形胶质细胞标志物的恢复，表明获得了多能性(数据未显示，图10C-C)。尽管MIM星形胶质细胞很快形成了类似神经球的结构，但它们的传代能力仅限于三次传代，而天然NSC并非如此。因此，MIM星形胶质细胞在功能上类似于NSC，但仍然与天然的不同(讨论，SI-1n)。尽管有这些限制，C1-MIM处理揭示了一种过渡状态的诱导，具有足够的可塑性，可以重新获得一些NSC性状。因此，C1-MIM的潜在应用可能涉及促进过渡阶段可能有利于细胞身份变化的示例，例如转分化过程。为了支持这一概念，我们证明在转导MSC中的MyoD(产生肌纤维)或成纤维细胞中的神经原素(Neurogenin)(产生神经元)之前添加C1-MIM增加和/或加速了新身份的获得(数据未显示，图10D-H)。尽管C1-MIM-混合物的效果并不能完全重现在正常分化过程中发现的天然C1波。(即细胞代谢组在过渡阶段精心策划的调节)这里描述的C1-MIM代表了通过使用代谢物诱导细胞身份过渡的新方向。这项工作追踪特定代谢物与细胞身份早期变化之间的关系。我们在几种多能干细胞类型的细胞分化的最初阶段发现了一波C1代谢物。这一波可能代表了过渡态的代谢组学属性，这是一个被多个理论生物学报告46,47认可的阶段，并且主要在转录组水平上进行了探究。C1代谢物可能在涉及细胞身份和细胞可塑性变化的广泛环境中发挥保守作用。虽然不受理论的束缚，但C1代谢物的快速增加可能会为转录网络的失活或激活提供细胞内环境，例如调节细胞周期的途径，并提供能够实现特定表观遗传调节的底物48-50，从而有利于细胞易于做出命运决定的可塑性状态。事实上，向完全分化的细胞提供C1相关代谢物会导致部分转化为祖细胞样状态。本文公开的观察结果支持补充生理效应物，如本文所述的代谢物，可能代表诱导细胞的替代策略。
讨论SI
1a:“稳态”是指一个细胞保持相同身份的时间(即具有作为该细胞类型特征的新陈代谢和转录程序)。每个稳态都需要根据其功能(即维持其稳态)的特定代谢需求。例如，与分化细胞相比，干细胞的需求意味着更高的合成代谢需求，并且通常与糖酵解代谢相关72-75。在与氧化代谢相关的分化细胞中，与有丝分裂后的细胞相比，增殖细胞在生物合成中对NADPH和ATP的需求更高8,72。从这个意义上说，稳态的例子是多能性干细胞、多能干细胞和从每个谱系分化的每个细胞亚型。
将细胞命运决定视为转录因子的联合激活，将驱动完整的基因表达程序(转录程序)，当任何细胞开始获得不同身份时，总是会关闭表征它的原始转录程序。诱导这种变化的信号传导来自生态位或培养基。与初始转录程序的关闭同时，应该发生新的转录程序的开启，它将识别随后的细胞身份。下面的草图表示细胞类型1，它可以接收信号以开始改变身份。细胞身份变化的一个例子发生在分化过程中。然而，今天我们知道，很少甚至单个转录因子的存在可以推动一种表型向另一种表型的转化，从而产生转分化和重编程的示例。因此，细胞身份的变化发生在不同的环境中(分化、重编程、转分化、天然或人工诱导)，但在所有这些环境中，都会发生转录程序的失活和激活。这种在转录水平上关闭/打开程序是一个渐进的过程，而不是遵循零一法则。然后，在程序的这种失活/激活的进程中，存在两者重叠最多的时间，即中间过渡阶段。一些理论生物学研究提出了这样的概念，主要解决了在命名的稳态和过渡态分化过程中转录组水平的变化46,47,76。在这里，我们建议类似的示例可能出现在其他水平，例如代谢组学水平；此外，在身份之间的任何其他类型的过渡中，过渡阶段可能是相似的，不仅限于分化过程。
1b:代谢组本身是一种表观遗传力量，具有调节影响分化程序的基因表达的潜力2,6,77。然而，i)代谢的调节是否可能涉及转录程序的关闭/打开或ii)特定的代谢组是否是允许高转录组动态的要求需要更多的审查。因此，我们探究了与中间阶段相关的代谢组，因为在这个阶段发生了一个主要的动态，源于转录程序的失活/激活，这些转录程序表征了位于该过程的每个极端(稳态)的细胞类型的身份。在所有过程中，都有一个转录程序正在进行。一旦达到稳态(命定的)，转录程序支持稳态，特定于每种细胞类型，并且不同于中间转录的动态。类似地，在具有稳态(多向、多能或完全分化)的不同细胞中，存在一种代谢组，可根据每种细胞类型的生理学所需的稳态需求来表征它们。相反，当细胞被诱导改变其身份时，它们可能需要特定的代谢需求来支持基本的稳态和与改变身份相关的过程。例如，我们可以可视化重编程过程中发生的从氧化磷酸化到糖酵解的转变74、75、78，这种转变比较了稳态的代谢；为了让这种转变发生，可能需要特定的代谢组。
认识到支持稳态的代谢组与支持变化过程的代谢组之间的差异，使我们能够区分代谢物丰度模式的重要性。在绘制的模型中(图1F)，显示了模式的重要性以及代谢物的丰度。假设的代谢物2的水平高于代谢物1。然而，代谢物2的水平可能是失去原始身份的结果(即，代谢物2可能是初始稳态特征的一部分，并且由于该状态开始被抑制，代谢物2衰变)。相反，代谢物1和3在身份改变触发后的早期显示峰值或钟状增加(此触发是独立的外部信号)，这意味着那些增加其水平的代谢物，特别是在那个窗口中，可能在代表细胞身份开启/关闭的更高转录活性中发挥作用。
另一方面，在那个时期完全不存在的代谢物很可能也有影响。然而，这项研究仅关注那些提高其水平的细胞，因为i)从循环模式策略中，钟形波或尖峰在所有测试的细胞类型中以稳健的方式(时间)发生，而u形代表一个与相反的尖峰相比，变化更加渐进且不太一致；ii)通过实验，可以很容易地控制代谢物的增加。其他模式，如减少模式和累积模式，分别代表初始和最终表型的专有特征。在这方面，u形代谢物代表两种表型共有的部分特征。不同类型的累积，仅反映细胞内积累的不同速率，因为最终表型的获得正在发生。最后，我们还发现了第二个表型标志物增加后的钟形模式或波，这可能与细胞特异性特征的成熟有关。这些晚期钟形不与过渡阶段重叠，因此在不同细胞类型之间的时间和组成上不保守。
1c:K-means聚类是一种稳健的分析，但它会根据整体的行为降低或放大变化的重要性；因此，它低估了一些趋势79,80。在这种情况下，我们确定了循环模式分类策略(RPC-策略)，这有利于代谢物个体动力学的轻松分组和可视化。RPC策略旨在识别特定时间窗口内代谢物水平的细微增加，否则这可能看起来不那么明显，并且可能导致剧烈影响。在解释聚类分析与RPC策略的数据时，应牢记这些警告，因为它们对数据的各个方面进行了不同的权衡。分子中离散增加的影响可以通过体外细胞培养来举例说明，其中添加了一系列化合物和小分子(一些在皮摩尔、纳摩尔范围内，其他在毫摩尔范围内等)。通常会观察到，即使在皮摩尔浓度的短暂时间内添加一些小分子，即使在持续时间内，也可能会产生比其他化合物以更高浓度存在的更有效的效果。因此，RPC策略允许我们考虑处于过渡阶段的代谢物，即使是小幅增加。
1d:甲硫氨酸和SAM水平分别通过荧光法和比色法间接测量。这些测定很好地了解了条件之间的比例，但可能会根据标准曲线返回不准确的浓度。对ESC过渡阶段动力学的进一步全面代谢组学研究将是未来的理想选择。使用当前描述的方法，我们在12小时观察到甲硫氨酸仅略有增加；该代谢物是SAM的前体，在18h时水平较高(与12h相比)；因此，18小时时甲硫氨酸的减少可能是当时SAM增加的结果，而甲硫氨酸可能在比本研究中测量的12小时更早的时间点显示出更高的水平。
1e:理论研究表明，在细胞中靠近用于决定命运的分叉边界的基因表达，具有特定基因表达的短暂振荡峰值。这种现象已在NSC的过渡阶段进行了研究。NSC分化的第一反应者之一是Hes5。Manning等人29发表的发现表明，神经祖细胞具有Hes5波动，其中Hes5在细胞过渡到分化时周期性地出现峰值。这篇专注于转录变化的论文表明，细胞状态的控制是一种在几个小时内发生的振荡行为。因此，不仅基因表达水平的变化是必不可少的，而且基因表达的短期动态也为细胞状态过渡提供了必要的信息。我们的模型可能代表了这种动态的并行性，但在代谢组学水平上。我们观察到C1代谢物的快速振荡(波)的发生和Notch信号传导之间存在潜在的时间/行为联系。与之前的观察结果一致，我们在诱导分化过程后立即发现了Hes5表达的振荡峰(图2L)。然后，我们探究了是否有任何C1代谢酶可以表现出类似的行为。其中，我们观察到Odc1的离散振荡、多胺代谢的酶限制以及Mat1a表达的大振荡峰值，Mat1a是参与甲硫氨酸循环的主要酶之一。这里基因表达的振荡峰是通过rt-PCR确定的，因此，在同一时间交叉的不同细胞池的水平上，在那些参考基因中观察到，但在其他基因中没有观察到(例如Mtr或Ahcy同时评估)。有趣的是，Mat1a峰与Hes5的振荡峰适时吻合，它们似乎可能相互依赖。简而言之，我们在NSC中用siRNA[250nM]敲低了Mat1a。24小时后，我们诱导它们分化。正如所料，我们发现Mat1的早期峰被抑制(45.1％±16.7，121n＝10)，出乎意料的是，我们发现Hes5峰也被抑制了18.8％±3.02(n＝6)；因此，在正常分化的背景下推测这些元素的潜在相互依赖性是很诱人的。虽然没有关于连接这两个元素的信号传导的报告，但通过STRING预测分析，我们观察到DNA甲基转移酶是这些成分(Hes5和Mat1)之间的假定联系，这使得如SAM和甲硫氨酸的C1代谢物的已知作用作为表观遗传变化的参与者有道理。未来应对产生多组学整合81的挑战的研究(即基因组学+甲基组学+转录组学+蛋白质组学+代谢组学)可以阐明这种联系和过渡阶段的运作机制。
1f:对于我们的目的，补充一些代谢物喂养C1网络就足够了，而不是完全复制早期的波/钟形代谢组。甲硫氨酸和多胺代谢是代表每个中间转录阶段的顶级富集途径之间的通用性。尽管如此，正如预期的那样，每个细胞谱系还有其他特定的途径。因此，波的完全复制虽然可能是理想的情况(在谱系特定的设置中)，但对于不同的细胞类型并不实用。然而，虽然每种细胞类型存在C1代谢物的不同富集值，但它们在经历过渡期的不同细胞类型之间似乎是恒定的。因此，我们选择了可以合成喂养C1波的目标代谢物，从甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)开始，因为它们被认为是中心C1代谢物，进而与多胺生物合成途径相互作用，其中腐胺是主要的前体(以及SAM可能作用于其)。选择腐胺的另一个原因是发现Mat1(腐胺催化成亚精胺步骤后产生的一种酶)表达增加。此外，半胱氨酸-甘氨酸-苏氨酸循环与甲硫氨酸循环相互关联，并向导致谷胱甘肽代谢的转硫途径进料22,82。谷胱甘肽循环的限制步骤是半胱氨酸池(图2B)。另一方面，苏氨酸调节SAM浓度，并且已知其对ESC分化的影响。总体而言，我们根据其参与C1网络的潜在相关性选择了C1代谢物。
对于初始测试，我们使用星形胶质细胞，因为在NSC谱系中，与MB和MSC相比，根据其P值，C1代谢具有更高的1显著性。有关混合物定制的详细信息在SI_4中。我们以[0.025至10mM]的剂量范围逐一测试了我们选择的成分。单一代谢物(如果有的话)的效果总是小于我们使用组合设置(四种代谢物，MIM(4)：甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸、腐胺；或六种代谢物，MIM(6)：之前的四种，加上SAM和半胱氨酸)。从代谢物的个体测试中，我们观察到半胱氨酸增强而不是抑制Gfap表达，而S-腺苷甲硫氨酸在毫摩尔范围内具有毒性(SI_4)；因此，补充剂也在这些代谢物存在或不存在的情况下进行了测试。与这些结果一致，从混合物中消除半胱氨酸甚至更多地抑制了Gfap表达，而消除SAM并不影响这种减少。最后，半胱氨酸和SAM联合撤出对Gfap(SI_4)的抑制效果最好。在分化神经元的情况下，这些细胞只有163个耐受MIM(4)处理，显示其成熟分化标志物β-164Tubb3和Map2的类似减少(图2O)。此外，我们测试了由6种与一碳循环(SI_4)没有直接关系的代谢物组成的干扰对照。在干扰条件下，Gfap表达增加而不是抑制。
因为C1代谢物的增加发生在初始细胞身份(MB、NSC或MSC)被外部信号诱导分化的情况下(每个谱系不同的培养基)，保守的C1波可能支持过渡而不是触发那个。因此，在促进稳态的情况下(例如由高浓度血清维持的状态)，预计不会观察到任何显著的身份变化，正如我们所证实的那样。这可以解释这样一个事实，即在我们添加FGF2以支持无血清培养基中的细胞存活的条件下，它作为主要诱导物在有利于变化并由C1-MIM创建的代谢组环境中重定向表型。这与图10D-H中所示的实验一致，其中主诱导物是引导转分化过程的分子MyoD或NGN1/2，而C1-MIM可能有助于促进1分叉或细胞命运决定所必需的细胞内动力学。
血清的减少，尤其是与其他因素的组合是观察C1-MIM效果的最佳方案。值得注意的是，对MEF进行化学重编程的方法通常是在无血清的已知成分的培养基中开发的78,83。
为了更好地确定添加C1-MIM后是否有可能获得新的表型，我们每隔一天用混合物持续的喂养五天。这种模式的原因是观察到即使在正常分化中(当C1波发生时，开始诱导后不久)，早期时间点还没有新的可辨别的细胞身份。在诱导分化后几天(甚至几周，取决于细胞类型)后，通常可以完全表征新表型的获得。在这种情况下，我们提供了几天的C1 MIM以确定是否出现了新的细胞类型。然而，考虑到这种混合物的补充引起的变化在其添加后不久发生，正如MIM星形胶质细胞中关键标志物的基因表达跟踪所证明的那样(图9D，F)。
作为关于C1-MIM组成的最后评论，我们知道这里补充的代谢物浓度仍然远未达到最佳方式，以最佳方式复制C1-代谢组。在这里，我们使用了可能使系统饱和的等摩尔浓度(6种代谢物中的5种)，并且每种代谢物的浓度组合可能更有效。
值得注意的是，我们测量了暴露于C1-MIM后细胞内代谢物的细胞内水平，我们发现代谢物水平增加了1.1到11倍，保持在一个仍被认为是生理性的范围内。尽管C1代谢物的浓度可能仍需要进一步定制，但我们研究的普遍发现是在转录身份变化开始时出现C1波。未来的研究可以解决代谢物理想浓度的标准化问题，以促进适应每种细胞类型的C1代谢组。
1g，在我们的研究中，我们比较评估了源自大量和单细胞RNA测序的数据。从这两组中，我们揭示了下调/上调基因的相似趋势(值得注意的是，从每个分析的独立样品中产生)。从分析的MIM-星形胶质细胞、NSC和星形胶质细胞比较之间的DEG的分析重叠，我们检测到专一的1215个基因在MIM-星形胶质细胞中的表达比NSC高(图5A)。该组的富集分析显示了与代谢相关的过程，这可能是在人工补充代谢物后促进了代谢物在其途径中的循环的结果。在同一行中，与MIM-星形胶质细胞相比，这是一组在NSC中表达更高的基因(n＝1001)；与MIM星形胶质细胞相比，该组的富集分析揭示了天然NSC中更多的神经发生能力(图5A)。此外，在星形胶质细胞和MIM-星形胶质细胞中存在高表达的基因组，但在NSC中不表达，反之亦然(图5A)。从这些比较中，我们推断973个共享基因在NSC与星形胶质细胞中上调，但在MIM星形胶质细胞与NSC中也上调。该组富集了细胞周期过程(图5A)。
1h，大多数相关性分析使用来自星形胶质细胞与MIM-星形胶质细胞比较的scRNAseq和大量-RNAseq之间基因表达的对数变化，相关性非常好，除了聚类-AM3(图6C，Pearson r＝0.110，p值＝0.069)。
1i，当NSC群和MIM星形胶质细胞群整合时，它们在很大程度上重叠，但它们并不相同(数据未显示；图7A-K)。从聚类之间的细胞数量和百分比比较，我们发现在MIM-星形胶质细胞聚类-NM0和-NM1中，细胞数量和百分比较低，而与NSC 223相比，聚类-NM2、-NM3和-NM4中的细胞数量和百分比较高。(图7A-K)。然后，从这种整合的聚类的DEG分析中，我们发现MIM中的所有聚类都呈现下调的基因表达模式，但与NSC相比没有上调，除了NM4聚类。与其他聚类相比，聚类-NM4不仅具有相对更多下调的基因数量，而且具有最高的上调基因数量。相关性分析再次表明，NM4的基因表达变化(倍数变化)在单细胞和大量-RNAseq中是相似的。此外，对这些DEG的GO分析表明，MIM的下调基因与中枢神经发育最相关(如聚类NM0、NM3和NM4)，而MIM的上调基因与淀粉样原纤维形成最相关(如NM0、NM1)(图7A-K)。
1j，Nakajima-Koyama等人42发表了一项关于用四种Yamanaka因子重编程小鼠星形胶质细胞的研究。他们详细介绍了这些重编程星形胶质细胞的转录组学特征，表明星形胶质细胞通过NSC样状态进行重编程。因为MIM星形胶质细胞表现出NSC样特征，我们比较了Nakajima-Koyama等人发现的中间状态中上调的DEG与MIM星形胶质细胞的NSC样状态。我们发现这些群体共享446个上调基因(数据未显示)。这些基因的KEGG富集指向与细胞周期相关的过程。值得注意的是，从MIM-星形胶质细胞-大量-转录组学的基因集富集分析(GSEA)来看，考虑到C1-MIM上调的前20个基因集，大多数(20个富集中的13个)与细胞周期(SI_8)相关。而从scRNAseq整合分析中，我们发现来自聚类AM2的细胞显著表达细胞周期相关基因，如Prc1、Cdk1、Cenpe、Cdca8、Cdc20、Chek1、Cenpf、Mki67等(图6H，N)；而聚类NM4 DEG的基因本体分析在功能上富集了参与调节细胞周期的基因(图7K)。
1k，关于天然NSC单细胞转录组的研究39,40表明，NSC在激活和命定为分化之间的不同定型阶段表现为异质的祖细胞谱。同样，在MIM星形胶质细胞中观察到的聚类揭示了不同的细胞状态，就像在天然NSC中发生的那样，可能代表不同程度的定型。
1l，C1-MIM处理可能会诱导不同的细胞状态，这可以通过轨迹分析44,70来表示。这种分析的一个基本原理是考虑在MIM处理后同时捕获的细胞群中发现的潜在异步性，这可能会导致难以观察从一个状态过渡到下一个状态的细胞。结果表明，MIM群体具有五种细胞状态和两个分支，这可能意味着从细胞池中，那些对处理没有相同方式的反应(数据未显示；图8C-D)。
1m，尽管Suv39h-1-2的高表达(图9B)，与组蛋白3K27和K36(其相应地分别是甲基转移酶Ezh2和Set的靶标)的修饰相比，MIM细胞的相关修饰H3K9me3不太明显(图9C)。
1n，关于MIM星形胶质细胞瞬时可塑性的观察结果包括它们在暴露于NSC增殖的培养基时形成神经球样结构的能力。由于缺乏专有标记，天然NSC通过功能性进行表征。真正NSC的功能鉴定包括三个特性：增殖、自我更新和多能性，由Gil-Perotin等人84进行了深入综述。获得的MIM处理的表型非常适合这种表征。除了图10A-H中所示的增殖和多能性证明外，我们还进行了低密度测定作为跟踪自我更新的一种方式。对于这种测定，大多数研究的接种密度范围为5到50个细胞/μL85-87。我们将MIM-星形胶质细胞衍生的NSC以1细胞/μL的密度接种在96孔270板中，每孔100μL NSC培养基；一个月后，我们发现2.7％±0.6的孔出现细胞群生长(n＝3个板)。该百分比与报告的天然NSC相似85。这种量化是在MIM-星形胶质细胞衍生的NSC的第一次传代期间进行的，因为我们观察到与天然NSC的相关差异是细胞在第三次传代后不能很好地增殖。另一个区别与多能性有关。在将MIM星形胶质细胞转移到NSC培养基后早期检测到β-Tubb3，这表明神经元祖细胞的快速获得。然而，在进行分化后，尽管获得了神经元特异性烯醇化酶、突触泡蛋白和Map2等成熟标志物，但一周后我们没有观察到神经元的存活情况，这可能是与MIM神经元衍生细胞的内在能力有关的问题(如转录组学谱所建议的那样)，但也有必要深入优化从这些细胞开始的神经元分化的适当方案(这可能是本文范围之外的目标)。这些结果与我们的转录组数据一致，这表明与NSC相比，MIM星形胶质细胞的神经发生能力降低(图5A)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的具有相同的含义。本文引用的出版物和引用它们的材料通过引用具体并入。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等价物。这些等价物旨在被以下权利要求所涵盖。

Claims (28)

1.用于调节细胞稳态的细胞培养基组合物，其包含至少两种C1-代谢物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物包含选自由甲硫氨酸、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)、苏氨酸、甘氨酸、腐胺和半胱氨酸组成的组的C1-代谢物，所述C1-代谢物的量有效诱导分化或部分分化的真核细胞重编程为祖细胞样细胞。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其包含至少三种C1代谢物(C1MIM)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述CI-MIM包含甲硫氨酸、苏氨酸、甘氨酸和腐胺。
5.根据权利要求4所述的组合物，进一步包含SAM或半胱氨酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中SAM的浓度小于0.5mM。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其包含细胞培养基。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述细胞培养基不含血清或包含少于3％的血清。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其包含FGF。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其进一步包含磷酸缓冲盐水(PBS)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、极限必需培养基(MEM)、Eagle基础培养基(BME)、罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基(RPMI)1640、MCDB 131、Click's培养基、McCoy's 5A培养基、培养基199、William's培养基E、昆虫培养基如Grace's培养基、Ham's营养混合物F-10(Ham'sF-10)、Ham's F-12、a-极限必需培养基(aMEM)、Glasgow's极限必需培养基(G-MEM)、Iscove改良杜氏培养基、Neurobasal培养基、DMEMF12和MEMα。
11.试剂盒中根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述C1代谢物以放入细胞培养基中用于分化的细胞去分化的相对量存在。
12.对部分或完全分化的细胞进行去分化以获得具有祖细胞样特征的C1代谢物诱导的去分化细胞(MIM细胞)的方法，所述方法包括：
将待诱导的细胞用权利要求7-9中任一项的组合物培养一段有效诱导去分化的时间，其中去分化被确定为当与在权利要求6-8中任一项的组合物中培养的细胞相比时，与部分或完全分化的细胞相比时，在细胞中表达的至少一种成熟细胞标志物的表达降低。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述分化的细胞选自由多能干细胞、血液来源的细胞、胚胎来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞和结缔组织细胞组成的组。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述待诱导的细胞选自由成纤维细胞、软骨细胞、脂肪来源的细胞、神经来源的细胞和肠上皮细胞组成的组。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述细胞未被转染以表达Oct4、KLF4、SOX2、C-Myc或NANOG中的任一种。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，还包括分离所述MIM细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述MIM细胞是使用祖细胞标志物分离的。
18.通过权利要求12-17中任一项的方法获得的C1代谢物诱导的去分化细胞(MIM细胞)。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中当与未处理的部分或完全分化的细胞相比时，所述细胞显示在所述分化或部分分化的细胞中表达的至少一种成熟细胞标志物的表达降低。
20.根据权利要求18所述的细胞，其从星形胶质细胞获得，其中与星形胶质细胞相比，所述MIM-细胞显示胶质细胞原纤维酸性蛋白编码基因Gfap和Cd44(分化簇44)的表达降低。
21.根据权利要求18所述的细胞，其从软骨细胞获得，其中所述MIM-细胞与软骨细胞相比显示软骨细胞标志物聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白(Col2)的表达降低。
22.根据权利要求18所述的细胞，其从神经元获得，其中所述MIM细胞显示Map2和β-III-微管蛋白的表达降低。
23.根据权利要求18所述的细胞，其从成纤维细胞获得，其中所述MIM细胞显示I型胶原蛋白α2链编码基因Col1A2的表达降低。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的细胞，其中所述细胞表现出与祖细胞状态相关的基因的上调的表达，其中所述基因选自由cMyc、Ascl1、SOX2、SOX5、Nestin、CD133、MyoD和Pax7组成的组。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述细胞不表达Oct4、Klf4和/或Nanog。
26.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞显示出至少一种细胞周期相关基因的表达增加和/或至少一种与胶原形成相关的基因的表达降低。
27.根据权利要求18所述的细胞，其从星形胶质细胞获得，其中所述MIM-细胞显示至少一种甲基化相关基因的表达增加，所述基因选自包含Setd1a、Km2a、Km2b、Km2d、Smyd2、Suv39h1、Suv39h2、Ehmt2、Ehmt1、Sstdb1、Ezh2、Setd2、Nsd1、Nsd2和Ash1L的组；
任选地，其中所述细胞表现出增加的组蛋白乙酰化，任选地其中所述组蛋白乙酰化在选自H2A K5、H2A K9、H3 K14、H3 K18、H3 K23和H 3.1K27的一个或多个位点处。
28.根据权利要求18所述的细胞，其从星形胶质细胞获得，其中所述MIM-细胞在NSC培养基中培养时形成神经球样结构、Nestin+和/或Ki67+神经球或其组合；
任选地，其中MIM-细胞能够分化成神经元、少突胶质细胞和/或星形胶质细胞。
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