ES2347339T3 - Ingenieria con factores orientadores. - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un andamiaje para implantación in vivo, que comprende la etapa de revestir una matriz estructural con un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.
Description
Ingeniería con factores orientadores.
La presente invención se refiere a la ingeniería
tisular y a la siembra celular de andamiajes de dispositivos
implantables. La invención se refiere además a moléculas que
aseguran la siembra in vitro y/o in vivo de una
matriz con células.
Las válvulas cardíacas protésicas sufren
posibles complicaciones tales como trombosis, endocarditis, fallo
mecánico, degradación tisular, calcificación. Estos problemas y el
hecho de que estas prótesis carezcan de potencial de crecimiento y
remodelación en pacientes pediátricos son el motivo de la ingeniería
tisular de las válvulas cardíacas.
El principal objetivo de la ingeniería tisular
es la restauración de la función mediante el aporte de elementos
vivos que se incorporan al paciente. La ingeniería tisular se basa
esencialmente en 3 elementos:
- células, que representan el componente
vivo
- matriz, que proporciona una estructura de
soporte tridimensional
- moléculas de señalización que influyen en la
expresión génica y la deposición de la matriz extracelular.
\vskip1.000000\baselineskip
La ingeniería tisular combina células y
andamiajes para construir nuevo tejido. Para la siembra celular de
matrices, se están investigando actualmente dos opciones: células
autólogas cultivadas para la siembra in vitro y la atracción
de células autólogas in vivo.
Diferentes matrices se están considerando para
la ingeniería tisular (véase la Figura 1). Una matriz puede ser un
andamiaje moldeado de un polímero sintético o de colágeno o fibrina.
El andamiaje puede ser natural (p. ej. raíz acelular) o puede ser
una prótesis reticulada.
Además, se han ideado diferentes procedimientos
para obtener una válvula cardíaca viable sometida a ingeniería
tisular. El paradigma completo describe la construcción de una
válvula al combinar células y andamiaje in vitro, seguido
por la maduración in vitro de la construcción en un
biorreactor (Figura 2). La construcción madura puede implantarse a
continuación en el paciente y posiblemente sufrir remodelación in
vivo (revisado en Rabkin & Schoen (2002) Cardiovasc.
Pathol. 11, 305-317). La construcción estudiada más
a fondo es una válvula creada por Hoerstup et ál. ((2002)
Circulation 106, 1143-1150)). Obtuvieron
satisfactoriamente una válvula pulmonar de oveja viable y
remodelada usando el paradigma completo con un biorreactor.
El documento US2001/051824 se refiere a una
válvula cardíaca bioprotésica que comprende una matriz acelular y
miofibroblastos aislados.
El documento US6082364 describe implantes o
andamiajes metálicos que comprenden células de la médula ósea o
similares a las pluripotenciales.
El documento WO2004/090120 se refiere a células
pluripotenciales que exhiben una sensibilidad incrementada a un
quimioatrayente.
El documento WO9941403 divulga una composición
de interés para introducir una molécula de ácido nucleico exógena
en una célula diana que comprende un liposoma, un ligando y un
andamiaje polímero, en la que dicho ligando puede unirse a un
receptor de la superficie celular o una molécula expresada por una
célula diana.
Campbell et ál. ((1999) Circ. Res. 85,
1173-1178) han sugerido asegurar la siembra de
andamiajes en la ingeniería tisular de vasos sanguíneos haciendo
uso de un mecanismo de defensa conocido, a saber la reacción a
cuerpos extraños. Una reacción madura a cuerpos extraños está
comprendida por una capa de macrófagos, varias capas de
fibroblastos y una capa mesotelial externa (Butler et ál.
(2001 a) Biomed. Sci. Instrum. 37, 19-24.; Butler
et ál. (2001 b) J. Invest Surg. 14, 139-152).
Aunque Campbell et ál. (1999, citado anteriormente) afirman
que los fibroblastos se derivan de macrófagos transdiferenciados,
todavía no se ha publicado una evidencia concluyente.
Para que sean satisfactorios, estos métodos
tienen que cumplir un número de retos reguladores, incluyendo una
función y una durabilidad óptimas. Para justificar el alto coste de
las válvulas sometidas a ingeniería tisular, deben demostrar tener
cualidades superiores a las válvulas existentes. Adicionalmente,
todas las técnicas mencionadas anteriormente tienen que vencer el
reto de la bioseguridad. Las cuestiones y las bases de la
bioseguridad en lo que respecta a la FDA están bien documentadas
("Guidance on applications for products comprised of living
autologous cells manipulated ex vivo and intended for
structural repair or reconstruction". 95N-0200
(1996); "Proposed approach to regulation of cellular and
tissue-based products - The food and drug
administration". Journal de Hematotherapy
6:195-212 (1997); "Guidance for industry -
Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy". Human
Gene Therapy 9:1513-1524 (1998); "PHS guideline on
infectious disease issues in xenotransplantation". (2001);
"Transmissible spongiform encephalopathies advisory committee
meeting". (2001)).
El uso de células cultivadas o incluso recogidas
in vitro plantea problemas específicos. Según se ilustra en
la Figura 3, tanto la recogida como el cultivo de células pueden
inducir inestabilidad genética o mutagénesis. Esto puede atribuirse
a diferentes factores. Tanto la recogida como el cultivo requieren
generalmente el uso de proteínas extrañas. El origen xenogénico de
las enzimas o los sueros proteolíticos es una fuente potencial de
contaminación por patógenos entre especies. Tal contaminación, si no
se detecta, no solo pone en riesgo el propio cultivo, sino también
al receptor. El mecanismo de proliferación de ciertos virus puede
permitir la inserción de su genoma en el genoma del huésped, lo que
puede provocar mutaciones perjudiciales dependiendo del sitio de
inserción. Ciertos genes virales también pueden actuar como
oncogenes. Las cuestiones de bioseguridad se aplican igualmente al
uso de materiales xenogénicos. Además del riesgo de infecciones
virales, el cultivo de células también expone a las células a
condiciones no fisiológicas tales como una tensión de oxígeno
incrementada. De media, el tejido de los mamíferos está expuesto a
una tensión de oxígeno que varía de 2-8%, mientras
que las incubadoras generalmente usan aire comprimido con una
tensión de oxígeno de 21%. Se ha demostrado que los fibroblastos
múridos primarios son extremadamente vulnerables al daño al DNA que
da como resultado senescencia e inmortalización espontánea. A pesar
del hecho de que en estos experimentos los fibroblastos humanos
estaban mucho menos afectados, otros estudios demuestran que las
células humanas no son insensibles al estrés oxidativo. Por
ejemplo, los condrocitos de cartílago articular humano han
demostrado ser sensibles al estrés oxidativo. Usando líneas
celulares, se ha demostrado que el oxígeno induce predominantemente
reagrupamientos genómicos en células que proliferan rápidamente.
Por otra parte, se ha demostrado que los fibroblastos humanos
también sufren senescencia en respuesta al estrés oxidativo, lo que
puede provocar acortamiento del telómero y roturas de la hebra
simple en el DNA telómero a una velocidad que depende del estrés
oxidativo. En cultivos de fibroblastos, se obtuvo un incremento en
los doblamientos de población cuando se disminuía la tensión de
oxígeno. Otra observación notable es que la senescencia regula al
alza ocho genes entre los que se encuentran fibronectina,
osteonectina y procolágeno alfa1.
La bioseguridad es un aspecto muy importante de
los retos reguladores para válvulas cardíacas sembradas con células
in vitro e impone el desarrollo de un control de calidad
restrictivo para cada prótesis valvular individual antes de la
implantación en el receptor. Los retos reguladores incrementados
también incrementarán notablemente los costes de tales prótesis,
limitando de ese modo su uso a grupos específicos de pacientes.
Existe una necesidad en la técnica de un modo
para obtener válvulas cardíacas y otros dispositivos implantables
sometidos a ingeniería tisular viables. Más particularmente, existe
una necesidad de andamiajes que sean adecuados para la siembra
celular, particularmente la siembra celular in vivo, lo más
particularmente cuando se necesita que la siembra celular se
produzca bajo condiciones de estrés por cizalladura incrementado,
tales como andamiajes de válvulas cardíacas y vasos sanguíneos.
La presente invención se refiere generalmente al
uso de factores orientadores en la generación de andamiajes de
tejidos y órganos usados para implantación en el cuerpo de un animal
o un ser humano de acuerdo con las reivindicaciones. De acuerdo con
un aspecto particular, la presente invención se refiere al uso de
factores orientadores en la generación de andamiajes susceptibles
de alto estrés por cizalladura al implantarse en el cuerpo. Lo más
particularmente, la invención se refiere a andamiajes para usar en
el sistema cardiovascular, el sistema linfático u otros vasos tales
como la uretra. Una realización específica de la presente invención
se refiere a andamiajes que comprenden una matriz estructural
revestida con uno o más factores orientadores. Más particularmente,
los factores orientadores de la presente invención son factores
capaces de unirse a células pluripotenciales o células
progenitoras.
Un aspecto particular de la presente invención
se refiere a andamiajes de dispositivos implantables destinados a
un uso y una función prolongados dentro del cuerpo, es decir,
basados en una matriz durable biocompatible pero no biodegradable.
De acuerdo con una realización específica, la matriz estructural es
una prótesis no reticulada o una raíz aórtica acelularizada.
Un aspecto particular adicional de la presente
invención se refiere a andamiajes que comprenden uno o más factores
orientadores en los que el factor orientador es un ligando de
receptor, o uno de sus fragmentos que comprende el dominio de unión
al receptor, o un péptido que se une al receptor. Lo más
particularmente, el receptor es un receptor expresado sobre células
pluripotenciales o células progenitoras.
Los factores orientadores o proteínas
orientadoras usados en el contexto de la presente invención son
factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales,
VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de
fibrinógeno, más particularmente factor derivado del estroma 1
(SDF-1) o factor de células pluripotenciales (SCF)
o sus fragmentos o derivados.
En una realización particular, la matriz del
andamiaje está revestida con uno o más factores orientadores y una
proteína que facilita la interacción entre una célula y la matriz
del andamiaje. Tal proteína puede ser, pero no se limita a,
fibronectina, colágeno o fibrinógeno. En una realización particular
en la que la proteína orientadora es VCAM-1, la
interacción entre VCAM-1 y su receptor en una célula
se potencia adicionalmente de forma opcional mediante la adición
del inhibidor de proteasa pleiotrópico macroglobulina alfa2.
En una realización particular de la invención,
el factor o los factores orientadores se reticulan químicamente a
la matriz estructural por medio de un brazo conector. En la presente
memoria, un brazo conector está espaciado entre el factor
orientador y la matriz estructural. La unión entre el factor
orientador y la matriz puede ser irreversible (permanente) o
biodegradable.
De acuerdo con una realización adicional de la
presente invención, el factor o los factores orientadores de la
presente invención pueden estar en la forma de una proteína de
fusión con una proteína que facilita la unión a la matriz
estructural (es decir, las dos proteínas forman una cadena
polipeptídica consecutiva).
En una realización particular, la matriz
estructural del andamiaje de la presente invención es un material
biológico tal como pericardio bovino reticulado o raíces aórticas
porcinas.
En una realización adicional más, el factor
orientador está químicamente reticulado a la matriz del andamiaje
de la presente invención.
La presente invención también se refiere a
métodos para preparar el andamiaje de la presente invención por los
que la matriz del andamiaje se reviste con uno o más factores
orientadores. De acuerdo con una realización particular, el
revestimiento se asegura mediante impregnación, es decir mediante
incubación de la matriz en una solución que comprende uno o más de
los factores orientadores mencionados anteriormente en un tampón de
impregnación apropiado (por ejemplo: solución salina tamponada con
fosfato). Realizaciones particulares de este método incluyen una
etapa de prerrevestimiento con una o más proteínas que facilitan la
interacción entre el factor orientador y la matriz estructural.
De acuerdo con una realización particular, los
andamiajes de la presente invención no comprenden factores
quimioatrayentes o factores de movilización. Alternativamente, los
andamiajes de la presente invención comprenden uno o más factores
orientadores de la presente invención en combinación con uno o más
factores quimioatrayentes y/o factores de movilización.
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona estuches ("kits") que comprenden una matriz
estructural, opcionalmente en la forma de un dispositivo
implantable, tal como, pero no limitado a, un vaso sanguíneo o una
válvula cardíaca, y uno o más factores orientadores.
De acuerdo con esto, la invención se refiere al
uso de factores orientadores para potenciar la siembra in
vivo sobre un andamiaje adecuado para reemplazar un tejido u
órgano alterado o enfermo. El uso de factores orientadores tiene
ventajas particulares en la generación de andamiajes para la
implantación en una zona que está bajo alto estrés por cizalladura,
p. ej. un andamiaje para el uso en el sistema cardiovascular tal
como una válvula cardíaca o un injerto vascular.
La presente invención divulga andamiajes, más
particularmente andamiajes para dispositivos implantables que
comprenden una matriz que, por la presencia de uno o más factores
orientadores, asegurará la unión de células apropiadas a los
mismos. Un "andamiaje", según se usa en la presente memoria, se
refiere a un dispositivo médico implantable para reparación,
restauración, aumento o regeneración tisular o para reemplazar un
tejido u órgano enfermo, dañado, perdido o comprometido de otro
modo en el cuerpo de un paciente. Un "dispositivo médico
implantable", según se usa en la presente memoria, se refiere a
cualquier dispositivo que esté destinado a ser introducido y
opcionalmente implantado en el cuerpo humano, incluyendo
dispositivos usados para la implantación en vasos, conductos u
órganos corporales, tales como un separador intraluminal
("stent"), un catéter, una cánula, una envuelta de injerto
vascular o arterial, un dispositivo para implantación en el esófago,
la tráquea, el colon, el tracto biliar, el tracto urinario,
dispositivos ortopédicos, etc.
De particular interés dentro del contexto de la
presente invención son andamiajes que están destinados a zonas en
las que el estrés por cizalladura actuará contra la adherencia
natural de células apropiadas a una matriz. Así, de particular
interés en el contexto de la presente invención son andamiajes para
el uso en la sustitución y/o la restauración de tejidos que son
susceptibles de alto estrés por cizalladura, tales como un vaso
sanguíneo o una válvula cardíaca, el uréter, los conductos
biliares, los conductos pancreáticos, los conductos císticos,
hepáticos o biliares comunes, y similares.
La siembra de tales andamiajes puede asegurarse
in vivo, in situ (es decir durante la implantación en
la zona de la arteria enferma o dañada) in vivo, ex
situ (es decir la implantación en otro sitio del cuerpo) o in
vitro (p. ej. en un biorreactor).
Las proteínas orientadoras o los factores
orientadores se definen como moléculas de atraque que interactúan
con uno o más tipos de células específicos y, así, cuando se ligan a
una matriz, permiten el enriquecimiento de esos tipos de células
sobre la matriz. Tal molécula de atraque asegura la interacción
entre la matriz y una molécula en la superficie de la célula, tal
como otra proteína o una estructura de carbohidrato, también
denominada en la presente memoria la molécula diana celular. De
acuerdo con una realización particular de la invención, el factor
orientador es una molécula que asegura una interacción específica
entre la matriz y uno o más tipos de células específicos; esto
puede asegurarse mediante la unión del factor orientador a una
molécula que se produce esencialmente solo sobre la superficie de
uno o más tipos de células específicos o al ajustar el factor
orientador a fin de que se una solamente a la molécula diana celular
sobre uno o más tipos de células específicos.
Típicamente, la interacción entre el factor
orientador y la célula es una interacción
ligando-receptor. Así, una realización particular
de la invención se refiere a andamiajes que comprenden uno o más
ligandos de receptores que se unen a un cierto tipo de célula, más
particularmente a los tipos de célula descritos posteriormente en
la presente memoria.
De acuerdo con otra realización, los factores
orientadores son moléculas que se unen específicamente a estructuras
de carbohidrato que, lo más particularmente, se expresan
específicamente sobre células pluripotenciales o células
progenitoras. Porciones de estas proteínas que se unen a
carbohidratos que retienen sus propiedades de unión a azúcares son
igualmente adecuadas para funciones como factor orientador.
Un factor orientador adecuado para los
andamiajes y los métodos de la presente invención pueden ser una
proteína truncada y/o un derivado tal como una proteína mutada, con
tal de que retenga su capacidad para unirse a la molécula diana
celular. Regiones de unión mínimas de una proteína orientadora
pueden definirse mapeando deleciones de truncamiento. De acuerdo
con una realización particular de la presente invención, la molécula
diana celular es un receptor y el factor orientador es un fragmento
de uno de sus ligandos, tal como uno de sus fragmentos que se unen
al receptor. Típicamente, factores orientadores que son formas
derivadas o mutadas de ligandos proteínicos o sus fragmentos tienen
al menos 80%, particularmente al menos 90%, lo más particularmente
al menos 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el
ligando natural o su fragmento mientras que retienen la capacidad
para unirse a la molécula diana celular.
Los factores orientadores de la presente
invención aseguran y/o incrementan la adherencia de las células a
una matriz bajo condiciones variables. La unión de células a través
de los factores orientadores de la presente invención proporciona
ventajas particulares para la siembra de andamiajes de tejidos en
condiciones de alto estrés por cizalladura.
Las células que son capturadas por medio de los
factores orientadores de la presente invención son células que son
de interés en la generación de un andamiaje apropiado, es decir un
andamiaje que puede funcionar de modo similar al tejido u órgano al
que sustituye. De acuerdo con una realización particular de la
presente invención, el factor orientador es una proteína capaz de
unirse a una célula pluripotencial o una célula progenitora (es
decir, no diferenciada pero comprometida a uno o más linajes
celulares), más particularmente células progenitoras
hematopoyéticas. Las células pluripotenciales de la presente
invención excluyen células pluripotenciales de origen embrionario
humano.
De acuerdo con una realización particular de la
presente invención, el factor orientador es una molécula capaz de
unirse a una célula pluripotencial mesenquimal o hematopoyética. La
presente invención demuestra que la orientación de células
pluripotenciales y/o células progenitoras sobre una matriz asegurará
un andamiaje matricial sembrado con células que se diferencian en,
entre otras, células miofibroblásticas.
Moléculas orientadoras particularmente adecuadas
son del grupo que consiste en los epítopos P1 y P2 de fibrinógeno,
factor de células pluripotenciales (SCF), factor derivado del
estroma 1 (SDF-1), fibronectina (FN) y molécula de
adhesión celular vascular 1 (VCAM-1) (figura 4), lo
más particularmente SDF-1 o SCF o sus fragmentos o
derivados que retienen su afinidad de unión al receptor.
Una realización particular de la presente
invención se refiere al uso de SDF-1 como una
proteína orientadora para la siembra de una matriz.
SDF-1 (factor derivado de células del estroma 1)
también se conoce como prefactor estimulante del crecimiento de
células B (PBSF) o como quimioquina, motivo cxc, ligando 12
(CXCL12). Las secuencias de cDNA y proteína de
SDF-1 se presentan respectivamente en Genbank bajo
los Números de Registro E09668 y NP_001029058.
SDF-1 existe en dos formas diferentes de 68
aminoácidos (alfa) y 72 aminoácidos (beta), respectivamente, en
donde la forma beta tiene 4 aminoácidos adicionales en el extremo
carboxi en comparación con la forma alfa. SDF-1 es
el ligando del receptor CXCR4 (Bleuel et ál. (1996) Nature
382, 829-833). La importancia de un extremo N
intacto de SDF1 para la unión al receptor está documentada [p. ej.
Sadir J Biol Chem. 2004 279, 43854-43860]. Así,
para la presente invención, fragmentos de SDF-1 son
fragmentos que retienen el extremo amino de la proteína. De acuerdo
con una realización particular, un fragmento o derivado de
SDF-1 es uno que contiene la región aminoterminal
(aminoácidos 1-14) y la lámina beta central
(aminoácidos 15-54) pero que carece de uno o más
aminoácidos de la región carboxiterminal (aminoácidos
55-68 y 55-72 de la forma alfa y
beta, respectivamente). La actividad de unión al receptor de tales
fragmentos puede evaluarse según se describe en Sadir et ál.
(citado anteriormente).
De acuerdo con otra realización más de la
presente invención, se usa SCF como una proteína orientadora en una
matriz. El SCF es reconocido por células pluripotenciales
mesenquimales (MSC) de la médula ósea a través de su receptor de
proteína tirosina quinasa (c-kit) en el ratón o
CD117 en seres humanos (Jiang et ál. (2002) Nature 418,
41-49; Nakamura et ál. (2004) Exp. Hematol.
32, 390-396) y puede así asegurar la orientación de
MSC. Adicionalmente, CD117 es un factor esencial en el desarrollo de
células progenitoras hematopoyéticas (Agis et ál. (1993) J
Immunol, 151, 4221-4227). El SCF (factor de células
pluripotenciales) también es conocido como ligando KIT (KITLG),
factor de crecimiento de células cebadas (MGF) y homólogo de factor
Steel (SF). Las secuencias de cDNA y proteína de SCF están
depositadas en Genbank bajo el número de registro M59964. SCF es el
ligando para el receptor de tirosina quinasa KIT. SCF existe
naturalmente como isoformas ancladas a la membrana o solubles como
resultado de reparación de RNA y procesamiento proteolítico
alternativos. De acuerdo con una realización particular de la
invención, un fragmento o derivado de SCF comprende el fragmento
aminoterminal de 189 aminoácidos que contiene el domino
extracelular de SCF. Alternativamente, un fragmento o derivado de
SCF comprende la forma soluble presente en la naturaleza que
contiene los 165 aminoácidos aminoterminales de SCF. De acuerdo con
otra realización particular más, el fragmento o derivado de SCF
comprende los 141 residuos aminoterminales que contienen el núcleo
de unión al receptor de SCF. La numeración de estos fragmentos se
refiere a una secuencia proteínica de 248 aminoácidos que se libera
después de la escisión de la secuencia líder. Los fragmentos de SCF
mencionados anteriormente y su capacidad de unión al receptor se
describen en Langley et ál. (1994) Arch Biochem Biophys.
311, 55-61. El SCF o los fragmentos o derivados de
SCF de la presente invención pueden ser monómeros o dímeros. Los
fragmentos dímeros pueden obtenerse al oxidar o reticular residuos
de cisteína que están implicados en la unión de dímeros.
Alternativamente, el SCF o sus fragmentos se expresan
recombinantemente en tándem con un péptido espaciador entre
ellos.
Una realización particular adicional de la
presente invención se refiere al uso de VCAM-1 como
proteína orientadora. Las secuencias de cDNA y proteína de
VCAM-1 se depositan en Genbank bajo el número de
registro M60335.
Una realización particular adicional de la
invención se refiere al uso combinado de un factor orientador y una
molécula que influye en la interacción entre la molécula orientadora
y su molécula diana celular (también denominada en la presente
memoria proteína facilitadora, véase posteriormente). De acuerdo con
una realización, VCAM-1 se añade a la matriz en
combinación con macroglobulina alfa2 (Figura 7), debido a que este
inhibidor de proteasas pleiotrópicas puede estabilizar la unión
entre VCAM-1 y VLA4. Esta función es un resultado de
la inhibición de proteasa pleiotrópica que degrada la proteína de
VCAM-1 (Levesque et ál. (2001) Blood 98,
1289-1297). Las secuencias de cDNA y proteína de
macroglobulina alfa2 se depositan en Genbank bajo el número de
registro NM_000014.
De acuerdo con otra realización particular, los
epítopos P1 y P2 de fibrinógeno se usan como proteínas orientadoras.
P1 y P2 se unen mediante la integrina mac1 de macrófagos (MF). Se
observó que la reacción a los cuerpos extraños es iniciada por la
adsorción de fibrinógeno a la superficie extraña. Esto induce
cambios de conformación de la molécula que dan como resultado la
exposición de 2 epítopos P1 y P2 (Hu et ál. (2001) Blood 98,
1231-1238). Los macrófagos unidos atraerán a
continuación a las células pluripotenciales como lo hacen en una
reacción a cuerpos extraños "estándar". Una realización de la
presente invención es una matriz adecuada que comprende los
epítopos P1 y P2 para atraer células pluripotenciales endógenas y
adecuada para la sustitución directa de una válvula cardíaca
deficiente, enferma o alterada. Los epítopos P1 y P2 pueden estar
conectados a la matriz. La invención también implica el uso de
epítopos P1 y P2 para revestir un andamiaje con dichos epítopos P1
y P2 para atraer células pluripotenciales endógenas después de la
implantación. Según se describe por Hu et ál. (2001, citado
anteriormente), el epítopo P1 se refiere a los aminoácidos 190 a 202
de fibrinógeno gamma, mientras que el epítopo P2 se refiere a los
aminoácidos 377 a 395 de fibrinógeno gamma.
De acuerdo con otra realización más de la
presente invención, la matriz comprende fibronectina para orientar
células progenitoras que expresan VLA-4 o
VLA-5. Las diferentes variantes de reparación de
fibronectina humana (FN1) se listan en la base de datos de
nucleótidos de NIH bajo los nº de registro: NM_212482 (variante 1),
NM_212475 (variante 2), NM_002026 (variante 3), NM_212478 (variante
4), NM_212476 (variante 5), NM_212474 (variante 6) y NM_054034
(variante 7).
Particularmente adecuada para el uso en el
andamiaje de la presente invención es una matriz o andamiaje que
comprende fibronectina y/o VCAM-1 y que comprende
además SDF-1 para actuar sinérgicamente con
fibronectina y/o VCAM-1.
El uso de las proteínas orientadoras factor
derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales,
VCAM-1, región P1 de fibrinógeno o región P2 de
fibrinógeno, caracterizado anteriormente, y de cualesquiera de sus
homólogos funcionales o derivados actualmente en la técnica o
disponibles para el experto en la técnica, como agentes
orientadores en andamiajes para válvulas cardíacas o vasos
sanguíneos, es parte de esta invención.
En teoría, los factores orientadores de la
presente invención pueden obtenerse del receptor del andamiaje,
pero con propósitos prácticos será más probable que los factores
orientadores se obtengan sintéticamente o recombinantemente (a
partir de un organismo bien pro- o bien eucariótico). Todas las
proteínas orientadoras mencionadas anteriormente están disponibles
comercialmente. SDF-1 humano recombinante y SCF
humano recombinante (E. coli) pueden obtenerse de diferentes
compañías (Sigma RBI, R&D systems, Campro y Calbiochem).
VCAM-1 humana recombinante (línea celular de
mieloma de ratón) está disponible de R&D systems. Fibronectina
nativa derivada de fibroblastos humanos está disponible de Sigma
RBI y Calbiochem. Fibrinógeno nativo derivado de plasma humano está
disponible de Sigma RBI y Calbiochem.
En cuanto a los epítopos P1 y P2 de fibrinógeno,
los epítopos pueden derivarse del fibrinógeno nativo mediante
escisión proteolítica de la proteína nativa, pero más
preferiblemente mediante biosíntesis in vitro siguiendo la
secuencia proteínica descrita por Hu et ál. (citado
anteriormente).
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, la presencia de uno o más factores orientadores asegura
la unión de uno o más tipos de células particulares a una matriz.
Así, en el contexto de la ingeniería tisular, más particularmente
la ingeniería tisular de órganos vasculares o linfáticos u otros
vasos tales como la uretra, donde la matriz está constantemente en
contacto con fluido, tal como la sangre o el fluido linfático, y las
células del mismo, la presencia de agentes orientadores solos puede
ser suficiente para asegurar la población de la matriz con las
células apropiadas. La presente invención demuestra que pueden
usarse factores orientadores para conectar físicamente y
específicamente células apropiadas a una matriz de elección (Figura
5). Así, una realización particular de la presente invención se
refiere a andamiajes que comprenden factores orientadores. Lo más
particularmente, la presente invención se refiere a andamiajes que
comprenden sobre su superficie solamente uno o más factores
orientadores, y no otras proteínas implicadas en la quimioatracción,
la movilización, etc. No solo los factores orientadores asegurarán
suficientemente la unión de las células pertinentes a la matriz,
sino que la ausencia de otras moléculas que afectan a la atracción
y/o la movilización celular evita efectos secundarios negativos
potencialmente importantes tales como la vascularización del
injerto.
Sin embargo, también se prevé dentro de la
presente invención que se use una combinación de factores
orientadores y otras moléculas bioactivas para el revestimiento de
la matriz que constituye el andamiaje de la presente invención.
Así, de acuerdo con una realización adicional de
la invención, la matriz también comprende, además del uno o más
factor o factores orientadores, uno o más de otros factores que
facilitan la unión de células apropiadas a una matriz. Tales otros
factores incluyen agentes de movilización, agentes quimioatrayentes
y factores facilitadores.
"Agentes de movilización", en el contexto
de la presente invención, son agentes que movilizan células, tales
como células pluripotenciales, desde el lugar del cuerpo en el que
se originan. Más particularmente, los agentes de movilización se
usan para incrementar la cantidad de células pluripotenciales en la
sangre. Un ejemplo particular de un agente de movilización es el
factor estimulante de colonias de granulocitos o GCSF. Este factor
presente en la naturaleza tiene baja toxicidad y efecto sinérgico
cuando se combina con otros factores de crecimiento
hematopoyéticos. Otros agentes de movilización son adenosina, factor
estimulante de colonias de granulocitos y monocitos
(GM-CSF), factor de células pluripotenciales (SCF),
interleuquina-1 (IL1), IL3, IL7, IL11 e IL12 (Fu
& Liesveld (2000) Blood Rev. 14, 205-218.). El
uso de factores de movilización además de los factores orientadores
de acuerdo con la presente invención es de particular interés en
aquellas herramientas y métodos que prevén la siembra de la matriz
in vivo. El agente de movilización se incluye opcionalmente
en la matriz, pero también puede administrarse al cuerpo antes de
la implantación del andamiaje.
Adicionalmente o alternativamente, la presente
invención prevé el uso de uno o más factores quimioatrayentes junto
con el factor o los factores orientadores y opcionalmente el agente
o los agentes de movilización descritos anteriormente.
"Quimioatrayentes" o "compuestos quimiotácticos", según se
usa en la presente memoria, son compuestos capaces de atraer
células. En general, tienen un efecto sobre las células cuando están
presentes en un gradiente. Posibles agentes quimioatrayentes para
células pluripotenciales son factor de crecimiento similar a
insulina (IGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
(Young et ál. (1999) Clin. Exp. Metastasis 17,
881-888).
Adicionalmente o alternativamente, la presente
invención prevé el uso de uno o más agentes facilitadores junto con
el factor o los factores orientadores y los factores adicionales
opcionales descritos anteriormente. Los "factores
facilitadores" son factores que facilitan o refuerzan la unión de
células a las proteínas o los factores orientadores de la presente
invención. Ejemplos de tales proteínas de facilitación incluyen
colágeno soluble, albúmina, fibrinógeno o fibronectina. Las
proteínas facilitadoras pueden revestirse sobre la matriz junto con
el factor orientador o pueden revestirse como una capa separada.
Así, la presente invención se refiere a una
matriz para el uso en la ingeniería tisular de vasos y otros
andamiajes implantables, tales como un vaso sanguíneo o válvulas
cardíacas, que comprende una matriz con uno o más factores
orientadores. Más particularmente, la invención se refiere a una
matriz que comprende SDF-1 y/o SCF diseñada para
sustituir válvulas cardíacas deficientes, enfermas o alteradas para
la recelularización in vivo. La matriz o el andamiaje
cargados con SDF-1 pueden comprender agentes
orientadores adicionales y pueden comprender además uno o más
agentes de movilización, por ejemplo un agente de movilización
seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de
colonias de granulocitos (G-CSF), adenosina, factor
estimulante de colonias de granulocitos y monocitos
(GM-CSF), factor de células pluripotenciales (SCF),
interleuquina-1 (IL1), IL3, IL7, IL11 e IL12 o una
de sus combinaciones. La matriz puede comprender además uno o más
agentes quimioatrayentes, por ejemplo un agente quimioatrayente
seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento similar
a insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF),
factor de crecimiento placentario (PLGF) o una de sus
combinaciones.
De acuerdo con una realización, el paradigma de
celularización de la presente invención comprende tres etapas
(Figura 2): Opcionalmente, una etapa inicial de movilización de
células pluripotenciales, en segundo lugar la implantación de un
andamiaje (p. ej. un vaso o una válvula) revestido con factores
orientadores y opcionalmente la liberación de agente
quimioatrayente por el andamiaje. De acuerdo con una realización
particular, tal andamiaje es un vaso o una válvula para el uso en
el sistema cardiovascular. Sin embargo, en esta realización, puesto
que los injertos de válvula o vaso sanguíneo se implantan en la
posición de la válvula o el vaso sanguíneo enfermos y están así en
contacto inmediato con la sangre, por lo tanto es suficiente
implantar la matriz con los factores orientadores, opcionalmente en
combinación con agentes quimioatrayentes.
La construcción de válvula cardíaca preparada
para la ligación de células endógenas de acuerdo con la presente
invención puede implantarse mediante un procedimiento de
implantación estándar, tal como, pero no limitado a, el descrito
posteriormente en la presente memoria. Las válvulas cardíacas se
implantan en posición ortotópica o heterotópica con o sin la
retirada completa o parcial de la válvula nativa. Se usan técnicas
de implantación clásicas como las descritas en la presente memoria
o la implantación puede implicar sistemas invasivos mínimos,
endovasculares o percutáneos (véase posteriormente). De forma
similar, los métodos de implantación para injertos vasculares son
conocidos en la técnica.
La tecnología de la invención también puede
aplicarse a prótesis valvulares percutáneamente implantables
mediante un método descrito en documentos tales como EP 1152780A1 y
WO 0045874A1. Estas solicitudes de patente describen un dispositivo
para la implantación de una válvula cardíaca a través de una ruta
percutánea comprendida por un globo de expansión periférica y una
bomba de flujo sanguíneo axial central, y son particularmente
adecuadas para injertos que no requieren siembra o maduración in
vitro.
La presente invención se refiere así a una
matriz para el uso en la ingeniería de andamiajes de órganos o
tejidos, más particularmente andamiajes de órganos y/o tejidos que
están sometidos a estrés por cizalladura, tales como andamiajes del
sistema cardiovascular o linfático o andamiajes del tracto urinario.
Lo más particularmente, la presente invención se refiere andamiajes
de tejido de válvulas cardíacas y vasos sanguíneos. De acuerdo con
una realización particular de la presente invención, el andamiaje
que comprende la matriz con el factor o los factores orientadores
de acuerdo con la presente invención se modela hasta la conformación
del dispositivo implantable que ha de usarse, y así corresponde a
un órgano, una válvula o un vaso prefabricado. El andamiaje debe
ser biocompatible e implantable bien quirúrgicamente o bien
percutáneamente. La presente invención prevé andamiajes tanto con
como sin separadores intraluminales.
Ejemplos de matrices adecuadas para el uso en el
contexto de la presente invención incluyen andamiajes
artificialmente producidos y moldeados, que pueden ser de polímero
sintético o de material biológico tal como colágeno o fibrina, y
andamiajes naturales tales como material radicular acelular o
material natural reticulado tal como pericardio (Figura 1). Una
matriz biológica incluye una matriz obtenida de novo a partir de
material biológico (tal como gel de fibrina humana) así como una
matriz que retiene la estructura de origen, tal como, pero no
limitada a, raíz aórtica acelularizada. El material biológico puede
ser autólogo (procedente del paciente en el que ha de implantarse
el dispositivo), homólogo (p. ej. procedente de material humano si
el implante ha de implantarse en un ser humano) o de origen
heterólogo (p. ej. bovino, porcino u ovino en el caso de un implante
en ser humano). La matriz biológica bien es reciente o bien se
trata de tal modo que no comprometa el crecimiento de células sobre
la superficie de la matriz o la flexibilidad de la matriz (p. ej.
crioconservación, radiación UV, fotooxidación). Los injertos
sintéticos pueden estar constituidos por materiales tales como
poliéster, politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) y otros
materiales compuestos que son conocidos en la técnica.
Particularmente, de acuerdo con la presente invención, la matriz
sintética es un material biocompatible y biodegradable tal como
mallas de poli(ácido glicólico) y polihidroxialcanoato, un poliéster
termoplástico derivado de bacterias. Alternativamente, los
dispositivos sintéticos pueden estar constituidos por materiales
tales como poliéster, politetrafluoretileno expandido (ePTFE) y
otros materiales compuestos que son conocidos en la técnica.
De acuerdo con una realización particular de la
presente invención, la matriz no es biodegradable y es así durable,
para permitir la presencia y el funcionamiento prolongados dentro
del cuerpo. Las matrices derivadas de pericardio bovino de las que
se han retirado las células (tales como Veritas® Collagen Matrix o
SynerGraf®) están previstas dentro del contexto de la presente
invención.
El "revestimiento" del factor o los
factores orientadores sobre la matriz de acuerdo con la presente
invención puede realizarse de varios modos. Entre los
procedimientos de revestimiento, tres procedimientos de
revestimiento son particularmente adecuados; para factores
orientadores que se unen naturalmente a la matriz, puede usarse un
procedimiento de impregnación. Esta unión dependerá tanto del factor
orientador como de la matriz. La impregnación implica una
incubación de la matriz en una solución comprendida por el factor
orientador en un disolvente apropiado tal como, pero no limitado a,
solución salina tamponada con fosfato. Esta solución es aplicable
tanto para dispositivos prerrevestidos como para un estuche de
revestimiento que permite el revestimiento antes de la implantación
en el quirófano.
Alternativamente, de acuerdo con la presente
invención, se realiza un prerrevestimiento con colágeno soluble,
albúmina, fibrinógeno o fibronectina. Esto es particularmente
adecuado cuando se usan factores orientadores que interactúan con
estas proteínas. Este método incluye un prerrevestimiento con una
proteína de la matriz extracelular. Este prerrevestimiento se basa
en interacciones con proteínas nativas reticuladas de la matriz y
sus homólogos naturales. En una segunda etapa, los factores
orientadores se unirán a continuación a estas proteínas de la
matriz extracelular. De nuevo, este procedimiento puede aplicarse
antes del transporte de los dispositivos implantables así como
también como un formato de estuche que permite el revestimiento en
el quirófano.
Alternativamente, puede asegurarse una
reticulación química con o sin una molécula espaciadora entre la
matriz y el factor orientador. El espaciador puede ser un conector
permanente o biodegradable, ya que una vez que las células se han
ligado, la presencia de los factores orientadores es menos crítica.
El factor puede reticularse inmediatamente a la matriz con tal de
que siga siendo funcional. Otra realización implica una reticulación
bioquímica con un brazo conector intercalado. La arquitectura
específica de este brazo conector permite el control de la
biodegradabilidad de la reticulación y, como tal, la farmacocinética
del factor orientador añadido. Se han descrito en la técnica
diferentes métodos para esta reticulación. Un paradigma
particularmente útil es el uso de una reticulación fotoquímica como
la descrita en el documento EP 0820483B1, pero se prevén diferentes
métodos de reticulación (p. ej. los métodos descritos en las
publicaciones de patente EP0991944B1, EP103587981 y
WO0159455A2).
De acuerdo con una realización particular de la
invención, uno o más factores orientadores y/o factores
quimioatrayentes y de movilización están presentes sobre la matriz
en la forma de una proteína de fusión. Una proteína de fusión puede
obtenerse mediante tecnología recombinante. A continuación, la
proteína de fusión se elige específicamente para la interacción con
la matriz, como tal la proteína de fusión comprende un resto
orientador así como un resto de interacción con la matriz.
Generalmente, una proteína de fusión es producida por un organismo
huésped que se ha alterado genéticamente mediante la inserción de
un gen, comprendido por la combinación de 2 genes que codifican
cada uno una proteína específica. Esto permite la combinación de
cualesquiera de los factores orientadores mencionados anteriormente
con una proteína que interactúa con la matriz reticulada. De nuevo,
la última proteína en el constructo de la proteína de fusión puede
ser el polipéptido completo o parcial de moléculas tales como, pero
no limitadas a, colágeno, fibrinógeno o fibronectina. La proteína de
fusión se selecciona en general por sus propiedades específicas de
orientación de células y unión a la matriz. La proteína de fusión
puede aplicarse al dispositivo implantable bien antes del transporte
o bien en formato de estuche inmediatamente antes de la
implantación en el receptor.
Es necesario adoptar precauciones para evitar la
desactivación de la proteína por cualquier tratamiento subsiguiente
de la válvula (es decir, esterilización). Es preferible una técnica
de esterilización que no altere significativamente la bioactividad
de los agentes de movilización, el agente quimioatrayente o los
agentes orientadores. Condiciones de esterilización adecuadas que
pueden conservar la actividad biológica de los agentes de
movilización, el agente quimioatrayente o los agente orientadores
están presentes en la técnica, tal como la esterilización de la
matriz cargada con, p. ej., una radiación gamma de baja dosis u
óxido de etileno. Métodos de esterilización particularmente
adecuados son óxido de etileno a una temperatura seleccionada de
dentro del intervalo de 37 a 63ºC o radiación con aproximadamente 1
a aproximadamente 3 mRad de radiación gamma o radiación de haz
electrónico. Si el agente bioactivo es una proteína o un péptido,
la actividad biológica puede optimizarse durante la esterilización
con radiación gamma al incluir en la formulación 1) una proteína
extraña, por ejemplo albúmina o gelatina; y 2) un eliminador de
radicales libres (antioxidante), por ejemplo galato de propilo,
3-terc-butil-4-hidroxianisol
(BHA) o ácido ascórbico, en cantidades eficaces para retardar la
degradación inducida por radiación del péptido biológicamente
activo. La esterilización se efectúa preferiblemente a baja
temperatura, por ejemplo -70ºC.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención se refiere a métodos para tratar a un paciente que tiene
un tejido, vaso u órgano enfermo o dañado, tal como, pero no
limitado a, un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca enfermo o
dañado, método que incluye implantar en dicho paciente el andamiaje
de la presente invención revestido con uno o más factores
orientadores.
De acuerdo con una realización particular, el
andamiaje se implanta para la siembra in vivo. Sin embargo,
alternativamente, también se prevé la siembra in vitro. La
siembra in vitro puede tener lugar en un biorreactor.
Biorreactores adecuados en el contexto de la presente invención son
conocidos en la técnica e incluyen los descritos por Hoerstrup
et ál. (2002, Tissue Engineering 8(5):
863-870).
Realizaciones particulares de los factores
orientadores usados de acuerdo con la presente invención y las
células ligadas a los mismos se ilustran en la Figura 4. Será
evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse
diversas combinaciones de factores orientadores. Por otra parte,
también se prevén diversas modificaciones y variaciones en la
fabricación y el uso de los andamiajes de la presente invención y en
la construcción del sistema y el método.
Los andamiajes de la presente invención
proporcionan ventajas particulares sobre los andamiajes de la
técnica anterior, que implican un número de riesgos según se
ilustra en la Figura 3. Un primer riesgo es una exposición de las
células del paciente a patógenos xenogénicos (p. ej. priones, virus
y otros). El riesgo de agentes adventicios es introducido a través
bien de enzimas proteolíticas o bien de medios de cultivo. Aunque
estos factores son típicos para la fase in vitro de
ingeniería tisular de la válvula cardíaca, el riesgo no se limita a
estas rutas de infección. Otras rutas de infección son materiales
matriciales xenogénicos o infección cruzada entre células de
pacientes cuando se tratan en las mismas instalaciones. Las
infecciones virales plantean algunos riesgos específicos, muchos de
los cuales dependen de la cepa de infección, tales como infección
del paciente después de la implantación, mutagénesis por inserción
genómica del DNA viral y función protooncogénica de proteínas
virales que posiblemente inducen la inmortalización. La segunda
familia de riesgos son el factor ambiental celular no fisiológico,
al que las células se exponen bajo condiciones in vitro. Un
ejemplo es el daño potencial al DNA inducido por tensión de oxígeno
no fisiológica que induce estrés oxidativo. La conclusión es que
cada uno de estos factores necesita probarse debido a que las
células son "propias" y serán aceptadas por el sistema
inmunitario del paciente ignorando su daño inducido
potencialmente.
Las siguientes Figuras ilustran la invención
pero no han de interpretarse como una limitación de la invención a
las realizaciones específicas descritas en ella.
Figura 1: Vista esquemática que muestra una
visión de conjunto general de las elecciones del andamiaje de
acuerdo con una realización particular de la presente invención. Un
primer grupo son andamiajes moldeados. Estos usan termoplásticos
bien biológicos o bien no biológicos para crear un andamiaje
valvular. En general, esto se alcanza usando un molde de colada en
el que el termoplástico se deja endurecer o mediante un
procedimiento conocido como electrohilado. Otra opción es usar
proteínas tales como colágeno o fibrina para crear tal válvula.
Estas construcciones formadas por una proteína natural, obtenida de,
p. ej., un paciente, son de origen alogénico o xenogénico o
recombinantes. A continuación, estas proteínas se dejan interactuar
entre sí en un molde para válvulas. El segundo grupo son los
andamiajes naturales, es decir válvulas biológicas bien alogénicas o
bien xenogénicas. Pueden distinguirse dos clases principales: (1)
raíces aórticas acelularizadas y (2) prótesis reticuladas.
Figura 2: Diagrama esquemático que muestra el
paradigma completo de la ingeniería tisular según se pone en
práctica en la ingeniería tisular de válvulas cardíacas de acuerdo
con una realización de la invención. Se realiza una construcción de
válvula mediante la siembra de células apropiadas sobre un andamiaje
apropiadamente elegido. Estas células pueden ser células
endoteliales, fibroblastos o células intersticiales de válvula. La
construcción valvular creada in vitro se pone a continuación
en un biorreactor durante un cierto período de tiempo para madurar
la construcción, mientras se acostumbran las células al incremento
gradual del flujo y la presión. A continuación, la construcción
madura se implanta generalmente después de algunas semanas en el
receptor, donde puede someterse a remodelación in vivo.
Figura 3: Vista esquemática que muestra los
riesgos del paradigma completo en la ingeniería tisular de válvulas
cardíacas de acuerdo con una realización de la presente
invención.
Figura 4: Vista esquemática que muestra
proteínas orientadoras y receptores respectivos presentes sobre
tipos de células específicos de acuerdo con una realización de la
invención. El epítopo P1 o P2 de fibrinógeno interactúa con la
integrina mac1 expresada por macrófagos. El factor de células
pluripotenciales (SCF) se une al receptor de proteína tirosina
quinasa (c-kit o CD117) de células pluripotenciales
"mesenquimales" (MSC). La orientación de células
pluripotenciales hematopoyéticas (HSC) puede alcanzarse mediante
diferentes interacciones. Esto se alcanza preferentemente mediante
factor derivado de estroma 1 (SDF-1) que se une a su
receptor CXCR4. Las HSC también se ligan a fibronectina (FN) por
medio de antígeno muy tardío (VLA) 4 ó 5, adicionalmente
VLA-4 también se está uniendo a molécula de
adhesión a células vasculares 1 o VCAM-1. La última
unión puede potenciarse mediante el inhibidor de proteasa
pleiotrópico a2-macroglobulina
(a2-MG).
Figura 5: Conformación esquemática de un
andamiaje de la presente invención después de la siembra celular de
acuerdo con un aspecto de la invención. Una proteína orientadora
sobre la matriz interactúa con un receptor de una célula atraída.
La especificidad de la unión celular se determina mediante la
elección apropiada de la proteína orientadora.
Figura 6: Ejemplo de laminilla sembrada
espontánea (A) y una presembrada IP (B) de acuerdo con un aspecto
de la invención. El Panel C muestra la recelularización (conteo
celular total/longitud de la laminilla) de laminillas tanto
sembradas espontáneas como presembradas IP en 1 semana y 1 mes
*:p<0,05.
Figura 7: Histología. Gráfica A: valor medio de
sobrecrecimiento de laminillas tanto sembradas espontáneas como
presembradas IP en 1 semana y un mes. Gráfica B: superficie mediana
de matriz recientemente depositada sobre el pericardio bovino
fotooxidado. Gráfica C: valor mediano de la longitud de la laminilla
medida desde la superficie hasta la punta. *:p<0,05
Figura 8: Caracterización de válvulas
implantadas usando anticuerpos para marcadores celulares según se
describe en la presente memoria en el Ejemplo 1. Los datos se
presentan como mediana [95% CI]. * indica diferencia significativa
entre los grupos de 1 semana; \dagger indica diferencia
significativa entre ambos grupos de control o entre ambos grupos
sembrados IP; t indica diferencia entre ambos grupos de 1 mes;
\NAK indica significativamente diferente de las muestras de
prueba IP, e indica que no podía realizarse un análisis estadístico
debido a que n < 6.
Figura 9: Porcentaje de células (A)
VLA-4+, (B) CD44+ y (C) CD172a+ presentes en el
material durante las diferentes fases de la FBR. Los puntos y las
barras de error representan promedio \pm desviación estándar. a)
significativamente diferente de 6 horas (p<0,05); b)
significativamente diferente de 6 horas, 1, 2 y 3 días (p<0,05);
c) significativamente diferente de 3 días (p<0,05); d)
significativamente diferente de 2 días (p<0,05). Para CD172a,
los datos de 6 horas se excluyen del análisis estadístico debido a
datos de 2 ratas perdidos. La capacidad de unión y orientación de
células es alta, directamente después de la implantación, y
generalmente disminuye posteriormente, excepto para un pico
significativo en células CD172a+ el día 3.
Figura 10: Porcentaje de células
pluripotenciales primitivas (A) CD133+ y (B) Sca-1+
y el porcentaje de progenitores (C) CD34+ y (D) CD117+ presentes en
el material durante las diferentes fases de la FBR. Los puntos y las
barras de error representan promedio \pm desviación estándar. a)
significativamente diferente de 5 días (p<0,05); b)
significativamente diferente de 3, 5 y 7 días (p<0,05); c)
significativamente diferente de 3 días (p<0,05); d)
significativamente diferente de 2 días (p<0,05). Como puede
observarse, las células pluripotenciales primitivas
Sca-1+ tienen un pico en su presencia a las 6 horas
después de la implantación, mientras que las células progenitoras
CD34+ y CD117+ tienen un pico en su presencia a los 2 y 3 días
después de la implantación.
Figura 11: Resultado obtenido de los perfiles de
expresión génica determinados por microordenación de implantes
intraperitoneales después de 1,5 y 3 días y macrófago peritoneal
(IP) de acuerdo con un aspecto de la invención.
Figura 12: Resultados de la fracción de células
CD117 (a) y Sca-1 (b) positivas presente en los
controles e injertos de arteria carótida impregnados con
SDF-1 y SCF (con o sin prerrevestimiento con FN). El
asterisco indica diferencia significativa del control (n=6 en cada
grupo) y # indica diferencia del grupo de SDF.
Figura 13: Presencia de células CD34+ (células
pluripotenciales/progenitoras hematopoyéticas) sobre parches
implantados en arterias de oveja.
Para obtener una matriz sembrada para
identificar los factores clave implicados en la adhesión de células
apropiadas, se usó una reacción de cuerpos extraños inmadura para
repoblar una matriz biológica reticulada, a saber pericardio bovino
fotooxidado. Tal tipo de matriz asegura la durabilidad por sí mismo.
En la oveja, un andamiaje o parche implantado intraperitoneal (IP)
de tres días se cubre con células similares a blastos con origen
mesenquimal y diferenciación inmadura que podrían diferenciarse y
normalmente lo harían en un fenotipo miofibroblástico. Más
particularmente, se encontró que estas células eran positivas para
la vimentina pero negativas para actina del músculo liso \Delta y
miosina de la cadena pesada (véase la Tabla 1).
- * indica diferencia significativa entre la oveja y la rata (p<0,05)
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró que podía obtenerse una matriz
estable con durabilidad probada que se diferencia en un fenotipo
diferente en unos pocos días.
Se construyó una válvula del material madurado
IP de oveja y se implantó en la artería pulmonar de la oveja, y se
determinó con respecto a la funcionalidad. Se implantaron 24
válvulas (12 controles no sembrados y 12 válvulas sembradas
intraperitonealmente). En cada uno de los dos grupos se estudiaron 2
puntos temporales 1 semana (n = 6 por grupo) y 1 mes (n = 6 por
grupo) después de la implantación en la arteria pulmonar. La
función de la válvula se determinó mediante ecocardiografía. No se
observaron anormalidades. No se observó una formación importante de
trombos en los injertos sembrados intraperitonealmente, mientras que
se encontró 1 en el grupo de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando tinción histológica, se encontró que
había una notable diferencia en la celularización entre los
controles y las construcciones valvulares sembradas
intraperitonealmente. En contraste con los controles, se observó
una deposición significativa de células y nueva matriz sobre la
válvula sembrada intraperitonealmente, que también mostraba
claramente una repoblación de la matriz original (véanse las Figuras
6 y 7). Criosecciones de 7 \mum de la válvula explantada y
muestras de control se tiñeron inmunofluorescentemente para CD44
(clon BAT 31A, VMRD Inc.), CD45 (clon 1.11.32, Serotec), CD172a
(clon DH59B, VMRD Inc.), vimentina (clon V9, DAKO), ASMA (clon 1A4,
DAKO), SMMS-1 (clon SMMS-1, DAKO),
fosfohistona H3 (policlonal, CAMPRO scientific), CD117 (policlonal,
ABCAM), ecNOS (clon 3, BD Biosciences), MHC-I (clon
H58A, VMRD, Inc), MHC-II (clon TH14B, VMRD, Inc y
CD34 (clon QBEnd 10, DAKO).
[CD44: H-CAM, ácido hialurónico
que se une a moléculas de la superficie celular; CD45: antígeno
común de leucocitos; CD172a: es un marcador para monocitos y
células pluripotenciales; vimentina: es un marcador para células
mesenquimales; actina del músculo liso alfa (ASMA): es un marcador
para miofibroblastos y células del músculo liso; miosina de la
cadena pesada (SMMS-1): es un marcador para células
del músculo liso; fosfohistona H3: es un marcador para la mitosis;
CD117 es un marcador para células pluripotenciales; ecNOS: es un
marcador para el endotelio; MHC-I y
MHC-II son marcadores para la respuesta inmune;
CD34: es un marcador para células progenitoras].
Se contaron las células que están presentes en y
sobre el material matricial implantado, en una sección de laminilla
completa. El control sembrado espontáneo tenía 3753 [995, 17254] y
3345 [1562, 4298] células por sección en 1 semana y 1 mes después
de la implantación en la posición pulmonar, respectivamente. Por
otra parte, las válvulas presembradas IP tenían 12126 [4571, 28216]
y 20404 [4723, 32084] células por sección en 1 semana y 1 mes,
respectivamente. Este incremento de cuatro a siete veces en el
conteo de células entre válvulas presembradas espontáneas e IP era
significativo.
Los porcentajes de células positivas encontrados
en las secciones valvulares se resumen en la Tabla de la Figura 8.
Los datos de todos los grupos y las tinciones se representan como
valores medianos y el intervalo de confianza de 95%. Puesto que
estos son porcentajes, solo se muestra la fracción de células
positivas, teniendo en cuente las grandes diferencias en las
células totales observadas, son evidentes grandes diferencias en el
conteo absoluto del tipo de célula.
Estos hallazgos ilustran claramente el potencial
de estas células para revitalizar la matriz biológica estabilizada
con miofibroblastos. Por otra parte, los implantes de 1 mes ya
mostraban signos de reendotelialización espontánea. El proceso de
recelularización parece ser autolimitante, ya que la cantidad de
material recientemente depositado no se incrementa continuamente y
está siendo cubierta por endotelio. Esto impide que nuevas células
se adhieran y contribuyan al proceso de recelularización.
Aunque se ha usado matriz biológica
estabilizada, las células obtenidas mediante siembra peritoneal son
capaces de modificar esta matriz así como de depositarse por sí
mismas.
Esta válvula biohíbrida construida de material
matricial xenogénico y células autólogas combina la fiabilidad de
la matriz con la viabilidad de las células. Las células son de
origen mesenquimal y pueden diferenciarse en el fenotipo apropiado,
miofibroblasto, para la repoblación celular. El presente estudio
demuestra que la repoblación, aunque mediada o iniciada por
macrófagos, se deriva de células pluripotenciales
(hematopoyéticas).
\vskip1.000000\baselineskip
El material matricial se introdujo
intraperitonealmente en ratas y se investigó el tipo de células
atraídas.
Se seleccionaron ratas Wistar macho (n = 36;
380-400 g). Se dio acceso a alimento ad líbitum.
Todos los animales se cuidaron de acuerdo con la "Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals" (publicación NIH
85-23, revisada en 1985). El estudio fue aprobado
por el Comité de Ética local.
La anestesia se indujo con isoflurano al 4% en
oxígeno al 100%, 1 l/min, durante 5 minutos y se mantuvo con
isoflurano al 2% en oxígeno al 100%, 0,5 l/min, durante el
procedimiento quirúrgico que duraba aproximadamente 20 min. Después
de afeitar y desinfectar, se realizó una incisión pararrectal de
aproximadamente 1,5 cm a través de la piel, los músculos
abdominales y el peritoneo. La jaula de acero inoxidable que
contiene el material matricial se insertó en la cavidad abdominal y
se fijó a la pared abdominal con suturas transabdominales (Ticron
3-0). El peritoneo y los músculos abdominales se
cerraron con una sutura corrida (Ticron 3-0) y la
piel se suturó intradérmicamente (Ticron 3-0) para
evitar la apertura de la herida por el acicalamiento. Después del
procedimiento quirúrgico, la anestesia se interrumpió. Después de
aproximadamente 5 min, los animales recobraban la consciencia y
colocaban en jaulas individuales.
La recuperación de los materiales matriciales se
realizó en diferentes puntos temporales. Los diferentes momentos de
recuperación eran 6 horas, 1, 2, 3, 5 y 7 días después de la
implantación, dependiendo del grupo al que se asignara el animal.
Con este propósito, los animales se anestesiaron de nuevo, la herida
se reabrió y la jaula se retiró.
El material matricial recuperado se embebió en
medio de congelación tisular (Leica - Van Hopplynus instruments,
Bruselas, Bélgica), se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y
se almacenó a -80ºC. El crioseccionamiento se realizó en un
criostato Microm HM500 OM (Prosan, Merelbeke, Bélgica). Las
secciones de 7 \mum se pusieron sobre portaobjetos revestidos con
poli-L-lisina y se almacenaron a
-20ºC hasta la tinción.
Antes de la tinción, el material se fijó en
acetona enfriada con hielo durante 10 min. Subsiguientemente, las
secciones matriciales se tiñeron inmunohistoquímicamente con
anticuerpos. Los anticuerpos primarios se detectaron con
anticuerpos secundarios conjugados a FITC. Se tomaron fotografías a
temperatura ambiente usando un microscopio de toma de imágenes
Axioplan 2 con una cámara Zeiss Axiocam MRc5 (Zeiss; Zaventem,
Bélgica). Las lentes del objetivo usadas eran
Plan-NEOFLUAR 1x/0.025,
Plan-POCHROMAT 10x/0.45 y 20x/0.75. El análisis de
las imágenes se realizó con Axiovision Rel. 4.4.
Para estudiar los fenotipos celulares
(inmunohistoquímica) con detalle, se agruparon de acuerdo con la
función o la especificidad. La densidad y la proliferación
celulares se estudiaron en 6 puntos temporales diferentes (n = 6
por punto temporal) después de la implantación intraperitoneal.
Los datos se representan como promedio \pm
desviación estándar. a diferencia significativa de 6 h (p<0,05);
b diferencia significativa de 5 d (p<0,05); c diferencia
significativa de 3 d (p<0,05).
La Tabla 3 muestra que las células están
presentes sobre el material implantado completamente acelular desde
6 horas después de la implantación intraperitoneal en adelante. En
los implantes, puede observarse un incremento general en el número
de células a lo largo del tiempo, haciéndose significativo desde el
día 1 en adelante. A los 7 días después de la implantación, se
observa un incremento de más de 4 veces en el número de células. El
marcador usado para determinar la proliferación celular in
situ, fosfohistona H3 (PPH-H3), muestra un pico
significativo de aproximadamente 5% en la proliferación celular
in situ el día 3 después de la implantación. Excepto por la
presencia del pico en la proliferación celular el día 3, estos datos
apoyan una neogénesis de tejido por aflujo celular más que por
división celular. Sólo el día 3 la proliferación celular parece
contribuir al incremento en la celularidad.
La capacidad de unión y orientación de células
se determinó con anticuerpos para VLA-4 (CD49d),
CD44 y CD172a o proteína reguladora de señales alfa (SIRPa). La
Figura 9 muestra que células VLA4+ estaban claramente presentes en
la primera fase de la FBR que comprende alrededor de 20% de la
población celular y que esta fracción disminuye significativamente
para aproximarse a la ausencia después de 5 días de la implantación
intraperitoneal. Las células CD44+ muestran una presencia de
partida similar pero disminuyen significativamente los días 2, 5 y
7, en comparación con las medidas a las 6 horas, pero manteniendo la
presencia en aproximadamente 10% hasta el día 7. Los datos de
CD172a muestran un patrón similar de presencia de estas células,
situado dentro del mismo orden de magnitud que los datos de CD44,
excepto por el hecho de que la disminución no está presente
significativamente y que un pico pequeño pero estadísticamente
significativo se sitúa en el día 3. VLA-4 (CD49d),
encontrado en células T, células B, timocitos, células
pluripotenciales hematopoyéticas CD34+ y células endoteliales, es
una molécula de integrina que se une a molécula de adhesión celular
vascular 1 (VCAM-1) sobre el estroma medular y está
implicada en la orientación de células pluripotenciales y
progenitoras al estroma medular (Krause et ál. (1996) Blood
87, 1-13). VLA-4 también media en la
ligación de células progenitoras hematopoyéticas a fibronectina
(Levesque & (1999) Exp. Hematol. 27, 579-586).
Se ha observado que CD44, una molécula de adhesión sobre
leucocitos, células progenitoras hematopoyéticas (Netelenbos et
ál. (2002) J Leukoc. Biol. 72, 353-362) y
células pluripotenciales mesenquimales (Rombouts & Ploemacfier
(2003) Leukemia 17, 160-170), media en interacciones
célula-célula y célula-ECM, para
representar un papel en el tráfico de leucocitos a zonas de
inflamación y para coestimular la activación de linfocitos y la
infiltración tisular (Wu et ál. (2005) Cell Res. 15,
483-494). Por otra parte, las interacciones del
proteoglicano CD44 de la superficie celular con el
glicosaminoglicano de la matriz extracelular hialuronano (HA) son
episodios clave en la inflamación (Levesque et ál. citado
anteriormente). Los elevados niveles de fracciones celulares tanto
VLA-4+ como CD44+ inmediatamente después de la
implantación indican claramente una capacidad incrementada de unión
a y orientación de células mediada por estas moléculas que
disminuye significativamente durante las últimas fases cuando las
células empiezan a diferenciarse, lo que también se observa en los
números absolutos de células.
De la forma más importante, se estudiaron 4
marcadores predominantemente expresados por células
pluripotenciales/progenitoras: CD133, antígeno de células
pluripotenciales 1 (Sca-1), CD34 y CD117
(c-kit) (véase la Figura 10). La fracción celular
CD133+, que representa la célula pluripotencial más primitiva
estudiada (Gehling et ál. (2000) Blood 95,
3106-3112), era muy pequeña, alcanzando su máximo de
2,3% en 1 rata después de 3 días de implantación. Se sabe que
Sca-1 es presentado por células pluripotenciales
hematopoyéticas y mesenquimales primitivas. Durante la fase inicial
de la implantación intraperitoneal, se encontraba aproximadamente 7%
de estas células. CD34 y c-kit (CD117) son ambos
marcadores para células pluripotenciales y progenitoras
hematopoyéticas en circulación (Okamoto et ál. (2005) Blood
105, 2757-2763). C-kit también se
expresa sobre células pluripotenciales mesenquimales. El perfil
temporal de células CD34+ muestra un incremento gradual en la
fracción de estas células encontrada sobre el material del
implante, alcanzando un valor pico significativo de aproximadamente
5-8% en los días 2 y 3. Es notable el retorno muy
rápido a bajos niveles de células CD34+ ya evidentes el día 5,
seguido de nuevo por un incremento significativo hacia el día 7. El
patrón de c-kit muestra un nivel elevado
significativo de aproximadamente 2% en los días 2 y 3. La expresión
de CD133, un antígeno superficial celular de transmembrana, está
restringida a un subgrupo de las células pluripotenciales y
progenitoras CD34+ (Buhring et ál. (1999) Ann. N. Y. Acad.
Sci. 872, 25-38) y a células precursoras
endoteliales (Gehling et ál. 2000, citado anteriormente).
Adicionalmente, es expresado por una pequeña porción de
aproximadamente 0,2% de las células CD34- (Gallacher et ál.,
citado anteriormente). Las células CD34+CD133+ están enriquecidas en
células progenitoras primitivas y mieloides, mientras que las
células CD34+CD133- consisten principalmente en progenitores de
células B y eritroides tardíos (Buhring at al. 1999, citado
anteriormente). El antígeno CD133 está presente esporádicamente en
los parches implantados, sugiriendo una contribución muy limitada de
estas células primitivas en la formación de nuevo tejido en la FBR.
Sca-1 se expresa sobre células pluripotenciales
primitivas multipotentes en la médula ósea y en sangre periférica,
así como sobre células pluripotenciales mesenquimales. Las células
Sca-1+ son más primitivas que las células
Sca-1- y responden mejor a una combinación de
factores hematopoyéticos, incluyendo SCF y células estromales
(Okada et ál. (1992) Blood 80, 3044-3050;
Rombouts y Ploemacher, citado anteriormente; Spangrude et
ál. (1991) Blood 78, 1395-1402.). De forma
interesante, se observó una fracción bastante grande de estas
células inmediatamente después de la implantación y una disminución
gradual en los últimos pasos. Un pico en el número absoluto de
células se observó 2 días después de la implantación. En conjunto,
los hallazgos indican claramente que estas células son una
contribución principal e inicial a la reacción FBR.
Tanto CD34 como CD117 se usaron como marcadores
para células pluripotenciales y progenitoras más comprometidas en
comparación con CD133 y Sca-1. El marcador CD34, una
proteína de membrana monocatenaria, indica la presencia de células
pluripotenciales/progenitoras hematopoyéticas, células precursoras
endoteliales y células endoteliales capilares.
C-kit (CD117), un miembro de la familia de tirosina
quinasas receptoras y el receptor de factor de células
pluripotenciales (SCF), se expresa sobre células pluripotenciales
primitivas hematopoyéticas y células progenitoras comprometidas
(Okada et ál. citado anteriormente), sobre células inmaduras
en circulación (Taguchi et ál. (2004) Circulation 109,
2972-2975) y sobre células pluripotenciales
mesenquimales (Rombouts y Ploemacher, citado anteriormente). Estos
resultados mostraban un nivel elevado temporal de células tanto
CD34+ como c-kit+ a los 2 y 3 días de la
implantación, que era especialmente pronunciado en las fracciones
de células CD34+. Estas células mostraban un pico claro el día 3 que
se aproxima a la fracción inicial de células Sca-1.
Estos hallazgos pueden explicarse bien mediante la diferenciación de
las células Sca-1+ en las células
c-kit+ o CD34+ más comprometidas o bien mediante el
reclutamiento temporal de estos tipos de células desde la corriente
sanguínea a través de factores de señalización liberados de otras
células presentes en la FBR en fase inicial, probablemente los
macrófagos. Puesto que el número absoluto de células CD34+ en su
pico sobrepasa con mucho el conteo absoluto de células
Sca-1, la última explicación es más aceptable.
Mediante la presente invención se encontró
sorprendentemente en un modelo de implantación intraperitoneal en
rata que durante la reacción a cuerpos extraños inmadura, las
células pluripotenciales y las células progenitoras son atraídas al
tejido y están implicadas activamente en la repoblación de la matriz
con (mio)fibroblastos.
\vskip1.000000\baselineskip
Según se menciona anteriormente, la neogénesis
tisular se estudió según se produce en la FBR en modelos de
animales adultos, debido a que es capaz de producir tejido laminar
con un componente celular similar a estructuras vasculares tales
como válvulas cardíacas (Butler et ál. 2001a, citado
anteriormente; Butler et ál. 2001b, citado anteriormente).
Desgraciadamente, el tejido maduro no es una solución ideal ya que
requeriría la construcción de una prótesis valvular en el
quirófano, un método propenso a la variación en la calidad de la
válvula (Grabenwoger et ál. (2000) J Heart Valve Dis 9,
104-109). No obstante, la neogénesis tisular en sí
es una característica interesante debido a que contiene todos los
componentes, esto es, las células (ejemplo 2), nueva matriz
extracelular, moléculas de señalización y proteínas orientadoras,
necesarios para construir un nuevo tejido. Se identificaron las
proteínas orientadoras, moléculas responsables de la conexión física
de las células a la matriz extracelular.
De forma similar al ejemplo 2, pericardio bovino
fotooxidado, una matriz completamente acelular y reticulada, se
suspendió en una jaula de acero inoxidable y se implantó en la
cavidad abdominal de ratas Wistar. Se han estudiado dos períodos de
implantación diferentes (1,5 d y 3 d) con 2 ratas en cada grupo. Los
implantes se recuperaron después de 1,5 d o 3 d, dependiendo del
grupo al que estuviera asignado el animal. Con este propósito, los
animales volvieron a anestesiarse, la herida se reabrió y la jaula
se retiró. Durante la recuperación, el parche matricial se puso
inmediatamente en RNAlater RNA Stabilization reagent (Qiagen) hasta
la extracción del RNA.
La expresión génica de fondo, que es la
expresión génica de macrófagos, se obtuvo a partir de macrófagos
intraperitoneales inducidos por tioglicolato (2 ml de tioglicolato
al 3% en solución salina estéril y esterilizados por filtración)
procedentes de 3 ratas.
El RNA total se extrajo usando reactivo TRIzol
(Invitrogen) seguido por una purificación adicional usando RNeasy
Mini Spin Columns (Qiagen). El RNA total se controló con respecto a
su integridad y pureza usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent
Technologies) y un espectrofotómetro Nanodrop en the MicroArray
Facility del VIB (Flemish Interuniversitary Institute for
Biotechnology), respectivamente. Se prepararon sondas a partir de 5
\mug de RNA total, que no mostraban signos de degradación o
impurezas (260/280 y 260/230 > 1,8), de acuerdo con las
directrices de Affymetrix. En resumen, a partir de RNA total, RNA de
poli-A se transcribió inversamente usando un
cebador de poli dT-T7 y se marcó durante una
reacción de transcripción in vitro de T7 usando el
Affymetrix IVT Labeling Kit (nº cat 900449, Affymetrix, High
Wycombe, Reino Unido). Las sondas se purificaron (GeneChip Sample
Cleanup Module, nº cat P/N 900371, Affymetrix, Reino Unido) y se
analizaron de nuevo con respecto al rendimiento
(30-120 \mug) y la pureza (260/280 y 260/230 >
1,8). Se fragmentaron 20 \mug con hidrólisis alcalina. El aRNA
fragmentado se resuspendió con adiciones de control en 300 \mul
de tampón de hibridación (Eukaryotic Hybridization Control Kit, nº
cat 900299, Affymetrix, High Wycombe, Reino Unido) y 200 \mul de
sonda se hibridaron en un horno de Rotisseri a 45ºC. Las
"microplaquetas génicas" (Affymetrix GeneChip Rat Genome 230
2.0 Array, Affymetrix, Reino Unido) se lavaron y se tiñeron en la
GeneChip Fluidics Station 400 (Affymetrix, Reino Unido) usando el
protocolo EukGE-WS2v4, y subsiguientemente se
exploraron con el GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix, Reino Unido).
El análisis de imágenes se realizó en GCOS.
El experimento se realizó por triplicado usando
muestras no reunidas obtenidas de un animal diferente. El análisis
de imágenes se realizó en GCOS. Los valores de intensidad de la
sonda que alcanzaban el nivel de fondo anterior con una
significación p < 0,05 se consideraban llamadas ("calls")
presentes. El análisis funcional de los datos de microordenación se
realizó usando Onto-Express que clasifica los genes
de acuerdo con las categorías de Gene Ontology [Draghici et
ál (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3775-3381].
Como se ilustra en el ejemplo 3, se produce una
reacción primaria seguida por una acumulación tanto de moléculas de
la matriz extracelular como de proteínas orientadoras,
proporcionando sitios de ligación a la células, el día tres.
Todos los genes (\pm 31000) presentes sobre la
microplaqueta de microordenación se consideraban para el análisis.
El diagrama de Venn (Figura 11) da una visión de conjunto del
hallazgo de la expresión génica. Comparando los perfiles de
expresión para FBR e IP, se encontraron 3868 genes específicos para
FBR3 y 2957 FBR1.5 (origen no macrófago). Genes de principal
interés codifican proteínas de la matriz extracelular y proteínas de
señalización que permiten la atracción y la orientación de células
pluripotenciales, que se ha mostrado que están implicadas en la FBR
inmadura. Aunque se encontró una señal significativa para moléculas
estructurales entre las cuales se encuentran diferentes colágenos y
lamininas tanto en FBR1.5 como en FBR3, la expresión general de
estas moléculas, según se agrupaban por GO, solo resultaba
significativa en el último grupo. Esto significa que,
independientemente de la expresión de algunas moléculas
estructurales en el grupo FBR1.5, la contribución significativa de
esos genes solo se encontró en el grupo FBR3, esto es, después de la
orientación de células. En FBR3 y FBR1.5, 85 y 116 genes se
atribuyeron respectivamente al término de GO actividad transductora
de señales, entre los cuales se encuentra el factor derivado de
células estromales 1 gamma (SDF-1), una molécula
que se une a células pluripotenciales hematopoyéticas y por lo tanto
un candidato interesante para la integración en una matriz
biológica.
A partir de estos resultados, parece que tanto
SDF-1 como SCF estaban presentes en esta neogénesis
tisular del adulto y que ambas son proteínas orientadoras
candidatas para ser estudiadas con respecto a la orientación de
células pluripotenciales/progenitoras in vivo hacia prótesis
vasculares/valvulares.
\vskip1.000000\baselineskip
El potencial de resiembra de los materiales
nanorrevestidos se determinó al injertar un injerto vascular de
pequeño calibre en la arteria carótida común como una interposición.
Los injertos se realizaron a mano a partir de pericardio
fotooxidado bien con SDF-1 o bien SCF a 1 \mug/por
tubo (en 30 \mul de PBS) con o sin revestimiento previo del
pericardio bovino con fibronectina. El injerto permanecía en su
lugar durante solo 24 h, suficiente para alcanzar la adhesión
celular pero no suficiente para dar como resultado la diferenciación
de las células, que daría como resultado una pérdida de sus
propiedades como células pluripotenciales. Se prepararon tubos de
pericardio bovino con un diámetro interno que se aproxima al
diámetro interno de una arteria carótida de rata. El injerto se
fabricó enrollando un pequeño parche de pericardio fotooxidado sobre
una cánula de plástico de calibre pequeño y suturando los bordes
longitudinales usando técnicas de microcirugía. La longitud del
injerto era aproximadamente 5 mm y el diámetro interno es 10 veces
menor. Comparar el diámetro interno del injerto con el diámetro
interno de la arteria carótida común revelaba que el diámetro del
injerto es aproximadamente 20% mayor. Este diámetro mayor se elegía
debido a que los implantes preliminares seguían siendo evidentes
durante varias semanas.
El protocolo de implantación es una adaptación
del protocolo para conejos publicado por Boeckx (1997) (Ann.
Thorac. Surg. 63, S128-S134). Ratas Wistar macho (n
= 6 para cada grupo de material) de 380 a 400 g se anestesiaron con
isoflurano (inducción: 4%; cirugía: 2%). Después de afeitar y
desinfectar con alcohol yodado, la arteria carótida común se disecó
libre del tejido circundante y se montó en una micropinza tipo
Acland. Las arteria se seccionó transversalmente y los extremos
tanto proximal como distal de la construcción de injerto se
suturaron con un nailon monofilamentoso 10/0, usando la técnica de
costura de las 7 en punto (Kirsch et ál. (1992) Am. Surg.
58, 722-727) que requiere de 9 a 12 puntadas. La
aguja abarcaba todo el grosor de la pared del vaso. Se tuvo cuidado
de que solo la aguja tocara la íntima de la arteria. Todo el
procedimiento se realizó sin espasmolíticos (p. ej. papaverina) ni
anticoagulantes (p. ej. heparina). Después de la última puntada, la
micropinza de tipo Acland doble se retiró. Después de unos pocos
minutos para asegurar la hemostasis completa, la piel se cerró. La
anestesia se interrumpió y aproximadamente 5 minutos más tarde el
animal se despertó y se transfirió a una jaula individual.
Después de 24 h, la herida se reabrió y el
injerto se recuperó y se lavó con solución salina tamponada con
fosfato. El injerto y, en cada anastomosis, una pequeña porción de
la arteria carótida natural se extirpó. La luz se barrió suavemente
con solución salina tamponada con fosfato y subsiguientemente se
cargó con medio de congelación tisular. Después de embeberse en el
mismo medio, la muestra se congeló inmediatamente en nitrógeno
líquido y se almacenó a -80ºC. El seccionamiento se realiza en un
criostato Microm HM500 OM (Prosan, Merelbeke, Bélgica). Las
secciones longitudinales de 7 \mum se pusieron sobre portaobjetos
revestidos con poli-L-lisina y se
almacenaron a -20ºC hasta la tinción.
Se puso énfasis en la atracción de células
pluripotenciales, por lo tanto las muestras se tiñeron
inmunohistoquímicamente para 4 marcadores CD3 (BD Pharmingen; clon
G4.18), c-kit (Santa Cruz Biotechnology; clon
H-300), CD34 (DAKO; clon QBEnd 10),
Sca-1 (R&D Systems; policlonal de cabra). La
Tabla posterior indica los tipos de células teñidos para cada
anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los anticuerpos primarios se detectaron
con un anticuerpo conjugado a fluorocromo, FITC o rojo de Texas. El
análisis de imágenes se realizó usando un microscopio de toma de
imágenes Axioplan 2 (Zeiss, Zaventem, Bélgica) y el paquete de
software Axiovision 4.4 (Zeiss, Zaventem, Bélgica). Para la
fenotipificación celular se determinó cada sección transversal
longitudinal de un total de 250 células y los resultados se
expresaron como un porcentaje. Para evitar la desviación, se
tomaron varias fotografías, se dividieron en cuadros y se contaron
de acuerdo con una lista de aleatorización.
Globalmente, no se encontró diferencia en la
adhesión celular cuantitativa (Tabla 5)
Se encontraron células CD34 positivas en dos
grupos. Estas células estaban presentes en los controles (1,85
[0,00, 7,21]%) que solo se sometían a siembra espontánea después de
la implantación en el vaso sanguíneo de la rata. Por otra parte, se
observaba que estaban presentes en pericardio bovino fotooxidado
impregnado con SCF (3,84 [0,00, 11,08]%), aunque se encontraba un
incremento numérico, este no era significativo debido a la gran
variación entre individuos. Los tres grupos restantes no contenían
células CD34+.
Los resultados de la inmunotinción de CD117 se
muestran en la Figura 12(A). Las muestras de control
comprendidas por pericardio fotooxidado mostraban una presencia
mediana de 4,70 [2,14, 12,17]% de células CD117^{+} después de
implantarse en la arteria carótida de una rata. Impregnar el mismo
material matricial bien con SCF o bien con SDF-1
incrementaba significativamente la fracción de células CD117^{+}
en y sobre la cara luminal de los implantes. Una fracción de 15,78
[10,04, 47,90]% y 34,02 [26,32, 37,39]% se encontró para SCF y
SDF-1, respectivamente. Aunque la coimpregnación
con fibronectina no tenía un efecto sobre la presencia de células
CD34^{+} y Sca-1^{+}, se encontró un claro
incremento en la orientación de las células CD117^{+}. La
coimpregnación de fibronectina y SCF daba como resultado una
fracción de células CD117^{+} de 47,84 [41,10, 66,00]%. A pesar
de un gran incremento numérico, se encontró que esto no era
significativo debido a la gran variación en la fracción CD117^{+}
en el grupo de SCF. Por otra parte, se encontró que el incremento
encontrado en la fracción CD117^{+} en el grupo coimpregnado con
fibronectina y SDF-1 (48,90 [42,32, 54,08]%) se
incrementaba significativamente cuando se comparaba con el grupo de
SDF-1. En general, se encontró que todos los
protocolos de impregnación inducían una orientación potenciada de
células CD117 positivas y que especialmente las combinaciones bien
de SCF o bien de SDF-1 con fibronectina daban como
resultado que aproximadamente 50% de las células eran positivas
para este marcador.
Finalmente, se investigó la atracción de células
pluripotenciales Sca-1+ a pericardio bovino
fotooxidado revestido con SDF-1 o SCF con o sin
prerrevestimiento con fibronectina (véase la Figura 12b). En el
control, algunas células Sca-1 positivas se
encontraron en 2 de 6 implantes. Cuando el mismo material matricial
se impregnaba, esto daba como resultado adhesión de células
Sca-1 positivas en todos los implantes así como un
incremento significativo en el porcentaje de células
Sca-1 positivas. Las células Sca-1
positivas pueden atribuirse bien al grupo de células
pluripotenciales o bien a un subgrupo de células T. Se observó que
la tinción para células T (inmunohistoquímica
anti-CD3) era negativa en todos los implantes,
confirmando de ese modo la orientación específica de células
pluripotenciales Sca-1 positivas hacia el material
impregnado.
\vskip1.000000\baselineskip
Parches pericardiales bovinos impregnados con
SCF y SDF-1 se han implantado en la arteria carótida
de ovejas. Ambas proteínas se han usado con o sin revestimiento
previo del material matricial con fibronectina. Se han implantado
cuatro parches en cada arteria carótida (izquierda y derecha). En
cada cara se implantaron un control, 1 \mug, 3 \mug y 10 \mug
por cm^{2} de parche revestido. El control se implantó aguas abajo
y subsiguientemente los parches de 1, 3 y 100 \mug/cm^{2} se
implantaron con el parche de 10 \mug/cm^{2} en la posición más
aguas arriba. La Figura 13 muestra que se encontraban algunas
células CD34+ (células pluripotenciales/progenitoras
hematopoyéticas).
Claims (24)
1. Un método para preparar un andamiaje para
implantación in vivo, que comprende la etapa de revestir una
matriz estructural con un ligando de un receptor o un fragmento de
dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor,
seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado
del estroma 1, factor de células pluripotenciales,
VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de
fibrinógeno.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el andamiaje es un andamiaje para válvulas cardíacas o
vasos sanguíneos.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que la matriz estructural es biodegradable.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, que no comprende la etapa de revestir
la matriz estructural con factores quimioatrayentes o factores de
movilización.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además la etapa de
revestir la matriz estructural con uno o más factores
quimioatrayentes y/o factores de movilización.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además la etapa de
prerrevestir la matriz del andamiaje con una o más proteínas que
facilitan la interacción entre el ligando o su fragmento y la
matriz estructural.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que el ligando o su fragmento y la proteína que facilita la
interacción con la matriz estructural se revisten sobre la matriz
como una proteína de fusión.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6
ó 7, en el que la proteína facilitadora se selecciona del grupo que
consiste en fibronectina, colágeno y fibrinógeno.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ligando o su fragmento
se reviste en dicha matriz estructural por medio de un brazo
conector.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que la matriz estructural es una
prótesis no reticulada o raíces aórticas acelularizadas.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de revestir la
matriz estructural con el ligando aislado o su fragmento se realiza
mediante reticulación química o mediante impregnación de la matriz
con una solución que comprende el ligando o su fragmento.
12. Un andamiaje para implantación in
vivo que comprende una matriz estructural, caracterizado
porque dicha matriz está revestida con uno o más ligandos de
receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el
dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos
que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células
pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y
región P2 de fibrinógeno.
13. El andamiaje de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que dicho andamiaje es un andamiaje de un
vaso sanguíneo o una válvula cardíaca.
14. El andamiaje de acuerdo con la
reivindicación 12 ó 13, que comprende además factores
quimioatrayentes y/o factores de movilización.
15. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho andamiaje está
revestido además con una o más proteínas que facilitan la
interacción entre el ligando o su fragmento y la matriz
estructural.
16. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la matriz estructural es
una prótesis no reticulada o raíces aórticas acelularizadas.
17. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el ligando o su
fragmento está químicamente reticulado a la matriz estructural.
18. Un estuche para el desarrollo de un
andamiaje que comprende una matriz estructural para un injerto y uno
o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que
comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo
de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de
células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de
fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.
19. El estuche de acuerdo con la reivindicación
18, en el que el injerto está en la forma de un vaso sanguíneo o
una válvula cardíaca.
20. Uso de un ligando de un receptor o un
fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al
receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor
derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales,
VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de
fibrinógeno, para preparar una matriz estructural en la forma de un
dispositivo implantable.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que el dispositivo es una válvula cardíaca o un injerto
vascular.
22. Uso de un ligando de un receptor o un
fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al
receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor
derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales,
VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de
fibrinógeno, para la fabricación de un andamiaje que comprende una
matriz estructural, para el tratamiento de un tejido, un vaso o un
órgano enfermo o dañado.
23. Un andamiaje que comprende una matriz
estructural revestida con uno o más ligandos de receptores, o
fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al
receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en
factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales,
VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de
fibrinógeno, para tratar un tejido, vaso u órgano enfermo o
dañado.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22 o
el andamiaje de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho
andamiaje es un andamiaje de válvula cardíaca o vaso sanguíneo.
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