DE10147975A1 - Klinische Qualitätstests zum Nachweis einer erfolgreichen Endothelialisierung organischer und künstlicher Oberflächen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Testverfahren zur klinischen Bestimmung und Überprüfung wichtiger Zellfunktionen im Rahmen der angewandten Biotechnologie. Hierdurch werden erstmals nicht zerstörende Testverfahren verfügbar gemacht, die es ermöglichen, das Risiko, das sich für die betreffenden Patienten ergibt, die derartige Produkte implantiert erhalten, deutlich zu senken. Außerdem werden Verfahren beschrieben, die die gezielte Propagierung diverser physiologischer Zellfunktionen im Rahmen des Tissue Engineerings bei der Herstellung des Produktes erstmals ermöglichen.

Description

• Die Erfindung betrifft neuartige Testverfahren, die es ermöglichen, die funktionelle Differenziertheit von Endothelzellen, die im Rahmen der Modellierung oder des Neuaufbaus von Geweben und Organen zur Beschichtung deren Oberflächen verwendet werden, zu überprüfen. Durch diese neuen Testverfahren wird es erstmals möglich, Funktionen, deren Vorhandensein und Funktionalität bei einer klinischen Verwendung solcher Produkte oftmals unabdingbar sind, in der Vorimplantationsphase zu überprüfen, ohne dass das entsprechende Produkt dabei in seiner Integrität verletzt wird.
• Das vaskuläre Endothel (als Deckgewebe der Innen- bzw. luminalen Seite von allen Blutgefäßen und Blutgefäßklappen) zeichnet sich durch eine Vielzahl antiaggregatorischer, antikoagulatorischer und profibrinolytischer Aktivitäten aus (Z. Kardiol. 82: Suppl. 5, 13-21, 1993; FASEB J. 2: 116-123, 1988). Beispielsweise sind die zellulären Komponenten der tieferen Gefäßwand vor allem durch die Expression von Gewebefaktor charakterisiert, der im Kontakt mit Plasmafaktoren eine sofortige Gerinnungsreaktion einleitet (Thrombosis Res. 81: 1-41, 1996; J. Clin. Invest. 100: 2276-2285, 1997; FASEB J. 8: 385-390, 1994; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 1-9, 1997). Derartige Gerinnungsreaktionen können zu einer kompletten- oder auch teilweisen thrombotischen Verlegung der davon betroffenen Blutgefäße führen. Dies führt zu einer sofortigen Minderversorgung der nachgeschalteten Versorgungsgebiete dieser Blutgefäße mit Blut. Hieraus können sich schwerste klinische Folgeerscheinungen, wie z. B. ein Herzinfarkt, entwickeln. Eine Abschirmung gerade dieser prothrombogenen Wandaktivitäten von Hohlorganen ist nicht nur bei Blutgefäßen und Blutgefäßklappen, sondern auch bei allen anderen in der Bypasschirurgie als Gefäßersatz verwendeten organischen und künstlichen Blutleiter von allergrößter Bedeutung.
• Aus diesen Gründen ist es daher nicht verwunderlich, dass das vaskuläre Endothel gerade bei der Herstellung neuartigen Gefäßersatzes immer mehr an Bedeutung gewinnt. Sollte es gelingen organischen- oder künstlichen Gefäßersatz an der Innenoberfläche mit differenzierten Endothelzellen auszukleiden, wäre eine deutliche Reduktion der Thrombogenität solchen Gefäßersatzes zu erwarten.
• Derartige Überlegungen sind vor allem dann erforderlich, wenn menschliche Hohlorgane (aber auch Hohlorgane tierischen Ursprungs) beispielsweise Venen und Arterien, die von Multiorganspendern entnommen werden, wieder im Rahmen einer Gewebetransplantation in den Körper eines Empfängers implantiert werden. In diesem Fall ist es erforderlich des Endothel des Spenders vollständig zu entfernen und mit dem Endothel des Empfängers zu ersetzen (Lamm P, Juchem G, Milz S. Schuffenhauer M, Reichart B. Autologous Endothelialized Vein Allograft: A Solution in the Search for Small-Caliber Grafts in Coronary Artery Bypass Graft Operations. Circulation 104: I-108-114, 2001. Lamm P, Juchem G, Weyrich P, Nees 5, Reichart B. New alternative coronary bypass graft: first clinical experience with an autologous endothelialized cryopreserved allograft. J Thorac Cardiovasc Surg 117(6): 1217-9, 1999).
• Ursächlich hierfür ist die Tatsache, daß gerade das vaskuläre und mikrovaskuläre Endothel im Rahmen der akuten und chronischen Organabstoßung eine Schlüsselposition spielt. Endothelspezifische nicht HLA-Antigene, die zu einer Aktivierung von CD4 T-Zellen führen, ermöglichen es nämlich dem Spenderendothel - im Zusammenwirken mit weiteren akzessorischen Molekülen - fremde Antigene dem Immunsystem des Empfängers anzubieten. Die Freisetzung von nicht HLA-Antigenen durch beschädigte Endothelzellen führt dann zu einer chronischen Immunreaktion und möglicherweise zur Graftvaskulopathie und chronischen Abstoßung (Rose ML, Role of endothelial cells in allograft rejection. Vasc. Med. 2(2): 105-14, 1997; Reul RM, Fang JC, Denton MD et al. CD 40 and CD 40 ligand (CD 154) are coexpressed in microvessels in vivo in human cardiac allograft rejection. Transpalantation 64(12): 1765-74, 1997; Salom RN, Maguire JA, Hancock WW, Endothelial activation and cytokine expression in human acute cardiac allograft rejection. Pathology 30(1): 24-29, 1998). Umgekehrt bewirkt die selektive Entfernung des Spenderendothels das Ausbleiben akuter Abstoßungsreaktionen im Tierexperiment (Ratte) (Ann. Surg. 206: 757-764, 1987), wo es anschließend zu einer spontanen Reendothelialisierung kommen kann. Derartig vorbehandelte Bypasses zeigten im Tierexperiment verbesserte Standzeiten. Am Menschen ist jedoch eine spontane Reendothelialisierung nicht bekannt.
• Zur Vermeidung der oben beschriebenen Nachteile wurde daher schon frühzeitig vorgeschlagen durch Methoden des "Tissue-Engineerings" neue oder veränderte Organe mit verbesserten antithrombogenen Eigenschaften zu entwickeln (Weinberg CB, Bell E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 1986; 231: 397-400. Lamm P, Juchem G, Milz S. Schuffenhauer M, Reichart B. New autologous coronary bypass graft: First clinical experience with an autologous endothelialized cryopreserved allograft. J Thorac Cardiovasc Surg 117: 1217-9, 1999). Hierbei konnte auf Erfahrungen zurückgegriffen werden, die bei der Ansiedelung einer stabilen Endothelzellschicht an der Innenseite von Kunststoffprothesen gewonnen worden waren (Zilla P, Fasol R, Deutsch M, Fischlein T, Minar E, Hammerle A, Krupicka O, Kadletz M. Endothelial cell seeding of polytetrafluoroethylene vascular grafis in humans: a preliminary report. J Vasc Surg. 1987; 6: 535-41.). Zilla et al. konnten überzeugend belegen, dass eine stabile Endothelzellschicht in der Tat die antithrombogenen Eigenschaften solcher Prothesen verbessert. Eine Auskleidung von zu implantierenden Blutgefäßen mit vaskulärem Endothel ist heute ein erklärtes Ziel der Biotechnologie und des "Tissue-Engineerings".
• Als "Funktionsteste" für derartige Endothelbeschichtungen von organischen und künstlichen Oberflächen werden bislang eine Reihe histologischer Untersuchungen durchgeführt. Diese Untersuchungen schließen die Charakterisierung der Endothelzellen mit den bekannten Endothelzell-typischen Markern genauso mit ein wie rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen der Innenoberfläche von beschichteten Hohlorganen zum Nachweis einer konfluenten Endothelzellschicht (Lamm P, Juchem G, Milz S. Schuffenhauer M, Reichart B. Autologous endothelialized vein allograft: a solution in the search for small-caliber grafts in coronary artery bypass graft operations. Circulation 104 (12 Suppl. 1): I 108-I 114, 2001). Weitere, in der Grundlagenwissenschaft genutzte, Tests, wie z. B. der Nachweis von iNOS oder NOx, sind in der klinisch angewandten Biotechnologie noch nicht etabliert. Im Fall der Endothelzellen gibt es bislang keine Methode die es erlauben würde, die funktionelle Differenziertheit der ausgesäten Endothelzellen nachzuweisen.
• Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Testverfahren für die angewandte Biotechnologie verfügbar zu machen, die es ermöglichen, die funktionelle Differenziertheit der bei der Herstellung der entsprechenden biotechnologischen Produkten verwendeten Endothelzellen nachzuweisen.
• Dieser Zielsetzung folgend gelang es uns erstmalig, die Barrierefunktion des vaskulären Endothels, die den Flüssigkeitsausgleich zwischen der Blutstrombahn und dem Zwischengewebe reguliert, durch einen neuartigen Test zu erfassen. In gleicher Weise wird eine weitere Methode beschrieben, die es ermöglicht, die Funktionalität der antithrombogenen Eigenschaften des vaskulären Endothels zu überprüfen, ohne die zellbeschichteten Produkte vor ihrer klinischen Verwendung zu beschädigen oder in ihrer Funktion zu beeinträchtigen.
• Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen, der nachfolgenden Beschreibung und den Abbildungen.
• Die vorliegende Erfindung stellt zunächst ein Testverfahren zur Überprüfung der hydraulischen Konduktivität der mit Endothelzellen beschichteten organischen - oder künstlichen Hohlorgane vor, bei dem die entsprechenden, bereits mit Endothelzellen beschichteten Hohlorgane zunächst in eine Boyle-Marriottsche-Apparatur (Abb. 1) verbracht werden, die es ermöglicht, einen konstanten Druckgradienten, der von der Innenseite des beschichteten Gefäßes zur Wand der Apparatur hin gerichtet ist, aufzubauen. Die Apparatur ist, genauso wie das darin aufgespannte Hohlorgan mit einer Flüssigkeit gefüllt, die bevorzugt aus einem entsprechenden Nährmedium für die aufgebrachten Endothelzellen besteht, gefüllt.
• Im Anschluß daran wird die Abnahme der hydraulische Konduktivität über die Venenwand gemessen (die transmurale Filtration wird in ml/cm² pro Zeiteinheit angegeben). Hierbei zeigt sich ein typischer Verlauf. Es kommt zu einer kontinuierlichen Abnahme der transmuralen Filtration, die sich im Mittel nach 72 Stunden bereits halbiert hat. Bei histolgischen Untersuchungen, die simultan durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass diese Abnahme mit der Ausbildung einer geschlossenen Endothelzellschicht korreliert. Ursächlich hierfür sind zwei wesentliche funktionelle Eigenschaften des natürlichen vaskulären Endothels:
  
• a) die Ausbildung der Verbindung zwischen den ausgesiedelten Endothelzellen und
• b) die beginnende Exprimierung neuer extrazellulärer Matrix durch die angesiedelten Endothelzellen.
• Beide Funktionen sind für die stabile Ansiedelung von Zellen an organischen und anorganischen Oberflächen unabdingbar erforderlich.
• Desweiteren beschreibt die Erfindung ein Testverfahren, das es ermöglicht, die antithrombogenen Eigenschaften, insbesondere die profibrinolytischen Eigenschaften des für die biotechnologische Anwendung eingesetzten Endothels zu überprüfen.
• Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zur präoperativen Überprüfung funktionell wichtiger Funktionen von Endothelzellen, die im Rahmen des Tissue-Engineerings Verwendung finden, geeignet. Sie erlauben eine Qualitätskontrolle dieser Organe und Gewebe. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind vor allem zur präoperativen Untersuchung von Hohlorganen, die im Rahmen des Tissue-Engineerings hergestellt wurden, geeignet und ermöglichen eine deutliche Reduzierung des Risikos, das die Implantation dieser Organe und Gewebe für die betroffenen Organempfänger, beinhaltet. Insbesondere werden hier erst mal funktionelle Qualitätstests für Endothelialisierungen im Rahmen der angewandten Biotechnologie zur Verfügung gestellt.
• Der Begriff "Tissue-Engineering" bedeutet Techniken, die es ermöglichen, verschiedene, teilweise organspezifische Zellen zu isolieren, zu kultivieren und zu vermehren (z. B. Reendothelialisation von Hohlorganen wie Arterien oder Venen). Letztendlich entstehen durch diese Techniken neue Organe und Gewebe.
• Besonders geeignet sind die Verfahren für natürliche Hohlorgane, die im Rahmen des Tissue- Engineerings an ihrer Innenoberfläche mit Endothelzellen ausgekleidet werden. Insbesondere eignen sie sich für Organe, die vor ihrer Endo- oder Re-Endothelialisierung einer Deendothelialisierung unterzogen worden sind. Hierbei werden Organe oder Gewebe entweder dezellularisiert (z. B. Bader A, Schilling T, Teebken O, Brandes G, Haverich A. Issue engineering of heart valves - human endothelial cell seeding of detergent acellularized porcine valves. Eur J Cardiovasc Surg 14, 129, 1998. Karim N, Stock U, Mertsching H, Steinhoff G, Haverich A, Bader A. New cardiovascular grafis by tissue remodelling: de-novo matrix synthesis in acellulaised animal aortas and heart valves by human and allogenic cells. Cell tissue organs, Vol. 166, 48, 1999. Goldstein 5, US Patent No 5,843,182. Goldstein 5, US Patent No 5,632,778. Goldstein 5, US Patent No 5,613,982. Orton EC, US Patent No 5,192,312) oder devitalisiert, auf jeden Fall wird jedoch versucht, die extrazellulären Matrix der betroffenen Hohlorgane zu erhalten. Dieser Effekt wird auch durch die Kryopräservierung der entsprechenden Organe erreicht oder durch die langfristige Lagerung der entsprechenden Organe bei 4°C im Dunkeln unter anaeroben Bedingungen. Bei all diesen Techniken entstehen extrazelluläre Matrices, die nicht mehr über ihre natürlichen Barrierefunktionen verfügen, d. h. es kommt bei all diesen Techniken zu einer Beschädigung der Matrices, die beispielsweise die transmurale Filtration über die entsprechenden Gefäßwände nicht mehr verhindern können. Dieser Vorgang korreliert mit unnatürlichen Auflockerungen der Wand dieser so vorbehandelten Gefäße bei der histologischen Untersuchung.
• Insbesondere sind diese Verfahren bei allen Zellbesiedelungstechniken mit großem Erfolg anwendbar, die auf eine Synthese oder Neusynthese von extrazellulärer Matrix ausgerichtet sind. Im kardiovaskulären Bereich betrifft dies beispielsweise die Synthese einer Basalmembran, die bevorzugt durch die Aussaat endothelialer und nichtendothelialer Zellen (z. B. Perizyten, "pericyte like cells", Myofibroblasten und Fibroblasten), einzeln oder gemeinsam erreicht wird. Wie wir in eigenen Untersuchungen detailliert belegen konnten, findet nach der Aussaat dieser "Mischkulturen", besonders bevorzugt nach der gemeinsamen Aussaat von Endothelzellen und Perizyten/"pericyte like ells", ein Remodelling ( = strukturelle Änderung, bzw. Veränderung) der zur initialen Zellansiedelung verwendeten Matrix (organisches und anorganisches Ausgangsmaterial) statt. Dabei kommt es bereits nach wenigen Tagen zur strukturellen Anordnung der o. e. ausgesäten Zelltypen, die der natürlichen Anordnung dieser Zellen im Organismus entsprechen. Dieser Umstrukturierungsprozeß wird durch die erfindungsgemäßen Verfahren mit ausreichender Zuverlässlichkeit für eine klinische Verwendung des neuen Konstruktes erfasst. Somit stehen dem Tissue Engineering erstmals Verfahren zur Verfügung, die eine gezielte, d. h. strukturerzeugende, genau abgestufte Aussaat verschiedener Zelltypen ermöglicht. Im kardiovaskulären Tissue Engineering ist es nun möglich bei dem zu erzeugenden Produkt beispielsweise durch geeignete Wahl des Mischungsverhältnisses zwischen endothelialen und nichtendothelialen Zellen entweder die initiale Zelladhäsion, die Ausbildung einer Basalmembran oder die funktionelle Differenzierung bestimmter Zelltypen einzeln oder in Kombination zu bewerkstelligen.
• Die erfindungsgemäßen Testverfahren können im gesamten Bereich der Medizin und Veterinärmedizin, der Chirurgie, insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie aber auch bei allen Anwendungen, bei denen eine geschlossene Endothelzellschicht in einem Hohlorgan erzeugt wird, verwendet werden. Besondere Verwendung finden sie bei beschichteten natürlichen Hohlorganen, die nach einem Dezellularisierungs- oder Devitalisierungsverfahren endo- oder reendothelialisiert werden und beispielsweise als aortokoronare Bypasses bei koronarer Herzkrankheit und als Gefäßtransplantate bei Gefäßrekonstruktionen jeglicher Art verwendet werden.
• Die Figuren dienen der Erläuterung der Erfindung.
• Abb. 1 zeigt ein bereits bekanntes Kultivationsgerät (Bioreaktor) zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren. Es besteht durchgängig aus biologisch inerten, autoklavierbaren Teilen und durch dieses Gerät kann ein beliebiger Druckgradient über die Venenwand aufgebaut werden. Des weiteren kann die Vene mit beliebigem Druck und Fluss mit Hilfe einer Pumpe perfundiert werden.
• Das Kultivationsgerät umfasst ein mit Medium gefülltes Kulturgefäß (1), in dem sich das Hohlorgan befindet (z. B. eine Vene (2)). Das Lumen der beiden Venenenden ist mittels zweier Adapter (3) mit den beiden Auslässen des Kulturgefäßes verbunden. Ein Adapter ist mit einer Computer-kontrollierten peristaltischen Pumpe verbunden (4). Der andere Adapter endet an einer Boyle-Marriotschen Flasche mit Skalierung (5). Der Druckgradient tip (abhängig von Kanüle (6)) wird nach gewünschtem Druckgradienten über die Gefäßwand eingestellt. Durch die peristaltische Pumpe (4) kann computergestützt ein Mediumwechsel im Innenlumen der Vene durchgeführt werden.
• Im Vorratsbehältnis befindet sich eine in ml gefasste Eichung, die das exakte Ablesen des filtrierten Volumens ermöglicht. Dieses Volumen wird nun mit der Graftinnenoberfläche korreliert. Die transmurale Filtration wird anschließend in ml/cm² innere Graftoberfläche pro Zeiteinheit angegeben.
• Abb. 2 zeigt den Testaufbau, der zur qualitativen Bestimmung der profibrinolytischen Eigenschaften der für die biotechnologische Anwendung vorbereiteten Endothelzellen erforderlich ist. Hierzu werden Plastik-Kulturschalen (35 mm Kulturschalen von Falcon, Becton Dickinson, USA) verwendet. Diese Kulturschalen werden nun mit jeweils 2 ml Fibringel gefüllt (15 mg Fibrin/ml, Immuno, Wien, Austria), anschließend mehrfach mit Kulturmedium gespült und mit Endothelzellen der gleichen Zellpassage bedeckt, mit denen simultan der zu beschichtende Bypass beschichtet wird. Die Zellen werden mit Kulturmedium bedeckt, das täglich ausgetauscht wird. Nach ca. 7 Tagen ist das aufgebrachte Fibringel komplett von den Endothelzellen lysiert. Abb. 2a zeigt die Kontrolle ohne Zellen, 2b zeigt eine Fibroblastenkultur, die keine profibrinolytischen Eigenschaften besitzt und 2c zeigt eine Kultur von humanen Endothelzellen, die nach 5 Tagen das Fibringel weitgehend aufgelöst haben.
• Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.
Beispiel 1 Erfindungsgemäße Anwendung des neuen Testverfahrens zur Bestimmung der hydraulischen Konduktivität bei der autologen Endothelialisierung einer devitalisierten Vene
• Bei den zu operierenden Patienten werden im präoperativen Verlauf ca. 500 ml Vollblut ohne gerinnungshemmende Substanzen entnommen, bei 4°C für 24 Stunden gelagert und anschließend werden die festen Bestandteile abzentrifugiert. Das Serum wird bis zur weiteren Verwendung tiefgekühlt.
• In einer Voroperation wird bei dem Empfänger der zu beschichtenden Vene in lokaler Anästhesie ein etwa 5 cm langes Venenstück entnommen. Die Zellisolierung und Vermehrung isolierter Endothelzellen erfolgt nach gängigen Zellkulturtechniken (Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest 52: 2745-56, 1973). Als Kulturmedium kann beispielsweise Medium 199 (Seromed) supplementiert mit 20% autologem Serum und 2 ng/ml rekombinantem bFGF (basic fibroblast growth factor) verwendet werden. Nach dem Erreichen einer für die Beschichtung ausreichenden Zellzahl wird die gelagerte, zu verwendende erfindungsgemäße Spendervene aus ihrem Lagerungsbehälter entnommen. Die Vene wird entweder direkt, ohne jede weitere Vorbehandlung (siehe unten) mit der Patienten-autologen Endothelzell-Suspension gefüllt oder aber zunächst mit Patienten-autologem Serum gefüllt und dann im Brutschrank im gefüllten Zustand für 12 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Hierfür werden die beiden Enden der Vene mit einem durchgängigen Adapterstopfen (der eingebunden wird) versehen, der selbst wiederum durch einen wiederentfernbaren Stopfen verschlossen wird. Im Anschluss wird durch Entfernung der Stopfen das Serum abgelassen, die vorbeschichtete Vene mit einer definierten Zellzahl (80.000-120.000 Zellen/cm² Graftoberfläche) Patienten-autologen Endothels gefüllt und durch Wiedereinführen der Stopfen verschlossen. Nun wird die Vene für mehrere Stunden in einem Rotationsgerät [Kadletz M, Moser R, Preiss P, et al. In vitro lining of fibronectin coated PTFE grafts with cryopreserved saphenous vein endothelial cells. Thorac Cardiovasc Surg, 35 Spec No 2: 143-147, 11/1987]) im Brutschrank bei 37°C rotiert. Dabei kommt es zur gleichmäßigen Adhäsion der Zellen auf der Graftinnenoberfläche. Danach wird die beschichtete Vene dem Rotationsgerät entnommen und in das spezielle Kultivationsgerät (siehe Abb. 1) eingebracht.
• Alle 12 Stunden wird die Abnahme des Füllstandes im Reservoir festgestellt und dokumentiert. Diese Abnahme wird nun auf die Innenoberfläche des eingespannten Bypasses bezogen und in ml Filtration/cm² Innenoberfläche in eine Filtrationskurve eingetragen. Die Vene wird nur dann in einen Patienten implantiert, wenn sich die Filtrationsrate innerhalb von 72 Stunden auf die Hälfte der anfänglichen Rate reduziert.
Beispiel 2 Erfindungsgemäße Anwendung des neuen Testverfahrens zur Bestimmung der hydraulischen Konduktivität bei der autologen Endothelialisierung einer kryopräservierten Vene
• Die Endothelialisierung von kryopräservierten Spendervenen wird entsprechend dem Verfahren des Beispiels 1 durchgeführt. Die Abnahme der hydraulischen Konduktivität wird wie in Beispiel 1 bestimmt.
Beispiel 3 Erfindungsgemäße Anwendung des neuen Testverfahrens zur qualitativen Bestimmung der profibrinolytischen Eigenschaften der zur Zellbeschichtung zu verwendenden Endothelzellen
• Die Gewinnung der Endothelzellen erfolgt wie in Beispiel 1. Simultan zur Befüllung der Venen von Beispiel 1 oder 2 mit autologen Endothelzellen (nach Ablassung der Serumvorbeschichtung) erfolgt die Aussaat von 500000 Endothelzellen der selben Kultur und Passage auf mit Fibringelen vorbeschichteten Zellkulturschalen. Die Zellen werden mit demselben Kulturmedium bedeckt, mit dem der Kultivationsapparat gefüllt ist und in den Brutschrank bei 37°C und 5% CO_s gelagert. Täglich wird ein Mediumwechsel durchgeführt. Die progressive Fibrinolyse wird täglich makroskopisch kontrolliert. Nach ca. 7 Tagen ist die vollständige Auflösung des Fibringels eingetreten.
• Bei Verunreinigung der Zellkultur mit nichtendothelialen Zellen (z. B. Fibroblasten, Pericyten oder "pericyte like" cells) ist die Fibrinolyse deutlich reduziert oder gar nicht vorhanden. Dasselbe trifft auf Endothelzellkulturen zu, die erst nach der dritten oder vierten Passage auf das Fibringel verbracht werden.

Claims (23)

1. Testverfahren zur Überprüfung der funktionalen Differenziertheit von Zellen, die im Rahmen biotechnologischer Anwendungen an organischen- oder künstlichen-, porösen, Hohlorganen angesiedelt werden. Umfassend die folgenden Tests:

a) Bestimmung der Hydraulischen Konduktivität der bereits mit Zellen beschichteten Bypasses.

b) Bestimmung der profibrinolytischen Eigenschaften der zur Beschichtung oder Mitbeschichtung bestimmten Endothelzellen durch Erfassung der progressiven Fibrinolyse, die durch die Stimulierung dieser Endothelzellen mit Fibrin ausgelöst wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wenn die Zellen Endothelzellen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wenn die Zellen Mischkulturen von endothelialen und nichtendothelialen Zellen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wenn die nichtendothelialen Zellen Perizyten sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wenn die nichtendothelialen Zellen "pericyte-likecells" sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wenn die nichtendothelialen Zellen Fibroblasten sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wenn die nichtendothelialen Zellen Mischkulturen zwischen den Zellen, die in den Ansprüchen 1-6 genannt sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, wenn andere, als die genannten Zellen beim Tissue- Engineering verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, wobei die Tests im Zusammenhang mit einer klinischen Anwendung erfolgen.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, wobei ein für die Bestimmung der hydraulischen Konduktivität erforderlicher Druckgradient zwischen der inneren (Lumen) und äußeren Umgebung des erfindungsgemäßen Hohlorgans erzeugt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fibringel zum Ausschluß einer Kontamination von Endothelzellkulturen durch andere Zellverbände, z. B. Fibroblasten, Pericyten, "pericyte like-celle" oder anderer Zellen verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei dem Fibringel diverse Substanzen, die bestimmte Funktionen der zu überprüfenden Zellen beeinflussen können, beigefügt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Test zur Beurteilung von Substanzen verwendet wird, die den direkten oder indirekten Einfluß dieser Substanzen auf die profibrinolytischen Eigenschaften der Endothelzellen untersuchen oder modifizieren.

14. Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung oder Bestimmung von Substanzen, Flüssigkeiten oder Gasen auf die hydraulische Konduktivität der Zellschichten oder der von den Zellschichten gebildeten Substanzen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wenn es sich bei der gebildeten Substanz um extrazelluläre Matrix handelt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Test zur Beurteilung von Zellen verwendet wird, die direkt oder indirekt Einfluß auf die profibrinolytischen Eigenschaften der Endothelzellen nehmen.

17. Verfahren nach Anspruch 13, wenn es sich bei den Zellen um Fibroblasten handelt.

18. Verfahren nach Anspruch 13, wenn es sich bei den Zellen um Perizyten handelt.

19. Verfahren nach Anspruch 13, wenn es sich bei den Zellen um pericyte like cells handelt.

20. Verfahren nach Anspruch 13, wenn es sich bei den Zellen um Muskelzellen handelt.

21. Verfahren nach Anspruch 1-20, wobei die Tests unter sterilen Bedingungen erfolgen.

22. Verfahren nach Anspruch 12, wenn dadurch die Biokompatibilität klinisch verwendeter Fibringele oder kommerziell erhältlicher "Fibrinkleber" beeinflusst, modifiziert oder verändert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 12, wenn dadurch die Biokompatibilität klinisch verwendeter Fibringele oder kommerziell erhältlicher "Fibrinkleber" bestimmt wird.