ES2347339T3

ES2347339T3 - Ingenieria con factores orientadores.

Info

Publication number: ES2347339T3
Application number: ES05808071T
Authority: ES
Inventors: Willem Flameng; Geofrey De Visscher
Original assignee: Alphagen N V; ALPHAGEN NV; Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Alphagen N V; ALPHAGEN NV; Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2005-11-08
Publication date: 2010-10-28
Anticipated expiration: 2025-11-08
Also published as: JP2008518606A; GB0424560D0; ATE471169T1; WO2006047841A2; EP2255834B1; AU2005301111B2; JP4854670B2; PL2255834T3; DK1812088T3; DK2255834T3; US20070264306A1; ES2385785T3; EP1812088A2; WO2006047841A3; EP1812088B1; ATE556728T1; CN101094697B; EP2255834A1; AU2005301111A1; CN101094697A

Abstract

Un método para preparar un andamiaje para implantación in vivo, que comprende la etapa de revestir una matriz estructural con un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

Description

Ingeniería con factores orientadores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la ingeniería tisular y a la siembra celular de andamiajes de dispositivos implantables. La invención se refiere además a moléculas que aseguran la siembra in vitro y/o in vivo de una matriz con células.

Antecedentes

Las válvulas cardíacas protésicas sufren posibles complicaciones tales como trombosis, endocarditis, fallo mecánico, degradación tisular, calcificación. Estos problemas y el hecho de que estas prótesis carezcan de potencial de crecimiento y remodelación en pacientes pediátricos son el motivo de la ingeniería tisular de las válvulas cardíacas.

El principal objetivo de la ingeniería tisular es la restauración de la función mediante el aporte de elementos vivos que se incorporan al paciente. La ingeniería tisular se basa esencialmente en 3 elementos:

- células, que representan el componente vivo

- matriz, que proporciona una estructura de soporte tridimensional

- moléculas de señalización que influyen en la expresión génica y la deposición de la matriz extracelular.

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La ingeniería tisular combina células y andamiajes para construir nuevo tejido. Para la siembra celular de matrices, se están investigando actualmente dos opciones: células autólogas cultivadas para la siembra in vitro y la atracción de células autólogas in vivo.

Diferentes matrices se están considerando para la ingeniería tisular (véase la Figura 1). Una matriz puede ser un andamiaje moldeado de un polímero sintético o de colágeno o fibrina. El andamiaje puede ser natural (p. ej. raíz acelular) o puede ser una prótesis reticulada.

Además, se han ideado diferentes procedimientos para obtener una válvula cardíaca viable sometida a ingeniería tisular. El paradigma completo describe la construcción de una válvula al combinar células y andamiaje in vitro, seguido por la maduración in vitro de la construcción en un biorreactor (Figura 2). La construcción madura puede implantarse a continuación en el paciente y posiblemente sufrir remodelación in vivo (revisado en Rabkin & Schoen (2002) Cardiovasc. Pathol. 11, 305-317). La construcción estudiada más a fondo es una válvula creada por Hoerstup et ál. ((2002) Circulation 106, 1143-1150)). Obtuvieron satisfactoriamente una válvula pulmonar de oveja viable y remodelada usando el paradigma completo con un biorreactor.

El documento US2001/051824 se refiere a una válvula cardíaca bioprotésica que comprende una matriz acelular y miofibroblastos aislados.

El documento US6082364 describe implantes o andamiajes metálicos que comprenden células de la médula ósea o similares a las pluripotenciales.

El documento WO2004/090120 se refiere a células pluripotenciales que exhiben una sensibilidad incrementada a un quimioatrayente.

El documento WO9941403 divulga una composición de interés para introducir una molécula de ácido nucleico exógena en una célula diana que comprende un liposoma, un ligando y un andamiaje polímero, en la que dicho ligando puede unirse a un receptor de la superficie celular o una molécula expresada por una célula diana.

Campbell et ál. ((1999) Circ. Res. 85, 1173-1178) han sugerido asegurar la siembra de andamiajes en la ingeniería tisular de vasos sanguíneos haciendo uso de un mecanismo de defensa conocido, a saber la reacción a cuerpos extraños. Una reacción madura a cuerpos extraños está comprendida por una capa de macrófagos, varias capas de fibroblastos y una capa mesotelial externa (Butler et ál. (2001 a) Biomed. Sci. Instrum. 37, 19-24.; Butler et ál. (2001 b) J. Invest Surg. 14, 139-152). Aunque Campbell et ál. (1999, citado anteriormente) afirman que los fibroblastos se derivan de macrófagos transdiferenciados, todavía no se ha publicado una evidencia concluyente.

Para que sean satisfactorios, estos métodos tienen que cumplir un número de retos reguladores, incluyendo una función y una durabilidad óptimas. Para justificar el alto coste de las válvulas sometidas a ingeniería tisular, deben demostrar tener cualidades superiores a las válvulas existentes. Adicionalmente, todas las técnicas mencionadas anteriormente tienen que vencer el reto de la bioseguridad. Las cuestiones y las bases de la bioseguridad en lo que respecta a la FDA están bien documentadas ("Guidance on applications for products comprised of living autologous cells manipulated ex vivo and intended for structural repair or reconstruction". 95N-0200 (1996); "Proposed approach to regulation of cellular and tissue-based products - The food and drug administration". Journal de Hematotherapy 6:195-212 (1997); "Guidance for industry - Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy". Human Gene Therapy 9:1513-1524 (1998); "PHS guideline on infectious disease issues in xenotransplantation". (2001); "Transmissible spongiform encephalopathies advisory committee meeting". (2001)).

El uso de células cultivadas o incluso recogidas in vitro plantea problemas específicos. Según se ilustra en la Figura 3, tanto la recogida como el cultivo de células pueden inducir inestabilidad genética o mutagénesis. Esto puede atribuirse a diferentes factores. Tanto la recogida como el cultivo requieren generalmente el uso de proteínas extrañas. El origen xenogénico de las enzimas o los sueros proteolíticos es una fuente potencial de contaminación por patógenos entre especies. Tal contaminación, si no se detecta, no solo pone en riesgo el propio cultivo, sino también al receptor. El mecanismo de proliferación de ciertos virus puede permitir la inserción de su genoma en el genoma del huésped, lo que puede provocar mutaciones perjudiciales dependiendo del sitio de inserción. Ciertos genes virales también pueden actuar como oncogenes. Las cuestiones de bioseguridad se aplican igualmente al uso de materiales xenogénicos. Además del riesgo de infecciones virales, el cultivo de células también expone a las células a condiciones no fisiológicas tales como una tensión de oxígeno incrementada. De media, el tejido de los mamíferos está expuesto a una tensión de oxígeno que varía de 2-8%, mientras que las incubadoras generalmente usan aire comprimido con una tensión de oxígeno de 21%. Se ha demostrado que los fibroblastos múridos primarios son extremadamente vulnerables al daño al DNA que da como resultado senescencia e inmortalización espontánea. A pesar del hecho de que en estos experimentos los fibroblastos humanos estaban mucho menos afectados, otros estudios demuestran que las células humanas no son insensibles al estrés oxidativo. Por ejemplo, los condrocitos de cartílago articular humano han demostrado ser sensibles al estrés oxidativo. Usando líneas celulares, se ha demostrado que el oxígeno induce predominantemente reagrupamientos genómicos en células que proliferan rápidamente. Por otra parte, se ha demostrado que los fibroblastos humanos también sufren senescencia en respuesta al estrés oxidativo, lo que puede provocar acortamiento del telómero y roturas de la hebra simple en el DNA telómero a una velocidad que depende del estrés oxidativo. En cultivos de fibroblastos, se obtuvo un incremento en los doblamientos de población cuando se disminuía la tensión de oxígeno. Otra observación notable es que la senescencia regula al alza ocho genes entre los que se encuentran fibronectina, osteonectina y procolágeno alfa1.

La bioseguridad es un aspecto muy importante de los retos reguladores para válvulas cardíacas sembradas con células in vitro e impone el desarrollo de un control de calidad restrictivo para cada prótesis valvular individual antes de la implantación en el receptor. Los retos reguladores incrementados también incrementarán notablemente los costes de tales prótesis, limitando de ese modo su uso a grupos específicos de pacientes.

Existe una necesidad en la técnica de un modo para obtener válvulas cardíacas y otros dispositivos implantables sometidos a ingeniería tisular viables. Más particularmente, existe una necesidad de andamiajes que sean adecuados para la siembra celular, particularmente la siembra celular in vivo, lo más particularmente cuando se necesita que la siembra celular se produzca bajo condiciones de estrés por cizalladura incrementado, tales como andamiajes de válvulas cardíacas y vasos sanguíneos.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere generalmente al uso de factores orientadores en la generación de andamiajes de tejidos y órganos usados para implantación en el cuerpo de un animal o un ser humano de acuerdo con las reivindicaciones. De acuerdo con un aspecto particular, la presente invención se refiere al uso de factores orientadores en la generación de andamiajes susceptibles de alto estrés por cizalladura al implantarse en el cuerpo. Lo más particularmente, la invención se refiere a andamiajes para usar en el sistema cardiovascular, el sistema linfático u otros vasos tales como la uretra. Una realización específica de la presente invención se refiere a andamiajes que comprenden una matriz estructural revestida con uno o más factores orientadores. Más particularmente, los factores orientadores de la presente invención son factores capaces de unirse a células pluripotenciales o células progenitoras.

Un aspecto particular de la presente invención se refiere a andamiajes de dispositivos implantables destinados a un uso y una función prolongados dentro del cuerpo, es decir, basados en una matriz durable biocompatible pero no biodegradable. De acuerdo con una realización específica, la matriz estructural es una prótesis no reticulada o una raíz aórtica acelularizada.

Un aspecto particular adicional de la presente invención se refiere a andamiajes que comprenden uno o más factores orientadores en los que el factor orientador es un ligando de receptor, o uno de sus fragmentos que comprende el dominio de unión al receptor, o un péptido que se une al receptor. Lo más particularmente, el receptor es un receptor expresado sobre células pluripotenciales o células progenitoras.

Los factores orientadores o proteínas orientadoras usados en el contexto de la presente invención son factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, más particularmente factor derivado del estroma 1 (SDF-1) o factor de células pluripotenciales (SCF) o sus fragmentos o derivados.

En una realización particular, la matriz del andamiaje está revestida con uno o más factores orientadores y una proteína que facilita la interacción entre una célula y la matriz del andamiaje. Tal proteína puede ser, pero no se limita a, fibronectina, colágeno o fibrinógeno. En una realización particular en la que la proteína orientadora es VCAM-1, la interacción entre VCAM-1 y su receptor en una célula se potencia adicionalmente de forma opcional mediante la adición del inhibidor de proteasa pleiotrópico macroglobulina alfa2.

En una realización particular de la invención, el factor o los factores orientadores se reticulan químicamente a la matriz estructural por medio de un brazo conector. En la presente memoria, un brazo conector está espaciado entre el factor orientador y la matriz estructural. La unión entre el factor orientador y la matriz puede ser irreversible (permanente) o biodegradable.

De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, el factor o los factores orientadores de la presente invención pueden estar en la forma de una proteína de fusión con una proteína que facilita la unión a la matriz estructural (es decir, las dos proteínas forman una cadena polipeptídica consecutiva).

En una realización particular, la matriz estructural del andamiaje de la presente invención es un material biológico tal como pericardio bovino reticulado o raíces aórticas porcinas.

En una realización adicional más, el factor orientador está químicamente reticulado a la matriz del andamiaje de la presente invención.

La presente invención también se refiere a métodos para preparar el andamiaje de la presente invención por los que la matriz del andamiaje se reviste con uno o más factores orientadores. De acuerdo con una realización particular, el revestimiento se asegura mediante impregnación, es decir mediante incubación de la matriz en una solución que comprende uno o más de los factores orientadores mencionados anteriormente en un tampón de impregnación apropiado (por ejemplo: solución salina tamponada con fosfato). Realizaciones particulares de este método incluyen una etapa de prerrevestimiento con una o más proteínas que facilitan la interacción entre el factor orientador y la matriz estructural.

De acuerdo con una realización particular, los andamiajes de la presente invención no comprenden factores quimioatrayentes o factores de movilización. Alternativamente, los andamiajes de la presente invención comprenden uno o más factores orientadores de la presente invención en combinación con uno o más factores quimioatrayentes y/o factores de movilización.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona estuches ("kits") que comprenden una matriz estructural, opcionalmente en la forma de un dispositivo implantable, tal como, pero no limitado a, un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca, y uno o más factores orientadores.

De acuerdo con esto, la invención se refiere al uso de factores orientadores para potenciar la siembra in vivo sobre un andamiaje adecuado para reemplazar un tejido u órgano alterado o enfermo. El uso de factores orientadores tiene ventajas particulares en la generación de andamiajes para la implantación en una zona que está bajo alto estrés por cizalladura, p. ej. un andamiaje para el uso en el sistema cardiovascular tal como una válvula cardíaca o un injerto vascular.

Descripción detallada de la invención

La presente invención divulga andamiajes, más particularmente andamiajes para dispositivos implantables que comprenden una matriz que, por la presencia de uno o más factores orientadores, asegurará la unión de células apropiadas a los mismos. Un "andamiaje", según se usa en la presente memoria, se refiere a un dispositivo médico implantable para reparación, restauración, aumento o regeneración tisular o para reemplazar un tejido u órgano enfermo, dañado, perdido o comprometido de otro modo en el cuerpo de un paciente. Un "dispositivo médico implantable", según se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier dispositivo que esté destinado a ser introducido y opcionalmente implantado en el cuerpo humano, incluyendo dispositivos usados para la implantación en vasos, conductos u órganos corporales, tales como un separador intraluminal ("stent"), un catéter, una cánula, una envuelta de injerto vascular o arterial, un dispositivo para implantación en el esófago, la tráquea, el colon, el tracto biliar, el tracto urinario, dispositivos ortopédicos, etc.

De particular interés dentro del contexto de la presente invención son andamiajes que están destinados a zonas en las que el estrés por cizalladura actuará contra la adherencia natural de células apropiadas a una matriz. Así, de particular interés en el contexto de la presente invención son andamiajes para el uso en la sustitución y/o la restauración de tejidos que son susceptibles de alto estrés por cizalladura, tales como un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca, el uréter, los conductos biliares, los conductos pancreáticos, los conductos císticos, hepáticos o biliares comunes, y similares.

La siembra de tales andamiajes puede asegurarse in vivo, in situ (es decir durante la implantación en la zona de la arteria enferma o dañada) in vivo, ex situ (es decir la implantación en otro sitio del cuerpo) o in vitro (p. ej. en un biorreactor).

Las proteínas orientadoras o los factores orientadores se definen como moléculas de atraque que interactúan con uno o más tipos de células específicos y, así, cuando se ligan a una matriz, permiten el enriquecimiento de esos tipos de células sobre la matriz. Tal molécula de atraque asegura la interacción entre la matriz y una molécula en la superficie de la célula, tal como otra proteína o una estructura de carbohidrato, también denominada en la presente memoria la molécula diana celular. De acuerdo con una realización particular de la invención, el factor orientador es una molécula que asegura una interacción específica entre la matriz y uno o más tipos de células específicos; esto puede asegurarse mediante la unión del factor orientador a una molécula que se produce esencialmente solo sobre la superficie de uno o más tipos de células específicos o al ajustar el factor orientador a fin de que se una solamente a la molécula diana celular sobre uno o más tipos de células específicos.

Típicamente, la interacción entre el factor orientador y la célula es una interacción ligando-receptor. Así, una realización particular de la invención se refiere a andamiajes que comprenden uno o más ligandos de receptores que se unen a un cierto tipo de célula, más particularmente a los tipos de célula descritos posteriormente en la presente memoria.

De acuerdo con otra realización, los factores orientadores son moléculas que se unen específicamente a estructuras de carbohidrato que, lo más particularmente, se expresan específicamente sobre células pluripotenciales o células progenitoras. Porciones de estas proteínas que se unen a carbohidratos que retienen sus propiedades de unión a azúcares son igualmente adecuadas para funciones como factor orientador.

Un factor orientador adecuado para los andamiajes y los métodos de la presente invención pueden ser una proteína truncada y/o un derivado tal como una proteína mutada, con tal de que retenga su capacidad para unirse a la molécula diana celular. Regiones de unión mínimas de una proteína orientadora pueden definirse mapeando deleciones de truncamiento. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la molécula diana celular es un receptor y el factor orientador es un fragmento de uno de sus ligandos, tal como uno de sus fragmentos que se unen al receptor. Típicamente, factores orientadores que son formas derivadas o mutadas de ligandos proteínicos o sus fragmentos tienen al menos 80%, particularmente al menos 90%, lo más particularmente al menos 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el ligando natural o su fragmento mientras que retienen la capacidad para unirse a la molécula diana celular.

Los factores orientadores de la presente invención aseguran y/o incrementan la adherencia de las células a una matriz bajo condiciones variables. La unión de células a través de los factores orientadores de la presente invención proporciona ventajas particulares para la siembra de andamiajes de tejidos en condiciones de alto estrés por cizalladura.

Las células que son capturadas por medio de los factores orientadores de la presente invención son células que son de interés en la generación de un andamiaje apropiado, es decir un andamiaje que puede funcionar de modo similar al tejido u órgano al que sustituye. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el factor orientador es una proteína capaz de unirse a una célula pluripotencial o una célula progenitora (es decir, no diferenciada pero comprometida a uno o más linajes celulares), más particularmente células progenitoras hematopoyéticas. Las células pluripotenciales de la presente invención excluyen células pluripotenciales de origen embrionario humano.

De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el factor orientador es una molécula capaz de unirse a una célula pluripotencial mesenquimal o hematopoyética. La presente invención demuestra que la orientación de células pluripotenciales y/o células progenitoras sobre una matriz asegurará un andamiaje matricial sembrado con células que se diferencian en, entre otras, células miofibroblásticas.

Moléculas orientadoras particularmente adecuadas son del grupo que consiste en los epítopos P1 y P2 de fibrinógeno, factor de células pluripotenciales (SCF), factor derivado del estroma 1 (SDF-1), fibronectina (FN) y molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1) (figura 4), lo más particularmente SDF-1 o SCF o sus fragmentos o derivados que retienen su afinidad de unión al receptor.

Una realización particular de la presente invención se refiere al uso de SDF-1 como una proteína orientadora para la siembra de una matriz. SDF-1 (factor derivado de células del estroma 1) también se conoce como prefactor estimulante del crecimiento de células B (PBSF) o como quimioquina, motivo cxc, ligando 12 (CXCL12). Las secuencias de cDNA y proteína de SDF-1 se presentan respectivamente en Genbank bajo los Números de Registro E09668 y NP_001029058. SDF-1 existe en dos formas diferentes de 68 aminoácidos (alfa) y 72 aminoácidos (beta), respectivamente, en donde la forma beta tiene 4 aminoácidos adicionales en el extremo carboxi en comparación con la forma alfa. SDF-1 es el ligando del receptor CXCR4 (Bleuel et ál. (1996) Nature 382, 829-833). La importancia de un extremo N intacto de SDF1 para la unión al receptor está documentada [p. ej. Sadir J Biol Chem. 2004 279, 43854-43860]. Así, para la presente invención, fragmentos de SDF-1 son fragmentos que retienen el extremo amino de la proteína. De acuerdo con una realización particular, un fragmento o derivado de SDF-1 es uno que contiene la región aminoterminal (aminoácidos 1-14) y la lámina beta central (aminoácidos 15-54) pero que carece de uno o más aminoácidos de la región carboxiterminal (aminoácidos 55-68 y 55-72 de la forma alfa y beta, respectivamente). La actividad de unión al receptor de tales fragmentos puede evaluarse según se describe en Sadir et ál. (citado anteriormente).

De acuerdo con otra realización más de la presente invención, se usa SCF como una proteína orientadora en una matriz. El SCF es reconocido por células pluripotenciales mesenquimales (MSC) de la médula ósea a través de su receptor de proteína tirosina quinasa (c-kit) en el ratón o CD117 en seres humanos (Jiang et ál. (2002) Nature 418, 41-49; Nakamura et ál. (2004) Exp. Hematol. 32, 390-396) y puede así asegurar la orientación de MSC. Adicionalmente, CD117 es un factor esencial en el desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas (Agis et ál. (1993) J Immunol, 151, 4221-4227). El SCF (factor de células pluripotenciales) también es conocido como ligando KIT (KITLG), factor de crecimiento de células cebadas (MGF) y homólogo de factor Steel (SF). Las secuencias de cDNA y proteína de SCF están depositadas en Genbank bajo el número de registro M59964. SCF es el ligando para el receptor de tirosina quinasa KIT. SCF existe naturalmente como isoformas ancladas a la membrana o solubles como resultado de reparación de RNA y procesamiento proteolítico alternativos. De acuerdo con una realización particular de la invención, un fragmento o derivado de SCF comprende el fragmento aminoterminal de 189 aminoácidos que contiene el domino extracelular de SCF. Alternativamente, un fragmento o derivado de SCF comprende la forma soluble presente en la naturaleza que contiene los 165 aminoácidos aminoterminales de SCF. De acuerdo con otra realización particular más, el fragmento o derivado de SCF comprende los 141 residuos aminoterminales que contienen el núcleo de unión al receptor de SCF. La numeración de estos fragmentos se refiere a una secuencia proteínica de 248 aminoácidos que se libera después de la escisión de la secuencia líder. Los fragmentos de SCF mencionados anteriormente y su capacidad de unión al receptor se describen en Langley et ál. (1994) Arch Biochem Biophys. 311, 55-61. El SCF o los fragmentos o derivados de SCF de la presente invención pueden ser monómeros o dímeros. Los fragmentos dímeros pueden obtenerse al oxidar o reticular residuos de cisteína que están implicados en la unión de dímeros. Alternativamente, el SCF o sus fragmentos se expresan recombinantemente en tándem con un péptido espaciador entre ellos.

Una realización particular adicional de la presente invención se refiere al uso de VCAM-1 como proteína orientadora. Las secuencias de cDNA y proteína de VCAM-1 se depositan en Genbank bajo el número de registro M60335.

Una realización particular adicional de la invención se refiere al uso combinado de un factor orientador y una molécula que influye en la interacción entre la molécula orientadora y su molécula diana celular (también denominada en la presente memoria proteína facilitadora, véase posteriormente). De acuerdo con una realización, VCAM-1 se añade a la matriz en combinación con macroglobulina alfa2 (Figura 7), debido a que este inhibidor de proteasas pleiotrópicas puede estabilizar la unión entre VCAM-1 y VLA4. Esta función es un resultado de la inhibición de proteasa pleiotrópica que degrada la proteína de VCAM-1 (Levesque et ál. (2001) Blood 98, 1289-1297). Las secuencias de cDNA y proteína de macroglobulina alfa2 se depositan en Genbank bajo el número de registro NM_000014.

De acuerdo con otra realización particular, los epítopos P1 y P2 de fibrinógeno se usan como proteínas orientadoras. P1 y P2 se unen mediante la integrina mac1 de macrófagos (MF). Se observó que la reacción a los cuerpos extraños es iniciada por la adsorción de fibrinógeno a la superficie extraña. Esto induce cambios de conformación de la molécula que dan como resultado la exposición de 2 epítopos P1 y P2 (Hu et ál. (2001) Blood 98, 1231-1238). Los macrófagos unidos atraerán a continuación a las células pluripotenciales como lo hacen en una reacción a cuerpos extraños "estándar". Una realización de la presente invención es una matriz adecuada que comprende los epítopos P1 y P2 para atraer células pluripotenciales endógenas y adecuada para la sustitución directa de una válvula cardíaca deficiente, enferma o alterada. Los epítopos P1 y P2 pueden estar conectados a la matriz. La invención también implica el uso de epítopos P1 y P2 para revestir un andamiaje con dichos epítopos P1 y P2 para atraer células pluripotenciales endógenas después de la implantación. Según se describe por Hu et ál. (2001, citado anteriormente), el epítopo P1 se refiere a los aminoácidos 190 a 202 de fibrinógeno gamma, mientras que el epítopo P2 se refiere a los aminoácidos 377 a 395 de fibrinógeno gamma.

De acuerdo con otra realización más de la presente invención, la matriz comprende fibronectina para orientar células progenitoras que expresan VLA-4 o VLA-5. Las diferentes variantes de reparación de fibronectina humana (FN1) se listan en la base de datos de nucleótidos de NIH bajo los nº de registro: NM_212482 (variante 1), NM_212475 (variante 2), NM_002026 (variante 3), NM_212478 (variante 4), NM_212476 (variante 5), NM_212474 (variante 6) y NM_054034 (variante 7).

Particularmente adecuada para el uso en el andamiaje de la presente invención es una matriz o andamiaje que comprende fibronectina y/o VCAM-1 y que comprende además SDF-1 para actuar sinérgicamente con fibronectina y/o VCAM-1.

El uso de las proteínas orientadoras factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno o región P2 de fibrinógeno, caracterizado anteriormente, y de cualesquiera de sus homólogos funcionales o derivados actualmente en la técnica o disponibles para el experto en la técnica, como agentes orientadores en andamiajes para válvulas cardíacas o vasos sanguíneos, es parte de esta invención.

En teoría, los factores orientadores de la presente invención pueden obtenerse del receptor del andamiaje, pero con propósitos prácticos será más probable que los factores orientadores se obtengan sintéticamente o recombinantemente (a partir de un organismo bien pro- o bien eucariótico). Todas las proteínas orientadoras mencionadas anteriormente están disponibles comercialmente. SDF-1 humano recombinante y SCF humano recombinante (E. coli) pueden obtenerse de diferentes compañías (Sigma RBI, R&D systems, Campro y Calbiochem). VCAM-1 humana recombinante (línea celular de mieloma de ratón) está disponible de R&D systems. Fibronectina nativa derivada de fibroblastos humanos está disponible de Sigma RBI y Calbiochem. Fibrinógeno nativo derivado de plasma humano está disponible de Sigma RBI y Calbiochem.

En cuanto a los epítopos P1 y P2 de fibrinógeno, los epítopos pueden derivarse del fibrinógeno nativo mediante escisión proteolítica de la proteína nativa, pero más preferiblemente mediante biosíntesis in vitro siguiendo la secuencia proteínica descrita por Hu et ál. (citado anteriormente).

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presencia de uno o más factores orientadores asegura la unión de uno o más tipos de células particulares a una matriz. Así, en el contexto de la ingeniería tisular, más particularmente la ingeniería tisular de órganos vasculares o linfáticos u otros vasos tales como la uretra, donde la matriz está constantemente en contacto con fluido, tal como la sangre o el fluido linfático, y las células del mismo, la presencia de agentes orientadores solos puede ser suficiente para asegurar la población de la matriz con las células apropiadas. La presente invención demuestra que pueden usarse factores orientadores para conectar físicamente y específicamente células apropiadas a una matriz de elección (Figura 5). Así, una realización particular de la presente invención se refiere a andamiajes que comprenden factores orientadores. Lo más particularmente, la presente invención se refiere a andamiajes que comprenden sobre su superficie solamente uno o más factores orientadores, y no otras proteínas implicadas en la quimioatracción, la movilización, etc. No solo los factores orientadores asegurarán suficientemente la unión de las células pertinentes a la matriz, sino que la ausencia de otras moléculas que afectan a la atracción y/o la movilización celular evita efectos secundarios negativos potencialmente importantes tales como la vascularización del injerto.

Sin embargo, también se prevé dentro de la presente invención que se use una combinación de factores orientadores y otras moléculas bioactivas para el revestimiento de la matriz que constituye el andamiaje de la presente invención.

Así, de acuerdo con una realización adicional de la invención, la matriz también comprende, además del uno o más factor o factores orientadores, uno o más de otros factores que facilitan la unión de células apropiadas a una matriz. Tales otros factores incluyen agentes de movilización, agentes quimioatrayentes y factores facilitadores.

"Agentes de movilización", en el contexto de la presente invención, son agentes que movilizan células, tales como células pluripotenciales, desde el lugar del cuerpo en el que se originan. Más particularmente, los agentes de movilización se usan para incrementar la cantidad de células pluripotenciales en la sangre. Un ejemplo particular de un agente de movilización es el factor estimulante de colonias de granulocitos o GCSF. Este factor presente en la naturaleza tiene baja toxicidad y efecto sinérgico cuando se combina con otros factores de crecimiento hematopoyéticos. Otros agentes de movilización son adenosina, factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), factor de células pluripotenciales (SCF), interleuquina-1 (IL1), IL3, IL7, IL11 e IL12 (Fu & Liesveld (2000) Blood Rev. 14, 205-218.). El uso de factores de movilización además de los factores orientadores de acuerdo con la presente invención es de particular interés en aquellas herramientas y métodos que prevén la siembra de la matriz in vivo. El agente de movilización se incluye opcionalmente en la matriz, pero también puede administrarse al cuerpo antes de la implantación del andamiaje.

Adicionalmente o alternativamente, la presente invención prevé el uso de uno o más factores quimioatrayentes junto con el factor o los factores orientadores y opcionalmente el agente o los agentes de movilización descritos anteriormente. "Quimioatrayentes" o "compuestos quimiotácticos", según se usa en la presente memoria, son compuestos capaces de atraer células. En general, tienen un efecto sobre las células cuando están presentes en un gradiente. Posibles agentes quimioatrayentes para células pluripotenciales son factor de crecimiento similar a insulina (IGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Young et ál. (1999) Clin. Exp. Metastasis 17, 881-888).

Adicionalmente o alternativamente, la presente invención prevé el uso de uno o más agentes facilitadores junto con el factor o los factores orientadores y los factores adicionales opcionales descritos anteriormente. Los "factores facilitadores" son factores que facilitan o refuerzan la unión de células a las proteínas o los factores orientadores de la presente invención. Ejemplos de tales proteínas de facilitación incluyen colágeno soluble, albúmina, fibrinógeno o fibronectina. Las proteínas facilitadoras pueden revestirse sobre la matriz junto con el factor orientador o pueden revestirse como una capa separada.

Así, la presente invención se refiere a una matriz para el uso en la ingeniería tisular de vasos y otros andamiajes implantables, tales como un vaso sanguíneo o válvulas cardíacas, que comprende una matriz con uno o más factores orientadores. Más particularmente, la invención se refiere a una matriz que comprende SDF-1 y/o SCF diseñada para sustituir válvulas cardíacas deficientes, enfermas o alteradas para la recelularización in vivo. La matriz o el andamiaje cargados con SDF-1 pueden comprender agentes orientadores adicionales y pueden comprender además uno o más agentes de movilización, por ejemplo un agente de movilización seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), adenosina, factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), factor de células pluripotenciales (SCF), interleuquina-1 (IL1), IL3, IL7, IL11 e IL12 o una de sus combinaciones. La matriz puede comprender además uno o más agentes quimioatrayentes, por ejemplo un agente quimioatrayente seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento placentario (PLGF) o una de sus combinaciones.

De acuerdo con una realización, el paradigma de celularización de la presente invención comprende tres etapas (Figura 2): Opcionalmente, una etapa inicial de movilización de células pluripotenciales, en segundo lugar la implantación de un andamiaje (p. ej. un vaso o una válvula) revestido con factores orientadores y opcionalmente la liberación de agente quimioatrayente por el andamiaje. De acuerdo con una realización particular, tal andamiaje es un vaso o una válvula para el uso en el sistema cardiovascular. Sin embargo, en esta realización, puesto que los injertos de válvula o vaso sanguíneo se implantan en la posición de la válvula o el vaso sanguíneo enfermos y están así en contacto inmediato con la sangre, por lo tanto es suficiente implantar la matriz con los factores orientadores, opcionalmente en combinación con agentes quimioatrayentes.

La construcción de válvula cardíaca preparada para la ligación de células endógenas de acuerdo con la presente invención puede implantarse mediante un procedimiento de implantación estándar, tal como, pero no limitado a, el descrito posteriormente en la presente memoria. Las válvulas cardíacas se implantan en posición ortotópica o heterotópica con o sin la retirada completa o parcial de la válvula nativa. Se usan técnicas de implantación clásicas como las descritas en la presente memoria o la implantación puede implicar sistemas invasivos mínimos, endovasculares o percutáneos (véase posteriormente). De forma similar, los métodos de implantación para injertos vasculares son conocidos en la técnica.

La tecnología de la invención también puede aplicarse a prótesis valvulares percutáneamente implantables mediante un método descrito en documentos tales como EP 1152780A1 y WO 0045874A1. Estas solicitudes de patente describen un dispositivo para la implantación de una válvula cardíaca a través de una ruta percutánea comprendida por un globo de expansión periférica y una bomba de flujo sanguíneo axial central, y son particularmente adecuadas para injertos que no requieren siembra o maduración in vitro.

La presente invención se refiere así a una matriz para el uso en la ingeniería de andamiajes de órganos o tejidos, más particularmente andamiajes de órganos y/o tejidos que están sometidos a estrés por cizalladura, tales como andamiajes del sistema cardiovascular o linfático o andamiajes del tracto urinario. Lo más particularmente, la presente invención se refiere andamiajes de tejido de válvulas cardíacas y vasos sanguíneos. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el andamiaje que comprende la matriz con el factor o los factores orientadores de acuerdo con la presente invención se modela hasta la conformación del dispositivo implantable que ha de usarse, y así corresponde a un órgano, una válvula o un vaso prefabricado. El andamiaje debe ser biocompatible e implantable bien quirúrgicamente o bien percutáneamente. La presente invención prevé andamiajes tanto con como sin separadores intraluminales.

Ejemplos de matrices adecuadas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen andamiajes artificialmente producidos y moldeados, que pueden ser de polímero sintético o de material biológico tal como colágeno o fibrina, y andamiajes naturales tales como material radicular acelular o material natural reticulado tal como pericardio (Figura 1). Una matriz biológica incluye una matriz obtenida de novo a partir de material biológico (tal como gel de fibrina humana) así como una matriz que retiene la estructura de origen, tal como, pero no limitada a, raíz aórtica acelularizada. El material biológico puede ser autólogo (procedente del paciente en el que ha de implantarse el dispositivo), homólogo (p. ej. procedente de material humano si el implante ha de implantarse en un ser humano) o de origen heterólogo (p. ej. bovino, porcino u ovino en el caso de un implante en ser humano). La matriz biológica bien es reciente o bien se trata de tal modo que no comprometa el crecimiento de células sobre la superficie de la matriz o la flexibilidad de la matriz (p. ej. crioconservación, radiación UV, fotooxidación). Los injertos sintéticos pueden estar constituidos por materiales tales como poliéster, politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) y otros materiales compuestos que son conocidos en la técnica. Particularmente, de acuerdo con la presente invención, la matriz sintética es un material biocompatible y biodegradable tal como mallas de poli(ácido glicólico) y polihidroxialcanoato, un poliéster termoplástico derivado de bacterias. Alternativamente, los dispositivos sintéticos pueden estar constituidos por materiales tales como poliéster, politetrafluoretileno expandido (ePTFE) y otros materiales compuestos que son conocidos en la técnica.

De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la matriz no es biodegradable y es así durable, para permitir la presencia y el funcionamiento prolongados dentro del cuerpo. Las matrices derivadas de pericardio bovino de las que se han retirado las células (tales como Veritas® Collagen Matrix o SynerGraf®) están previstas dentro del contexto de la presente invención.

El "revestimiento" del factor o los factores orientadores sobre la matriz de acuerdo con la presente invención puede realizarse de varios modos. Entre los procedimientos de revestimiento, tres procedimientos de revestimiento son particularmente adecuados; para factores orientadores que se unen naturalmente a la matriz, puede usarse un procedimiento de impregnación. Esta unión dependerá tanto del factor orientador como de la matriz. La impregnación implica una incubación de la matriz en una solución comprendida por el factor orientador en un disolvente apropiado tal como, pero no limitado a, solución salina tamponada con fosfato. Esta solución es aplicable tanto para dispositivos prerrevestidos como para un estuche de revestimiento que permite el revestimiento antes de la implantación en el quirófano.

Alternativamente, de acuerdo con la presente invención, se realiza un prerrevestimiento con colágeno soluble, albúmina, fibrinógeno o fibronectina. Esto es particularmente adecuado cuando se usan factores orientadores que interactúan con estas proteínas. Este método incluye un prerrevestimiento con una proteína de la matriz extracelular. Este prerrevestimiento se basa en interacciones con proteínas nativas reticuladas de la matriz y sus homólogos naturales. En una segunda etapa, los factores orientadores se unirán a continuación a estas proteínas de la matriz extracelular. De nuevo, este procedimiento puede aplicarse antes del transporte de los dispositivos implantables así como también como un formato de estuche que permite el revestimiento en el quirófano.

Alternativamente, puede asegurarse una reticulación química con o sin una molécula espaciadora entre la matriz y el factor orientador. El espaciador puede ser un conector permanente o biodegradable, ya que una vez que las células se han ligado, la presencia de los factores orientadores es menos crítica. El factor puede reticularse inmediatamente a la matriz con tal de que siga siendo funcional. Otra realización implica una reticulación bioquímica con un brazo conector intercalado. La arquitectura específica de este brazo conector permite el control de la biodegradabilidad de la reticulación y, como tal, la farmacocinética del factor orientador añadido. Se han descrito en la técnica diferentes métodos para esta reticulación. Un paradigma particularmente útil es el uso de una reticulación fotoquímica como la descrita en el documento EP 0820483B1, pero se prevén diferentes métodos de reticulación (p. ej. los métodos descritos en las publicaciones de patente EP0991944B1, EP103587981 y WO0159455A2).

De acuerdo con una realización particular de la invención, uno o más factores orientadores y/o factores quimioatrayentes y de movilización están presentes sobre la matriz en la forma de una proteína de fusión. Una proteína de fusión puede obtenerse mediante tecnología recombinante. A continuación, la proteína de fusión se elige específicamente para la interacción con la matriz, como tal la proteína de fusión comprende un resto orientador así como un resto de interacción con la matriz. Generalmente, una proteína de fusión es producida por un organismo huésped que se ha alterado genéticamente mediante la inserción de un gen, comprendido por la combinación de 2 genes que codifican cada uno una proteína específica. Esto permite la combinación de cualesquiera de los factores orientadores mencionados anteriormente con una proteína que interactúa con la matriz reticulada. De nuevo, la última proteína en el constructo de la proteína de fusión puede ser el polipéptido completo o parcial de moléculas tales como, pero no limitadas a, colágeno, fibrinógeno o fibronectina. La proteína de fusión se selecciona en general por sus propiedades específicas de orientación de células y unión a la matriz. La proteína de fusión puede aplicarse al dispositivo implantable bien antes del transporte o bien en formato de estuche inmediatamente antes de la implantación en el receptor.

Es necesario adoptar precauciones para evitar la desactivación de la proteína por cualquier tratamiento subsiguiente de la válvula (es decir, esterilización). Es preferible una técnica de esterilización que no altere significativamente la bioactividad de los agentes de movilización, el agente quimioatrayente o los agentes orientadores. Condiciones de esterilización adecuadas que pueden conservar la actividad biológica de los agentes de movilización, el agente quimioatrayente o los agente orientadores están presentes en la técnica, tal como la esterilización de la matriz cargada con, p. ej., una radiación gamma de baja dosis u óxido de etileno. Métodos de esterilización particularmente adecuados son óxido de etileno a una temperatura seleccionada de dentro del intervalo de 37 a 63ºC o radiación con aproximadamente 1 a aproximadamente 3 mRad de radiación gamma o radiación de haz electrónico. Si el agente bioactivo es una proteína o un péptido, la actividad biológica puede optimizarse durante la esterilización con radiación gamma al incluir en la formulación 1) una proteína extraña, por ejemplo albúmina o gelatina; y 2) un eliminador de radicales libres (antioxidante), por ejemplo galato de propilo, 3-terc-butil-4-hidroxianisol (BHA) o ácido ascórbico, en cantidades eficaces para retardar la degradación inducida por radiación del péptido biológicamente activo. La esterilización se efectúa preferiblemente a baja temperatura, por ejemplo -70ºC.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos para tratar a un paciente que tiene un tejido, vaso u órgano enfermo o dañado, tal como, pero no limitado a, un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca enfermo o dañado, método que incluye implantar en dicho paciente el andamiaje de la presente invención revestido con uno o más factores orientadores.

De acuerdo con una realización particular, el andamiaje se implanta para la siembra in vivo. Sin embargo, alternativamente, también se prevé la siembra in vitro. La siembra in vitro puede tener lugar en un biorreactor. Biorreactores adecuados en el contexto de la presente invención son conocidos en la técnica e incluyen los descritos por Hoerstrup et ál. (2002, Tissue Engineering 8(5): 863-870).

Realizaciones particulares de los factores orientadores usados de acuerdo con la presente invención y las células ligadas a los mismos se ilustran en la Figura 4. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse diversas combinaciones de factores orientadores. Por otra parte, también se prevén diversas modificaciones y variaciones en la fabricación y el uso de los andamiajes de la presente invención y en la construcción del sistema y el método.

Los andamiajes de la presente invención proporcionan ventajas particulares sobre los andamiajes de la técnica anterior, que implican un número de riesgos según se ilustra en la Figura 3. Un primer riesgo es una exposición de las células del paciente a patógenos xenogénicos (p. ej. priones, virus y otros). El riesgo de agentes adventicios es introducido a través bien de enzimas proteolíticas o bien de medios de cultivo. Aunque estos factores son típicos para la fase in vitro de ingeniería tisular de la válvula cardíaca, el riesgo no se limita a estas rutas de infección. Otras rutas de infección son materiales matriciales xenogénicos o infección cruzada entre células de pacientes cuando se tratan en las mismas instalaciones. Las infecciones virales plantean algunos riesgos específicos, muchos de los cuales dependen de la cepa de infección, tales como infección del paciente después de la implantación, mutagénesis por inserción genómica del DNA viral y función protooncogénica de proteínas virales que posiblemente inducen la inmortalización. La segunda familia de riesgos son el factor ambiental celular no fisiológico, al que las células se exponen bajo condiciones in vitro. Un ejemplo es el daño potencial al DNA inducido por tensión de oxígeno no fisiológica que induce estrés oxidativo. La conclusión es que cada uno de estos factores necesita probarse debido a que las células son "propias" y serán aceptadas por el sistema inmunitario del paciente ignorando su daño inducido potencialmente.

Breve descripción de los dibujos

Las siguientes Figuras ilustran la invención pero no han de interpretarse como una limitación de la invención a las realizaciones específicas descritas en ella.

Figura 1: Vista esquemática que muestra una visión de conjunto general de las elecciones del andamiaje de acuerdo con una realización particular de la presente invención. Un primer grupo son andamiajes moldeados. Estos usan termoplásticos bien biológicos o bien no biológicos para crear un andamiaje valvular. En general, esto se alcanza usando un molde de colada en el que el termoplástico se deja endurecer o mediante un procedimiento conocido como electrohilado. Otra opción es usar proteínas tales como colágeno o fibrina para crear tal válvula. Estas construcciones formadas por una proteína natural, obtenida de, p. ej., un paciente, son de origen alogénico o xenogénico o recombinantes. A continuación, estas proteínas se dejan interactuar entre sí en un molde para válvulas. El segundo grupo son los andamiajes naturales, es decir válvulas biológicas bien alogénicas o bien xenogénicas. Pueden distinguirse dos clases principales: (1) raíces aórticas acelularizadas y (2) prótesis reticuladas.

Figura 2: Diagrama esquemático que muestra el paradigma completo de la ingeniería tisular según se pone en práctica en la ingeniería tisular de válvulas cardíacas de acuerdo con una realización de la invención. Se realiza una construcción de válvula mediante la siembra de células apropiadas sobre un andamiaje apropiadamente elegido. Estas células pueden ser células endoteliales, fibroblastos o células intersticiales de válvula. La construcción valvular creada in vitro se pone a continuación en un biorreactor durante un cierto período de tiempo para madurar la construcción, mientras se acostumbran las células al incremento gradual del flujo y la presión. A continuación, la construcción madura se implanta generalmente después de algunas semanas en el receptor, donde puede someterse a remodelación in vivo.

Figura 3: Vista esquemática que muestra los riesgos del paradigma completo en la ingeniería tisular de válvulas cardíacas de acuerdo con una realización de la presente invención.

Figura 4: Vista esquemática que muestra proteínas orientadoras y receptores respectivos presentes sobre tipos de células específicos de acuerdo con una realización de la invención. El epítopo P1 o P2 de fibrinógeno interactúa con la integrina mac1 expresada por macrófagos. El factor de células pluripotenciales (SCF) se une al receptor de proteína tirosina quinasa (c-kit o CD117) de células pluripotenciales "mesenquimales" (MSC). La orientación de células pluripotenciales hematopoyéticas (HSC) puede alcanzarse mediante diferentes interacciones. Esto se alcanza preferentemente mediante factor derivado de estroma 1 (SDF-1) que se une a su receptor CXCR4. Las HSC también se ligan a fibronectina (FN) por medio de antígeno muy tardío (VLA) 4 ó 5, adicionalmente VLA-4 también se está uniendo a molécula de adhesión a células vasculares 1 o VCAM-1. La última unión puede potenciarse mediante el inhibidor de proteasa pleiotrópico a2-macroglobulina (a2-MG).

Figura 5: Conformación esquemática de un andamiaje de la presente invención después de la siembra celular de acuerdo con un aspecto de la invención. Una proteína orientadora sobre la matriz interactúa con un receptor de una célula atraída. La especificidad de la unión celular se determina mediante la elección apropiada de la proteína orientadora.

Figura 6: Ejemplo de laminilla sembrada espontánea (A) y una presembrada IP (B) de acuerdo con un aspecto de la invención. El Panel C muestra la recelularización (conteo celular total/longitud de la laminilla) de laminillas tanto sembradas espontáneas como presembradas IP en 1 semana y 1 mes *:p<0,05.

Figura 7: Histología. Gráfica A: valor medio de sobrecrecimiento de laminillas tanto sembradas espontáneas como presembradas IP en 1 semana y un mes. Gráfica B: superficie mediana de matriz recientemente depositada sobre el pericardio bovino fotooxidado. Gráfica C: valor mediano de la longitud de la laminilla medida desde la superficie hasta la punta. *:p<0,05

Figura 8: Caracterización de válvulas implantadas usando anticuerpos para marcadores celulares según se describe en la presente memoria en el Ejemplo 1. Los datos se presentan como mediana [95% CI]. * indica diferencia significativa entre los grupos de 1 semana; \dagger indica diferencia significativa entre ambos grupos de control o entre ambos grupos sembrados IP; t indica diferencia entre ambos grupos de 1 mes; \NAK indica significativamente diferente de las muestras de prueba IP, e indica que no podía realizarse un análisis estadístico debido a que n < 6.

Figura 9: Porcentaje de células (A) VLA-4+, (B) CD44+ y (C) CD172a+ presentes en el material durante las diferentes fases de la FBR. Los puntos y las barras de error representan promedio \pm desviación estándar. a) significativamente diferente de 6 horas (p<0,05); b) significativamente diferente de 6 horas, 1, 2 y 3 días (p<0,05); c) significativamente diferente de 3 días (p<0,05); d) significativamente diferente de 2 días (p<0,05). Para CD172a, los datos de 6 horas se excluyen del análisis estadístico debido a datos de 2 ratas perdidos. La capacidad de unión y orientación de células es alta, directamente después de la implantación, y generalmente disminuye posteriormente, excepto para un pico significativo en células CD172a+ el día 3.

Figura 10: Porcentaje de células pluripotenciales primitivas (A) CD133+ y (B) Sca-1+ y el porcentaje de progenitores (C) CD34+ y (D) CD117+ presentes en el material durante las diferentes fases de la FBR. Los puntos y las barras de error representan promedio \pm desviación estándar. a) significativamente diferente de 5 días (p<0,05); b) significativamente diferente de 3, 5 y 7 días (p<0,05); c) significativamente diferente de 3 días (p<0,05); d) significativamente diferente de 2 días (p<0,05). Como puede observarse, las células pluripotenciales primitivas Sca-1+ tienen un pico en su presencia a las 6 horas después de la implantación, mientras que las células progenitoras CD34+ y CD117+ tienen un pico en su presencia a los 2 y 3 días después de la implantación.

Figura 11: Resultado obtenido de los perfiles de expresión génica determinados por microordenación de implantes intraperitoneales después de 1,5 y 3 días y macrófago peritoneal (IP) de acuerdo con un aspecto de la invención.

Figura 12: Resultados de la fracción de células CD117 (a) y Sca-1 (b) positivas presente en los controles e injertos de arteria carótida impregnados con SDF-1 y SCF (con o sin prerrevestimiento con FN). El asterisco indica diferencia significativa del control (n=6 en cada grupo) y # indica diferencia del grupo de SDF.

Figura 13: Presencia de células CD34+ (células pluripotenciales/progenitoras hematopoyéticas) sobre parches implantados en arterias de oveja.

Ejemplos Ejemplo 1 Ingeniería de una válvula mediante implantación IP de un andamiaje

Para obtener una matriz sembrada para identificar los factores clave implicados en la adhesión de células apropiadas, se usó una reacción de cuerpos extraños inmadura para repoblar una matriz biológica reticulada, a saber pericardio bovino fotooxidado. Tal tipo de matriz asegura la durabilidad por sí mismo. En la oveja, un andamiaje o parche implantado intraperitoneal (IP) de tres días se cubre con células similares a blastos con origen mesenquimal y diferenciación inmadura que podrían diferenciarse y normalmente lo harían en un fenotipo miofibroblástico. Más particularmente, se encontró que estas células eran positivas para la vimentina pero negativas para actina del músculo liso \Delta y miosina de la cadena pesada (véase la Tabla 1).

TABLA 1 Comparación entre siembra IP de 3 días en ovejas y ratas

1

: * indica diferencia significativa entre la oveja y la rata (p<0,05)

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Se encontró que podía obtenerse una matriz estable con durabilidad probada que se diferencia en un fenotipo diferente en unos pocos días.

Se construyó una válvula del material madurado IP de oveja y se implantó en la artería pulmonar de la oveja, y se determinó con respecto a la funcionalidad. Se implantaron 24 válvulas (12 controles no sembrados y 12 válvulas sembradas intraperitonealmente). En cada uno de los dos grupos se estudiaron 2 puntos temporales 1 semana (n = 6 por grupo) y 1 mes (n = 6 por grupo) después de la implantación en la arteria pulmonar. La función de la válvula se determinó mediante ecocardiografía. No se observaron anormalidades. No se observó una formación importante de trombos en los injertos sembrados intraperitonealmente, mientras que se encontró 1 en el grupo de control.

TABLA 2 Datos de ovejas y ecocardiografía

2

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Usando tinción histológica, se encontró que había una notable diferencia en la celularización entre los controles y las construcciones valvulares sembradas intraperitonealmente. En contraste con los controles, se observó una deposición significativa de células y nueva matriz sobre la válvula sembrada intraperitonealmente, que también mostraba claramente una repoblación de la matriz original (véanse las Figuras 6 y 7). Criosecciones de 7 \mum de la válvula explantada y muestras de control se tiñeron inmunofluorescentemente para CD44 (clon BAT 31A, VMRD Inc.), CD45 (clon 1.11.32, Serotec), CD172a (clon DH59B, VMRD Inc.), vimentina (clon V9, DAKO), ASMA (clon 1A4, DAKO), SMMS-1 (clon SMMS-1, DAKO), fosfohistona H3 (policlonal, CAMPRO scientific), CD117 (policlonal, ABCAM), ecNOS (clon 3, BD Biosciences), MHC-I (clon H58A, VMRD, Inc), MHC-II (clon TH14B, VMRD, Inc y CD34 (clon QBEnd 10, DAKO).

[CD44: H-CAM, ácido hialurónico que se une a moléculas de la superficie celular; CD45: antígeno común de leucocitos; CD172a: es un marcador para monocitos y células pluripotenciales; vimentina: es un marcador para células mesenquimales; actina del músculo liso alfa (ASMA): es un marcador para miofibroblastos y células del músculo liso; miosina de la cadena pesada (SMMS-1): es un marcador para células del músculo liso; fosfohistona H3: es un marcador para la mitosis; CD117 es un marcador para células pluripotenciales; ecNOS: es un marcador para el endotelio; MHC-I y MHC-II son marcadores para la respuesta inmune; CD34: es un marcador para células progenitoras].

Se contaron las células que están presentes en y sobre el material matricial implantado, en una sección de laminilla completa. El control sembrado espontáneo tenía 3753 [995, 17254] y 3345 [1562, 4298] células por sección en 1 semana y 1 mes después de la implantación en la posición pulmonar, respectivamente. Por otra parte, las válvulas presembradas IP tenían 12126 [4571, 28216] y 20404 [4723, 32084] células por sección en 1 semana y 1 mes, respectivamente. Este incremento de cuatro a siete veces en el conteo de células entre válvulas presembradas espontáneas e IP era significativo.

Los porcentajes de células positivas encontrados en las secciones valvulares se resumen en la Tabla de la Figura 8. Los datos de todos los grupos y las tinciones se representan como valores medianos y el intervalo de confianza de 95%. Puesto que estos son porcentajes, solo se muestra la fracción de células positivas, teniendo en cuente las grandes diferencias en las células totales observadas, son evidentes grandes diferencias en el conteo absoluto del tipo de célula.

Estos hallazgos ilustran claramente el potencial de estas células para revitalizar la matriz biológica estabilizada con miofibroblastos. Por otra parte, los implantes de 1 mes ya mostraban signos de reendotelialización espontánea. El proceso de recelularización parece ser autolimitante, ya que la cantidad de material recientemente depositado no se incrementa continuamente y está siendo cubierta por endotelio. Esto impide que nuevas células se adhieran y contribuyan al proceso de recelularización.

Aunque se ha usado matriz biológica estabilizada, las células obtenidas mediante siembra peritoneal son capaces de modificar esta matriz así como de depositarse por sí mismas.

Esta válvula biohíbrida construida de material matricial xenogénico y células autólogas combina la fiabilidad de la matriz con la viabilidad de las células. Las células son de origen mesenquimal y pueden diferenciarse en el fenotipo apropiado, miofibroblasto, para la repoblación celular. El presente estudio demuestra que la repoblación, aunque mediada o iniciada por macrófagos, se deriva de células pluripotenciales (hematopoyéticas).

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Ejemplo 2 Atracción de células pluripotenciales a la matriz intraperitoneal

El material matricial se introdujo intraperitonealmente en ratas y se investigó el tipo de células atraídas.

Animales

Se seleccionaron ratas Wistar macho (n = 36; 380-400 g). Se dio acceso a alimento ad líbitum. Todos los animales se cuidaron de acuerdo con la "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (publicación NIH 85-23, revisada en 1985). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética local.

Procedimiento

La anestesia se indujo con isoflurano al 4% en oxígeno al 100%, 1 l/min, durante 5 minutos y se mantuvo con isoflurano al 2% en oxígeno al 100%, 0,5 l/min, durante el procedimiento quirúrgico que duraba aproximadamente 20 min. Después de afeitar y desinfectar, se realizó una incisión pararrectal de aproximadamente 1,5 cm a través de la piel, los músculos abdominales y el peritoneo. La jaula de acero inoxidable que contiene el material matricial se insertó en la cavidad abdominal y se fijó a la pared abdominal con suturas transabdominales (Ticron 3-0). El peritoneo y los músculos abdominales se cerraron con una sutura corrida (Ticron 3-0) y la piel se suturó intradérmicamente (Ticron 3-0) para evitar la apertura de la herida por el acicalamiento. Después del procedimiento quirúrgico, la anestesia se interrumpió. Después de aproximadamente 5 min, los animales recobraban la consciencia y colocaban en jaulas individuales.

Condiciones

La recuperación de los materiales matriciales se realizó en diferentes puntos temporales. Los diferentes momentos de recuperación eran 6 horas, 1, 2, 3, 5 y 7 días después de la implantación, dependiendo del grupo al que se asignara el animal. Con este propósito, los animales se anestesiaron de nuevo, la herida se reabrió y la jaula se retiró.

Material

El material matricial recuperado se embebió en medio de congelación tisular (Leica - Van Hopplynus instruments, Bruselas, Bélgica), se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. El crioseccionamiento se realizó en un criostato Microm HM500 OM (Prosan, Merelbeke, Bélgica). Las secciones de 7 \mum se pusieron sobre portaobjetos revestidos con poli-L-lisina y se almacenaron a -20ºC hasta la tinción.

Antes de la tinción, el material se fijó en acetona enfriada con hielo durante 10 min. Subsiguientemente, las secciones matriciales se tiñeron inmunohistoquímicamente con anticuerpos. Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos secundarios conjugados a FITC. Se tomaron fotografías a temperatura ambiente usando un microscopio de toma de imágenes Axioplan 2 con una cámara Zeiss Axiocam MRc5 (Zeiss; Zaventem, Bélgica). Las lentes del objetivo usadas eran Plan-NEOFLUAR 1x/0.025, Plan-POCHROMAT 10x/0.45 y 20x/0.75. El análisis de las imágenes se realizó con Axiovision Rel. 4.4.

Para estudiar los fenotipos celulares (inmunohistoquímica) con detalle, se agruparon de acuerdo con la función o la especificidad. La densidad y la proliferación celulares se estudiaron en 6 puntos temporales diferentes (n = 6 por punto temporal) después de la implantación intraperitoneal.

TABLA 3 Conteo y proliferación celulares in situ

3

Los datos se representan como promedio \pm desviación estándar. a diferencia significativa de 6 h (p<0,05); b diferencia significativa de 5 d (p<0,05); c diferencia significativa de 3 d (p<0,05).

La Tabla 3 muestra que las células están presentes sobre el material implantado completamente acelular desde 6 horas después de la implantación intraperitoneal en adelante. En los implantes, puede observarse un incremento general en el número de células a lo largo del tiempo, haciéndose significativo desde el día 1 en adelante. A los 7 días después de la implantación, se observa un incremento de más de 4 veces en el número de células. El marcador usado para determinar la proliferación celular in situ, fosfohistona H3 (PPH-H3), muestra un pico significativo de aproximadamente 5% en la proliferación celular in situ el día 3 después de la implantación. Excepto por la presencia del pico en la proliferación celular el día 3, estos datos apoyan una neogénesis de tejido por aflujo celular más que por división celular. Sólo el día 3 la proliferación celular parece contribuir al incremento en la celularidad.

La capacidad de unión y orientación de células se determinó con anticuerpos para VLA-4 (CD49d), CD44 y CD172a o proteína reguladora de señales alfa (SIRPa). La Figura 9 muestra que células VLA4+ estaban claramente presentes en la primera fase de la FBR que comprende alrededor de 20% de la población celular y que esta fracción disminuye significativamente para aproximarse a la ausencia después de 5 días de la implantación intraperitoneal. Las células CD44+ muestran una presencia de partida similar pero disminuyen significativamente los días 2, 5 y 7, en comparación con las medidas a las 6 horas, pero manteniendo la presencia en aproximadamente 10% hasta el día 7. Los datos de CD172a muestran un patrón similar de presencia de estas células, situado dentro del mismo orden de magnitud que los datos de CD44, excepto por el hecho de que la disminución no está presente significativamente y que un pico pequeño pero estadísticamente significativo se sitúa en el día 3. VLA-4 (CD49d), encontrado en células T, células B, timocitos, células pluripotenciales hematopoyéticas CD34+ y células endoteliales, es una molécula de integrina que se une a molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1) sobre el estroma medular y está implicada en la orientación de células pluripotenciales y progenitoras al estroma medular (Krause et ál. (1996) Blood 87, 1-13). VLA-4 también media en la ligación de células progenitoras hematopoyéticas a fibronectina (Levesque & (1999) Exp. Hematol. 27, 579-586). Se ha observado que CD44, una molécula de adhesión sobre leucocitos, células progenitoras hematopoyéticas (Netelenbos et ál. (2002) J Leukoc. Biol. 72, 353-362) y células pluripotenciales mesenquimales (Rombouts & Ploemacfier (2003) Leukemia 17, 160-170), media en interacciones célula-célula y célula-ECM, para representar un papel en el tráfico de leucocitos a zonas de inflamación y para coestimular la activación de linfocitos y la infiltración tisular (Wu et ál. (2005) Cell Res. 15, 483-494). Por otra parte, las interacciones del proteoglicano CD44 de la superficie celular con el glicosaminoglicano de la matriz extracelular hialuronano (HA) son episodios clave en la inflamación (Levesque et ál. citado anteriormente). Los elevados niveles de fracciones celulares tanto VLA-4+ como CD44+ inmediatamente después de la implantación indican claramente una capacidad incrementada de unión a y orientación de células mediada por estas moléculas que disminuye significativamente durante las últimas fases cuando las células empiezan a diferenciarse, lo que también se observa en los números absolutos de células.

De la forma más importante, se estudiaron 4 marcadores predominantemente expresados por células pluripotenciales/progenitoras: CD133, antígeno de células pluripotenciales 1 (Sca-1), CD34 y CD117 (c-kit) (véase la Figura 10). La fracción celular CD133+, que representa la célula pluripotencial más primitiva estudiada (Gehling et ál. (2000) Blood 95, 3106-3112), era muy pequeña, alcanzando su máximo de 2,3% en 1 rata después de 3 días de implantación. Se sabe que Sca-1 es presentado por células pluripotenciales hematopoyéticas y mesenquimales primitivas. Durante la fase inicial de la implantación intraperitoneal, se encontraba aproximadamente 7% de estas células. CD34 y c-kit (CD117) son ambos marcadores para células pluripotenciales y progenitoras hematopoyéticas en circulación (Okamoto et ál. (2005) Blood 105, 2757-2763). C-kit también se expresa sobre células pluripotenciales mesenquimales. El perfil temporal de células CD34+ muestra un incremento gradual en la fracción de estas células encontrada sobre el material del implante, alcanzando un valor pico significativo de aproximadamente 5-8% en los días 2 y 3. Es notable el retorno muy rápido a bajos niveles de células CD34+ ya evidentes el día 5, seguido de nuevo por un incremento significativo hacia el día 7. El patrón de c-kit muestra un nivel elevado significativo de aproximadamente 2% en los días 2 y 3. La expresión de CD133, un antígeno superficial celular de transmembrana, está restringida a un subgrupo de las células pluripotenciales y progenitoras CD34+ (Buhring et ál. (1999) Ann. N. Y. Acad. Sci. 872, 25-38) y a células precursoras endoteliales (Gehling et ál. 2000, citado anteriormente). Adicionalmente, es expresado por una pequeña porción de aproximadamente 0,2% de las células CD34- (Gallacher et ál., citado anteriormente). Las células CD34+CD133+ están enriquecidas en células progenitoras primitivas y mieloides, mientras que las células CD34+CD133- consisten principalmente en progenitores de células B y eritroides tardíos (Buhring at al. 1999, citado anteriormente). El antígeno CD133 está presente esporádicamente en los parches implantados, sugiriendo una contribución muy limitada de estas células primitivas en la formación de nuevo tejido en la FBR. Sca-1 se expresa sobre células pluripotenciales primitivas multipotentes en la médula ósea y en sangre periférica, así como sobre células pluripotenciales mesenquimales. Las células Sca-1+ son más primitivas que las células Sca-1- y responden mejor a una combinación de factores hematopoyéticos, incluyendo SCF y células estromales (Okada et ál. (1992) Blood 80, 3044-3050; Rombouts y Ploemacher, citado anteriormente; Spangrude et ál. (1991) Blood 78, 1395-1402.). De forma interesante, se observó una fracción bastante grande de estas células inmediatamente después de la implantación y una disminución gradual en los últimos pasos. Un pico en el número absoluto de células se observó 2 días después de la implantación. En conjunto, los hallazgos indican claramente que estas células son una contribución principal e inicial a la reacción FBR.

Tanto CD34 como CD117 se usaron como marcadores para células pluripotenciales y progenitoras más comprometidas en comparación con CD133 y Sca-1. El marcador CD34, una proteína de membrana monocatenaria, indica la presencia de células pluripotenciales/progenitoras hematopoyéticas, células precursoras endoteliales y células endoteliales capilares. C-kit (CD117), un miembro de la familia de tirosina quinasas receptoras y el receptor de factor de células pluripotenciales (SCF), se expresa sobre células pluripotenciales primitivas hematopoyéticas y células progenitoras comprometidas (Okada et ál. citado anteriormente), sobre células inmaduras en circulación (Taguchi et ál. (2004) Circulation 109, 2972-2975) y sobre células pluripotenciales mesenquimales (Rombouts y Ploemacher, citado anteriormente). Estos resultados mostraban un nivel elevado temporal de células tanto CD34+ como c-kit+ a los 2 y 3 días de la implantación, que era especialmente pronunciado en las fracciones de células CD34+. Estas células mostraban un pico claro el día 3 que se aproxima a la fracción inicial de células Sca-1. Estos hallazgos pueden explicarse bien mediante la diferenciación de las células Sca-1+ en las células c-kit+ o CD34+ más comprometidas o bien mediante el reclutamiento temporal de estos tipos de células desde la corriente sanguínea a través de factores de señalización liberados de otras células presentes en la FBR en fase inicial, probablemente los macrófagos. Puesto que el número absoluto de células CD34+ en su pico sobrepasa con mucho el conteo absoluto de células Sca-1, la última explicación es más aceptable.

Mediante la presente invención se encontró sorprendentemente en un modelo de implantación intraperitoneal en rata que durante la reacción a cuerpos extraños inmadura, las células pluripotenciales y las células progenitoras son atraídas al tejido y están implicadas activamente en la repoblación de la matriz con (mio)fibroblastos.

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Ejemplo 3 Expresión génica específica en la neogénesis tisular

Según se menciona anteriormente, la neogénesis tisular se estudió según se produce en la FBR en modelos de animales adultos, debido a que es capaz de producir tejido laminar con un componente celular similar a estructuras vasculares tales como válvulas cardíacas (Butler et ál. 2001a, citado anteriormente; Butler et ál. 2001b, citado anteriormente). Desgraciadamente, el tejido maduro no es una solución ideal ya que requeriría la construcción de una prótesis valvular en el quirófano, un método propenso a la variación en la calidad de la válvula (Grabenwoger et ál. (2000) J Heart Valve Dis 9, 104-109). No obstante, la neogénesis tisular en sí es una característica interesante debido a que contiene todos los componentes, esto es, las células (ejemplo 2), nueva matriz extracelular, moléculas de señalización y proteínas orientadoras, necesarios para construir un nuevo tejido. Se identificaron las proteínas orientadoras, moléculas responsables de la conexión física de las células a la matriz extracelular.

De forma similar al ejemplo 2, pericardio bovino fotooxidado, una matriz completamente acelular y reticulada, se suspendió en una jaula de acero inoxidable y se implantó en la cavidad abdominal de ratas Wistar. Se han estudiado dos períodos de implantación diferentes (1,5 d y 3 d) con 2 ratas en cada grupo. Los implantes se recuperaron después de 1,5 d o 3 d, dependiendo del grupo al que estuviera asignado el animal. Con este propósito, los animales volvieron a anestesiarse, la herida se reabrió y la jaula se retiró. Durante la recuperación, el parche matricial se puso inmediatamente en RNAlater RNA Stabilization reagent (Qiagen) hasta la extracción del RNA.

La expresión génica de fondo, que es la expresión génica de macrófagos, se obtuvo a partir de macrófagos intraperitoneales inducidos por tioglicolato (2 ml de tioglicolato al 3% en solución salina estéril y esterilizados por filtración) procedentes de 3 ratas.

El RNA total se extrajo usando reactivo TRIzol (Invitrogen) seguido por una purificación adicional usando RNeasy Mini Spin Columns (Qiagen). El RNA total se controló con respecto a su integridad y pureza usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) y un espectrofotómetro Nanodrop en the MicroArray Facility del VIB (Flemish Interuniversitary Institute for Biotechnology), respectivamente. Se prepararon sondas a partir de 5 \mug de RNA total, que no mostraban signos de degradación o impurezas (260/280 y 260/230 > 1,8), de acuerdo con las directrices de Affymetrix. En resumen, a partir de RNA total, RNA de poli-A se transcribió inversamente usando un cebador de poli dT-T7 y se marcó durante una reacción de transcripción in vitro de T7 usando el Affymetrix IVT Labeling Kit (nº cat 900449, Affymetrix, High Wycombe, Reino Unido). Las sondas se purificaron (GeneChip Sample Cleanup Module, nº cat P/N 900371, Affymetrix, Reino Unido) y se analizaron de nuevo con respecto al rendimiento (30-120 \mug) y la pureza (260/280 y 260/230 > 1,8). Se fragmentaron 20 \mug con hidrólisis alcalina. El aRNA fragmentado se resuspendió con adiciones de control en 300 \mul de tampón de hibridación (Eukaryotic Hybridization Control Kit, nº cat 900299, Affymetrix, High Wycombe, Reino Unido) y 200 \mul de sonda se hibridaron en un horno de Rotisseri a 45ºC. Las "microplaquetas génicas" (Affymetrix GeneChip Rat Genome 230 2.0 Array, Affymetrix, Reino Unido) se lavaron y se tiñeron en la GeneChip Fluidics Station 400 (Affymetrix, Reino Unido) usando el protocolo EukGE-WS2v4, y subsiguientemente se exploraron con el GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix, Reino Unido). El análisis de imágenes se realizó en GCOS.

El experimento se realizó por triplicado usando muestras no reunidas obtenidas de un animal diferente. El análisis de imágenes se realizó en GCOS. Los valores de intensidad de la sonda que alcanzaban el nivel de fondo anterior con una significación p < 0,05 se consideraban llamadas ("calls") presentes. El análisis funcional de los datos de microordenación se realizó usando Onto-Express que clasifica los genes de acuerdo con las categorías de Gene Ontology [Draghici et ál (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3775-3381].

Como se ilustra en el ejemplo 3, se produce una reacción primaria seguida por una acumulación tanto de moléculas de la matriz extracelular como de proteínas orientadoras, proporcionando sitios de ligación a la células, el día tres.

Todos los genes (\pm 31000) presentes sobre la microplaqueta de microordenación se consideraban para el análisis. El diagrama de Venn (Figura 11) da una visión de conjunto del hallazgo de la expresión génica. Comparando los perfiles de expresión para FBR e IP, se encontraron 3868 genes específicos para FBR3 y 2957 FBR1.5 (origen no macrófago). Genes de principal interés codifican proteínas de la matriz extracelular y proteínas de señalización que permiten la atracción y la orientación de células pluripotenciales, que se ha mostrado que están implicadas en la FBR inmadura. Aunque se encontró una señal significativa para moléculas estructurales entre las cuales se encuentran diferentes colágenos y lamininas tanto en FBR1.5 como en FBR3, la expresión general de estas moléculas, según se agrupaban por GO, solo resultaba significativa en el último grupo. Esto significa que, independientemente de la expresión de algunas moléculas estructurales en el grupo FBR1.5, la contribución significativa de esos genes solo se encontró en el grupo FBR3, esto es, después de la orientación de células. En FBR3 y FBR1.5, 85 y 116 genes se atribuyeron respectivamente al término de GO actividad transductora de señales, entre los cuales se encuentra el factor derivado de células estromales 1 gamma (SDF-1), una molécula que se une a células pluripotenciales hematopoyéticas y por lo tanto un candidato interesante para la integración en una matriz biológica.

A partir de estos resultados, parece que tanto SDF-1 como SCF estaban presentes en esta neogénesis tisular del adulto y que ambas son proteínas orientadoras candidatas para ser estudiadas con respecto a la orientación de células pluripotenciales/progenitoras in vivo hacia prótesis vasculares/valvulares.

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Ejemplo 4 Injertos de la arteria carótida en ratas

El potencial de resiembra de los materiales nanorrevestidos se determinó al injertar un injerto vascular de pequeño calibre en la arteria carótida común como una interposición. Los injertos se realizaron a mano a partir de pericardio fotooxidado bien con SDF-1 o bien SCF a 1 \mug/por tubo (en 30 \mul de PBS) con o sin revestimiento previo del pericardio bovino con fibronectina. El injerto permanecía en su lugar durante solo 24 h, suficiente para alcanzar la adhesión celular pero no suficiente para dar como resultado la diferenciación de las células, que daría como resultado una pérdida de sus propiedades como células pluripotenciales. Se prepararon tubos de pericardio bovino con un diámetro interno que se aproxima al diámetro interno de una arteria carótida de rata. El injerto se fabricó enrollando un pequeño parche de pericardio fotooxidado sobre una cánula de plástico de calibre pequeño y suturando los bordes longitudinales usando técnicas de microcirugía. La longitud del injerto era aproximadamente 5 mm y el diámetro interno es 10 veces menor. Comparar el diámetro interno del injerto con el diámetro interno de la arteria carótida común revelaba que el diámetro del injerto es aproximadamente 20% mayor. Este diámetro mayor se elegía debido a que los implantes preliminares seguían siendo evidentes durante varias semanas.

El protocolo de implantación es una adaptación del protocolo para conejos publicado por Boeckx (1997) (Ann. Thorac. Surg. 63, S128-S134). Ratas Wistar macho (n = 6 para cada grupo de material) de 380 a 400 g se anestesiaron con isoflurano (inducción: 4%; cirugía: 2%). Después de afeitar y desinfectar con alcohol yodado, la arteria carótida común se disecó libre del tejido circundante y se montó en una micropinza tipo Acland. Las arteria se seccionó transversalmente y los extremos tanto proximal como distal de la construcción de injerto se suturaron con un nailon monofilamentoso 10/0, usando la técnica de costura de las 7 en punto (Kirsch et ál. (1992) Am. Surg. 58, 722-727) que requiere de 9 a 12 puntadas. La aguja abarcaba todo el grosor de la pared del vaso. Se tuvo cuidado de que solo la aguja tocara la íntima de la arteria. Todo el procedimiento se realizó sin espasmolíticos (p. ej. papaverina) ni anticoagulantes (p. ej. heparina). Después de la última puntada, la micropinza de tipo Acland doble se retiró. Después de unos pocos minutos para asegurar la hemostasis completa, la piel se cerró. La anestesia se interrumpió y aproximadamente 5 minutos más tarde el animal se despertó y se transfirió a una jaula individual.

Después de 24 h, la herida se reabrió y el injerto se recuperó y se lavó con solución salina tamponada con fosfato. El injerto y, en cada anastomosis, una pequeña porción de la arteria carótida natural se extirpó. La luz se barrió suavemente con solución salina tamponada con fosfato y subsiguientemente se cargó con medio de congelación tisular. Después de embeberse en el mismo medio, la muestra se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. El seccionamiento se realiza en un criostato Microm HM500 OM (Prosan, Merelbeke, Bélgica). Las secciones longitudinales de 7 \mum se pusieron sobre portaobjetos revestidos con poli-L-lisina y se almacenaron a -20ºC hasta la tinción.

Se puso énfasis en la atracción de células pluripotenciales, por lo tanto las muestras se tiñeron inmunohistoquímicamente para 4 marcadores CD3 (BD Pharmingen; clon G4.18), c-kit (Santa Cruz Biotechnology; clon H-300), CD34 (DAKO; clon QBEnd 10), Sca-1 (R&D Systems; policlonal de cabra). La Tabla posterior indica los tipos de células teñidos para cada anticuerpo.

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TABLA 4 Anticuerpos usados para la tinción de células

4

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Todos los anticuerpos primarios se detectaron con un anticuerpo conjugado a fluorocromo, FITC o rojo de Texas. El análisis de imágenes se realizó usando un microscopio de toma de imágenes Axioplan 2 (Zeiss, Zaventem, Bélgica) y el paquete de software Axiovision 4.4 (Zeiss, Zaventem, Bélgica). Para la fenotipificación celular se determinó cada sección transversal longitudinal de un total de 250 células y los resultados se expresaron como un porcentaje. Para evitar la desviación, se tomaron varias fotografías, se dividieron en cuadros y se contaron de acuerdo con una lista de aleatorización.

Globalmente, no se encontró diferencia en la adhesión celular cuantitativa (Tabla 5)

TABLA 5 Datos de conteo celular

5

Se encontraron células CD34 positivas en dos grupos. Estas células estaban presentes en los controles (1,85 [0,00, 7,21]%) que solo se sometían a siembra espontánea después de la implantación en el vaso sanguíneo de la rata. Por otra parte, se observaba que estaban presentes en pericardio bovino fotooxidado impregnado con SCF (3,84 [0,00, 11,08]%), aunque se encontraba un incremento numérico, este no era significativo debido a la gran variación entre individuos. Los tres grupos restantes no contenían células CD34+.

Los resultados de la inmunotinción de CD117 se muestran en la Figura 12(A). Las muestras de control comprendidas por pericardio fotooxidado mostraban una presencia mediana de 4,70 [2,14, 12,17]% de células CD117^{+} después de implantarse en la arteria carótida de una rata. Impregnar el mismo material matricial bien con SCF o bien con SDF-1 incrementaba significativamente la fracción de células CD117^{+} en y sobre la cara luminal de los implantes. Una fracción de 15,78 [10,04, 47,90]% y 34,02 [26,32, 37,39]% se encontró para SCF y SDF-1, respectivamente. Aunque la coimpregnación con fibronectina no tenía un efecto sobre la presencia de células CD34^{+} y Sca-1^{+}, se encontró un claro incremento en la orientación de las células CD117^{+}. La coimpregnación de fibronectina y SCF daba como resultado una fracción de células CD117^{+} de 47,84 [41,10, 66,00]%. A pesar de un gran incremento numérico, se encontró que esto no era significativo debido a la gran variación en la fracción CD117^{+} en el grupo de SCF. Por otra parte, se encontró que el incremento encontrado en la fracción CD117^{+} en el grupo coimpregnado con fibronectina y SDF-1 (48,90 [42,32, 54,08]%) se incrementaba significativamente cuando se comparaba con el grupo de SDF-1. En general, se encontró que todos los protocolos de impregnación inducían una orientación potenciada de células CD117 positivas y que especialmente las combinaciones bien de SCF o bien de SDF-1 con fibronectina daban como resultado que aproximadamente 50% de las células eran positivas para este marcador.

Finalmente, se investigó la atracción de células pluripotenciales Sca-1+ a pericardio bovino fotooxidado revestido con SDF-1 o SCF con o sin prerrevestimiento con fibronectina (véase la Figura 12b). En el control, algunas células Sca-1 positivas se encontraron en 2 de 6 implantes. Cuando el mismo material matricial se impregnaba, esto daba como resultado adhesión de células Sca-1 positivas en todos los implantes así como un incremento significativo en el porcentaje de células Sca-1 positivas. Las células Sca-1 positivas pueden atribuirse bien al grupo de células pluripotenciales o bien a un subgrupo de células T. Se observó que la tinción para células T (inmunohistoquímica anti-CD3) era negativa en todos los implantes, confirmando de ese modo la orientación específica de células pluripotenciales Sca-1 positivas hacia el material impregnado.

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Ejemplo 5 Parches implantados en la arteria carótida de ovejas

Parches pericardiales bovinos impregnados con SCF y SDF-1 se han implantado en la arteria carótida de ovejas. Ambas proteínas se han usado con o sin revestimiento previo del material matricial con fibronectina. Se han implantado cuatro parches en cada arteria carótida (izquierda y derecha). En cada cara se implantaron un control, 1 \mug, 3 \mug y 10 \mug por cm^{2} de parche revestido. El control se implantó aguas abajo y subsiguientemente los parches de 1, 3 y 100 \mug/cm^{2} se implantaron con el parche de 10 \mug/cm^{2} en la posición más aguas arriba. La Figura 13 muestra que se encontraban algunas células CD34+ (células pluripotenciales/progenitoras hematopoyéticas).

Claims

1. Un método para preparar un andamiaje para implantación in vivo, que comprende la etapa de revestir una matriz estructural con un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el andamiaje es un andamiaje para válvulas cardíacas o vasos sanguíneos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la matriz estructural es biodegradable.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que no comprende la etapa de revestir la matriz estructural con factores quimioatrayentes o factores de movilización.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además la etapa de revestir la matriz estructural con uno o más factores quimioatrayentes y/o factores de movilización.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además la etapa de prerrevestir la matriz del andamiaje con una o más proteínas que facilitan la interacción entre el ligando o su fragmento y la matriz estructural.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el ligando o su fragmento y la proteína que facilita la interacción con la matriz estructural se revisten sobre la matriz como una proteína de fusión.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que la proteína facilitadora se selecciona del grupo que consiste en fibronectina, colágeno y fibrinógeno.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ligando o su fragmento se reviste en dicha matriz estructural por medio de un brazo conector.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la matriz estructural es una prótesis no reticulada o raíces aórticas acelularizadas.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de revestir la matriz estructural con el ligando aislado o su fragmento se realiza mediante reticulación química o mediante impregnación de la matriz con una solución que comprende el ligando o su fragmento.

12. Un andamiaje para implantación in vivo que comprende una matriz estructural, caracterizado porque dicha matriz está revestida con uno o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

13. El andamiaje de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho andamiaje es un andamiaje de un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca.

14. El andamiaje de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, que comprende además factores quimioatrayentes y/o factores de movilización.

15. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho andamiaje está revestido además con una o más proteínas que facilitan la interacción entre el ligando o su fragmento y la matriz estructural.

16. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la matriz estructural es una prótesis no reticulada o raíces aórticas acelularizadas.

17. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el ligando o su fragmento está químicamente reticulado a la matriz estructural.

18. Un estuche para el desarrollo de un andamiaje que comprende una matriz estructural para un injerto y uno o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

19. El estuche de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el injerto está en la forma de un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca.

20. Uso de un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, para preparar una matriz estructural en la forma de un dispositivo implantable.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el dispositivo es una válvula cardíaca o un injerto vascular.

22. Uso de un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, para la fabricación de un andamiaje que comprende una matriz estructural, para el tratamiento de un tejido, un vaso o un órgano enfermo o dañado.

23. Un andamiaje que comprende una matriz estructural revestida con uno o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, para tratar un tejido, vaso u órgano enfermo o dañado.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22 o el andamiaje de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho andamiaje es un andamiaje de válvula cardíaca o vaso sanguíneo.