ES2278435T3

ES2278435T3 - Protesis con factores de crecimiento asociados.

Info

Publication number: ES2278435T3
Application number: ES99904210T
Authority: ES
Inventors: Wenda C. Carlyle; Sheila J. Kelly; Matthew F. Ogle
Original assignee: St Jude Medical AB; St Jude Medical LLC
Current assignee: St Jude Medical AB; St Jude Medical LLC
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-21
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2019-01-21
Also published as: CA2319000A1; AU2465899A; WO1999037337A2; WO1999037337A3; US7722671B1; DE69934298D1; EP1051204B1; BR9907273A; EP1051204A2; CN1289259A; DE69934298T2; JP2002500929A

Abstract

Una prótesis que comprende un tejido y factor de crecimiento endotelial vascular, donde el factor de crecimiento endotelial vascular está unido covalentemente al tejido utilizando agentes de entrecruzamiento, siendo efectivo el factor de crecimiento endotelial vascular para estimular la asociación de células viables con el tejido.

Description

Prótesis con factores de crecimiento asociados.

Campo de la invención

La invención se refiere a prótesis que tienen componentes que han sido modificados con un factor de crecimiento polipeptídico. La invención se refiere adicionalmente a métodos para producir estas prótesis.

Antecedentes de la invención

Las prótesis, p. ej., los dispositivos protésicos, se utilizan para reparar o reemplazar órganos, tejidos y otras estructuras dañados o enfermos en seres humanos y animales. Las prótesis deben ser generalmente biocompatibles puesto que se implantan típicamente durante largos períodos de tiempo. Por ejemplo, las prótesis pueden incluir corazones artificiales, válvulas cardíacas artificiales, material para la reparación de ligamentos, reparación de vasos, parches quirúrgicos, construidos de tejido de mamífero y similares.

Las prótesis se pueden construir a partir de sustancias naturales tales como tejidos, materiales sintéticos o una combinación de los mismos. Por ejemplo, las prótesis sintéticas tales como las prótesis para válvulas cardíacas mecánicas se fabrican de metales biocompatibles y otros materiales tales como grafito y poliéster. Si bien las válvulas cardíacas mecánicas tienen la ventaja de la probada durabilidad durante décadas de uso, están asociadas con una elevada incidencia de coágulos sanguíneos en o en torno a la válvula protésica. Los coágulos sanguíneos pueden conducir al cierre agudo o subagudo de la válvula o del vaso sanguíneo asociado. Por esta razón, los pacientes con válvulas cardíacas mecánicas implantadas continúan con anticoagulantes en tanto que la válvula permanece implantada. Los anticoagulantes comunican un riesgo anual del 3-5% de hemorragia significativa y no puede ser aceptado con seguridad por algunos individuos.

Además de las válvulas cardíacas mecánicas, las prótesis de válvulas cardíacas pueden ser construidas con velos tisulares o velos poliméricos. La trombosis y la posterior calcificación son asuntos asociados con las válvulas cardíacas poliméricas. La calcificación de estas válvulas puede conducir a insuficiencia.

Las válvulas cardíacas de tejido protésico pueden estar derivadas, por ejemplo, de válvulas cardíacas porcinas o fabricadas de otro material biológico tal como pericardio bovino. Los materiales biológicos de las válvulas cardíacas protésicas tienen generalmente un perfil y unas características de superficie que proporcionan generalmente un flujo sanguíneo laminar, no turbulento. Por consiguiente, es menos probable que se produzcan coágulos intravasculares que con las válvulas cardíacas mecánicas. Desafortunadamente, las válvulas cardíacas de tejido protésico están limitadas por una tendencia a fallar que comienza aproximadamente siete años después de la implantación. La degeneración de la válvula es particularmente rápida en pacientes jóvenes y durante el embarazo.

La calcificación, es decir, el depósito de sales de calcio, especialmente fosfato de calcio (hidroxiapatita), parece ser la causa principal de degeneración. Los esfuerzos para estudiar el problema de la calcificación han incluido el tratamiento de prótesis de válvulas fijadas con glutaraldehído con compuestos para reducir la nucleación del calcio. Otros enfoques incluyen el uso de técnicas de fijación de tejido alternativas puesto que la evidencia sugiere que la fijación de glutaraldehído puede contribuir a la calcificación y a la degradación mecánica. Además, puesto que las células no viables pueden ser sitios para el depósito de calcio, se han desarrollado diversos procedimientos para eliminar las células no viables dejando intacta la matriz extracelular. El tejido intacto con células viables tiene protección natural contra la calcificación.

Otra desventaja importante de las prótesis a base de tejido es el fracaso de tales dispositivos en su auto-mantenimiento. La durabilidad a largo plazo resulta afectada por la capacidad de las células viables para poblar el tejido implantado y llevar a cabo funciones de mantenimiento. La importancia de las células viables ha sido estudiada en el contexto de los trasplantes de homoinjertos, es decir, los trasplantes de un miembro de una especie a otro miembro de la misma especie. La conservación del homoinjerto apropiado puede maximizar el número de células viables que permanecen en el tejido como se determina mediante la síntesis de proteína de la matriz. Las técnicas de conservación que no promueven la supervivencia celular, tales como el almacenamiento a largo plazo a 4ºC, están asociadas con la reducción de la durabilidad in vivo y el aumento de las tasas de reoperación.

Compendio de la invención

Un factor de crecimiento polipeptídico puede estar unido a un sustrato tisular o a un sustrato sintético para promover la población del sustrato con células viables. Los factores de crecimiento polipeptídicos preferidos incluyen los factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGF). Con tejido entrecruzado, los VEGF asociados alivian al menos algo de la toxicidad celular resultante del entrecruzamiento con glutaraldehído. Los VEGF se pueden unir al sustrato mediante contacto directo en solución. Alternativamente, los VEGF se pueden unir al sustrato junto con un aglutinante o través de unión química del VEGF al sustrato con o sin la intervención de una molécula conectora.

Un sustrato modificado con VEGF proporciona la afiliación de células endoteliales viables al sustrato para mejorar el funcionamiento del sustrato como prótesis. Por ejemplo, la durabilidad a largo plazo de la prótesis debe mejorar en parte debido a una reducción de la calcificación, y la incidencia de infección asociada con la prótesis se debe reducir debido al descenso de localizaciones adecuadas para el anclaje de microorganismos. Utilizando un sistema de cultivo celular, el sustrato tratado con VEGF puede promover la población in vitro del sustrato con células endoteliales. Además, los VEGF pueden promover la población del sustrato con las células endoteliales in vivo siguiente a la implantación del sustrato como parte de la prótesis.

En un primer aspecto, la invención caracteriza una prótesis que comprende un tejido y un factor de crecimiento endotelial vascular, donde el factor de crecimiento endotelial vascular está unido covalentemente al tejido utilizando agentes de entrecruzamiento, siendo efectivo el factor de crecimiento endotelial vascular para estimular la asociación de las células viables con el tejido. La unión del factor de crecimiento polipeptídico al tejido puede implicar interacciones de unión específica y/o unión covalente.

El tejido puede incluir tejido entrecruzado y/o tejido no entrecruzado. El tejido puede estar derivado de válvulas cardíacas porcinas, tejido pericárdico bovino, o cualquier otro material sintético o biológico. Entre los factores de crecimiento polipeptídicos se puede incluir el factor de crecimiento endotelial vascular. Los factores de crecimiento endoteliales vasculares adecuados incluyen, por ejemplo, una proteína seleccionada del grupo formado por bVEGF164, bVEGF120, hVEGF165, hVEGF121, VEGF II, HVEGFBO, VEGF-B, VEGF2, las formas activas modificadas los mismos, y las combinaciones de los mismos.

En otro aspecto, la invención caracteriza un artículo que incluye tejido entrecruzado con VEGF asociado. El entrecruzamiento puede implicar radicales glutaraldehído unidos al tejido utilizando agentes de entrecruzamiento.

Además, la invención caracteriza una válvula cardíaca protésica que comprende VEGF asociado. La válvula protésica puede incluir una válvula cardíaca porcina.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método ex vivo para asociar células endoteliales con una prótesis que comprende poner en contacto la prótesis según la presente invención con un cultivo celular que comprende células endoteliales.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una micrografía de una muestra de tejido entrecruzada que se trató con VEGF antes de un período de incubación de cinco días durante el cual el tejido se puso en contacto con células endoteliales viables desarrolladas sobre un inserto en un pocillo para el cultivo de tejidos. Las células endoteliales presentes en el tejido fijado se visualizan mediante marcaje fluorescente.

La Fig. 2 es una micrografía de una muestra de tejido entrecruzada que se trató con VEGF antes de una incubación de cinco días con células endoteliales en un pocillo para el cultivo de tejidos. En este ejemplo, el tejido tratado con VEGF no estuvo en contacto directo con las células endoteliales al comienzo del período de incubación. Las células endoteliales presentes sobre el tejido fijado se visualizan mediante marcaje fluorescente.

La Fig. 3 es un conjunto de micrografías de muestras de tejido tras la incubación con células endoteliales en un sistema de cultivo celular, donde el tejido se trató sólo con etanol (Fig. 3A), o donde el tejido tratado con etanol entrecruzado se trató durante quince minutos con una solución de VEGF/glutaraldehído (Fig. 3B) o durante treinta minutos con una solución de VEGF/glutaraldehído (Fig. C). Las células se visualizaron mediante marcaje fluorescente.

La Fig. 4 es un conjunto de micrografías de células endoteliales aórticas humanas que colonizan tejido de velo de válvula aórtica porcina entrecruzado con glutaraldehído (Fig. 4A), tejido entrecruzado con glutaraldehído tratado con etanol (Fig. 4B), o tejido entrecruzado con glutaraldehído tratado con etanol y después con una solución de 100 ng/ml de VEGF + 0,01% de glutaraldehído. Las células se visualizaron mediante marcaje fluorescente.

La Fig. 5 es un conjunto de micrografías de células endoteliales aórticas humanas que colonizan tejido de velo de válvula aórtica porcina entrecruzado con glutaraldehído (Fig. 5A), tejido entrecruzado con glutaraldehído tratado con etanol (Fig. 5B), o tejido entrecruzado con glutaraldehído tratado con etanol y después con una solución de 100 ng/ml de VEGF + 0,01% de glutaraldehído. Las células se visualizaron mediante microscopia electrónica de barrido.

La Fig. 6 es un conjunto de micrografías de células endoteliales aórticas humanas que colonizan tejido de velo de válvula aórtica porcina no entrecruzado incubado previamente en una solución salina tamponada con HEPES (Fig. 6A), en una solución salina tamponada con HEPES/0,01% de glutaraldehído (Fig. 6B) o en una solución HEPES/0,01% de glutaraldehído/100 ng/ml de VEGF (Fig. 6C). Las células se visualizaron mediante marcaje fluorescente.

La Fig. 7 es una representación gráfica del contenido de calcio en velos entrecruzados con glutaraldehído que no recibieron tratamiento adicional (control), que recibieron tratamiento con etanol (etanol) o etanol y tratamiento con VEGF (VEGF) antes de la implantación subcutánea en ratas macho jóvenes durante 21 o 63 días.

La Fig. 8 es un conjunto de micrografías de tejido de velo de válvula aórtica porcina entrecruzado con glutaraldehído que no recibieron tratamiento adicional (Fig. 8A), que recibieron tratamiento con etanol (Fig. 8B) o etanol y tratamiento con VEGF (Fig. 8C) antes de la implantación subcutánea en ratas macho jóvenes durante 21 días. Con el sistema de tinción utilizado, el fosfato de calcio se tiñe de color pardo y se representa como pequeños parches oscuros en las fotografías.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Un factor de crecimiento polipeptídico o un fragmento del mismo se pueden asociar con un sustrato tisular o un sustrato sintético in vitro. Generalmente, el sustrato forma, o formará toda o una porción de la prótesis. Los factores de crecimiento polipeptídicos preferidos incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y compuestos relacionados. Siguiente a la modificación del sustrato con VEGF, el VEGF puede estimular la quimiotaxis y la proliferación de células endoteliales. En realizaciones preferidas, se fija el sustrato. La asociación de células endoteliales viables con el tejido protésico debe contribuir a la viabilidad a largo plazo de la prótesis. La modificación con VEGF es particularmente adecuada para la producción de prótesis que tienen naturalmente un revestimiento de células endoteliales o epiteliales, tal como componentes vasculares, estructuras cardiovasculares, porciones del sistema linfático, tejido uterino o tejido retiniano.

El VEGF se puede asociar con el sustrato de varias formas. Por ejemplo, el sustrato se puede combinar con una solución de VEGF de manera que el VEGF pasa a estar unido al tejido protésico mediante anclaje directo. Alternativamente, el VEGF puede ser asociado con el tejido protésico utilizando un adhesivo. Además, el VEGF se puede unir al tejido protésico utilizando un enlace químico.

Como se demuestra en el Ejemplo 1 de más abajo, el anclaje directo o la asociación se pueden producir mediante la adición de VEGF a tejido entrecruzado. Si bien el mecanismo de anclaje directo del VEGF al tejido entrecruzado es desconocido, el VEGF se puede unir a los grupos funcionales libres del glutaraldehído en el tejido entrecruzado.

Con respecto al enlace químico del VEGF al tejido, el VEGF se puede entrecruzar al tejido con glutaraldehído. Las condiciones para entrecruzar VEGF al tejido se deben controlar cuidadosamente para mantener los niveles deseados de actividad de VEGF tras el entrecruzamiento y para evitar la citotoxicidad mediada por el glutaraldehído residual. El entrecruzamiento controlado del VEGF al tejido con glutaraldehído puede adherir eficazmente el VEGF al tejido entrecruzado o no entrecruzado. Así, este enfoque es particularmente apropiado para asociar el VEGF a un tejido de autoinjerto u homoinjerto no entrecruzado.

El VEGF puede inducir eficazmente el crecimiento de células endoteliales sobre el sustrato in vitro o in vivo de manera que el tejido pase a estar poblado por células viables. Para el crecimiento in vivo, el sustrato con VEGF asociado se puede implantar en un paciente. Una vez implantado en el paciente, las células endoteliales son atraídas hacia la prótesis debido a la presencia de VEGF. Alternativamente, las células endoteliales se pueden asociar con la prótesis en un sistema de cultivo celular, como se describe más abajo.

A. Prótesis

Las prótesis pueden incluir un sustrato tisular o un sustrato sintético, al menos como un componente, de manera que el sustrato es adecuado como localización para el anclaje celular. Generalmente, estas prótesis están diseñadas para la implantación en un paciente durante largos períodos de tiempo. Las prótesis incluyen, por ejemplo, corazones artificiales, válvulas cardíacas artificiales, anillos de anuloplastia, estents vasculares y estructurales, injertos vasculares, tapones, sutura, cables, dispositivos percutáneos de residencia permanente, derivaciones vasculares o cardiovasculares, injertos dérmicos para la curación de heridas, y parches quirúrgicos. Los dispositivos biomédicos que están diseñados para residir durante largos períodos de tiempo en el interior de un paciente también son adecuados para incluir sustratos con factores de crecimiento asociados. Estos dispositivos incluyen, por ejemplo, catéteres de Hickman.

Los tejidos naturales para su uso como sustratos están derivados de especies animales, típicamente mamíferos, tales como seres humanos, vacas, cerdos, perros, focas o canguros. Los tejidos se pueden obtener, por ejemplo, de válvulas cardíacas, raíces aórticas, paredes aórticas, velos aórticos, tejido pericárdico tal como parches pericárdicos, tejido conectivo tal como duramadre, injertos de bypass, tendones, ligamentos, parches de piel, vasos sanguíneos, tejido umbilical humano, hueso, fascia, submucosa y similares. Estos tejidos naturales incluyen generalmente material que contiene colágeno. El tejido natural es típicamente, pero no necesariamente, tejido blando. Una prótesis a base de tejido puede mantener elementos estructurales de su forma natural, y/o se pueden incorporar elementos estructurales a las prótesis a partir del ensamblaje de distintas porciones de tejido. Por ejemplo, una prótesis para válvula cardíaca se puede ensamblar a partir de una válvula cardíaca porcina, a partir de pericardio bovino o a partir de una combinación de los mismos.

Los sustratos sintéticos se pueden formar a partir de sustratos poliméricos y/o polímeros biológicos, tales como los que se encuentran generalmente en una matriz de tejido natural, para formar una matriz de tejido sintético. En concreto, se pueden formar polímeros de colágeno y elastina en una matriz correspondiente a un componente tisular mediante cualquiera de una variedad de técnicas tales como trenzado y moldeo. El sustrato sintético formado a partir de estos polímeros biológicos imita una matriz de tejido natural. Alternativamente, los sustratos sintéticos pueden estar en forma de un tejido sintético con una matriz que incluye polímeros sintéticos y/o biológicos junto con células viables y/o no viables. Los polímeros pueden ser, pero no son necesariamente, bio-reabsorbibles. Los polímeros sintéticos y biológicos adecuados se describen más abajo.

Los tejidos se pueden fijar mediante entrecruzamiento. Esto proporciona estabilización mecánica, por ejemplo, previniendo la degradación enzimática del tejido. El entrecruzamiento también elimina sitios antigénicos que podrían ocasionar el rechazo de la prótesis por el paciente. Para la fijación se utiliza típicamente glutaraldehído o formaldehído, pero se pueden utilizar otros fijativos, tales como epóxidos y otros aldehídos bifuncionales. Los xenoinjertos, es decir, las prótesis que incorporan tejido de una especie diferente de la especie del paciente, generalmente se fijan antes de su uso. Los homoinjertos, es decir, las prótesis que incorporan tejido de un individuo diferente de la especie del paciente, se pueden fijar o no antes de su uso. De un modo similar, los autoinjertos, es decir, las prótesis que incorporan tejido del mismo individuo, se pueden fijar o no antes de su uso.

Las prótesis pueden incluir otros componentes no tisulares tales como material polimérico, cerámicas y metal. Las cerámicas apropiadas incluyen, sin limitación, hidroxiapatita, alúmina y carbón pirolítico. Los materiales poliméricos se pueden fabricar a partir de polímeros sintéticos así como de polímeros biológicos purificados. Los materiales sintéticos apropiados pueden incluir hidrogeles y otros materiales sintéticos que no pueden resistir deshidratación severa.

Los polímeros sintéticos apropiados incluyen sin limitación poliamidas (v.g., nailon), poliésteres, poliestirenos, poliacrilatos, polímeros vinílicos (v.g., polietileno, politetrafluoroetileno, polipropileno y poli(cloruro de vinilo), policarbonatos, poliuretanos, polidimetilsiloxanos, acetatos de celulosa, poli(metacrilatos de metilo), acetatos de etilenvinilo, polisulfonas, nitrocelulosas y copolímeros similares. También se pueden utilizar polímeros bio-reabsorbibles tales como dextrano, hidroxietilalmidón, gelatina, derivados de gelatina, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida], poli(hidroxiácidos), poli(épsilon-caprolactona), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido dimetilglicólico), poli(hidroxibutirato), y copolímeros similares. Estos materiales poliméricos sintéticos se pueden tejer en una malla para formar una matriz o un sustrato. Alternativamente, los materiales poliméricos sintéticos se pueden moldear o fundir a las formas apropiadas.

Los polímeros biológicos pueden ser de origen natural o se pueden producir in vitro, por ejemplo, mediante fermentación y similares. Los polímeros biológicos purificados se pueden formar apropiadamente en un sustrato mediante técnicas tales como trenzado, anudado, fundición, moldeo, extrusión, alineamiento celular y alineamiento magnético. Para una descripción de alineamientos magnéticos ver, por ejemplo, R.T. Tranquillo et al., Biomaterials 17:349-357 (1996), incorporada aquí como referencia. Los polímeros biológicos adecuados incluyen, sin limitación, colágeno, elastina, seda, queratina, gelatina, poliaminoácidos, suturas de tripa de gato, polisacáridos (v.g., celulosa y almidón) y copolímeros de los mismos.

B. Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF)

El VEGF hace referencia a una familia de polipéptidos que se ha encontrado que estimulan preferentemente el crecimiento de las células endoteliales vasculares sobre otras células, tal como las células de la musculatura lisa. Se han identificado algunas formas de VEGF. Los polipéptidos VEGF tienen generalmente homología de secuencia con el factor de crecimiento derivado de plaquetas, que pueden alterar la migración y la proliferación de una variedad de tipos celulares. El VEGF ha sido referido ocasionalmente como factor de permeabilidad vascular.

La forma de VEGF identificada originalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 45 a 46 kilodaltons (kDa). Esta forma es aparentemente un homodímero teniendo cada subunidad un peso molecular de aproximadamente 23 kDa. De han determinado las secuencias de ADNc que codifican el polipéptido humano (165 aminoácidos, hVEGF_{165}) y el polipéptido bovino correspondiente (164 aminoácidos, bVEGF_{164}). Además, también se han identificado las variantes de los polipéptidos con 121 aminoácidos para la versión humana (hVEGF_{121}) y 120 aminoácidos para la versión bovina (bVEGF_{120}). Para las secuencias de aminoácidos correspondientes, ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.194.596, de Tischer et al. Se han identificado otras variables insolubles con 189 y 206 aminoácidos, respectivamente. Ver, por ejemplo, E. Tischer et al., "The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing", J. Biol. Chem. 266: 11947-11954 (1991) y K.A. Houck et al., "The vascular endothelial growth factor family identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA", Molec. Endocrinology 5:1806-1814 (1991).

Otra forma de VEGF, denominada VEGF II, es un heterodímero. Según se aisló a partir de células de glioma de rata, la primera subunidad tiene 190 aminoácidos mientras que la segunda subunidad tiene una forma de 135 aminoácidos y una forma de 115 aminoácidos. El VEGF II se describe en EP 0 476 983A.

También se ha identificado un VEGF humano polipeptídico sencillo, sin nombre. Este polipéptido tiene un peso molecular ordinariamente de 80 kDa. Se aisló el ADNc correspondiente y se determinó una secuencia de 728 aminoácidos a partir de la secuencia de ADNc. Los detalles de la proteína se proporcionan en EP 0 550 296A.

Se ha identificado otro factor de crecimiento humano, VEGF2, de una fase temprana de osteoclastomas embrionarios humanos, de corazón adulto y de varias líneas de cáncer de mama. El VEGF2 tiene 350 aminoácidos, de los cuales aproximadamente 24 aminoácidos representan una secuencia líder. La secuencia para VEGF2 se describe en WO 95/24473.

Recientemente, se ha identificado otra variante de VEGF, VEGF-B. Parece ser que VEGF-B está asociado con los músculos cardíacos y esqueléticos. Las secuencias completas para el VEGF-B de ratón y humano se presentan en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.607.918, de Erikson y col.

Además de las variantes de VEGF que son expresadas en células de mamífero en condiciones fisiológicas normales, proteínas virales tales como la proteína Tat del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)-1 comparten homología de secuencia con VEGF y se unen a los receptores de VEGF naturales. Estas propiedades son descritas por Albini et. al., "The angiogenesis induced by HIV-1 Tat proteins is mediated by the Flk-1/KDR receptor on vascular endotelial cells". Nature Medicine 2(12):1371-1375 (1996) y Mitola et al., "Tat-human immunodeficiency virus-1 induces human monocyte chemotaxis by activarion of vascular endothelial growth factor receptor-1", Blood 90(4); 1365-1372 (1997). A través de una interacción con estos receptores de VEGF, una proteína Tat estimula la quimiotaxis y la proliferación de las células endoteliales. Así, para los fines de esta solicitud, se considera que la proteína Tat y otras proteínas virales similares que se unen a los receptores de VEGF son un factor de crecimiento VEGF.

Como se ha descrito antes, se han identificado una variedad de polipéptidos VEGF. Muchos de estos están asociados a tejidos concretos. Al menos algunos de los polipéptidos tienen variaciones basadas en empalmes de mensaje alternativos, tales como hVEGF_{165} y hVEGF_{121}. Según se utiliza en las otras secciones de esta solicitud, "VEGF" hace referencia, sin limitación, a todos los polipéptidos VEGF identificados, tales como los descritos en esta sección, así como cualquier polipéptido VEGF identificado en el futuro, que promueven selectivamente la quimiotaxis o la proliferación de las células endoteliales. "VEGF" también hace referencia a fragmentos polipeptídicos que conservan su capacidad para promover selectivamente la quimiotaxis o la proliferación de las células endoteliales. Como se ha observado antes, por ejemplo, el VEGF_{121} humano es un fragmento de origen natural del VEGF_{165} humano. El VEGF_{165} humano recombinante, El VEGF_{121} humano y el VEGF de ratón son asequibles de R&D Systems of Minneapolis, MN. De un modo similar, el "VEGF" referido aquí incluye proteínas VEGF modificadas por adiciones químicas a la molécula de proteína mediante unión no covalente.

Utilizando técnicas normalizadas de biología molecular (ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Press, (1989)), es posible elaborar formas recombinantes modificadas de polipéptidos VEGF naturales. Estas modificaciones sencillas incluyen la adición de aminoácidos al extremo N, al extremo C o a ambos. Asimismo, las modificaciones se pueden realizar sustituyendo los aminoácidos junto con la cadena polipeptídica. Algunas modificaciones pueden destruir la actividad de la proteína. Es sencillo eliminar las modificaciones inactivadoras sometiendo a ensayo la actividad de los sistemas en cultivo celular. Las formas activas de estos péptidos modificados están dentro de la definición general de los autores de la presente invención de "VEGF".

C. Conexión del VEGF con un Sustrato

La conexión del VEGF con un sustrato puede implicar el anclaje directo, la aplicación de un recubrimiento que incluye un adhesivo, o la unión química. El VEGF se puede conectar sólo a una porción de un sustrato o al sustrato entero. Si el VEGF se une a una porción del sustrato, las células se pueden asociar todavía a otras porciones del sustrato no unido al VEGF como resultado de estar presente el VEGF sobre parte del sustrato.

En anclaje directo supone combinar el sustrato, tal como un sustrato tisular, con una solución del VEGF. En particular, se ha descubierto que el VEGF se puede asociar con tejido biológico entrecruzado con glutaraldehído de manera que el VEGF no se separa mediante lavado fácilmente. Este anclaje directo es particularmente eficaz cuando el tejido ha sido incubado en glutaraldehído al 0,5% durante menos de un mes antes de la incubación con VEGF. La posterior unión del VEGF al tejido entrecruzado con glutaraldehído parece que permanece durante al menos períodos moderados de tiempo, hasta un mes o más, cuando el tejido está en contacto con solución tampón. Se han obtenido evidencias, como se muestra en el Ejemplo 1 de más abajo, de que el tratamiento con etanol antes del contacto con el VEGF reduce la asociación de VEGF con el tejido fijado. La reducción de la asociación del VEGF resultante de la incubación del tejido con etanol posiblemente podría ser debida a la eliminación de los sitios de unión al VEGF, a la inactivación de los sitios de unión al VEGF o la unión del etanol a los sitios de unión al VEGF.

Para el anclaje directo del VEGF a un sustrato, tal como tejido entrecruzado con glutaraldehído, el sustrato o una porción del mismo se combina con una solución de VEGF a una concentración generalmente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 \mug/ml y preferiblemente de aproximadamente 25 ng/ml a aproximadamente 250 mg/ml. Durante la incubación con el VEGF, la solución se enfría preferiblemente, por ejemplo, a aproximadamente 4ºC. El sustrato permanece preferiblemente en la solución de VEGF a aproximadamente 4ºC durante aproximadamente 24 horas y hasta aproximadamente 14 días o más. La solución de VEGF está tamponada preferiblemente a un pH que oscila de aproximadamente 6 a aproximadamente 8,5, y más preferiblemente oscila de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,4. Los tampones adecuados pueden estar basados, por ejemplo, en los siguientes compuestos: fosfato, borato, bicarbonato, carbonato, cacodilato, citrato, y otros tampones orgánicos tales como tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), y ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS).

Alternativamente, el VEGF puede estar asociado con el sustrato a través del uso de un aglutinante o adhesivo. El VEGF y el adhesivo forman un recubrimiento sobre el sustrato. Entre los adhesivos preferidos se incluyen, por ejemplo, colas biológicas tales como goma de fibrina, y similares. La cola de fibrina se puede formar a partir de la polimerización de fibrinógeno y trombina. Las colas de fibrina adecuadas son asequibles, por ejemplo, de Immuno Ag, Austria e Zymogenetics, Seattle, WA.

Para aplicar el VEGF con una cola de fibrina, se puede hacer que el sustrato absorba una pequeña cantidad de trombina. El VEGF se puede mezclar con una solución que contiene fibrinógeno para producir una solución con una concentración de VEGF que oscila preferiblemente de aproximadamente 1 ng/ml - 10 \mug/ml. Después, la mezcla de fibrinógeno/VEGF se aplica con un pincel sobre la superficie del sustrato con trombina absorbida, o el tejido con la trombina absorbida se puede sumergir en la solución de fibrinógeno/VEGF. El recubrimiento adherente al VEGF se puede aplicar a todo o sólo a una porción del sustrato. Con los sustratos sintéticos, el VEGF también se puede incorporar al material sustrato cuando se forma el sustrato.

Las colas de fibrina y colas similares son reabsorbidas lentamente por el paciente después de la aplicación. El VEGF se puede mezclar con otros polímeros reabsorbibles y formar en un recubrimiento sobre un sustrato. Los polímeros reabsorbibles adecuados incluyen, por ejemplo, dextrano, hidroxietilalmidón, gelatina, derivados de gelatina, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida], poliglicoles, poliésteres, poliortoésteres, poli(esteramidas), polianhídridos. Los poliésteres reabsorbibles incluyen, por ejemplo, poli(hidroxiácidos), y sus copolímeros, poli(\varepsilon-caprolactona), poli(ácido dimetilglicólico), y poli(hidroxibutirato). Los polímeros reabsorbibles preferidos incluyen, por ejemplo, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), y copolímeros de ácido L-láctico, ácido D-láctico y ácido glicólico. Además, el VEGF puede ser almacenado en los intersticios de una matriz polimérica. La matriz polimérica puede ser reabsorbible para liberar el material VEGF o tener la porosidad apropiada de manera que el VEGF se pueda difundir gradualmente fuera del sustrato.

Los diferentes enfoques basados en los polímeros bio-reabsorbibles naturales o sintéticos tienen la ventaja de establecer un gradiente de concentración de VEGF de manera que el VEGF puede actuar como un agente quimiotáctico que indica a las células que migren hacia una mayor concentración de VEGF. Asimismo, se puede liberar una dosis más precisa a lo largo de un período de tiempo limitado.

En otras realizaciones, la asociación del VEGF con el sustrato implica una unión química. La unión química incluye, por ejemplo, unión covalente, una pluralidad de interacciones químicas no covalentes o interacciones tanto covalentes como no covalentes. Las interacciones químicas no covalentes incluyen, por ejemplo, puentes de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones iónicas y transposiciones moleculares, que caracterizan, por ejemplo, asociaciones anticuerpo-antígeno, proteína de unión específica-receptor y enzima-sustrato. En otras palabras, los reaccionantes o los agentes aglutinantes se utilizan para formar una interacción química directa entre el VEGF y el sustrato, implicando posiblemente una molécula conectora. La unión química del VEGF tiene lugar preferiblemente a pH fisiológico o próximo al mismo, oscilando preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8,5 y más preferiblemente de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,4.

La unión química del VEGF puede implicar la unión covalente a la superficie del sustrato con agentes reactivos tales como glutaraldehído y otros agentes de entrecruzamiento generales. Un procedimiento típico para la unión química del VEGF a la superficie de un tejido hace uso de glutaraldehído, que entrecruza las proteínas por medio de dos grupos aldehído. Puesto que el glutaraldehído se utiliza típicamente para la fijación de algunos materiales biocompatibles, el entrecruzamiento no específico para unir el VEGF al material biocompatible se puede realizar simultáneamente a la fijación del tejido. Alternativamente, el entrecruzamiento no específico para unir covalentemente el VEGF se puede realizar como una etapa separada antes o después de completar un procedimiento de fijación, suponiendo que se realiza una etapa de fijación. Otros reactivos químicos para la unión covalente de VEGF a un sustrato incluyen, por ejemplo, epóxidos.

Preferiblemente, la unión del VEGF a un sustrato con un agente de entrecruzamiento se realiza en condiciones controladas cuidadosamente para evitar inactivar el VEGF. En concreto, el entrecruzamiento se realiza preferiblemente con una solución diluida de agente de entrecruzamiento, tal como glutaraldehído. El entrecruzamiento se realiza preferiblemente con una concentración de agente de entrecruzamiento menor de aproximadamente el 0,1% de agente de entrecruzamiento, preferiblemente menos de aproximadamente el 0,05% de agente de entrecruzamiento y más preferiblemente de aproximadamente el 0,005% a aproximadamente el 0,02% de agente de entrecruzamiento. Según el uso convencional en su campo, los valores en porcentaje están basados en una dilución volumen por volumen de una solución
de partida concentrada a un porcentaje de volumen, generalmente una solución de partida al 50 por ciento en volumen.

El entrecruzamiento se puede realizar durante al menos aproximadamente 5 minutos y generalmente se realiza durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas o más. En concreto, el entrecruzamiento del VEGF al sustrato se puede realizar preferiblemente durante menos de aproximadamente 1 hora y, más preferiblemente, durante entre aproximadamente 15 minutos y aproximadamente 30 minutos. Se ha observado que el grado de unión del VEGF, según se evidencia por la capacidad del VEGF para estimular la proliferación de células endoteliales in vitro, se estabiliza de manera relativamente rápida con respecto al tiempo de entrecruzamiento. Los tiempos de entrecruzamiento preferidos pueden ser evaluados empíricamente basándose en la descripción de la presente memoria.

Bajo las condiciones suaves preferidas descritas en la presente memoria, generalmente el tejido no se fija significativamente. Si se desea, se puede utilizar una membrana de exclusión por tamaños, tal como un tubo de diálisis, durante la incubación simultánea del VEGF y el glutaraldehído. Por ejemplo, se puede utilizar un tubo de diálisis con un corte a un peso molecular de 10.000 para que contenga el sustrato y la solución de VEGF en un volumen relativamente pequeño. El tubo con el sustrato y el VEGF se puede sumergir en una solución diluida de glutaraldehído. El glutaraldehído puede penetrar el tubo de diálisis, pero la solución de VEGF permanece dentro del tubo debido a su mayor tamaño molecular. Este procedimiento permite el uso de un pequeño volumen de VEGF y un volumen de solución de entrecruzamiento relativamente mayor.

Por otra parte, la unión química del VEGF al sustrato puede implicar interacciones de unión específica. Si se seleccionan de acuerdo con esto, las interacciones de unión específica se pueden utilizar para buscar localizaciones específicas en el sustrato. La búsqueda de localizaciones específicas puede ser útil, por ejemplo, si las localizaciones específicas son resistentes a la colonización por las células endoteliales o si la colonización por las células endoteliales es particularmente beneficiosa en localizaciones específicas. Un ejemplo de una posible localización diana podría ser los velos de una prótesis de válvula cardíaca.

Un método para buscar una localización concreta implica el uso de conectores que buscan sitios de unión celular o extracelular específica en un tejido natural. En algunas realizaciones, el conector se une covalentemente a la molécula de VEGF, y el conector se asocia con el tejido mediante una pluralidad de interacciones no covalentes. Alternativamente, el conector se puede unir covalentemente al tejido por medio de una pluralidad de interacciones no covalentes. Como conectores se pueden utilizar una variedad de anticuerpos y otros reactivos de unión específica asequibles comercialmente. Alternativamente, los anticuerpos se pueden preparar mediante técnicas convencionales.

Se considera que un polipéptido VEGF que tiene un anticuerpo anclado o cualquier otra molécula diana comparable o una quimera construida mediante ingeniería genética del polipéptido VEGF y la molécula diana es una molécula VEGF para los fines de la presente solicitud. La unión química de los compuestos a los anticuerpos así como el desarrollo de quimeras está bien establecido, especialmente cuando el compuesto es una proteína. Los ajustes empíricos se pueden realizar para asegurar que la actividad de la molécula de VEGF no resulta deteriorada significativamente.

En una realización alternativa, se puede utilizar el acoplamiento fotoquímico para el acoplamiento covalente. El acoplamiento fotoquímico está basado en el uso de luz de alta energía, v.g., luz ultravioleta, para formar intermedios reactivos de ciertos grupos funcionales. Estos intermedios reactivos pueden formar enlaces carbono-carbono entre dos composiciones. Los grupos funcionales arilcetona son particularmente útiles a este respecto.

El acoplamiento fotoquímico se puede utilizar para el anclaje del VEGF al tejido. Ver, por ejemplo, Dunkirk et al., J. Biomaterials Applications 6:131-156 (1991), incorporada aquí como referencia. El tejido puede ser entrecruzado separadamente o no puesto que el acoplamiento fotoquímico también entrecruza generalmente el tejido, es decir, fotofijación. Alternativamente, el acoplamiento fotoquímico se puede utilizar para anclar un conector al tejido antes, después, o durante la unión del conector al polipéptido VEGF.

Sin tener en cuenta la naturaleza de la interacción, el VEGF unido está generalmente en equilibrio con las moléculas no unidas. Como resultado, el VEGF se puede perder finalmente en la solución circundante si se repone la solución. Para algunas aplicaciones puede ser suficiente para el VEGF estar unido durante un período de tiempo relativamente corto, por ejemplo horas o días, si proliferan suficientes células endoteliales viables en el tejido durante el tiempo relevante. En otras circunstancias, pueden ser deseables para la unión a largo plazo del VEGF al tejido, por ejemplo meses o años. La naturaleza de la asociación del VEGF con el tejido se puede seleccionar de acuerdo con esto.

D. Otros Modificadores

Puede ser deseable asociar otras moléculas con el sustrato, además del VEGF, para mejorar el funcionamiento del sustrato en una prótesis. La formación de entotelio debida a la conexión del VEGF con el sustrato puede reducir la incidencia de calcificación y de infección. No obstante, puesto que la calcificación es el modo principal de fracaso del tejido bioprotésico, el VEGF se puede utilizar junto con un tratamiento anticalcificación biocompatible. Así, puede ser deseable incluir agentes que actúen para reducir adicionalmente la calcificación y/o la infección microbiana.

El etanol es un tratamiento anticalcificación demostrado, como describen Vyavahare et al., Circulation 95:479-488 (1997) y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.746.775 de Levy et al. Utilizados juntos, el etanol y el VEGF pueden facilitar la producción de un tejido viable a largo plazo retrasando el etanol la calcificación de comienzo temprano y estimulando el VEGF las capas endoteliales. En el Ejemplo 4 se demuestra la capacidad del tratamiento con etanol para inhibir la calcificación de velos de válvula aórtica porcina entrecruzada con glutaraldehído en un modelo de implante subcutáneo en rata joven. En este Ejemplo también se muestra que el tratamiento de estos velos con VEGF, además de etanol, puede atenuar adicionalmente la calcificación. Además, se ha encontrado que los iones aluminio, hierro y magnesio reducen la calcificación. Estos iones polivalentes se pueden asociar directamente con el tejido como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.094.661, de Levy et al.

En ciertas realizaciones preferidas, los cationes polivalentes están asociados sólo con una porción del sustrato. En concreto, para las válvulas cardíacas tisulares, puede ser deseable asociar sólo los iones con la pared de la válvula, tal como la pared aórtica de una válvula aórtica, dejando los velos sin tratar con los iones. Preferiblemente, se podría tratar la válvula tisular completa con el VEGF. El tratamiento de sólo una porción de una prótesis con una solución, tal como una solución que contiene cationes polivalentes, se describe adicionalmente en la Solicitud de Patente de los estados Unidos cedida comúnmente con el Núm. de Serie 08/850.812 de Williams et al., titulada "Differential Treatment of Prothetic Devices".

Alternativamente, los iones polivalentes se pueden asociar con estructuras de almacenamiento exógeno que se asocian sucesivamente con el sustrato. El uso de estructuras de almacenamiento exógeno para el almacenamiento de iones metálicos anticalcificación se describe en las solicitudes de patente copendientes, cedidas comúnmente con los Núms. de Serie 08/595.402 y 08/690.661. De un modo similar, ciertos metales tales como la plata han sido asociados con la actividad antimicrobiana. La estructuras de almacenamiento exógeno se pueden utilizar para almacenar los iones metálicos antimicrobianos adecuados asociados con un sustrato como se describe en la solicitud de patente copendiente y cedida comúnmente con el Núm. de Serie 08/787.139. Las estructuras de almacenamiento exógeno preferidas incluyen, por ejemplo, ferritina y otras proteínas de almacenamiento de metales. Las proteínas de almacenamiento exógeno se pueden asociar con el sustrato de maneras similares a las utilizadas para el VEGF. Las actividades no deben interferir entre sí.

E. Anclaje in vitro de Células Endoteliales

Se puede promover in vitro el crecimiento de las células endoteliales sobre las prótesis antes de la implantación en un paciente conectando el VEGF con un sustrato. Con el fin de reducir la posibilidad de rechazo del trasplante, las células endoteliales utilizadas para la endotelización in vitro son preferiblemente células autólogas, esto es, células del último receptor. Las células adecuadas podían ser cosechadas, por ejemplo, del tejido adiposo del paciente. El procedimiento de recogida puede implicar una liposucción seguida de digestión con colagenasa y purificación de las células endoteliales microvasculares. Un procedimiento adecuado lo describe adicionalmente S.K. Williams, "Endothelial Cell Transplantation", Cell Transplantation 4:401-410 (1995) y en las Patentes de los Estados Unidos 4.883.755, 5.372.945 y 5.628.781. Las células endoteliales purificadas se pueden suspender en medios de crecimiento apropiados tales como M199E (v.g., Sigma Cell Culture, St. Louis, MO) con la adición de suero autólogo.

El tejido protésico con el VEGF unido se puede incubar en una suspensión celular agitada durante un período de horas a días para permitir la siembra de células endoteliales. La siembra de células proporciona el anclaje al azar de células endoteliales que proliferan para recubrir la superficie del sustrato protésico antes o después de la implantación en el paciente. Alternativamente, el sustrato protésico se puede incubar en un gradiente de presión durante un período de minutos para promover la formación de un césped celular. Un método adecuado para la formación de césped celular se puede adaptar de un procedimiento descrito para los injertos vasculares en el artículo de S.K. Williams, supra. La formación de césped celular puede producir una monocapa de células sobre la superficie del tejido protésico.

Además, el tejido protésico se puede colocar en un sistema de cultivo en el que se deja que las células endoteliales del paciente migren sobre la superficie del sustrato protésico desde las superficies del cultivo de tejido de plástico adyacentes. Si cualquier anclaje o migración de células endoteliales se realiza en condiciones que implican tensión de cizalla fisiológica, las células endoteliales que colonizan la superficie del sustrato pueden expresar las proteínas adherentes apropiadas que permiten a las células adherirse más tenazmente tras su implantación.

F. Almacenamiento, Envasado, Distribución y Uso

Siguiente a la unión del VEGF al sustrato, el sustrato, posiblemente formado en una prótesis, se puede almacenar. El sustrato no tendría preferiblemente crecimiento hacia dentro de células viables si el sustrato se desea para un almacenamiento prolongado. Las técnicas de almacenamiento preferidas minimizan el riesgo de contaminación microbiana. Por ejemplo, el sustrato modificado se puede almacenar en un recipiente sellado con tampón estéril y/o solución salina.

En un recipiente sellado, el sustrato modificado no se somete a un aporte continuo de líquido. No obstante, se debe tomar en consideración la posible pérdida de VEGF o de actividad VEGF del sustrato durante el almacenamiento. Si existe la posibilidad de una pérdida excesiva, el tiempo de almacenamiento debe ser limitado apropiadamente para mantener la pérdida en un nivel aceptable.

Para la distribución, las prótesis se colocan generalmente en recipientes sellados y estériles. Los recipientes pueden ser fechados de manera que la fecha refleje el tiempo de almacenamiento máximo recomendable que represente la posible pérdida o degradación de actividad VEGF. Los recipientes se distribuyen a los profesionales del cuidado de la salud para la implantación quirúrgica de las prótesis. La asociación in vitro de las células con una prótesis modificada con VEGF se realiza preferiblemente en hospitales en los que las células de los pacientes pueden ser retiradas para su uso en un sistema de cultivo celular.

Como alternativa al anterior enfoque de almacenamiento y distribución, la modificación con VEGF se puede realizar en un hospital u otro sitio separado del sitio de fabricación, si se desea. En estas circunstancias, se distribuye la prótesis preparada para la modificación con VEGF y la asociación con VEGF se realiza en el último momento. Una vez que la prótesis es modificada con VEGF, ésta se puede implantar, almacenar durante un período de tiempo razonable (hasta un mes o más) o introducir en un sistema de cultivo celular para afiliar células, preferiblemente células autólogas, con las prótesis modificadas con el VEGF.

En ciertas realizaciones preferidas específicas, las prótesis preparadas, una solución de VEGF y una solución de entrecruzamiento (si se desea) son transportadas a recipientes separados, como un estuche para su uso conjunto o como artículos separados para su uso en las combinaciones deseadas. En concreto, la solución de VEGF puede ser transportada con las instrucciones para modificar un sustrato con el VEGF. La prótesis y las soluciones se combinan inmediatamente antes de su uso. Después de incubar las prótesis en las soluciones durante el período de tiempo especificado, la prótesis se retira de la solución, se enjuaga con solución salina estéril y se implanta en el paciente.

La incorporación del VEGF a una prótesis para promover la endotelización de un sustrato debe mejorar la biocompatibilidad del sustrato siguiente a la implantación. En concreto, una monocapa de células endoteliales quiescentes puede servir como barrera contra la infección, la inflamación, y la calcificación. La endotelización de una prótesis también puede promover la recelularización adicional de la prótesis con células capaces de reparar y remodelar el tejido. Así, la durabilidad y la longevidad de una prótesis pueden resultar mejoradas significativamente. Por último, la recelularización puede proporcionar una prótesis que se parezca más íntimamente al tejido natural, biológicamente competente.

Ejemplos Ejemplo 1 Asociación Directa del VEGF

Este ejemplo demuestra la capacidad del VEGF para asociarse con tejido entrecruzado y la eficacia correspondiente del VEGF para estimular la afiliación de células endoteliales viables al tejido.

Se prepararon varias soluciones. La solución de glutaraldehído se preparó en un volumen de 5 litros mediante la adición de 19,3 g de NaCl, 70,0 g de citrato de sodio, 2,5 g de ácido cítrico, 50 ml de glutaraldehído al 50% en volumen (Electron Spectroscopy Sciences, Fort Washington, PA), y suficiente agua purificada mediante osmosis inversa (agua RO). Se preparó una solución de VEGF diluyendo 50 \mug/ml de solución de partida de VEGF (VEGF_{165} recombinante humano, R&D Systems, Minneapolis, MN) con 5 ml de solución salina tamponada con HEPES 30 mM (HBSS, de Clonetics, San Diego, CA) para una concentración final de 100 ng/ml. Se preparó una solución salina tamponada con HEPES añadiendo 17,4 g de NaCl y 35,7 g de ácido sin HEPES a tres litros de agua RO. Se preparó una solución con etanol al 80% combinando 1,8 g de NaCl, 3,8 g de ácido sin HEPES, 1.684 ml de etanol del 95% (Worum Chemical, Saint Paul, MN, número de catálogo 200115) y 316 ml de agua RO para completar 2 litros de solución. Todas las soluciones fueron sometidas a filtración estéril antes de su uso.

Para preparar las muestras, 75 velos de válvula cardíaca porcina se separaron de válvulas cardíacas porcinas cosechadas. Los velos se almacenaron durante la noche a 4ºC en solución salina estéril al 0,9%. Después, los velos se entrecruzaron con glutaraldehído en solución de glutaraldehído tamponada con citrato durante un mínimo de 6 días. La solución de glutaraldehído se cambió dos veces durante el procedimiento de entrecruzamiento, al cabo de 24 horas y al cabo de 3 días. Los velos entrecruzados se almacenaron en glutaraldehído tamponado con HEPES a la temperatura ambiente durante 5 días seguido de tratamiento con etanol (35 velos) o durante 46 días (40 velos).

Como se ha indicado antes, se retiraron treinta y cinco velos del glutaraldehído y se trataron con etanol. Después de la separación del glutaraldehído, estos velos se incubaron en 500 ml de solución salina tamponada con HEPES durante 10 minutos. Esta solución salina se eliminó vertiéndola, y los velos se incubaron en 500 ml de solución salina tamponada con HEPES de nueva aportación durante 15 minutos adicionales. Después de eliminar la segunda solución salina, los velos se enjuagaron una vez con etanol al 80% y después se empaparon en 500 ml de una solución de etanol al 80% durante 15 minutos. Después, la primera solución de etanol se reemplazó por 500 ml de una solución de etanol al 80% de nueva aportación equivalente, y los velos se incubaron en la segunda solución de etanol durante aproximadamente 24 horas a la temperatura ambiente.

Al cabo de 24 horas en etanol, los velos se enjuagaron con solución salina tamponada con HEPES y después se empaparon con solución salina tamponada con HEPES durante 15 minutos. Después de cambiar la solución, los velos se empaparon en solución salina tamponada con HEPES durante 24 horas. Los velos se transfirieron después a un recipiente de almacenamiento que contenía solución salina tamponada con HEPES. Los velos en el recipiente de almacenamiento se sometieron a esterilización gamma mediante SteriGenics (Charlotte, SC). La irradiación gamma ocasionó que los velos en la solución salina tamponada con HEPES se volvieran de color pardo. Siguiente a la esterilización, los velos se almacenaron en este recipiente a 4ºC hasta su nuevo uso.

Los velos entrecruzados con glutaraldehído tratados con etanol y no tratados con etanol se retiraron del almacenamiento y se cortaron por la mitad. Los velos cortados se enjuagaron tres veces con 100 ml de solución salina estéril al 0,9%. Después de los enjuagues, seis de las mitades de los velos tratados con etanol y seis de los no tratados con etanol se incubaron en HBSS conteniendo 100 ng/ml de VEGF. Los velos se incubaron en la solución de VEGF durante la noche a 4ºC.

Se prepararon cuatro placas de seis pocillos con gelatina al 2% (Sigma Chemical, St. Louis, MO) y medio EGM (Clonetics, San Diego, Ca) para mantener el crecimiento celular. Se hicieron crecer hasta la confluencia células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) de Clonetics (lote Núm. 2803) en cada uno de los 24 pocillos. Veinticuatro horas después de alcanzar la confluencia, se utilizó un policeman de goma esterilizado para raspar las células del centro de cada pocillo. El medio que contenía los restos celulares se separó y se reemplazó por medio EGM de nueva aportación. Cada pocillo se examinó mediante microscopia óptica para asegurarse de que las células habían sido eliminadas del centro de cada pocillo.

Las mitades de los velos se colocaron en el centro despejado raspado de cada placa, y se añadió medio EGM normal o medio EGM conteniendo 10 mg/ml de VEGF según el siguiente protocolo:

1): Sin velo, medio sin VEGF (3 pocillos);

2): Sin velo, medio con VEGF (3 pocillos);

3): Velo tratado con etanol, medio sin VEGF (4 pocillos);

4): Velo tratado con etanol, medio con VEGF (4 pocillos);

5): Velo tratado con etanol y VEGF, medio sin VEGF (4 pocillos);

6): Velo no tratado con etanol, medio sin VEGF (2 pocillos); y

7): Velo tratado con VEGF, no tratado con etanol, medio sin VEGF (4 pocillos).

Las mitades de los velos que no fueron pretratadas con VEGF se enjuagaron tres veces con solución salina estéril, como se ha descrito previamente. Los velos pretratados con VEGF habían sido enjuagados antes del tratamiento con VEGF y no recibieron ningún enjuague adicional antes de la colocación en un pocillo.

Se utilizó una quinta placa de seis pocillos en la que se cultivaron HUVECs sobre la membrana superior de los insertos de cultivo de tejido que se colocaron dentro de cada pocillo. Una vez que las células de esta membrana habían alcanzado la confluencia, se cortó un agujero en el centro de cada membrana del inserto que quedaba sobre el velo. Cada pocillo se rellenó con 2 ml de medio EGM. Sobre esta placa, dos de los velos se trataron con etanol con el tratamiento sin VEGF, dos velos tuvieron tratamiento con etanol seguido de tratamiento con VEGF y dos velos tuvieron tratamientos con VEGF pero no tratamiento con etanol.

Al cabo de aproximadamente cinco horas, se reemplazó el medio de todos los pocillos de las cinco placas. Después las células se dejaron crecer durante un total de aproximadamente cinco días añadiendo cada día medio de nueva aportación. Al cabo de cuatro días, todos los pocillos se examinaron utilizando un microscopio óptico. Puesto que los velos son opacos, esta técnica no permite la visualización de células ancladas a los velos. También fue imposible observar las células desarrolladas en la parte superior de los insertos puesto que estas membranas también eran opacas. Dadas estas limitaciones, se realizaron las siguientes observaciones:

1): Las células desarrolladas en los pocillos que no contenían velos reanudaron el crecimiento hasta cubrir el área raspada clara y de nuevo casi fueron confluentes.

2): La mayoría de las células de los pocillos que contenían velos con glutaraldehído sin tratamientos adicionales murieron; y

3): Los velos tratados con etanol no parecían ser citotóxicos.

Al cabo de cinco días, la mitad de las muestras de tejido se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Gibco BRL, Grand Island, NY). Las muestras enjuagadas se fijaron con una solución de formaldehído al 3% durante al menos cinco minutos. Las muestras fijadas se enjuagaron tres veces con agua RO y una vez con sacarosa 0,25 M.

Una solución de partida 5 mM de una sonda fluorescente, lipófila, perclorato de dioctadecil-tetrametil-indocarbocianina (Dil) de Molecular Probes Inc., Eugene, OR (Núm. de catálogo D-282) se preparó añadiendo 0,00467 gramos de polvo de Dil a ml de sulfato de dimetilo (DMS) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Dil es un colorante de la membrana celular. El tubo se sometió a vórtice para disolver el polvo. El tubo se almacenó a la temperatura ambiente envuelto en papel de aluminio y se mantuvo apartado de fuentes luminosas. Se preparó una solución 50 \muM de Dil añadiendo 150 \mul de la solución de partida 5 mM a 15 ml de una solución de sacarosa 0,25 M en un tubo de centrífuga. El tubo se sometió a vórtice para mezclar la solución. La solución de Dil diluida se elaboró de nuevo el día de su uso.

Las muestras de tejido se tiñeron fluorescentemente cubriendo cada velo enjuagado en su pocillo con suficiente solución de Dil 50 \muM. Las placas se cubrieron con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Los velos se tiñeron durante al menos aproximadamente 15 minutos pero no más de aproximadamente 25 minutos. Después, las muestras se enjuagaron cuatro veces con agua RO. Después de enjuagar, se añadió solución salina al 0,9% a cada muestra para evitar que se seque, y las muestras se cubrieron con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento antes del examen. Se formaron las imágenes de las muestras de tejido teñidas utilizando un filtro con isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) y se fotografiaron.

No crecieron células en los velos tratados con etanol, y no crecieron células en los velos no tratados excepto para unas pocas células que crecieron en una muestra en contacto con un inserto de membrana. De un modo similar, 10 mg/ml de VEGF en solución no estimularon la afiliación de células al tejido. Unicamente se observó la fluorescencia del fondo con los velos que carecían de células cuanto se examinaron a través del filtro TRITC. Los velos con VEGF adsorbido en la superficie tenían colonias de células brillantemente fluorescentes ancladas a los velos indicando la estimulación de la migración de células endoteliales hacia el velo y de la adherencia al velo. Esto se puede observar en la Fig. 1 para un velo representativo en contacto directo con células endoteliales sobre un inserto de membrana y en la Fig. 2 para un velo representativo colocado en una sección de un pocillo inicialmente vaciado de células endoteliales. El uso de un inserto no altera cualitativamente los resultados.

Se observaron resultados similares en otros experimentos en los que se incubaron velos entrecruzados con glutaraldehído en 100 ng/ml de VEGF. En concreto, el VEGF potenció la colonización de los velos tanto con HUVEC como con células endoteliales aórticas humanas a lo largo de un período de cinco a treinta días en cultivo. Experimentos adicionales también mostraron que el VEGF era más efectivo cuando se adhería a velos que habían sido almacenados en solución de glutaraldehído tamponada con HEPES durante menos de un mes antes de la incubación con
VEGF.

Ejemplo 2 Entrecruzamiento de VEGF con glutaraldehído a Tejido Entrecruzado Tratado con Etanol

Este ejemplo demuestra que una solución de glutaraldehído de baja concentración entrecruza eficazmente el VEGF al tejido entrecruzado con glutaraldehído tratado etanol sin pérdida de la capacidad del VEGF para estimular la proliferación de células endoteliales y la quimiotaxis.

Todas las soluciones se prepararon de nuevo el día de su uso y se filtraron a través de un filtro de 0,25 \mum. Una solución salina tamponada con HEPES consistía en NaCl 0,1 M y HEPES 50 mM en agua purificada mediante ósmosis inversa (agua RO). El pH de la solución salina tamponada con HEPES se ajustó a 7,4. Se preparó una solución con el 0,01% de glutaraldehído añadiendo 20 \mul de una solución de partida al 50% en volumen de glutaraldehído (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) a 100 ml de solución salina tamponada con HEPES. Se preparó una solución de VEGF/glutaraldehído añadiendo 2 \mug de VEGF (VEGF_{165} recombinante humano, R&D Systems, Minneapolis, MN) a 20 ml de la solución con ep 0,01% de glutaraldehído, produciéndose una solución con 100 ng/ml de VEGF y el 0,01% de glutaraldehído.

Se prepararon ocho velos entrecruzados con glutaraldehído y tratados con etanol como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se enjuagaron con solución salina estéril. Tres velos se incubaron en la solución de VEGF/glutaraldehído durante 30 minutos. Los dos velos restantes se almacenaron en solución salina tamponada con HEPES para utilizarlos como controles. Una vez finalizados los períodos de incubación, los velos se enjuagaron tres veces en solución salina al 0,9% durante dos minutos por enjuague.

Algunos días antes de la incubación de los velos tratados, se sembraron dos placas de cultivo de seis pocillos recubiertos con gelatina al 2% con células endoteliales aórticas humanas (Clonetics, San Diego, CA). Las células endoteliales se hicieron crecer hasta la confluencia, con medio de crecimiento endotelial de nueva aportación (EGM) (Clonetics, San Diego, CA) añadido cada día. Antes de la adición de la muestra de tejido a las placas de cultivo de tejido, se despejó la sección central de cada pocillo de cultivo de tejido raspando las células endoteliales. Cada pocillo se enjuagó dos veces con EGM para eliminar los restos celulares.

Inmediatamente después de la incubación con VEGF y del enjuague de los velos, los velos se colocaron en la porción despejada de los pocillos, un velo por pocillo. Los insertos de cultivo de tejido estériles (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se colocaron sobre los velos para evitar que flotaran. Se añadió EGM de nueva aportación a los pocillos cada día. Al cabo de cinco días, los velos se colocaron en formaldehído al 3% para fijar cualquier célula que se hubiera adherido a la superficie de los velos. Los velos se tiñeron después con una sonda lipófila fluorescente, perclorato de dioctadecil-tetrametil-indocarbocianina (Molecular Probes Inc., Eugene, OR), como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Se formaron las imágenes de las muestras teñidas utilizando un filtro con isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) y se fotografiaron. Los velos se incubaron durante 15 minutos (Fig. 3B) o 30 minutos (Fig. 3C) en la solución de VEGF/glutaraldehído que tenía un número significativo de células endoteliales colonizando la superficie de los velos, en comparación con los velos de control (Fig. 3A). De este modo, no parecía que el uso del 0,1% de glutaraldehído para entrecruzar el VEGF a la superficie de un velo tratado con etanol fuera citotóxico para las células endoteliales que colonizan el velo. Adicionalmente, el VEGF era eficaz promoviendo la colonización por células endoteliales del tejido tratado. Resulta significativo que el tratamiento con etanol de los velos no evite la unión de VEGF en estas circunstancias puesto que se había demostrado previamente que el tratamiento con etanol del tejido entrecruzado con glutaraldehído mejora la biocompatibilidad e inhibe la calcificación del tejido después de su implantación.

Se observaron resultados similares en otros experimentos en los que se utilizaron ensayos in vitro para comparar la capacidad de las células endoteliales aórticas humanas para colonizar tejido entrecruzado con glutaraldehído no tratado o tratado. El tejido entrecruzado con glutaraldehído sin tratamiento con etanol o VEGF era un mal sustrato para el crecimiento de las células endoteliales humanas, como se muestra en las Figs. 4A y 5A. Las micrografías mostradas en la Fig. 4 se obtuvieron después de fijar las células adheridas al tejido con formalina al 3% y de la tinción fluorescente. Las micrografías mostradas en la Fig. 5 se obtuvieron después de fijar las células adheridas al tejido con solución con el 2% de glutaraldehído tamponada con fosfato durante al menos 24 horas. Después, el tejido se deshidrató en serie con etanol y con una deshidratación final con hexametildisilazano. Las muestras se anclaron a portamuestras de SEM, y se recubrieron con oro-paladio. Se formaron las imágenes de las muestras de tejido utilizando un Microscopio Electrónico de Barrido Hitachi® 450.

La incubación del tejido entrecruzado con glutaraldehído en etanol al 80%, como se ha descrito en el Ejemplo 1, mejora la biocompatibilidad, de manera que el tejido tratado con etanol sostiene más colonias de células endoteliales, como se muestra en las Figs. 4B y 5B. Las micrografías electrónicas de barrido de esta muestra, no obstante, muestran que las células endoteliales que se adhieren al tejido tratado con etanol tienen una morfología redonda característica de las células flojamente adheridas o teñidas (Fig. 5B). Si los velos tratados con etanol experimentan una incubación adicional de 30 minutos en una solución de 100 ng/ml de VEGF/0,01% de glutaraldehído, como se ha descrito antes, el tejido tratado con VEGF es susceptible de endotelización más rápida y completa, como se muestra en las Figs. 4C y 5C. En contacto con las células observadas en los otros grupos de tratamiento, las micrografías electrónicas de barrido muestran que las células endoteliales que se adhieren al tejido tratado con VEGF están considerablemente más diseminadas (Fig. 5C). Esta morfología diseminada es indicativa de un revestimiento de células endoteliales más saludable.

Ejemplo 3 Entrecruzamiento con Glutaraldehído de VEGF a Tejido de Nueva Aportación

Este ejemplo demuestra que se puede utilizar una baja concentración (0,01%) de solución de glutaraldehído para anclar VEGF a tejido de velo aórtico porcino de nueva aportación sin pérdida de la capacidad del VEGF para estimular la proliferación y la quimiotaxis de las células endoteliales.

Se prepararon una solución salina tamponada con HEPES, una solución con el 0,01% de glutaraldehído y una solución de VEGF/glutaraldehído como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se recogieron seis velos aórticos porcinos utilizando una técnica quirúrgica estéril y se enjuagaron con solución salina estéril al 0,9%. Dos de los velos se incubaron en 10 ml de solución salina tamponada con HEPES. Otros dos velos se incubaron en 10 ml de solución con el 0,01% de glutaraldehído. Los dos velos restantes se incubaron en 10 ml de solución de VEGF/glutaraldehído. Todos los velos se incubaron en sus respectivas soluciones durante 30 minutos. Al final del período de incubación de 30 minutos, los velos se enjuagaron tres veces en 100 ml de solución salina estéril al 0,9%. Cada enjuague se realizó durante dos minutos.

Algunos días antes del tratamiento de los velos, una placa de cultivo de tejido de seis pocillos con gelatina al 2% se sembró con células endoteliales aórticas humanas (Clonetics, San Diego, CA). Se dejó que las células endoteliales crecieran hasta la confluencia y se añadió EGM de nueva aportación (Clonetics, San Diego, CA) a los pocillos cada día. Durante el período de incubación de 30 minutos de los velos, se despejó la sección central de cada pocillo de cultivo de tejido raspando las células endoteliales. Los pocillos se enjuagaron después con EGM de nueva aportación para eliminar los restos celulares. Inmediatamente, después del período de incubación de 30 minutos y los posteriores enjuagues, se colocó un velo en la porción despejada de cada pocillo de cultivo de tejido. Los insertos de cultivo de tejido estériles (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se colocaron sobre los velos para evitar que flotaran. Se añadió EGM de nueva aportación y la placa de cultivo de tejido se devolvió a una incubadora de cultivo de tejido.

Se añadió EGM de nueva aportación a los pocillos cada día. La incubación continuó durante cinco días. Al final del período de cinco días, las células adheridas a la superficie de los velos se fijaron con formaldehído al 3%. Los velos se tiñeron después con una sonda lipófila fluorescente, perclorato de dioctadecil-tetrametil-indocarbocianina (Molecular Probes Inc., Eugene, OR), como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Se formaron las imágenes de las muestras teñidas utilizando un filtro con isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) y se fotografiaron. Las fotografías se observan en las Figs. 6A-6C. Se observaron algunas colonias de células endoteliales sobre el tejido que había sido incubado con solución salina tamponada con HEPES o con el 0,01% de glutaraldehído. Los velos incubados en la solución de VEGF/glutaraldehído tenían muchas más células endoteliales colonizando el tejido, como se observó comparando la Fig. 6C con las Figs. 6A y 6B. De este modo, la incubación en una solución salina tamponada de glutaraldehído al 0,01% que contenía 100 mg/ml de VEGF no tuvo efecto negativo sobre la supervivencia de las células endoteliales aórticas humanas y aceleró la cobertura del tejido aórtico porcino con las células endoteliales humanas.

Ejemplo 4 Inhibición Inducida por VEGF de la Calcificación de los Velos

Este ejemplo demuestra que un tratamiento combinado de velos de válvula aórtica porcina entrecruzados con glutaraldehído con VEGF y con etanol puede inhibir la calcificación de esos velos, como se evalúa en un modelo de implante subcutáneo en rata joven.

Se ha demostrado que un modelo de implante subcutáneo en rata joven imita estrechamente la calcificación de las válvulas cardíacas clínicamente relevante (Levy et al., Am. J. Pathol. 113: 143-145 (1983)). Por consiguiente, el modelo se utiliza para evaluar la calcificación potencial de los velos sometidos a diferentes procedimientos o a modificaciones de su superficie.

La preparación de todas las soluciones y el tratamiento de los velos en estas soluciones se realizaron como se describe en detalle en los Ejemplos 1 y 2. Brevemente, se recogieron 45 velos de válvulas aórticas porcinas y se entrecruzaron en glutaraldehído tamponado con citrato al 0,5%. Quince de estos velos (el grupo de control) se almacenaron en solución salina tamponada con HEPES hasta inmediatamente antes de la implantación. Los 30 velos restantes se incubaron en una solución de etanol al 80% durante 24 horas y después se sometieron a esterilización mediante irradiación gamma. Durante y después de la irradiación gamma, los velos se almacenaron en solución salina tamponada con HEPES. Quince de los velos tratados con etanol (el grupo de Etanol y VEGF) se incubaron en una solución de glutaraldehído/solución de 100 ng/ml de VEGF durante treinta minutos el día de la implantación.

Antes de la implantación, todos los velos se enjuagaron tres veces en 100 ml de solución salina al 9% estéril durante aproximadamente dos minutos por enjuague. Utilizando una técnica aséptica, los velos se codificaron con sutura coloreada estéril para diferenciar los velos de cada uno de los tres grupos (blanco = Grupo de Control, verde =
Grupo de Etanol, negro = Grupo de Etanol y VEGF). Los velos codificados se almacenaron en solución salina estéril y se transportaron al Ramsey Animal Laboratory del Regions Hospital de Saint Paul, MN, donde se realizó la implantación subcutánea.

Los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones asépticas. Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de tres semanas de edad mediante una inyección intraperitoneal de hidrocloruro de cetamina y se diseccionaron cuatro sacos subcutáneos de al menos 2 cm de diámetro en la pared abdominal media de cada rata. Se implantaron cuatro velos en los sacos subcutáneos de cada rata, un velo por saco. Cada rata recibió al menos uno, pero no más de dos velos de cada grupo de tratamiento. Las heridas se cerraron con grapas quirúrgicas, y se dejó que las ratas se recuperaran. Los velos se implantaron por 21 días (10 velos en cada grupo de tratamiento) o 63 días (5 por cada grupo de tratamiento). Al final del período de implantación, las muestras se recuperaron de las ratas. Las muestras recuperadas se almacenaron en solución salina estéril y se transportaron para el análisis.

Cada muestra de tejido se seccionó por la mitad a lo largo del eje radial. Una mitad de la muestra de tejido se limpió del tejido del anfitrión que resulta de la respuesta de encapsulación durante la implantación y se deshidrató. Las muestras deshidratadas se sometieron a espectroscopia de emisión atómica por plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) para la determinación del contenido de calcio. La segunda mitad de cada muestra de tejido se colocó en formalina al 10% y se envió al American Histo Labs (Gaithesbourg, MD) para la preparación de la muestra histológica utilizando tinción de von Kossa para teñir específicamente los cristales de fosfato de calcio.

La Fig. 7 es un gráfico de los resultados medios del ensayo ICP-AES para el contenido de calcio. El tratamiento con etanol inhibió significativamente la calcificación tanto a los 21 como a los 63 días. La adición de VEGF al tratamiento con etanol atenuó adicionalmente la calcificación. La Fig. 8 muestra fotografías representativas del análisis histológico de las muestras de tejido para el fosfato de calcio utilizando tinción de von Kossa. Las fotografías de la Fig. 8 confirman la inhibición de la calcificación por etanol y la inhibición sinérgica de la calcificación por la combinación de etanol/VEGF.

Se desea que las realizaciones descritas antes sean ilustrativas y no limitantes. Las realizaciones adicionales están en las reivindicaciones. Si bien la presente invención ha sido descrita con referencia a las realizaciones preferidas, los trabajadores expertos en la técnica advertirán que se pueden realizar cambios en la forma y los detalles.

Claims

1. Una prótesis que comprende un tejido y factor de crecimiento endotelial vascular, donde el factor de crecimiento endotelial vascular está unido covalentemente al tejido utilizando agentes de entrecruzamiento, siendo efectivo el factor de crecimiento endotelial vascular para estimular la asociación de células viables con el tejido.

2. Una prótesis según la reivindicación 1, donde el tejido comprende tejido humano.

3. Una prótesis según la reivindicación 1, donde el tejido se selecciona entre tejido porcino, tejido bovino, tejido de canguro, tejido canino y combinaciones de los mismos.

4. Una prótesis según la reivindicación 1 para un paciente humano, donde el tejido comprende tejido de aloinjerto, tejido de xenoinjerto o tejido sintético.

5. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior, donde la asociación entre el tejido y el factor de crecimiento endotelial vascular implica interacciones de unión específica.

6. Una prótesis según las reivindicaciones 1 a 4, donde la asociación entre el tejido y el factor de crecimiento endotelial vascular implica interacciones de unión no específica.

7. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior, donde el tejido comprende tejido entrecruzado.

8. Una prótesis de las reivindicaciones 1 a 6, donde el tejido comprende tejido no entrecruzado.

9. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior, donde el factor de crecimiento endotelial vascular comprende una proteína seleccionada entre bVEGF164, bVEGF120, hVEGF165, hVEGF121, VEGF II, hVEGF80, VEGF-B, VEGF2, las formas activas modificadas los mismos, y las combinaciones de los mismos.

10. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior, donde el factor de crecimiento endotelial vascular comprende una proteína viral.

11. Una prótesis según la reivindicación 10, donde la proteína viral comprende una proteína Tat.

12. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior que comprende una prótesis de válvula cardíaca.

13. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior, donde el entrecruzamiento implica restos glutaraldehído.

14. Una prótesis de cualquier reivindicación anterior, donde el agente de entrecruzamiento comprende aldehídos bifuncionales.

15. Una prótesis según la reivindicación 14, donde el aldehído bifuncional comprende glutaraldehído.

16. La prótesis según las reivindicaciones 1 a 13, donde el agente de entrecruzamiento comprende epóxidos.

17. Un método ex vivo para asociar células endoteliales con una prótesis que comprende poner en contacto una prótesis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores con un cultivo celular que comprende células endoteliales.