JP2002500929A - 成長因子を結合したプロテーゼ - Google Patents

成長因子を結合したプロテーゼ

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ケリー，シイラ・ジェイ
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St Jude Medical LLC
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Abstract

(57)【要約】 ポリペプチド成長因子を基質に結びつけて、基質と内皮細胞との集団化を促進させる。成長因子を基質に架橋させると、プロテーゼが形成される。好ましいポリペプチド成長因子としてはVEGFがある。VEGF処理した組織は、インビトロおよび/またはインビボにおいて内皮細胞と集団化することができる。これとは別のアプローチにおいては、基質とVEGF溶液とを直接接触させることによって、接着剤をコーティングとして使用してVEGFを基質に施すことによって、あるいはVEGFを基質に化学結合させることによって(リンカー分子を介在させる場合とそうでない場合)、VEGFを基質に結びつけることができる。1つの好ましいアプローチにおいては、架橋プロセスの後に成長因子が活性を保持するよう適度に温和な条件下で架橋させることによって、成長因子を基質に結びつける。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、ポリペプチド成長因子で変性させた構成要素を有するプロテーゼに
関する。さらに本発明は、こうしたプロテーゼを製造するための方法に関する。
【０００２】 発明の背景 プロテーゼ(すなわち補綴装具)は、ヒトや動物における損傷もしくは罹患した
器官、組織、および他の構造物を修復または置き換えるのに使用されている。プ
ロテーゼは通常長期間にわたって埋め込まれるので、一般には生物学適合性でな
ければならない。プロテーゼは例えば、人工心臓、人工心臓弁、靭帯修復材、血
管修復材、および哺乳類組織で造られた外科用パッチなどを含んでよい。
【０００３】 プロテーゼは、組織等の天然物質、合成物質、またはこれらの組合せ物から造
ることができる。例えば、人工心臓弁プロテーゼ等の合成プロテーゼは、生物学
的適合性の金属や他の物質(例えば、グラファイトやポリエステル)から製造され
る。人工心臓弁は、数十年にわたる使用によってその耐久性が証明された利点が
あるが、補綴弁の上または周囲に血液の凝固を起こしやすい。血液が凝固すると
、弁もしくはそれに結合した血管の急性または亜急性の閉鎖を引き起こすことが
ある。このため、人工心臓弁が埋め込まれている患者は、こうした弁が埋め込ま
れている間は抗凝血剤の服用を続ける。抗凝血剤の服用は、年間3〜5%の割合で ひどい出血を起こす恐れを与え、特定の個人に対しては安全に服用させることが
できない。
【０００４】 人工心臓弁のほかに、心臓弁プロテーゼも、組織小葉またはポリマー小葉(pol
ymer leaflet)を使用して造ることができる。血栓症とその後に起こる石灰化が 、ポリマー心臓弁に関連した問題点である。これらの弁の石灰化は機能不全を引
き起こすことがある。
【０００５】 補綴組織心臓弁は、例えば豚の心臓弁から製造することもできるし、あるいは
他の生物学的物質(例えばウシの心膜)から製造することもできる。補綴心臓弁に
おける生物学的物質は通常、一般には層流で非乱流の血流をもたらすような輪郭
と表面特性を有する。したがって血管内の凝固は、人工心臓弁の場合より起こり
にくい。残念なことに、補綴組織心臓弁は、埋め込んでから約7年ごろに機能不 全を起こしやすいために制約を受ける。若い患者においては、また妊娠中におい
ては、弁の変質が特に速やかである。
【０００６】 石灰化、すなわちカルシウム塩〔特にリン酸カルシウム(ヒドロキシアパタイ ト)〕の付着が変質の主要な原因である。石灰化の問題を解消すべく、グルタル アルデヒドで固定された弁プロテーゼがカルシウム核形成を減少させる化合物で
処理されている。グルタルアルデヒドによる固定が石灰化とメカニカルな劣化の
一因になりうるということがわかっているので、これに代わる組織固定法を使用
するという他のアプローチもとられている。さらに、生存不可能な細胞がカルシ
ウム付着のための部位となりうるので、細胞外のマトリックスを損なわずに生存
不可能な細胞を除去するための種々の方法が開発されている。当然ながら、生存
可能な細胞を含んだ非損傷組織は石灰化を受けない。
【０００７】 組織をベースとするプロテーゼの他の大きな欠点は、このような装具に自己保
持性がないことである。長期間での耐久性は、生存可能な細胞が埋め込まれた組
織中に生息する能力、および生存可能な細胞が保持機能を果たす能力によって影
響される。生存可能な細胞の重要性は、同種移植片の移植(すなわち、1つの種の
あるメンバーから同じ種の他のメンバーへの移植)という観点にて研究されてい る。同種移植片の保存を適切に行えば、組織中に残存する生存可能な細胞の数( マトリックス蛋白質合成によって測定)を最大にすることができる。細胞の生存 を促さないような保存方法(例えば、4℃での長期貯蔵)は、インビボ耐久性の低 下および再操作率(reoperation rate)の増大につながる。
【０００８】 発明の概要 ポリペプチド成長因子を組織基質または合成基質に結合して、基質における生
存可能な細胞の生育(population)を促進することができる。好ましいポリペプチ
ド成長因子としては血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor; V
EGF)がある。架橋した組織の場合、結合したVEGFが、グルタルアルデヒド架橋か
ら生じる細胞毒性の少なくとも一部を軽減する。VEGFは、溶液中で直接接触させ
ることによって基質と結合させることができる。これとは別に、VEGFを結合剤と
ともに基質に施すことによって、あるいはVEGFの基質への化学結合によって(リ ンカー分子を介在させる場合とそうでない場合がある)VEGFを基質に結合させる こともできる。
【０００９】 基質をVEGFで変性させることにより、基質に対する生存可能な内皮細胞の親和
性(affiliation)を与え、これにより基質のプロテーゼとしての性能を向上させ ることが可能である。例えば、石灰化の減少によってプロテーゼの長期間耐久性
がある程度は改良され、また微生物の付着に適した場所が減少することによって
プロテーゼに関連した感染症が発生しにくくなる。細胞培養系(cell culture sy
stem)を使用すると、VEGFで処理された基質は、基質における内皮細胞のインビ トロ での生育を促進することができる。VEGFはさらに、基質をプロテーゼの一部
として埋め込んだ後に、基質における内皮細胞のインビボでの生育を促進するこ
とができる。
【００１０】 第1の態様においては、本発明は、ポリペプチド成長因子を結合させた同種移 植片組織または異種移植片組織、または合成組織を含み、前記ポリペプチド成長
因子が、前記組織に対して生存可能な細胞の親和性を高めるのに効果的である、
ヒト患者のためのプロテーゼを特徴とする。ポリペプチド成長因子の組織への結
合には、特異的な結合相互作用および/または共有結合が関与してよい。ポリペ プチド成長因子の組織への結合にはリンカー分子が関与してよい。
【００１１】 組織は、架橋した組織および/または架橋していない組織を含んでよい。組織 は、豚の心臓弁、ウシの心嚢組織、あるいは他のいかなる合成物質もしくは生物
学的物質からも得ることができる。ポリペプチド成長因子は血管内皮成長因子を
含んでよい。適切な血管内皮成長因子としては、例えば、bVEGF164、bVEGF120、
hVEGF165、hVEGF121、VEGF II、hVEGF80、VEGF-B、VEGF2、これらの変性活性形 、およびこれらの組合せ物からなる群から選ばれる蛋白質がある。
【００１２】 他の態様においては、本発明は、結合したVEGFを有する架橋した組織を含む物
品を特徴とする。架橋は、グルタルアルデヒド部分を含んでよい。 本発明はさらに、結合したVEGFを含む補綴心臓弁を特徴とする。この補綴心臓
弁は豚の心臓弁を含んでよい。
【００１３】 さらに他の態様においては、本発明は、ポリペプチド成長因子を同種移植片組
織または異種移植片組織に結合させることを含む、同種移植片組織または異種移
植片組織を含んだヒト患者用プロテーゼの製造法を特徴とする。本発明の製造法
はさらに、ポリペプチド成長因子を結合させた組織を生存可能な細胞と共にイン ビトロ にてインキュベートして前記組織に対する前記細胞の親和性を高めること
を含んでよい。生存可能な細胞はヒトの細胞を含んでよい。生存可能な細胞は、
プロテーゼに対して意図されているレシピエントから得られる細胞を含んでよい
。
【００１４】 さらに他の態様においては、本発明は、インビトロでの生存可能な細胞を組織
と共にインキュベートして、結合したポリペプチド成長因子を含む基質に対する
前記細胞の親和性を高めることを含む基質の変性法を特徴とする。
【００１５】 さらに他の態様においては、本発明は、基質と、生存可能な細胞と前記基質と
の結合を刺激するのに効果的な、前記基質に架橋したポリペプチド成長因子とを
含むプロテーゼに関する。
【００１６】 本発明はさらに、ポリペプチド成長因子が生存可能な細胞と基質との結合を刺
激するのに効果的となるよう、ポリペプチド成長因子を種々の条件下にて基質に
架橋させることを含む、生物学的適合性物質を製造するための方法に関する。
【００１７】 本発明の他の特徴および利点は、本発明についての以下の詳細な説明および特
許請求の範囲から明らかとなろう。 好ましい実施態様の詳細な説明 ポリペプチド成長因子またはそのフラグメントは、インビトロにて組織基質(
tissue substrate)または合成基質と結合させることができる。一般には基質が 、プロテーゼの全部または一部を形成する(あるいは形成するであろう)。好まし
いポリペプチド成長因子としては、血管内皮成長因子(VEGF)および関連化合物が
ある。VEGFによる基質の変性後、VEGFは内皮細胞の化学走性と増殖を刺激するこ
とができる。好ましい実施態様においては、基質が固定される。生存可能な内皮
細胞と補綴組織との結合は、プロテーゼの長期生存可能性に寄与する。VEGFによ
る変性は、内皮細胞または上皮細胞のライニングを元々有しているようなプロテ
ーゼ(例えば、血管構成成分、心臓血管構造物、リンパ系の一部、子宮組織の一 部、または網膜組織の一部)の製造に特に適している。
【００１８】 VEGFは、種々の方法で基質と結合させることができる。例えば、VEGFが直接的
な付着によって補綴組織と結合するよう、VEGF溶液を使用して基質と結びつける
ことができる。これとは別に、接着剤を使用してVEGFと補綴組織とを結合させる
こともできる。さらに、化学結合を使用してVEGFと補綴組織とを結合させること
もできる。
【００１９】 後述の実施例1に示すように、架橋した組織にVEGFを加えることによって付着(
attachment)または結合(association)を直接起こさせることができる。架橋組織
とVEGFとの直接的な付着のメカニズムは明らかになっていないが、VEGFは架橋組
織中の遊離のクルタルアルデヒド官能基と結びつくことがある。
【００２０】 VEGFの組織への化学結合に対しては、グルタルアルデヒドを使用してVEGFを組
織に架橋させることができる。VEGFを組織に架橋させるための条件は、架橋の後
に所望レベルのVEGF活性が保持されるよう、また残留するグルタルアルデヒドに
より仲介される細胞毒性を防止するよう、注意深く制御しなければならない。グ
ルタルアルデヒドによるVEGFの組織への制御された架橋により、架橋した組織に
対しても、あるいは架橋していない組織に対しても、VEGFを効果的に接着させる
ことができる。したがってこのアプローチは、架橋していない自家移植片組織ま
たは同種移植片組織とVEGFとを結合させるのに特に適している。
【００２１】 組織が生存可能な細胞を生育させるよう、VEGFは、インビトロまたはインビボ にて基質上に内皮細胞の成長を効果的に促すことができる。インビボでの成長に
対しては、結合したVEGFを含む基質を患者の体内に埋め込むことができる。いっ
たん患者の体内に埋め込まれると、VEGFが存在するために内皮細胞がプロテーゼ
に引き付けられる。これとは別に、細胞培養系中にて内皮細胞とプロテーゼとを
結合させることもできる(後述)。
【００２２】 A. プロテーゼ プロテーゼは、組織基質または合成基質を、該基質が細胞付着のための場所と
して適切なものとなるように少なくとも構成要素として含んでよい。一般には、
こうしたプロテーゼは、患者の体内に長期間にわたって埋め込まれるように設計
される。プロテーゼとしては、例えば人工心臓、人工心臓弁、弁形成リング、血
管用・構造用ステント、代用血管、綿撤糸、縫合糸、導線、永久的に内在する経
皮デバイス、血管用もしくは心臓血管用シャント、創傷治癒のための移植皮膚、
および外科用パッチなどがある。患者の体内に長期間にわたって存在するように
設計されている生物医学的器具は、結合した成長因子を有する基質を含むのにも
適している。これらの器具としては、例えばヒックマンカテーテル(Hickman cat
heter)がある。
【００２３】 基質として使用するための天然の組織は、動物種(一般には、ヒト、ウシ、豚 、犬、アザラシ、またはカンガルー等の哺乳類)から得る。これらの組織は、例 えば、心臓弁、大動脈起始部、大動脈壁、大動脈小葉、心嚢組織(心嚢パッチ等)
、結合組織(硬膜等)、バイパス移植片、腱、靭帯、皮膚パッチ、血管、ヒトの臍
帯組織、骨組織、筋膜、および粘膜下組織などから得ることができる。これらの
天然組織は通常コラーゲン含有物質を含む。天然組織は一般には軟質の組織であ
るが、必ずしもそうである必要はない。組織をベースとしたプロテーゼは、その
天然の形態からの構造要素(structural elements)を保持することができるし、 および/または、明確に識別された組織断片の集成体からプロテーゼ中に構造要 素を導入することもできる。例えば心臓弁プロテーゼは、豚の心臓弁から、ウシ
の心膜から、あるいはこれらの組合せ物から造り上げることができる。
【００２４】 合成基質は、合成ポリマーおよび/または生物学的ポリマー(例えば、合成組織
マトリックスを形成させるために天然組織マトリックス中に一般的に見出される
もの)から形成させることができる。特に、コラーゲンポリマーとエラスチンポ リマーは、種々ある方法(例えば、製織や成形)のいずれによっても組織成分に相
当するマトリックス中に形成させることができる。これらの生物学的ポリマーか
ら形成される合成基質は、天然組織のマトリックスによく似ている。これとは別
に、合成基質は、合成ポリマーおよび/または生物学的ポリマーと生存可能な細 胞および/または生存不可能な細胞とを含んだマトリックスを有する合成組織の 形態をとってもよい。ポリマーは生物学的再吸収性(bioresorbable)であってよ いが、必ずしもそうである必要はない。適切な合成ポリマーと生物学的ポリマー
については下記にて説明する。
【００２５】 組織は架橋によって固定することができる。架橋で固定できれば、例えば酵素
による組織の分解が防止されるために物理的な安定化(mechanical stabilizatio
n)が得られる。架橋はさらに、プロテーゼに対する患者の拒絶反応を起こす可能
性のある抗原性部位を取り除く。固定のためには通常グルタルアルデヒドまたは
ホルムアルデヒドが使用されるが、他の固定剤(例えば、エポキシ化合物や他の 二官能アルデヒドなど)も使用することができる。異種移植片〔すなわち、患者 の種(species)とは異なる種からの組織を導入しているプロテーゼ〕は、一般に は使用する前に固定する。同種移植片(すなわち、患者の種であるが異なった個 体の組織を導入しているプロテーゼ)は、使用の前に固定してもしなくてもよい 。同様に、自家移植片(すなわち、同じ個体からの組織を導入しているプロテー ゼ)は、使用の前に固定してもしなくてもよい。
【００２６】 プロテーゼは、他の非組織成分(non-tissue component)(例えばポリマー物質 、セラミック、および金属など)を含んでよい。適切なセラミックとしては、ヒ ドロキシアパタイト、アルミナ、および熱分解炭素などがあるが、これらに限定
されない。ポリマー物質は、合成ポリマーおよび精製した生物学的ポリマーから
造ることができる。適切な合成物質は、ヒドロゲルおよび厳しい脱水に耐えるこ
とのできない他の合成物質を含んでよい。
【００２７】 適切な合成ポリマーとしては、ポリアミド(例えばナイロン)、ポリエステル、
ポリスチレン、ポリアクリレート、ビニルポリマー(例えばポリエチレン、ポリ テトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、およびポリ塩化ビニル)、ポリカー ボネート、ポリウレタン、ポリジメチルシロキサン、酢酸セルロース、メタクリ
ル酸ポリメチル、エチレン酢酸ビニル、ポリスルホン、ニトロセルロース、およ
び類似のコポリマーなどがあるが、これらに限定されない。デキストラン、ヒド
ロキシエチルスターチ、ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、ポリ[N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]、ポリ
(ヒドロキシ酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポ リ(ジメチルグリコール酸)、ポリ(ヒドロキシブチレート)、および類似のコポリ
マー等の生物学的再吸収性ポリマーも使用することができる。これらの合成ポリ
マー物質をメッシュに織り込んでマトリックスまたは基質を形成させることがで
きる。これとは別に、合成ポリマー物質は、成形または注型して適切な形態物に
することができる。
【００２８】 生物学的ポリマーは、天然に産するものであってもよいし、あるいはインビト ロ で(例えば発酵などによって)生成させることもできる。精製した生物学的ポリ
マーは、製織、編成、注型、成形、押出、細胞整列、および磁気整列(magnetic
alignment)等の方法により適切に基質に形成することができる。磁気整列の説明
については、例えばR. T. Tranquilloらによる"Biomaterials 17:349-357(1996)
"(該文献を参照により本明細書に含める)を参照のこと。適切な生物学的ポリマ ーとしては、コラーゲン、エラスチン、シルク、ケラチン、ゼラチン、ポリアミ
ノ酸、腸線、縫合糸、多糖類(例えばセルロースやスターチ)、およびこれらのコ
ポリマーなどがあるが、これらに限定されない。
【００２９】 B. 血管内皮成長因子(VEGF) VEGFとは、他の細胞(例えば平滑筋細胞)よりも血管内皮細胞の成長を優先的に
刺激することが明らかとなっているある一系統のポリペプチドを表わしている。
幾つかの形態のVEGFが確認されている。VEGFポリペプチドは一般に、血小板から
誘導される成長因子を含めて配列相同性を有しており、したがって種々のタイプ
の細胞の移行と増殖を変化させることができる。VEGFは血管透過性因子と呼ばれ
ることもある。
【００３０】 もともと確認されている形態のVEGFは、約45〜46キロダルトン(kDa)の分子量 を有する。この形態は明らかに、それぞれのサブユニットが約23kDaの分子量を 有するホモダイマーである。ヒトのポリペプチド(165-アミノ酸, hVEGF165)およ
び対応するウシのポリペプチド(164-アミノ酸, bVEGF164)をコード化しているc-
DNA配列が決定されている。さらに、ヒトのバージョンに対しては121-アミノ酸 によるポリペプチド変性体(hVEGF121)が、そしてウシのバージョンに対しては12
0-アミノ酸によるポリペプチド変性体(bVEGF120)が確認されている。対応するア
ミノ酸配列に関しては、Tischerらによる米国特許第5,194,596号を参照のこと( 該特許を参照により本明細書に含める)。それぞれ189-アミノ酸と206-アミノ酸 による他の不溶性変性体も確認されている。例えば、E. Tischerらによる"The h
uman gene for vascular endothelial growth factor"を参照。多様な蛋白質形 態代替エクソンスプライシングによりコード化されている〔"J. Biol. Chem. 26 6 : 11947-11954(1991)"およびK. A. Houckらによる"The vascular endothelial
growth factor family: identification of a fourth molecular species and c
haracterization of alternative splicing of RNA, Molec. Endocrinology 5:1
806-1814(1991)", これら2つの文献を参照により本明細書に含める〕。
【００３１】 VEGFの他の形態(VEGF IIという名称が付けられている)はヘテロダイマーであ る。ラットの神経膠腫細胞から単離されるので、第1のサブユニットは190-アミ ノ酸を有しているが、第2のサブユニットは135-アミノ酸形態と115-アミノ酸形 態を有している。VEGF IIについてはEP 0 476 983A(該特許文献を参照により本 明細書に含める)に記載されている。
【００３２】 ヒトの単一ポリペプチドVEGF(名称はない)も確認されている。このポリペプチ
ドは約80kDaの分子量を有する。対応するcDNAを単離し、728-アミノ配列をcDNA 配列から決定した。EP 0 550 296Aに蛋白質が詳細に説明されている(該特許文献
を参照により本明細書に含める)。
【００３３】 さらに他のヒトの成長因子であるVEGF2が、初期段階のヒトの胎児の骨巨細胞 腫、成人の心臓、および幾つかの乳癌ラインから確認されている。VEGF2は350種
のアミノ酸を含んでおり、そのうちの約24種のアミノ酸がリーダー・シーケンス
を表わしている。VEGF2に対する配列についてはWO95/24473に開示されている(該
特許文献を参照により本明細書に含める)。
【００３４】 最近、VEGFの他の変性体であるVEGF-Bが確認された。VEGF-Bは、心筋および骨
格筋に関連しているようである。マウスとヒトのVEGF-Bに対する完全な配列が、
Erikssonらによる米国特許第5,607,918号に記載されている(該特許文献を参照に
より本明細書に含める)。
【００３５】 通常の生理学的条件下で哺乳類細胞中に発現するVEGF変性体の他に、ウイルス
蛋白質〔例えば、ヒトの免疫不全ウイルス(HIV)-1からのTat蛋白質〕はVEGFと配
列相同性を共有し、もともとのVEGF受容体に結びつく。これらの性質は、Albini
らによる「"The angiogenesis induced by HIV-1 Tat proteins is mediated by
the Flk-1/KDR receptor on vascular endothelial cells", Nature Medicine
2(12): 1371-1375 (1996)」及びMitolaらによる「"Tat-human immunodeficiency
virus-1 induces human monocyte chemotaxis by activation of vascular end
othelial growth factor receptor-1", Blood 90(4): 1365-1372(1997)」に記載
されている(これら2つの文献を参照により本明細書に含める)。これらVEGF受容 体との相互作用により、Tat蛋白質は内皮細胞の走化性と増殖を刺激する。した がって本出願の目的に対し、Tat蛋白質およびVEGF受容体と結合する他の類似の ウイルス蛋白質はVEGF成長因子であると考えられる。
【００３６】 前述したように、種々のVEGFポリペプチドが確認されている。これらの多くは
特定の組織と関連している。ポリペプチドの少なくとも一部は、代替メッセージ
・スプライシング(alternative message splicing)に基づいたバリエーション( 例えばhVEGF165やhVEGF121)を有する。本出願の他のセクションにおいても使用 している"VEGF"とは、これまでに確認されている全てのVEGFポリペプチド(例え ば本出願中に記載のもの)だけでなく、内皮細胞の走化性または増殖を選択的に 促進する今後確認されるVEGFポリペプチド(但し、これらに限定されない)も表わ
している。"VEGF"はさらに、内皮細胞の走化性または増殖を選択的に促進する能
力を保持するポリペプチドフラグメントも表わしている。前記したように、例え
ばヒトのVEGF121は、ヒトのVEGF165の天然に産するフラグメントである。組換え
られたヒトのVEGF165、ヒトのVEGF121、およびマウスのVEGFは、ミネソタ州ミネ
アポリスのR&Dシステムズ社から市販されている。同様に、本明細書に記載の"VE
GF"は、共有結合または非共有結合による蛋白質分子への化学的付加によって変 性されたVEGF蛋白質を含む。
【００３７】 標準的な分子生物学的方法を使用して〔例えば、Sambrook, Fritsch, およびM
aniatisによる「"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第2版, Cold Spr
ing Harbor Press, (1989)」を参照〕、天然のVEGFポリペプチドの組換えられた
変性形を造ることができる。これらの直接的な変性は、N-末端、C-末端、または
これら両方に対するアミノ酸の付加を含む。さらに、ポリペプチド鎖に沿ってア
ミノ酸を置き換えることによって変性を施すことができる。変性の種類によって
は、蛋白質の活性を消滅させることがある。細胞培養系における活性を調べるこ
とによって、不活性化を引き起こす変性を避けることが簡単な対処法である。こ
れらの変性ポリペプチドの活性形は、"VEGF"についての我々の一般的な定義の範
囲内に入る。
【００３８】 C. VEGFと基質との結合 VEGFと基質との結合は、直接的な付着、接着剤を含んだコーティング物質の適
用、または化学結合を含んでよい。VEGFは、基質の一部だけと結合させることも
できるし、あるいは基質全体と結合させることもできる。VEGFを基質の一部と結
合させる場合、VEGFが基質のある部分上に存在する結果、細胞はやはり、VEGFと
結合していない基質の他の部分と結合することがある。
【００３９】 直接的な付着では、基質(例えば組織基質)とVEGFの溶液とを合わせることを含
む。特に、VEGFが簡単には洗い落ちないように、VEGFを、グルタルアルデヒドで
架橋した生物学的組織と結合できることが見出されている。この直接的な付着は
、組織をVEGFとともにインキュベートする前に、組織を0.5%グルタルアルデヒド
中で1ヶ月未満インキュベートしたときに特に効果的である。グルタルアルデヒ ドで架橋した組織へのVEGFのその後の結合は、組織が緩衝液と接触していれば、
少なくとも中程度の期間(最大1ヶ月またはそれ以上)にわたって持続するようで ある。後述の実施例1に記載のように、組織をVEGFと接触させる前にエタノール で処理すると、VEGFと固定組織との結合が少なくなるという結果が得られている
。組織をエタノールとともにインキュベートすることから起こるVEGFの結合の減
少は、おそらく、VEGF結合部位が消失すること、VEGF結合部位が不活性化するこ
と、またはVEGF結合部位にエタノールが結合していることによるものであろう。
【００４０】 VEGFの基質(例えばグルタルアルデヒドで架橋した組織)への直接的な付着に対
しては、基質または基質の一部と、一般には約1ng/ml〜約1μg/ml(好ましくは約
25ng/ml〜約250ng/ml)の濃度のVEGF溶液とを合わせる。VEGFとともにインキュベ
ートしている間、溶液を、例えば約4℃に冷却するのが好ましい。基質をVEGF溶 液中に約4℃で約24時間保持するのが好ましい(最高約14日またはそれ以上保持す
ることもある)。VEGF溶液は、約6〜約8.5の範囲のpHにて緩衝剤処理するのが好 ましく、約6.3〜約7.4の範囲のpHにて緩衝剤処理するのがさらに好ましい。適切
な緩衝剤は、例えば下記のような化合物をベースにしてよい: リン酸塩、ホウ酸
塩、重炭酸塩、炭酸塩、カコジル酸塩、クエン酸塩、ならびに他の有機緩衝剤〔
例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)、N-(2-ヒドロキシエチ ル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸(HEPES)、およびモルホリンプロパンス ルホン酸(MOPS)〕。
【００４１】 これとは別に、結合剤または接着剤を使用することによって、VEGFと基質とを
結合させることもできる。VEGFと接着剤が基質上に被膜を形成する。好ましい接
着剤としては、生物学的グルー(例えばフィブリングルーなど)がある。フィブリ
ングルーは、フィブリノゲンとトロンビンとの重合により形成させることができ
る。適切なフィブリングルーは、例えば、Immuno AG社(オーストリア)およびZym
ogenetics社(ワシントン州シアトル)から市販されている。
【００４２】 フィブリングルーを使用してVEGFを施すために、基質に少量のトロンビンを吸
収させることができる。フィブリノゲンを含有する溶液とVEGFとを混合して、好
ましくは約1ng/ml〜10μg/mlの範囲のVEGF濃度を有する溶液を得ることができる
。次いでフィブリノゲン/VEGF混合物を、吸収したトロンビンを含む基質の表面 上にはけ塗りしてもよいし、あるいは吸収したトロンビンを含む組織をフィブリ
ノゲン/VEGF溶液中に浸漬してもよい。VEGF-接着剤コーティングは、基質の全体
に施してもよいし、あるいは基質の一部だけに施してもよい。合成基質の場合、
基質が形成されるときにVEGFを基質物質中に導入することもできる。
【００４３】 フィブリングルーおよび類似のグルーは、施された後に患者によって徐々に再
吸収される。VEGFを他の再吸収性ポリマーと混合し、この混合物を使用して基質
上に被膜として形成させることができる。適切な再吸収性ポリマーとしては、例
えば、デキストラン、ヒドロエチルスターチ、ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ[N-(2-ヒドロキシプロピル)メ タクリルアミド]、ポリグリコール、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポ リ(エステルアミド)、およびポリ無水物(polyanhydrides)などがある。再吸収性
ポリエステルとしては、例えば、ポリ(ヒドロキシ酸)とそれらのコポリマー、ポ
リ(ε-カプロラクトン)、ポリ(ジメチルグリコール酸)、およびポリ(ヒドロキシ
ブチレート)などがある。好ましい再吸収性ポリマーとしては、例えば、D,L-ポ リ乳酸、L-ポリ乳酸、ポリ(グリコール酸)、L-乳酸とグリコール酸とのコポリマ
ー、およびD-乳酸とグリコール酸とのコポリマーなどがある。VEGFはさらに、ポ
リマーマトリックスの隙間に貯蔵することもできる。ポリマーマトリックスは、
VEGF物質を放出するよう機能して再吸収性であってもよいし、あるいはVEGFが基
質から外に向かって徐々に拡散できるよう適切な多孔性を有していてもよい。
【００４４】 天然または合成の生物学的再吸収性ポリマーをベースとする種々のアプローチ
は、より高い濃度のVEGFのほうに移行するよう細胞に信号を送る化学走化性剤と
してVEGFが作用できるように、VEGFの濃度勾配が確立されるという利点を有する
。さらに、限られた時間にわたってより正確な用量を供給することができる。
【００４５】 他の実施態様においては、VEGFと基質との結合に化学結合が関与する。化学結
合としては、例えば、共有結合、複数の非共有結合的化学相互作用(noncovalent
chemical interaction)、あるいは共有結合と非共有結合的化学相互作用との組
合せがある。非共有結合的化学互作用としては、例えば水素結合、ファンデルワ
ールス相互作用、イオン相互作用、および分子内転位などがあり、これらは例え
ば、抗体-抗原結合、特異的な結合蛋白質-受容体結合、および酵素-基質結合を 特徴とする。言い換えると、反応物または結合剤は、VEGFと基質との直接的な化
学的相互作用を形成させる(おそらくはリンカー分子が関与している)ために使用
される。VEGFの化学結合は、生理学的pHまたはその付近(好ましくは約6〜約8.5 、さらに好ましくは約6.3〜約7.4)にて行うのが好ましい。
【００４６】 VEGFの化学結合は、反応性試剤(例えば、グルタルアルデヒドや他の一般的な 架橋剤)による基質表面への共有結合を含んでよい。基質表面へVEGFを化学結合 させるための典型的な手順ではグルタルアルデヒドが使用される。グルタルアル
デヒドが、2つのアルデヒド基によって蛋白質を架橋する。グルタルアルデヒド は通常、ある種の生物学的適合性物質の固定のために使用されるので、VEGFを生
物学的適合性物質に結合させるための非特異的な架橋を組織の固定と同時的に行
うことができる。これとは別に、VEGFを共有結合的に結合させるための非特異的
な架橋は、固定プロセス(固定工程が実施される場合)の完了前または完了後に別
個の工程として行うこともできる。VEGFを基質に共有結合させるための他の化学
試剤としては、例えばエポキシ化合物がある。
【００４７】 架橋剤によるVEGFの基質への結合は、VEGFの不活性化を防ぐよう、注意深く制
御された条件下で行うのが好ましい。架橋は特に、架橋剤(例えばグルタルアル デヒド)の希薄溶液を使用して行うのが好ましい。架橋は、約0.1%未満の架橋剤 濃度で行い、約0.05%未満の架橋剤濃度で行うのが好ましく、約0.005%〜約0.02%
の架橋剤濃度で行うのがさらに好ましい。当該分野における従来からの使用状況
にしたがって、パーセント値は、高濃度容量%原液(一般には50容量%原液)のv/v 希釈(a volume per volume dilution)に基づいている。
【００４８】 架橋は少なくとも約5分行われ、一般には約15分から約24時間あるいはそれ以 上行われる。特に、基質へのVEGFの架橋は約1時間未満行うのが好ましく、約15 分から約30分行うのがさらに好ましい。VEGFの結合の程度(VEGFが、インビトロ にて内皮細胞の増殖を刺激する能力により示される)は、架橋時間に対して比較 的速やかに安定する。好ましい架橋時間は、本明細書の開示内容に基づいて経験
的に評価することができる。
【００４９】 本明細書に記載の好ましい温和な条件下では、組織は通常、それほど著しくは
固定されない。必要であれば、VEGFとグルタルアルデヒドの同時的なインキュベ
ーション時にサイズ排除膜(a size exclusion membrane)(例えば透析用チューブ
)を使用することができる。例えば、分子量10,000のカットオフを有する透析用 チューブを使用して、基質とVEGF溶液を比較的少ない体積にて収容することがで
きる。基質とVEGFとを含んだこのチューブをグルタルアルデヒドの希薄溶液中に
浸漬することができる。グルタルアルデヒドは透析用チューブを透過できるが、
VEGF溶液は、VEGFの分子サイズがより大きいためにチューブ内に留まる。この手
順では、わずかな体積のVEGFと比較的多めの体積の架橋剤溶液を使用すればよい
。
【００５０】 一方、VEGFの基質への化学結合には、特異的な結合反応を関与させることがで
きる。したがって適切に選択すれば、こうした特異的な結合反応を使用して基質
内の特定の場所を標的とすることができる。特定の場所を標的とすることは、例
えば、特定の場所が内皮細胞による転移増殖を受けにくいという場合、あるいは
内皮細胞による転移増殖が特定の場所において特に有益であるという場合には有
用なこととなる。可能な標的場所の1つの例は心臓弁プロテーゼの小葉であろう 。
【００５１】 ある特定の場所を標的とする1つの方法は、天然組織内の特定の細胞結合部位 もしくは細胞外結合部位を標的とするリンカーの使用を含む。特定の実施態様に
おいては、リンカーはVEGF分子に共有結合しており、またリンカーが複数の非共
有結合的相互作用によって組織と結びついている。これとは別に、リンカーが組
織に共有結合していてもよく、またVEGFが複数の非共有結合的相互作用によって
リンカーと結びついていてもよい。種々の市販の抗体や他の特異的結合用試剤も
リンカーとして使用することができる。これとは別に、従来の方法によって抗体
を製造することもできる。
【００５２】 結びついた抗体または他の類似の標的決定用分子を有するVEGFポリペプチド、
あるいはVEGFポリペプチドと標的決定用分子の工学的処理キメラ(engineered ch
imera)は、本出願の目的に対しVEGF分子であると考えられる。抗体への化合物の
化学結合ならびにキメラの発現は、特に化合物が蛋白質である場合に確実に形成
される。VEGF分子の活性が大幅に損なわれないよう、経験的な調整を行ってよい
。
【００５３】 他の実施態様においては、共有結合によるカップリングを起こさせるために光
化学的カップリングを使用することができる。光化学的カップリングは、高エネ
ルギー光(例えば紫外線)を使用して、特定の官能基をもつ反応性中間体を形成さ
せることに基づいている。これらの反応性中間体は、2つの組成物間に炭素-炭素
結合を形成することができる。この点に関しては、アリールケトン官能基が特に
有用である。
【００５４】 VEGFを組織に結びつけるのに光化学的カップリングを使用することができる。
例えば、Dunkirkらによる"J. Biomaterials Applications 6: 131-156 (1991)" を参照のこと(該文献を参照により本明細書に含める)。光化学的カップリングも
通常は組織を架橋するので〔すなわち光固定(photofixation)〕、組織を別個に 架橋してもよいし、あるいはそうしなくてもよい。これとは別に、光化学的カッ
プリングを使用して、リンカーをVEGFポリペプチドに結合する前、結合させた後
、あるいは結合時に、リンカーを組織に結びつけることができる。
【００５５】 相互作用の性質に関係なく、結合したVEGFは通常、結合していない分子と平衡
状態にある。その結果、周囲溶液(surrounding solution)が補充されれば、VEGF
は最終的にはその周囲溶液へと失われるであろう。幾つかの応用に対し、関連し
た時間中に充分な量の生存可能な内皮細胞が組織上に増殖する場合は、VEGFが比
較的短時間(例えば数時間または数日)結合していれば充分である場合がある。他
の状況においては、より長い期間(例えば数ヶ月または数年)にわたってVEGFが組
織に結合しているのが望ましいこともある。これらの状況に応じて、VEGFと組織
との結合の性質を選択することができる。
【００５６】 D. 他の変性剤 他の分子を、VEGFのほかに基質にも結合させて、プロテーゼにおける基質の性
能を改良するのが望ましいことがある。VEGFと基質との結合による内皮化によっ
て、石灰化と感染が起こりにくくなることがある。それでもやはり、石灰化が生
物学的補綴組織に対する主要な破綻モードであるので、VEGFを生物学的適合性の
抗石灰化処理剤と組み合わせて使用することができる。したがって、石灰化およ
び/または細菌感染をより一層少なくするよう作用する薬剤を含むのが望ましい 。
【００５７】 エタノールは実績のある抗石灰化処理剤であり、Vyavahareらによる"Circulat
ion 95: 479-488 (1997)"(該文献を参照により本明細書に含める)およびLevyら による米国特許第5,746,775号(該特許を参照により本明細書に含める)に記載さ れている。エタノールとVEGFを一緒に使用することにより、長期間にわたって生
存可能な組織の製造が容易となり、このときエタノールは石灰化の早い開始を遅
らせ、VEGFは生存可能な内皮層を刺激する。実施例4は、若年性ラットの皮下イ ンプラントモデルにおける、エタノール処理剤の、グルタルアルデヒド架橋した
豚の大動脈弁小葉の石灰化を阻害する能力を明らかにしている。本実施例はさら
に、エタノールだけでなくVEGFと共にこれら小葉を処理することにより、石灰化
をさらに減少させることができるということを示している。さらに、アルミニウ
ムイオン、鉄イオン、およびマグネシウムイオンが石灰化を減少させることがわ
かっている。Levy1らによる米国特許第5,094,661号(該特許を参照により本明細 書に含める)に記載のように、これらの多価イオンは組織に直接結合させること ができる。
【００５８】 特定の好ましい実施態様においては、多価カチオンを基質の一部だけに結合さ
せる。特に、組織心臓弁の場合は、小葉をイオンで処理しないままにしておいて
、イオンを弁壁体(例えば、大動脈弁のための大動脈壁体)だけに結合させるのが
望ましいことがある。組織弁全体をVEGFで処理するのが好ましい。プロテーゼの
一部だけを溶液(例えば、多価イオンを含有する溶液)で処理することについては
、"補綴装具の特異的処置法"と題する、同時係属中で同一人に譲渡された、Will
iamsらによる米国特許出願第08/850,812号(該特許文献を参照により本明細書に 含める)において詳細に記載されている。
【００５９】 これとは別に、多価イオンを外来性貯蔵構造物(exogenous storage structure
s)と結合させることができ、そしてさらにこの構造物を基質と結合させることも
できる。外来性貯蔵構造物を抗石灰化用金属イオンを貯蔵するために使用するこ
とについては、同時係属中で同一人に譲渡された米国特許出願第08/595,402号と
第08/690,661号(これら2つの特許文献を参照により本明細書に含める)に記載さ れている。同様に、特定の金属(例えば銀)が抗菌活性をもたせた状態で結びつけ
られている。同時係属中で同一人に譲渡された米国特許出願第08/787,139号(該 特許文献を参照により本明細書に含める)に記載のように、外来性貯蔵構造物を 使用して、適切な抗菌性金属イオンを基質と結びつけた状態で貯蔵することがで
きる。好ましい外来性貯蔵構造物としては、例えば、フェリチンや他の金属貯蔵
蛋白質などがある。外来性貯蔵蛋白質は、VEGFに対して使用した方法と類似の方
法にて基質と結合させることができる。抗菌活性は互いに阻害するようなもので
あってはならない。
【００６０】 E. 内皮細胞のインビトロ付着 患者の体内に埋め込む前のプロテーゼ上への生存可能な細胞の成長は、VEGFと
基質とを結合することによってインビトロで促進させることができる。移植組織
に対する拒絶反応の可能性を少なくするために、インビトロでの内皮化のために
使用される内皮細胞は自己細胞(すなわち最終レシピエントからの細胞)であるの
が好ましい。適切な細胞は、例えば患者の脂肪組織から採取することができる。
採取プロセスは、脂肪吸引およびその後のコラゲナーゼ温浸と微小血管内皮細胞
の精製を含んでよい。適切な方法が、S. K. Williamsによる「"Endotherial Cel
l Transplantation", Cell Transplantation 4: 401-410 (1955)」(該文献を参 照により本明細書に含める)、ならびに米国特許第4,883,755号、第5,372,945号 、および第5,628,781号(これら3つの特許文献を参照により本明細書に含める)に
詳細に記載されている。精製した内皮細胞を、自己血清を加えて適切な成長媒体
〔例えばM199E(ミズーリ州セントルイスのシグマ・セル・カルチャー社)〕中に 懸濁させることができる。
【００６１】 結合したVEGFを含む補綴組織を撹拌状態の細胞懸濁液中で数時間〜数日インキ
ュベートして、内皮細胞の播種(seeding)を起こさせることができる。細胞の播 種により内皮細胞のランダムな付着がもたらされ、このとき内皮細胞は、患者の
体内に埋め込む前でも、あるいは患者の体内に埋め込んだ後でも補綴基質の表面
を被覆するように増殖することができる。これとは別に、補綴基質を圧力勾配下
にて数分インキュベートして細胞のソッディング(sodding)を促進させることが できる。細胞のソッディングのための適切な方法は、S. K. Williamsによる前記
論文中における代用血管に関して記載の手順から取り入れることができる。細胞
のソッディングにより、補綴組織の表面上に細胞の単一層を生成させることがで
きる。
【００６２】 さらに、隣接したプラスチック組織培養表面から補綴基質の表面上に患者の内
皮細胞が移行することが可能な培養系中に補綴組織を配置することもできる。内
皮細胞の付着または移行が、生理学的なせん断応力を含んだ条件下で行われる場
合、基質の表面に転移増殖する内皮細胞は、埋め込まれた後に細胞がより頑強に
接着するのを可能にするような適切な接着蛋白質を発現させることがある。
【００６３】 F. 貯蔵、包装、分配、および使用 VEGFを基質に結合させた後に、基質(おそらくはプロテーゼに形成される)を貯
蔵することができる。基質をより長期にわたって貯蔵しようとする場合は、生存
可能な細胞の内方成長が起こらないのが好ましい。好ましい貯蔵法は、細菌汚染
の危険性を最小限に抑えるような貯蔵法である。例えば、変性を施した基質は、
無菌の緩衝液および/または塩水と共にシールされた容器中に貯蔵することがで きる。
【００６４】 シールされた容器においては、変性された基質は液体の継続的な供給を受けな
い。それでもやはり、貯蔵中に基質からVEGFまたはVEGFの活性が失われる可能性
があることを考慮しておかなければならない。過剰な消失が起こるおそれがある
場合は、消失が許容しうるレベルに保持されるよう貯蔵時間を適切に制限するこ
とができる。
【００６５】 分配しやすいように、プロテーゼは通常、シールされた無菌の容器中に入れる
。適切な最大貯蔵時間がわかるように容器に日付をつけることができ、これによ
ってVEGF活性の起こりうる消失もしくは劣化の状況がわかる。容器は、プロテー
ゼの手術移植のための医療専門家に分配される。VEGF変性プロテーゼと細胞との インビトロ 結合は、細胞培養系にて使用すべく患者の細胞を切除することができ
るような病院で行うのが好ましい。
【００６６】 上記の貯蔵・分配アプローチの代わりに、VEGF変性を病院で行ってもよいし、
あるいは必要であれば製造場所とは離れた他の場所で行ってもよい。こうした状
況下では、VEGF変性用に調製されたプロテーゼが分配され、VEGFの結合はあとで
行う。プロテーゼがVEGFでいったん変性されれば、これを埋め込むことができる
し、妥当な期間(最大１ヶ月またはそれ以上)にわたって貯蔵することができるし
、あるいは細胞培養系中に導入して、VEGF変性プロテーゼに対する細胞(好まし くは自己細胞)の親和性を高めることもできる。
【００６７】 特定の好ましい実施態様においては、調製されたプロテーゼ、VEGF溶液、およ
び架橋用溶液(必要な場合)を別々の容器に入れて(一緒に使用すべく調整された キットとして、あるいは望ましい組合わせで使用するための別個の物品として) 出荷する。特に、VEGF溶液は、基質をVEGFで変性するための使用説明書と共に出
荷することができる。プロテーゼと溶液は、使用する直前に組合わせて処理する
。プロテーゼを溶液中で所定時間インキュベートした後、溶液からプロテーゼを
取り出し、無菌の塩水ですすぎ洗いし、そして患者の体内に移植する。
【００６８】 VEGFをプロテーゼ中に組み込んで基質の内皮化を促進させるためには、移植後
の基質の生体適合性が改良されなければならない。特に、静止性の(quiescent) 内皮細胞単層は、感染、炎症、および石灰化に対するバリヤーとして機能するこ
とができる。プロテーゼの内皮化はさらに、プロテーゼと細胞とのさらなる再細
胞形成(recellularization)を促進することができ、これによって組織の修復と 造り直しが可能となる。したがって、プロテーゼの耐久性と寿命を大幅に向上さ
せることができる。最後に、こうした再細胞形成により、天然の生物学的要求に
適った組織に極めて類似したプロテーゼを得ることができる。
【００６９】 実施例1 - 直接的なVEGFの結合 本実施例では、VEGFが架橋した組織と結合する能力、およびこれに対応してVE
GFが生存可能な内皮細胞と組織との合体を刺激する有効性について示す。
【００７０】 幾つかの溶液を調製した。グルタルアルデヒド溶液は、19.3gのNaCl、70.0gの
クエン酸ナトリウム、2.5gのクエン酸、50mlの50容量%グルタルアルデヒド(ペン
シルバニア州フォート・ワシントンのエレクトロン・スペクトロスコピー・サイ
エンス社)、および充分な量の逆浸透精製水(RO水)を加えることによって5リット
ル体積として調製した。VEGF溶液は、VEGFの50μg/ml原液(ヒトの組換えVEGF165 、ミネソタ州ミネアポリスのR&Dシステムズ社)を5mlの30mM HEPES緩衝塩水(HBSS
、カリフォルニア州サンディエゴのクローンティクス社から市販)で希釈して、1
00ng/mlの最終濃度となるようにして調製した。HEPES緩衝塩水は、17.4gのNaCl と35.7gのHEPES遊離酸を3リットルのRO水に加えることによって調製した。80%エ
タノール溶液は、1.8gのNaCl、3.8gのHEPES遊離酸、1684mlの95%エタノール(ミ ネソタ州セントポールのウォラムケミカル社、カタログ番号200115)、および316
mlのRO水を混合して2リットルの溶液とすることによって調製した。溶液はいず れも、使用前に無菌濾過した。
【００７１】 サンプルを調製するために、採取した豚の心臓弁から75個の豚の心臓弁小葉を
取り出した。これらの小葉を0.9%の無菌塩水中にて4℃で一晩貯蔵した。次いで 、クエン酸塩緩衝によるグルタルアルデヒド溶液中で少なくとも６日間、小葉を
グルタルアルデヒド架橋した。架橋処理中に２回(24時間後と3日後)、グルタル アルデヒド溶液を替えた。架橋した小葉を、HEPES緩衝によるグルタルアルデヒ ド中にて室温で、5日間貯蔵した後にエタノールで処理するか(35個の小葉)、あ るいは46日間貯蔵した(40個の小葉)。
【００７２】 上記のように、35個の小葉をグルタルアルデヒドから取り出し、エタノールで
処理した。グルタルアルデヒドから取り出した後、これらの小葉を500mlのHEPES
緩衝塩水中で10分間インキュベートした。この塩水を注ぎ出し、小葉を500mlの 新たなHEPES緩衝塩水中でさらに15分インキュベートした。この第2の塩水を除去
した後、小葉を80%エタノールで一回すすぎ洗いし、次いで500mlの80%エタノー ル溶液中に15分浸漬した。第1のエタノール溶液を同量500mlの新たな80%エタノ ール溶液で置き換え、小葉をこの第2のエタノール溶液中にて室温で約24時間イ ンキュベートした。
【００７３】 エタノール中での24時間後、小葉をHEPES緩衝塩水ですすぎ洗いし、HEPES緩衝
塩水中に15分浸漬した。HEPES緩衝塩水を新たに取り替えた後、小葉をHEPES緩衝
塩水中に24時間浸漬した。HEPES緩衝塩水を収容する貯蔵容器に小葉を移した。 貯蔵容器中の小葉を、ステリジェニクス社(サウスカロライナ州シャーロット)に
よるγ線滅菌法にて処理した。γ線照射により、HEPES緩衝塩水中の小葉は褐色 に変わった。滅菌処理の後、使用するまでは4℃にてこの容器中に小葉を貯蔵し た。
【００７４】 エタノール処理したグルタルアルデヒド架橋小葉と、エタノール処理していな
いグルタルアルデヒド架橋小葉とを貯蔵容器から取り出し、半分にカットした。
カットした小葉を100mlの0.9%無菌塩水で3回すすぎ洗いした。すすぎ洗いの後、
エタノール処理した小葉半分カット品(leaflet halves)のうちの6個と、エタノ ール処理していない小葉半分カット品のうちの6個とを、100ng/mlのVEGFを含有 するHBSS中でインキュベートした。小葉は、VEGF溶液中で4℃にて一晩インキュ ベートした。
【００７５】 2%ゼラチン(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社)とEGM培地(カリフォ
ルニア州サンジエゴのクローンティクス社)とを使用して6個のウェルの付いた4 枚のプレートを作製し、これにより細胞の成長を支えた。クローンティクス社か
らのヒト臍帯血管の内皮細胞(HUVEC)(ロット#2803)を、24個のウェルのそれぞれ
において集密状態(confluence)に成長させた。集密状態を達成してから24時間後
に、殺菌処理したラバー・ポリスマン(rubber policeman)を使用して、各ウェル
の中心から細胞をこすり取った。細胞破片を含有する培地を取り出し、新たなEG
M培地で置き換えた。各ウェルを光学顕微鏡法によって調べて、細胞が各ウェル の中心から除去されていることを確認した。
【００７６】 小葉半分カット品を各プレートのこすった透明中心部に置き、通常のEGM培地 または10ng/mlのVEGFを含有するEGM培地を下記のプロトコルにしたがって加えた
。
【００７７】 1) 小葉なし、VEGFを含まない培地(3個のウェル) 2) 小葉なし、VEGFを含んだ培地(3個のウェル) 3) エタノール処理した小葉、VEGFを含まない培地(4個のウェル) 4) エタノール処理した小葉、VEGFを含んだ培地(4個のウェル) 5) エタノールとVEGFで処理した小葉、VEGFを含まない培地(4個のウェル) 6) エタノールで処理していない小葉、VEGFを含まない培地(2個のウェル)お よび 7) VEGFで処理してエタノールで処理していない小葉、VEGFを含まない培地(4
個のウェル) VEGFで予備処理していない小葉半分カット品を、前述のように無菌の塩水で3 回すすぎ洗いした。VEGFで予備処理した小葉は、VEGFでの処理の前にすすぎ洗い
しておき、ウェル中に配置する前にはさらなるすすぎ洗いは行わなかった。
【００７８】 各ウェルの内部に配置された組織培養インサートのトップ膜(top membrane)上
にHUVECが培養される、という6個のウェルの付いた第5のプレートを使用した。 この膜上の細胞がいったん集密状態を達成したら、外科用のメスを使用して、各
インサート膜の中心部に孔をカットした。各ウェルの底部に小葉を置き、インサ
ート膜中の孔の端が小葉の上に載るように、インサートを小葉上に配置した。各
ウェルに2mlのEGM培地を充填した。このプレート上にて、2個の小葉に対しては エタノール処理した後にVEGF処理を行わず、2個の小葉に対してはエタノール処 理した後にVEGF処理を行い、そして2個の小葉に対してはVEGF処理をしたがエタ ノール処理は行わなかった。
【００７９】 約5時間後に、5つのプレートの全てのウェル中の培地を取り替えた。次いで、
1日ごとに新たな培地を加えて、合計約5日間にわたって細胞を成長させた。4日 後、光学顕微鏡を使用して全てのウェルを調べた。小葉は不透明であるので、こ
の方法は小葉に結合した細胞を見ることはできなかった。インサート膜も不透明
であったので、インサートの上に成長した細胞を見ることもできなかった。この
ような制約のもとに、下記のような観察が得られた: 1) 小葉を収容していないウェル中で成長した細胞が成長を再開してこすった
透明部分を覆い、再び集密状態になった; 2) さらなる処理を施していないグルタルアルデヒド小葉を収容しているウェ
ル中の細胞の殆どが死滅した; および 3) エタノール処理した小葉は細胞毒性ではないようであった。
【００８０】 5日後、組織サンプルの半分を、Dubeccoリン酸塩緩衝塩水(ニューヨーク州グ ランドアイランドのGibco BRL)で2回すすぎ洗いした。すすぎ洗いしたサンプル を、3%ホルムアルデヒド溶液で少なくとも5分固定した。固定したサンプルを、R
O水で3回および0.25Mスクロースで1回すすぎ洗いした。
【００８１】 オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ社(Molecular Probes Inc.,)
から市販の、蛍光性で親油性のプローブである過塩素酸ジオクタデシルテトラ メチルインドカルボシアニン(カタログ番号D-282)の5mM原液を、1.5mlのミクロ 遠心分離管(microcentrifuge tube)中にて0.00467gのDiI粉末を1mlの硫酸ジメチ
ル(DMS)に加えることによって調製した。DiIは細胞膜染料である。ミクロ遠心分
離管を渦流混合して粉末を溶解した。ミクロ遠心分離管をアルミ箔で包んで室温
にて貯蔵し、光源からの光が当たらないようにした。DiIの50μM溶液は、遠心分
離管中にて150μlの5mM原液を15mlの0.25Mスクロース溶液に加えることによって
調製した。遠心分離管を渦流混合して均一溶液にした。希薄DiI溶液は、使用す る日に新たにした。
【００８２】 ウェル中のすすぎ洗いした各小葉を充分な量の50μM DiI溶液で覆うことによ って、組織サンプルを蛍光を発現するよう染色した。プレートをアルミニウム箔
で被覆して、光に対する暴露を避けた。小葉を少なくとも約15分(但し、約25分 以下)染色した。次いでサンプルをRO水で4回すすぎ洗いした。すすぎ洗いの後、
各サンプルに0.9%塩水を加えてサンプルが乾燥するのを防止し、サンプルをアル
ミニウム箔で被覆して実験前の脱色を防止した。染色した組織サンプルを、テト
ラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)フィルターを使用して画像化し 、写真に撮った。
【００８３】 エタノール処理した小葉上に細胞は成長せず、また膜インサートと接触状態に
あるサンプル上に成長した幾つかの細胞を除けば、エタノール処理していない小
葉上にも細胞は成長しなかった。同様に、10ng/mlのVEGF溶液は、細胞と組織と の親和性を高めなかった。TRITCフィルターを通して調べたとき、細胞の存在し ない小葉にはバックグラウンドの蛍光だけが観察された。VEGFが表面に吸着して
いる小葉は、小葉に結合した状態の、明るく輝く蛍光を発生する細胞のコロニー
を有しており、このことは、小葉への内皮細胞の移行と小葉に対する接着が刺激
されていることを示している。このことは、膜インサート上にて内皮細胞と直接
接触している代表的な小葉に関し図1において、また最初は内皮細胞のないウェ ルのセクションに配置された代表的な小葉に関し図2において見ることができる 。インサートを使用しても、定性的にみれば結果は変わらなかった。
【００８４】 グルタルアルデヒド架橋した小葉を100ng/mlのVEGF中でインキュベートした他
の実験の場合も類似の結果が観察された。VEGFは特に、5〜30日間の培養に対し てHUVECの転移増殖とヒト大動脈の内皮細胞の転移増殖を促進した。さらなる実 験により、VEGFと共にインキュベートする前にHEPES緩衝グルタルアルデヒド溶 液中に１ヶ月未満貯蔵された小葉にVEGFを接着させたときにVEGFが最も有効であ
ることがわかった。
【００８５】 実施例2 - エタノール処理と架橋を施した組織へのVEGFのグルタルアルデヒド 架橋 本実施例では、低濃度のグルタルアルデヒド溶液が、内皮細胞の増殖と走化性
を刺激するというVEGFの能力を失わせることなく、エタノール処理とグルタルア
ルデヒド架橋を施した組織にVEGFを効果的に架橋するということを示す。
【００８６】 溶液は全て使用する日に新たに調製し、0.25μmのフィルターを通して濾過し た。HEPES緩衝塩水は、0.1M のNaClと50mMのHEPESを逆浸透精製水(RO水)中に溶 解して得た。HEPES緩衝塩水のpHを7.4に調節した。グルタルアルデヒドの50容量
%原液(ペンシルバニア州フォートワシントンのエレクトロン・マイクロスコピー
・サイエンス社)20μlを100mlのHEPES緩衝塩水に加えることによって、0.01%グ ルタルアルデヒド溶液を調製した。2μgのVEGF(ヒトの組換えVEGF165、ミネソタ
州ミネアポリスのR&Dシステムズ社)を20mlの0.01%グルタルアルデヒド溶液に加 えることによって、100ng/mlのVEGFと0.01%のグルタルアルデヒドを含むVEGF/グ
ルタルアルデヒド溶液を調製した。
【００８７】 グルタルアルデヒド架橋とエタノール処理を施した8個の小葉を実施例1に記載
のように調製し、無菌の塩水ですすぎ洗いした。3個の小葉をVEGF/グルタルアル
デヒド溶液中で15分インキュベートし、3個の小葉をVEGF/グルタルアルデヒド溶
液中で30分インキュベートした。残りの2個の小葉は、対照標準として使用すべ くHEPES緩衝塩水中に貯蔵した。インキュベーション時間の終了後、1回のすすぎ
洗いに対して2分かけて、小葉を0.9%塩水中で3回すすぎ洗いした。
【００８８】 処理された小葉をインキュベートする数日前に、6個のウェルの付いた組織培 養プレート2枚を2%ゼラチンで被覆し、ヒト大動脈の内皮細胞(カリフォルニア州
サンディエゴのクローンティクス社)を接種した。新たな内皮成長培地(EGM)(カ リフォルニア州サンディエゴのクローンティクス社)を1日おきに加えて、内皮細
胞を集密状態にまで成長させた。組織サンプルを組織培養プレートに加える前に
、各組織培養ウェルの中心部分をこすって内皮細胞が存在しないようにした。各
ウェルをEGMで2回すすぎ洗いして細胞の破片を除去した。
【００８９】 VEGFとのインキュベーションと小葉のすすぎ洗いのすぐ後に、小葉をウェルの
清浄部分配置した(ウェル1つ当たり小葉1個)。無菌の組織培養インサート(ミズ ーリ州セントルイスのシグマケミカル社)を小葉の上に配置して、小葉が浮くの を防止した。1日おきに新たなEGMをウェルに加えた。5日後、小葉を3%ホルムア ルデヒド中に配置して、小葉の表面に接着していたいかなる細胞も固定した。次
いで小葉を、実施例1に記載のように、蛍光性で親油性のプローブである過塩素 酸ジオクタデシルテトラメチルインドカルボシアニン(オレゴン州ユージーンの モレキュラー・プローブ社)で染色した。
【００９０】 染色したサンプルをテトラメチルローダミンイソチオシアネートフィルターを
使用して画像化し、写真に撮った。VEGF/グルタルアルデヒド溶液中にて15分(図
3B)または30分(図3C)インキュベートした小葉は、対照標準の小葉(図3A)に比較 して、小葉の表面をコロニー化している相当数の内皮細胞を有していた。したが
って、エタノール処理した小葉の表面にVEGFを架橋するのに0.01%グルタルアル デヒドを使用しても、当該小葉をコロニー化している内皮細胞に対しては細胞毒
性を示さないようであった。VEGFはさらに、処理した組織の内皮細胞コロニー化
を促進させるのに効果的であった。これらの状況下では、小葉のエタノール処理
がVEGFの結合を妨げないことは明らかである。なぜなら、グルタルアルデヒド架
橋した組織のエタノール処理は、生物学的適合性を向上させること、および移植
後の組織の石灰化を阻害することがあらかじめわかっているからである。
【００９１】 インビトロアッセイを使用して、ヒト大動脈の内皮細胞が未処理の又は処理を
施したグルタルアルデヒド架橋組織をコロニー化する能力を比較する、という他
の実験においても類似の結果が観察された。図4Aと5Aに示すように、エタノール
処理またはVEGF処理を施していないグルタルアルデヒド架橋組織は、ヒト内皮細
胞の成長に対しては不適切な基質であった。図4に示する顕微鏡写真は、組織に 接着した細胞を3%ホルマリンで固定し、そして蛍光染色した後に得たものである
。図5に示す顕微鏡写真は、組織に接着した細胞を、リン酸塩緩衝剤を含んだ2% グルタルアルデヒド溶液で少なくとも24時間固定した後に得たものである。次い
で組織をエタノールで連続的に脱水し、そして最終的にはヘキサメチルジシラザ
ンで脱水した。サンプルをSEMスタブ(stub)に付着させ、金パラジウム(gold pal
ladium)で被覆した。日立(商標)450走査電子顕微鏡を使用して、組織サンプルを
画像化した。
【００９２】 実施例1に記載のようにグルタルアルデヒド架橋組織を80%エタノール中でイン
キュベーションすると、エタノール処理した組織が内皮細胞のより大きなコロニ
ーをサポートするようになる(図4Bと5Bに示す)、というように生物学的適合性が
改良される。しかしながら、これらサンプルの走査電子顕微鏡写真から、エタノ
ール処理した組織に接着している内皮細胞が、ゆるく接着した細胞または乾燥し
ている細胞に関して丸みを帯びたモルホロジー特性を有する(図5B)ということが
わかる。エタノール処理した小葉が、前述のように100ng/ml VEGF/0.01%グルタ ルアルデヒドの溶液中でさらに30分インキュベーションを受けると、VEGF処理さ
れた組織はより速やかで完全な内皮化が可能となる(図4Cと5C)。他の処理グルー
プにおいて見られる細胞とは対照的に、VEGF処理した組織に接着している内皮細
胞がより顕著に広がっていることが走査電子顕微鏡写真からわかる(図5C)。この
広がった状態のモルホロジーは、より健全な内皮細胞のライニングを示している
。
【００９３】 実施例3 - 新たな組織へのVEGFのグルタルアルデヒド架橋 本実施例では、低濃度(0.01%)のグルタルアルデヒド溶液を使用して、VEGFが 内皮細胞の増殖と走化性を刺激する能力を失わせることなく、VEGFを豚の新たな
大動脈小葉組織に結合できることを示す。
【００９４】 HEPES緩衝塩水、0.01%グルタルアルデヒド溶液、およびVEGF/グルタルアルデ ヒド溶液を実施例2に記載のように調製した。6個の豚の大動脈小葉を、無菌の外
科的方法を使用して採取し、0.9%の無菌塩水中ですすぎ洗いした。2つの小葉を1
0mlのHEPES緩衝塩水溶液中でインキュベートした。他の2つの小葉を10mlの0.01%
グルタルアルデヒド溶液中でインキュベートした。残りの2つの小葉を10mlのVEG
F/グルタルアルデヒド溶液中でインキュベートした。全ての小葉をそれぞれの溶
液中で30分インキュベートした。30分のインキュベーション時間の終了後、小葉
を100mlの0.9%無菌塩水中で3回すすぎ洗いした。それぞれのすすぎ洗いを2分間 行った。
【００９５】 小葉を処理する数日前に、2%ゼラチンで被覆した6個のウェル付きの組織培養 プレートにヒト大動脈の内皮細胞(カリフォルニア州サンディエゴのクローンテ ィクス社)を接種した。内皮細胞を成長させて集密状態にし、1日置きにウェルに
新たなEGM(カリフォルニア州サンディエゴのクローンティクス社)を加えた。小 葉に対する30分のインキュベーション時間中、各組織培養ウェルの中心部分をこ
すって内皮細胞が存在しないようにした。次いでウェルを新たなEGMですすぎ洗 いして細胞破片を除去した。30分間のインキュベーションとそれに続くすすぎ洗
いのすぐ後に、1個の小葉を各組織培養ウェルの清浄部分に配置した。無菌の組 織培養インサート(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社)を小葉の上に配
置して小葉が浮き上がるのを防止した。新たなEGMを加え、組織培養プレートを 組織培養インキュベーターに戻した。
【００９６】 新たなEGMを1日おきにウェルに加えた。インキュベーションを5日間続けた。 インキュベーション終了後、小葉の表面に接着した細胞を3%ホルムアルデヒドで
固定した。次いで小葉を、実施例1に記載のように、蛍光性で親油性のプローブ である過塩素酸ジオクタデシルテトラメチルインドカルボシアニン(オレゴン州 ユージーンのモレキュラー・プローブ社)で染色した。
【００９７】 染色した組織サンプルを、テトラメチルローダミンイソチオシアネートフィル
ターを使用して画像化し、写真に撮った。写真を図6A〜6Cに示す。HEPES緩衝塩 水中または0.01%グルタルアルデヒド中でインキュベートした組織上に、内皮細 胞の幾つかのコロニーが観察された。VEGF/グルタルアルデヒド溶液中でインキ ュベートした小葉では、組織をコロニー化している内皮細胞がより多かった(図6
Cと図6Aおよび6Bとを比較することによってわかる)。したがって、100ng/mlのVE
GFを含有する0.01%グルタルアルデヒドという緩衝溶液中でのインキュベーショ ンは、ヒトの大動脈の内皮細胞の生存に対して悪影響を及ぼさず、豚の大動脈組
織の内皮細胞による被覆を促進した。
【００９８】 実施例4 - 小葉石灰化のVEGFによる阻害 本実施例では、グルタルアルデヒド架橋した豚の大動脈弁小葉をVEGFとエタノ
ールで組合わせ処理することにより、小葉の石灰化が阻害できる(若年性ラット の皮下インプラントモデルにて評価した)ことを示す。
【００９９】 若年性ラットの皮下インプラントモデルは、臨床的に関連した心臓弁の石灰化
によく似ていることが報告されている(Levyらによる"Am. J. Pathol. 113:143-1
55 (1983))。したがってこのモデルを使用して、種々のプロセスまたは表面変性
を受けた小葉の石灰化可能性について評価した。
【０１００】 全ての溶液の調製とこれら溶液中での小葉の処理は、実施例1と2に詳細に記載
したように行った。簡単に言えば、45個の小葉を豚の大動脈弁から採取し、0.5%
のクエン酸塩緩衝剤を含んだグルタルアルデヒド中で架橋させた。15個の小葉( 対照標準グループ)を移植の直前までHEPES緩衝塩水中に貯蔵した。残りの30個の
小葉を80%エタノール溶液中で24時間インキュベートし、γ線の照射による殺菌 処理を施した。γ線の照射中および照射後、小葉をHEPES緩衝塩水中に貯蔵した 。エタノール処理した小葉のうちの15個(エタノール/VEGFグループ)を、移植当 日に0.01%グルタルアルデヒド/100ng/ml VEGF溶液の溶液中で30分インキュベー トした。
【０１０１】 移植の前に全ての小葉を、100mlの0.9%無菌塩水中で3回すすぎ洗いした(1回の
すすぎ洗い当たり約2分かけた)。無菌法(aseptic technique)を使用して小葉を 無菌の着色縫合糸でコード化し、これにより小葉を3つのグループ(白色=対照標 準グループ、緑色=エタノールグループ、黒色=エタノール/VEGFグループ)のそれ
ぞれと識別した。コード化した小葉を無菌の塩水中で貯蔵し、ミネソタ州セント
ポールのリージョンズ病院(Regions Hospital)におけるラムゼイ・アニマル・ラ
ボラトリー(Ramsey Animal Laboratory)に輸送し、そこで皮下移植を行った。
【０１０２】 外科的処置は無菌状態のもとで行った。3週齢の雄性Sprague-Dawleyラットに 対し塩酸ケタミンの腹膜間注射により麻酔をかけ、各ラットの腹部中央壁に少な
くとも直径2cmの4つの皮下嚢を切り開いた。各ラットの皮下嚢中に4個の小葉を 移植した(嚢1つ当たり1個の小葉)。いずれのラットに対しても、それぞれの処理
グループから少なくとも1個の、しかしながら2個以下の小葉を移植した。創傷を
外科用ステープルで閉じ、ラットを回復させた。小葉を21日間(各処理グループ に対して10個の小葉)または63日間(各処理グループに対して5個の小葉)埋め込ん
だ。移植期間の終了後、ラットからサンプルを取り出した。回収したサンプルを
無菌の塩水中に保管し、分析のため輸送した。
【０１０３】 各組織サンプルを半径軸に沿って半分に区分けした。組織サンプルの一方の半
分から、移植時の包み込みレスポンス(encapsulation response)により生じる宿
主組織を取り除いて清浄にし、脱水処理を施した。脱水したサンプルを誘導結合
プラズマ原子発光分光法(ICP-AES)にて処理して、カルシウム含量を測定した。 各組織サンプルの他方の半分を10%ホルマリン中に入れ、フォンコッサ染料(von
Kossa's stain)を使用する組織学的サンプルの調製を行うためにAmerican Histo
Labs(メリーランド州ゲーサーズバーグ)に送り、リン酸カルシウム結晶を特異 的に染色した。
【０１０４】 図7は、カルシウム含量に対するICP-AESアッセイからの平均的な結果をプロッ
トしたものである。エタノール処理は、21日および63日の両方とも石灰化を顕著
に阻害した。エタノール処理にVEGFを組合わせると、石灰化がさらに減少した。
図8は、フォンコッサ染料を使用したときの、組織サンプルのリン酸カルシウム に関する組織学的分析からの代表的な写真を示している。図8の写真から、エタ ノールによる石灰化の阻害、およびエタノールとVEGFとの組合わせによる石灰化
の相乗的な阻害が確認される。
【０１０５】 上記の実施態様は例示のためのものであって、これらの実施態様に限定される
わけではない。さらなる実施態様は特許請求の範囲中に含まれている。好ましい
実施態様に関して本発明を説明してきたが、当業者にとっては、本発明の精神と
範囲を逸脱することなく形態および詳細において種々の変更が可能であることは
言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、組織をVEGFで処理してから5日間インキュベーションを行い、そのイン
キュベーション時に組織が、組織培養ウェル内のインサート上に成長した生存可
能な内皮細胞と接触していた場合の、架橋組織サンプルの顕微鏡写真である。固
定された組織上に存在する内皮細胞が、蛍光性のラベリングによって目視可能に
なっている。
【図２】 図2は、組織をVEGFで処理してから、組織培養ウェルにおいて内皮細胞と共に5
日間インキュベーションしたときの、架橋組織サンプルの顕微鏡写真である。こ
の例では、VEGFで処理した組織が、インキュベーション時間の開始時に内皮細胞
と直接接触していなかった。固定された組織上に存在する内皮細胞が、蛍光性の
ラベリングによって目視可能になっている。
【図３】 図3は、細胞培養系中で内皮細胞と共にインキュベーションした後における組 織サンプルの一組の顕微鏡写真であって、図3Aは、組織をエタノールで処理した
だけの場合の写真であり; 図3Bは、エタノール処理した架橋組織をVEGF/グルタ ルアルデヒド溶液で15分処理した場合の写真であり; そして図3Cは、エタノール
処理した架橋組織をVEGF/グルタルアルデヒド溶液で30分処理した場合の写真で ある。蛍光性のラベリングによって細胞が目視可能になっている。
【図４】 図4は、ヒト大動脈内皮細胞の一組の顕微鏡写真であって、図4Aは、グルタル アルデヒド架橋した豚の大動脈弁小葉組織をコロニー化しているヒト大動脈内皮
細胞の写真であり; 図4Bは、エタノールで処理したグルタルアルデヒド架橋組織
をコロニー化しているヒト大動脈内皮細胞の写真であり; そして図4Cは、エタノ
ールで処理し、次いで(100ng/ml VEGF + 0.01%グルタルアルデヒド)の溶液で処 理したグルタルアルデヒド架橋組織をコロニー化しているヒト大動脈内皮細胞の
写真である。蛍光性のラベリングによって細胞が目視可能になっている。
【図５】 図5は、ヒト大動脈内皮細胞の一組の顕微鏡写真であって、図5Aは、グルタル アルデヒド架橋した豚の大動脈弁小葉組織をコロニー化しているヒト大動脈内皮
細胞の写真であり; 図5Bは、エタノールで処理したグルタルアルデヒド架橋組織
をコロニー化しているヒト大動脈内皮細胞の写真であり; そして図5Cは、エタノ
ールで処理し、次いで(100ng/ml VEGF + 0.01%グルタルアルデヒド)の溶液で処 理したグルタルアルデヒド架橋組織をコロニー化しているヒト大動脈内皮細胞の
写真である。蛍光性のラベリングによって細胞が目視可能になっている。
【図６】 図6は、ヒト大動脈内皮細胞の一組の顕微鏡写真であって、図6Aは、HEPES緩衝
塩水中であらかじめインキュベートした非架橋の豚の大動脈弁小葉組織をコロニ
ー化しているヒト大動脈内皮細胞の写真であり; 図6Bは、HEPES緩衝塩水/0.01% グルタルアルデヒド溶液中であらかじめインキュベートした非架橋の豚の大動脈
弁小葉組織をコロニー化しているヒト大動脈内皮細胞の写真であり; そして図6C
は、HEPES/0.01%グルタルアルデヒド/(100ng/ml VEGF)溶液中であらかじめイン キュベートした非架橋の豚の大動脈弁小葉組織をコロニー化しているヒト大動脈
内皮細胞の写真である。蛍光性のラベリングによって細胞が目視可能になってい
る。
【図７】 図7は、さらなる処理を施さずに(対照標準)、エタノールで処理してから(エタ
ノール)、あるいはエタノールとVEGFで処理してから(VEGF)、若年性の雄のラッ ト中に21日間または63日間皮下移植したグルタルアルデヒド架橋小葉中のカルシ
ウム含量をグラフ表示したものである。
【図８】 図8は、さらなる処理を施さずに(図8A)、エタノールで処理してから(図8B)、 あるいはエタノールとVEGFで処理してから(図8C)、若年性の雄のラット中に21日
間皮下移植したグルタルアルデヒド架橋した豚の大動脈弁小葉組織の一組の顕微
鏡写真である。染色系を使用すると、リン酸カルシウムは褐色に染色され、写真
中に小さな黒っぽいパッチとして示される。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月９日（２００１．３．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｕ Ａ６１Ｌ 27/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ケリー，シイラ・ジェイ アメリカ合衆国ミネソタ州55127，バドナ イズ・ハイツ，ポンドヴュー・コート 1051 (72)発明者 オウグル，マシュー・エフ アメリカ合衆国ミネソタ州55105，セン ト・ポール，ジュリエット・アベニュー 2053 Ｆターム(参考） 4C076 AA99 BB32 CC50 EE41 EE45 FF70 4C081 AB13 AB19 AB31 AB34 AC02 BA12 CD111 DA16 EA13 4C084 AA02 BA03 CA18 DB52 DB57 NA14 ZA362 ZA542 4C097 AA15 AA23 AA26 AA27 BB01 CC01 DD15 SB10

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリペプチド成長因子を結合させた同種移植片組織または異
    種移植片組織を含み、前記ポリペプチド成長因子が、前記組織に対する生存可能
    な細胞の親和性を高めるのに効果的である、ヒト患者のためのプロテーゼ。
  2. 【請求項２】 前記ポリペプチド成長因子の前記組織への前記結合に際して
    特異的な結合相互作用が関与する、請求項1記載のプロテーゼ。
  3. 【請求項３】 前記ポリペプチド成長因子の前記組織への前記結合に際して
    共有結合が関与する、請求項1記載のプロテーゼ。
  4. 【請求項４】 前記ポリペプチド成長因子の前記組織への前記結合に際して
    リンカー分子が関与する、請求項1記載のプロテーゼ。
  5. 【請求項５】 前記組織が架橋した組織を含む、請求項1記載のプロテーゼ 。
  6. 【請求項６】 前記組織が架橋していない組織を含む、請求項1記載のプロ テーゼ。
  7. 【請求項７】 前記組織が豚の心臓弁を含む、請求項1記載のプロテーゼ。
  8. 【請求項８】 前記組織がウシの心嚢組織を含む、請求項1記載のプロテー ゼ。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチド成長因子が血管内皮成長因子を含む、請求
    項1記載のプロテーゼ。
  10. 【請求項１０】 前記血管内皮成長因子が、bVEGF164、bVEGF120、hVEGF165
    、hVEGF121、VEGF II、hVEGF80、VEGF-B、VEGF2、これらの変性活性形、および これらの組合せ物からなる群から選ばれる蛋白質を含む、請求項9記載のプロテ ーゼ。
  11. 【請求項１１】 前記組織が合成組織を含む、請求項1記載のプロテーゼ。
  12. 【請求項１２】 結合したVEGFを有する架橋した組織を含む物品。
  13. 【請求項１３】 前記架橋がグルタルアルデヒド部分を含む、請求項12記載
    の物品。
  14. 【請求項１４】 結合したVEGFを含む補綴心臓弁。
  15. 【請求項１５】 前記補綴心臓弁が豚の心臓弁を含む、請求項14記載の補綴
    心臓弁。
  16. 【請求項１６】 ポリペプチド成長因子を同種移植片組織または異種移植片
    組織に結合させることを含む、同種移植片組織または異種移植片組織を含んだヒ
    ト患者用プロテーゼの製造法。
  17. 【請求項１７】 結合したポリペプチド成長因子を有する前記組織を生存可
    能な細胞と共にインビトロにてインキュベートして前記組織に対して前記細胞の
    親和性を高めることをさらに含む、請求項16記載の製造法。
  18. 【請求項１８】 前記細胞がヒトの細胞を含む、請求項16記載の製造法。
  19. 【請求項１９】 前記細胞が、前記プロテーゼに対して意図されているレシ
    ピエントから得られる細胞を含む、請求項16記載の製造法。
  20. 【請求項２０】 インビトロでの生存可能な細胞を組織と共にインキュベー
    トして、結合したポリペプチド成長因子を含む前記基質に対して前記細胞の親和
    性を高めることを含む基質の変性法。
  21. 【請求項２１】 基質と、生存可能な細胞と前記基質との結合を刺激するの
    に効果的な、前記基質と結合したポリペプチド成長因子とを含むプロテーゼ。
  22. 【請求項２２】 架橋剤を使用してポリペプチド成長因子を基質に結合させ
    る、請求項21記載のプロテーゼ。
  23. 【請求項２３】 前記架橋剤が二官能アルデヒドを含む、請求項22記載のプ
    ロテーゼ。
  24. 【請求項２４】 前記二官能アルデヒドがグルタルアルデヒドを含む、請求
    項23記載のプロテーゼ。
  25. 【請求項２５】 ポリペプチド成長因子と基質とに結合した接着剤をさらに
    含む、請求項21記載のプロテーゼ。
  26. 【請求項２６】 前記接着剤が再吸収性物質を含む、請求項25記載のプロテ
    ーゼ。
  27. 【請求項２７】 前記再吸収性物質がフィブリングルーを含む、請求項26記
    載のプロテーゼ。
  28. 【請求項２８】 前記基質が組織を含む、請求項21記載のプロテーゼ。
  29. 【請求項２９】 前記基質がヒトの組織を含む、請求項21記載のプロテーゼ
    。
  30. 【請求項３０】 前記基質が、豚の組織、ウシの組織、カンガルーの組織、
    犬の組織、およびこれらの組み合わせ物からなる群から選ばれる、請求項21記載
    のプロテーゼ。
  31. 【請求項３１】 前記基質が合成基質を含む、請求項21記載のプロテーゼ。
  32. 【請求項３２】 前記基質が生物学的再吸収性物質を含む、請求項21記載の
    プロテーゼ。
  33. 【請求項３３】 前記ポリペプチド成長因子が血管内皮成長因子を含む、請
    求項21記載のプロテーゼ。
  34. 【請求項３４】 前記ポリペプチド成長因子がTat蛋白質を含む、請求項21 記載のプロテーゼ。
  35. 【請求項３５】 前記プロテーゼが、人工臓器、心臓弁プロテーゼ、弁形成
    リング、ステント、綿撤糸、縫合糸、導線、永久的に内在する経皮デバイス、AV
    シャント、代用血管、移植皮膚、または外科用パッチを含む、請求項21記載のプ
    ロテーゼ。
  36. 【請求項３６】 請求項21記載のプロテーゼと内皮細胞を含んだ培養細胞物
    とを接触させることを含む、内皮細胞と基質とを結合させるための方法。
  37. 【請求項３７】 請求項21記載のプロテーゼを無菌状態下にてパッケージ中
    に配置すること、および医療専門家による使用のために前記パッケージを分配す
    ることを含む、医療専門家による使用のために医療用物品を分配するための方法
    。
  38. 【請求項３８】 ポリペプチド成長因子が基質に対して生存可能な細胞の結
    合力を高めるのに効果的となるよう、ポリペプチド成長因子を種々の条件下にて
    基質に接着させることを含む、生物学的適合性物質を製造するための方法。
  39. 【請求項３９】 ポリペプチド成長因子を基質に接着させることが架橋させ
    ることを含む、請求項38記載の方法。
  40. 【請求項４０】 VEGFの架橋がグルタルアルデヒドを使用して行われる、請
    求項39記載の方法。
  41. 【請求項４１】 VEGFの架橋が約1時間未満にわたって行われる、請求項39 記載の方法。
  42. 【請求項４２】 VEGFの架橋が約24時間を超えて行われる、請求項39記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 前記基質が組織を含む、請求項38記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記組織が架橋した組織である、請求項43記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記組織が架橋していない組織である、請求項43記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 前記基質がヒトの組織を含む、請求項38記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記基質が、豚の組織、ウシの組織、カンガルーの組織、
    犬の組織、またはこれらの組み合わせ物を含む、請求項38記載の方法。
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