DE69934298T2

DE69934298T2 - Wachstumsfaktoren enthaltende prothesen

Info

Publication number: DE69934298T2
Application number: DE69934298T
Authority: DE
Inventors: C. Wenda Petaluma CARLYLE; J. Sheila Vadnais Heights KELLY; F. Matthew St. Paul OGLE
Original assignee: St Jude Medical AB; St Jude Medical LLC
Current assignee: St Jude Medical AB; St Jude Medical LLC
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-21
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2019-01-22
Also published as: BR9907273A; CA2319000A1; EP1051204A2; ES2278435T3; WO1999037337A3; DE69934298D1; AU2465899A; EP1051204B1; CN1289259A; US7722671B1; WO1999037337A2; JP2002500929A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Prothesen mit Komponenten, die mit einem Polypeptidwachstumsfaktor modifiziert wurden. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung dieser Prothesen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prothesen, d.h. prothetische Vorrichtungen, werden zum Reparieren oder Ersetzen beschädigter oder erkrankter Organe, Gewebe und anderer Strukturen bei Menschen und Tieren verwendet. Prothesen müssen im Allgemeinen biokompatibel sein, da sie typischerweise für längere Zeiträume implantiert werden. Prothesen können zum Beispiel künstliche Herzen, künstliche Herzklappen, Ligamentreparaturmaterial, Gefäßreparatur, chirurgische Patches aus Säugetiergewebe und dergleichen umfassen.
Prothesen können aus natürlichen Materialien wie Gewebe, synthetischen Materialien oder einer Kombination davon konstruiert werden. Synthetische Prothesen wie mechanische Herzklappenprothesen werden zum Beispiel aus biokompatiblen Metallen und anderen Materialien wie Graphit und Polyester hergestellt. Mechanische Herzklappen haben zwar den Vorteil einer nachgewiesenen Haltbarkeit über einen jahrzehntelangen Gebrauch, doch stehen sie mit einem hohen Vorkommen an Blutgerinnung auf der oder um die prothestische(n) Klappe herum in Zusammenhang. Blutgerinnung kann zu einem akuten oder subakuten Verschluss der Klappe oder des damit verbundenen Blutgefäßes führen. Aus diesem Grund müssen Patienten mit implantierten mechanischen Herzklappen über die Implantationsdauer der Klappe Antikoagulationsmittel einnehmen. Antikoagulationsmittel sind mit einem signifikanten Blutungsrisiko verbunden (3–5% pro Jahr) und können von manchen Patienten nicht bedenkenlos eingenommen werden.
Neben mechanischen Herzklappen können Herzklappenprothesen mit Gewebeflügeln oder Polymerflügeln konstruiert werden. Thrombosebildung und eine anschließende Kalzifizierung sind Probleme in Verbindung mit Polymerherzklappen. Die Kalzifizierung dieser Klappen kann zu einem Ausfall führen.
Prothetische Gewebeherzklappen können zum Beispiel von Schweineherzklappen gewonnen oder aus anderem biologischem Material wie Rinderperikard hergestellt werden. Biologische Materialien in prothetischen Herzklappen haben gewöhnlich Profil- und Oberflächencharakteristiken, die im Allgemeinen einen laminaren, nicht turbulenten Blutfluss ergeben. Folglich ist die Wahrscheinlichkeit einer intravaskulären Gerinnung geringer als bei mechanischen Herzklappen. Leider sind prothetische Gewebeherzklappen darin begrenzt, dass sie gewöhnlich etwa sieben Jahre nach der Implantation auszufallen beginnen. Die Klappendegeneration verläuft bei jungen Patienten und in der Schwangerschaft besonders schnell.
Die Kalzifizierung, d.h. die Ablagerung von Calciumsalzen, besonders Calciumphosphat (Hydroxyapatit), scheint eine Hauptursache für die Degeneration zu sein. Bemühungen, das Kalzifizierungsproblem anzugehen, waren u.a. die Behandlung von mit Glutaraldehyd fixierten Klappenprothesen mit Verbindungen zur Reduzierung der Calciumverkernung. Andere Methoden sind z.B. die Verwendung alternativer Gewebefixierungstechniken, da es Hinweise dafür gibt, dass die Glutaraldehydfixierung zu einer Kalzifizierung und mechanischen Degradation beitragen kann. Da lebensunfähige Zellen Orte für Calciumablagerung sein können, wurden außerdem verschiedene Prozesse zur Beseitigung lebensunfähiger Zellen entwickelt, während die extrazelluläre Matrix intakt bleibt. Intaktes Gewebe mit lebensfähigen Zellen weist einen natürlichen Schutz vor Kalzifizierung auf.
Ein weiterer großer Nachteil von Prothesen auf Gewebebasis ist, dass solche Vorrichtungen nicht selbsterhaltungsfähig sind. Eine Langzeithaltbarkeit wird durch die Fähigkeit lebensfähiger Zellen beeinflusst, das implantierte Gewebe zu besiedeln und Erhaltungsfunktionen auszuführen. Die Bedeutung lebensfähiger Zellen wurde im Kontext von Homograft-Transplantaten, d.h. Transplantate von einem Mitglied einer Spezies zu einem anderen Mitglied derselben Spezies, untersucht. Durch eine ordnungsgemäße Homograft-Konservierung kann die Anzahl lebensfähiger Zellen, die im Gewebe verbleiben, maximiert werden, wie durch eine Matrixproteinsynthese bestimmt wird. Konservierungstechniken, die kein Zellüberleben unterstützen, wie eine langfristige Aufbewahrung bei 4°C, stehen mit einer verringerten In-vivo-Haltbarkeit und erhöhten Reoperationsraten in Zusammenhang.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Polypeptidwachstumsfaktor kann mit einem Gewebesubstrat oder einem synthetischen Substrat verbunden werden, um die Besiedelung des Substrats mit lebensfähigen Zellen zu unterstützen. Zu bevorzugten Polypeptidwachstumsfaktoren gehören vaskuläre Endothelwachstumsfaktoren (VEGF). Mit vernetztem Gewebe assoziierter VEGF mildert wenigstens einen Teil der zellulären Toxizität infolge der Glutaraldehydvernetzung. Der VEGF kann mit dem Substrat durch direkten Kontakt in Lösung verbunden werden. Alternativ kann der VEGF mit dem Substrat entweder durch Aufbringen auf das Substrat zusammen mit einem Bindemittel oder durch chemische Bindung des VEGF an das Substrat, mit oder ohne intervenierendes Linkermolekül, verbunden werden.
Ein mit VEGF modifiziertes Substrat erbringt eine Angliederung lebensfähiger Endothelzellen an das Substrat, um die Leistung des Substrats als Prothese zu verbessern. Die Langzeithaltbarkeit der Prothese müsste zum Beispiel aufgrund einer Reduzierung der Kalzifizierung zum Teil verbessert werden und das Infektionsvorkommen in Verbindung mit der Prothese müsste aufgrund eines Rückgangs von Orten, die für das Anlagern von Mikroorganismen geeignet sind, verringert werden. Unter Verwendung eines Zellkultursystems kann das VEGF-behandelte Substrat die In-vitro-Besiedelung des Substrats mit Endothelzellen unterstützen. Darüber hinaus kann der VEGF die Besiedelung des Substrats mit Endothelzellen in vivo nach der Implantation des Substrats als Teil einer Prothese unterstützen.
In einem ersten Aspekt weist die Erfindung eine Prothese auf, die ein Gewebe und einen vaskulären Endothelwachstumsfaktor umfasst, wobei der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor kovalent an das Gewebe unter Verwendung von Vernetzungsmitteln gebunden wird, wobei der vaskuläre Endothelwachsumsfaktor die Assoziation von lebensfähigen Zellen mit dem Gewebe stimuliert. Die Bindung des Polypeptidwachstumsfaktors an das Gewebe kann spezifische Bindungsinteraktionen und/oder eine kovalente Bindung einschließen.
Das Gewebe kann vernetztes Gewebe und/oder nicht vernetztes Gewebe beinhalten. Das Gewebe kann von Schweineherzklappen, Rinderperikardgewebe oder einem beliebigen anderen synthetischen oder biologischen Material gewonnen werden. Der Polypeptidwachstumsfaktor kann einen vaskulären Endothelwachstumsfaktor beinhalten. Zu geeigneten vaskulären Endothelwachstumsfaktoren gehören zum Beispiel ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus bVEGF164, bVEGF120, hVEGF165, hVEGF121, VEGF II, HVEGFBO, VEGF-B, VEGF2, modifizierten aktiven Formen davon und Kombinationen davon.
In einem anderen Aspekt weist die Erfindung einen Artikel, einschließlich vernetztes Gewebe mit assoziiertem VEGF, auf. Die Vernetzung kann Glutaraldehydanteile einschließen, die an das Gewebe mit Vernetzungsmitteln gebunden werden.
Darüber hinaus weist die Erfindung eine prothetische Herzklappe auf, die assoziierten VEGF umfasst. Die prothetische Herzklappe kann eine Schweineherzklappe beinhalten.
In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Ex-vivo-Verfahren zum Assoziieren von Endothelzellen mit einer Prothese auf, das das Inkontaktbringen einer Prothese gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Zellkultur beinhaltet, die Endothelzellen umfasst.
Weitere Merkmale und Vorzüge der Erfindung sind anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung und anhand der Ansprüche offensichtlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Mikrofotografie einer vernetzten Gewebeprobe, die vor einer fünftägigen Inkubationsperiode, während der das Gewebe mit lebensfähigen Endothelzellen in Kontakt war, die auf einem Insert in einem Gewebekulturwell wuchsen, mit VEGF behandelt wurde. Auf dem fixierten Gewebe vorhandene Endothelzellen sind durch Fluoreszenzmarkierung visualisiert.
2 ist eine Mikrofotografie einer vernetzten Gewebeprobe, die vor einer fünftägigen Inkubationsperiode mit Endothelzellen in einem Gewebekulturwell mit VEGF behandelt wurde. In diesem Beispiel war das mit VEGF behandelte Gewebe zu Beginn der Inkubationsperiode nicht in direktem Kontakt zu Endothelzellen. Auf dem fixierten Gewebe vorhandene Endothelzellen sind durch Fluoreszenzmarkierung visualisiert.
3 ist ein Satz Mikrofotografien von Gewebeproben nach einer Inkubation mit Endothelzellen in einem Zellkultursystem, wobei das Gewebe nur mit Ethanol behandelt wurde (3A), oder wobei das vernetzte, mit Ethanol behandelte Gewebe fünfzehn Minuten lang mit einer VEGF/Glutaraldehydlösung behandelt wurde (3B) oder dreißig Minuten lang mit einer VEGF/Glutaraldehydlösung behandelt wurde (C). Die Zellen wurden durch Fluoreszenzmarkierung visualisiert.
4 ist ein Satz Mikrofotografien humaner Aortenendothelzellen, die Glutaraldehyd-vernetztes Schweineaortenklappenflügelgewebe (4A), Glutaraldehydvernetztes, mit Ethanol behandeltes Gewebe (4B) oder Glutaraldehyd-vernetztes, mit Ethanol und dann mit einer Lösung aus 100 ng/ml VEGF + 0,01% Glutaraldehyd behandeltes Gewebe besiedeln. Die Zellen wurden durch Fluoreszenzmarkierung visualisiert.
5 ist ein Satz Mikrofotografien humaner Aortenendothelzellen, die Glutaraldehyd-vernetztes Schweineaortenklappenflügelgewebe (5A), Glutaraldehydvernetztes, mit Ethanol behandeltes Gewebe (5B) oder Glutaraldehyd-vernetztes, mit Ethanol und dann mit einer Lösung aus 100 ng/ml VEGF + 0,01% Glutaraldehyd behandeltes Gewebe besiedeln. Die Zellen wurden durch Rasterelektronenmikroskopie visualisiert.
6 ist ein Satz Mikrofotografien humaner Aortenendothelzellen, die nicht vernetztes Schweineaortenklappenflügelgewebe besiedeln, das zuvor in einer HEPES-gepufferten Salzlösung (6A), in einer HEPES-gepufferten Salzlösung/0,01% Glutaraldehydlösung (6B) oder in einer HEPES/0,01% Glutaraldehyd/100 ng/ml VEGF-Lösung (6C) inkubiert wurde. Die Zellen wurden durch Fluoreszenzmarkierung visualisiert.
7 ist eine graphische Darstellung des Calciumgehalts in Glutaraldehyd-vernetzten Flügeln, die keine weitere Behandlung (Kontrolle), eine Ethanolbehandlung (Ethanol) oder eine Ethanol- und VEGF-Behandlung (VEGF) vor der subkutanen Implantation in männliche Jungratten über einen Zeitraum von 21 oder 63 Tagen erhielten.
8 ist ein Satz Mikrofotografien von Glutaraldehyd-vernetztem Schweineaortenklappenflügelgewebe, das entweder keine weitere Behandlung (8A), eine Ethanolbehandlung (8B) oder eine Ethanol- und VEGF-Behandlung (8C) vor der subkutanen Implantation in männliche Jungratten über einen Zeitraum von 21 Tagen erhielt. Mit dem verwendeten Färbesystem färbt sich Calciumphosphat braun und ist als kleine dunkle Flecken in den Fotografien erkennbar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN
Ein Polypeptidwachstumsfaktor oder ein Fragment davon kann mit einem Gewebesubstrat oder einem synthetischen Substrat in vitro assoziiert werden. Im Allgemeinen bildet das Substrat ganz oder teilweise eine Prothese. Zu bevorzugten Polypeptidwachstumsfaktoren gehören vaskulärer Endothelwachstumsfaktor (VEGF) und verwandte Verbindungen. Nach der Modifikation des Substrats mit VEGF kann der VEGF die Endothelzellchemotaxis und -proliferation stimulieren. In bevorzugten Ausgestaltungen ist das Substrat fixiert. Die Assoziation lebensfähiger Endothelzellen mit dem prothetischen Gewebe müsste zu einer langfristigen Lebensfähigkeit der Prothese beitragen. Eine VEGF-Modifikation ist vor allem für die Produktion von Prothesen geeignet, die naturbedingt eine Endothel- oder Epithelzellauskleidung haben, wie Gefäßkomponenten, kardiovaskuläre Strukturen, Teile des lymphatischen Systems, Uterusgewebe oder Netzhautgewebe.
Der VEGF kann mit dem Substrat auf vielerlei Arten und Weisen assoziiert werden. Das Substrat kann z.B. mit einer VEGF-Lösung kombiniert werden, so dass der VEGF mit dem prothetischen Gewebe durch direkte Anlagerung verbunden wird. Alternativ kann der VEGF mit dem prothetischen Gewebe mit einem Klebstoff assoziiert werden. Darüber hinaus kann der VEGF mit dem prothetischen Gewebe durch chemische Bindung verbunden werden.
Wie im folgenden Beispiel 1 demonstriert wird, kann eine direkte Anlagerung oder Assoziation durch die Zugabe von VEGF zu vernetztem Gewebe erfolgen. Zwar ist der Mechanismus der direkten Anlagerung des VEGF an das vernetzte Gewebe unbekannt, doch verbindet sich der VEGF möglicherweise mit freien Glutaraldehyd-Funktionsgruppen in dem vernetzten Gewebe.
Im Hinblick auf die chemische Bindung des VEGF an das Gewebe kann VEGF mit dem Gewebe mit Glutaraldehyd vernetzt werden. Die Bedingungen zum Vernetzen von VEGF mit dem Gewebe müssen sorgfältig kontrolliert werden, um ein gewünschtes Niveau an VEGF-Aktivität nach der Vernetzung beizubehalten und eine durch Restglutaraldehyd vermittelte Zytotoxizität zu verhindern. Durch die kontrollierte Vernetzung von VEGF mit dem Gewebe mit Glutaraldehyd kann VEGF an vernetztes oder nicht vernetztes Gewebe effektiv adhäriert werden. Dieser Ansatz ist daher besonders für die Assoziation von VEGF mit nicht vernetztem Autograft- oder Homograft-Gewebe geeignet.
VEGF kann das Wachstum von Endothelzellen auf dem Substrat in vitro oder in vivo effektiv induzieren, so dass das Gewebe mit lebensfähigen Zellen besiedelt wird. Für In-vivo-Wachstum kann das Substrat mit assoziiertem VEGF in einen Patienten implantiert werden. Nach der Implantation in den Patienten werden Endothelzellen aufgrund der Anwesenheit von VEGF zur Prothese angezogen. Alternativ können Endothelzellen wie nachfolgend beschrieben mit der Prothese in einem Zellkultursystem assoziiert werden.
A. Prothesen
Prothesen können ein Gewebesubstrat oder ein synthetisches Substrat, wenigstens als eine Komponente, beinhalten, so dass das Substrat als ein Ort für zelluläre Anlagerung geeignet ist. Diese Prothesen sind im Allgemeinen zur Implantation in einen Patienten für längere Zeiträume vorgesehen. Prothesen sind z.B. künstliche Herzen, künstliche Herzklappen, Anuloplastikringe, Gefäß- und Strukturstents, Gefäßtransplantate, Pledgets, Nahtmaterial, Leitungen, dauerhaft verweilende perkutane Vorrichtungen, vaskuläre oder kardiovaskuläre Shunts, Hauttransplantate zur Wundheilung und chirurgische Patches. Biomedizinische Vorrichtungen, die für eine längere Verweilzeit in einem Patienten ausgelegt sind, sind auch für die Aufnahme von Substraten mit assoziierten Wachstumsfaktoren geeignet. Zu diesen Vorrichtungen gehören zum Beispiel Hickman-Katheter.
Als Substrat verwendetes natürliches Gewebe wird von einer Tiergattung gewonnen, gewöhnlich von Säugetieren wie Menschen, Rinder, Schweine, Hunde, Robben oder Kängurus. Dieses Gewebe kann z.B. von Herzklappen, Aortenwurzeln, Aortenwänden, Aortenflügeln, Perikardgewebe wie Perikard-Patches, Bindegewebe wie Dura mater, Bypass-Transplantaten, Bändern, Sehnen, Hautpatches, Blutgefäßen, menschliches Umbilikalgewebe, Knochen, Faszie, Submukosa und dergleichen gewonnen werden. Dieses natürliche Gewebe beinhaltet im Allgemeinen kollagenhaltiges Material. Natürliches Gewebe ist typischerweise, aber nicht zwangsläufig, Weichgewebe. Eine Prothese auf Gewebebasis kann Strukturelemente von ihrer nativen Form beibehalten und/oder Strukturelemente können in die Prothese aus der Zusammenfügung verschiedener Gewebestücke eingebaut werden. Eine Herzklappenprothese kann z.B. aus einer Schweinherzklappe, aus Rinderperikard oder aus einer Kombination davon zusammengefügt werden.
Synthetische Substrate können aus synthetischen Polymeren und/oder biologischen Polymeren wie solche geformt werden, die gewöhnlich in einer natürlichen Gewebematrix zu finden sind, um eine synthetische Gewebematrix zu bilden. Im Speziellen können Kollagen und Elastinpolymere zu einer Matrix, die einer Gewebekomponente entspricht, durch eine beliebige einer Auswahl von Techniken wie Weben und Formpressen geformt werden. Das aus diesen biologischen Polymeren gebildete synthetische Substrat ähnelt einer natürlichen Gewebematrix. Alternativ können synthetische Substrate in Form eines synthetischen Gewebes vorliegen, wobei eine Matrix synthetische und/oder biologische Polymere zusammen mit lebensfähigen und/oder nicht lebensfähigen Zellen beinhaltet. Die Polymere können, müssen aber nicht bioresorptionsfähig sein. Im Folgenden werden geeignete synthetische und biologische Polymere beschrieben.
Gewebe können durch Vernetzung fixiert werden. Dadurch wird eine mechanische Stabilisierung erzielt, indem z.B. ein enzymatischer Abbau des Gewebes verhindert wird. Durch Vernetzung werden außerdem antigene Orte beseitigt, die zu einer Abstoßung der Prothese durch den Patienten führen könnten. Zum Fixieren wird gewöhnlich Glutaraldehyd oder Formaldehyd verwendet, es können aber auch andere Fixierungsmittel wie Epoxide und andere bifunktionelle Aldehyde verwendet werden. Xenografts, d.h. Prothesen mit Gewebe von einer Spezies, die sich von der Spezies des Patienten unterscheidet, werden gewöhnlich vor der Verwendung fixiert. Homografts, d.h. Prothesen mit Gewebe eines anderen Individuums der Spezies des Patienten, können vor der Verwendung fixiert werden oder auch nicht. Ebenso können Autografts, d.h. Prothesen mit Gewebe von demselben Individuum, vor der Verwendung fixiert werden oder nicht.
Die Prothesen können andere Nichtgewebekomponenten wie Polymermaterial, Keramik und Metall beinhalten. Geeignete Keramiken sind, ohne Begrenzung, Hydroxyapatit, Aluminiumoxid und pyrolytischer Kohlenstoff. Polymermaterialien können aus synthetischen Polymeren sowie aus gereinigten biologischen Polymeren gefertigt werden. Zu geeigneten synthetischen Materialien können Hydrogele und andere synthetische Materialien gehören, die einer starken Dehydratisierung nicht standhalten können.
Zu geeigneten synthetischen Polymeren gehören u.a. Polyamide (z.B. Nylon), Polyester, Polystyrole, Polyacrylate, Vinylpolymere (z.B. Polyethylen, Polytetrafluorethylen, Polypropylen und Polyvinylchlorid), Polycarbonate, Polyurethane, Polydimethylsiloxane, Celluloseacetate, Polymethylmethacrylate, Ethylenvinylacetate, Polysulfone, Nitrocellulosen und ähnliche Copolymere. Es können auch bioresorptionsfähige Polymere wie Dextran, Hydroxyethylstärke, Gelatine, Derivate von Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Poly[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid], Poly(hydroxysäuren), Poly(epsilon-caprolacton), Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Poly(dimethylglykolsäure), Poly(hydroxybuterat) und ähnliche Copolymere verwendet werden. Diese synthetischen Polymermaterialien können zu einem Netz gewebt werden, um eine Matrix oder ein Substrat zu bilden. Alternativ können die synthetischen Polymermaterialien zu geeigneten Formen formgepresst oder gegossen werden.
Biologische Polymere können natürlich vorkommen oder in vitro zum Beispiel durch Fermentation und dergleichen hergestellt werden. Gereinigte biologische Polymere können durch Techniken wie Weben, Wirken, Gießen, Formpressen, Strangpressen, zelluläre Ausrichtung und magnetische Ausrichtung sachgemäß zu einem Substrat geformt werden. Eine Beschreibung magnetischer Ausrichtungen ist z.B. in R. T. Tranquillo et al., Biomaterials 17: 349–357 (1996) zu finden, hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Zu geeigneten biologischen Polymeren gehören, ohne Begrenzung, Kollagen, Elastin, Seide, Keratin, Gelatine, Polyaminosäuren, Katgutnahtmaterialien, Polysaccharide (z.B. Cellulose und Stärke) und Copolymere davon.
B. Vaskulärer Endothelwachstumsfaktor (VEGF)
VEGF bezieht sich auf eine Polypeptidfamilie, die Feststellungen zufolge bevorzugt das Wachstum von vaskulären Endothelzellen gegenüber anderen Zellen wie glatte Muskelzellen stimulieren. Es wurden verschiedene VEGF-Formen identifiziert. VEGF-Polypeptide weisen im Allgemeinen Sequenzhomologie zum aus Blutblättchen gewonnenen Wachstumsfaktor auf, der die Migration und Proliferation einer Vielfalt von Zelltypen verändern kann. VEGF wird gelegentlich als vaskulärer Permeabilitätsfaktor bezeichnet.
Die ursprünglich identifizierte Form von VEGF hat eine relative Molekülmasse von etwa 45 bis 46 Kilodalton (kDa). Diese Form ist anscheinend ein Homodimer, wobei jede Untereinheit eine relative Molekülmasse von etwa 23 kDa hat. Die c-DNA-Sequenzen, die das humane Polypeptid (165 Aminosäuren, hVEGF₁₆₅) und das entsprechende bovine Polypeptid (164 Aminosäuren, bVEGF₁₆₄) kodieren, wurden bestimmt. Zudem wurden auch Varianten der Polypeptide mit > 121 Aminosäuren für die humane Version (hVEGF₁₂₁) und 120 Aminosäuren für die bovine version (bVEGF₁₂₀) identifiziert. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind im US-Patent 5,194,596 von Tischer et al. zu finden. Andere unlösliche Varianten wurden jeweils mit 189 und 206 Aminosäuren identifiziert (siehe z.B. E. Tischer et al. „The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing", J. Biol. Chem. 266: 11947–11954 (1991), und K. A. Houck et al. „The vascular endothelial growth factor family identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA", Molec. Endocrinology 5: 1806–1814 (1991)).
Eine andere VEGF-Form mit der Bezeichnung VEGF II ist ein Heterodimer. Da von Ratten-Gliomzellen isoliert, hat die erste Untereinheit 190 Aminosäuren, während die zweite Untereinheit eine 135-Aminosäuren-Form und eine 115-Aminosäuren-Form hat. VEGF II ist in der EP 0 476 983A beschrieben.
Außerdem wurde ein einzelnes humanes Polypeptid VEGF ohne Bezeichnung identifiziert. Dieses Polypeptid hat eine relative Molekülmasse von etwa 80 kDa. Die entsprechende cDNA wurde isoliert und es wurde eine 728-Aminosequenz von der cDNA-Sequenz bestimmt. Einzelheiten über das Protein sind in der EP 0 550 296A enthalten.
Noch ein anderer humaner Wachstumsfaktor, VEGF2, wurde anhand von humanen Frühstadium-Embryonalosteoklastomen, adultem Herz und verschiedenen Brustkrebslinien identifiziert. VEGF2 hat 350 Aminosäuren, von denen etwa 24 Aminosäuren eine Leader-Sequenz repräsentieren. Die Sequenz für VEGF2 ist in der WO 95/24473 offenbart.
Kürzlich wurde VEGF-B identifiziert, eine weitere Variante von VEGF. VEGF-B scheint mit Herz- und Skelettmuskeln assoziiert zu sein. Volle Sequenzen für Maus- und Human-VEGF-B sind im US-Patent 5,607,918 von Eriksson et al. enthalten.
Zusätzlich zu VEGF-Varianten, die in Säugetierzellen unter normalen physiologischen Bedingungen exprimiert werden, zeigen Virusproteine wie das Tat-Protein vom humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1 Sequenzhomologie zu VEGF und binden sich an native VEGF-Rezeptoren. Diese Eigenschaften sind in Albini et al. „The angiogenesis induced by HIV-1 Tat protein is mediated by the Flk-1/KDR receptor on vascular endothelial cells. Nature Medicine 2(12): 1371–1375 (1996) und Mitola et al. „Tat-human immunodeficiency virus-1 induces human monocyte chemotaxis by activation of vascular endothelial growth factor receptor-1", Blood 90(4): 1365–1372 (1997), beschrieben. Über eine Interaktion mit diesen VEGF-Rezeptoren stimuliert ein Tat-Protein Endothelzellchemotaxis und -proliferation. Im Hinblick auf die vorliegende Anmeldung werden das Tat-Protein und andere ähnliche VEGF-Rezeptoren bindende Virusproteine daher als VEGF-Wachstumsfaktor angesehen.
Wie oben beschrieben, wurde eine Vielfalt von VEGF-Polypeptiden identifiziert. Viele davon sind mit speziellen Geweben assoziiert. Zumindest ein Teil der Polypeptide hat Variationen auf der Basis eines alternativen „Message Splicing", wie hVEGF₁₆₅ und hVEGF₁₂₁. Der in den anderen Abschnitten der vorliegenden Anmeldung verwendete Begriff „VEGF" bezieht sich u.a. auf alle bisher identifizierten VEGF-Polypeptide, wie die im vorliegenden Abschnitt beschriebenen, sowie auf evtl. zukünftig identifizierten VEGF-Polypeptide, die die Chemotaxis oder Proliferation von Endothelzellen selektiv unterstützen. „VEGF" bezieht sich außerdem auf Polypeptidfragmente, die ihre Fähigkeit zur selektiven Unterstützung der Chemotaxis oder Proliferation von Endothelzellen beibehalten. Wie zuvor erwähnt, ist humaner VEGF₁₂₁ z.B. ein natürlich vorkommendes Fragment von humanem VEGF₁₆₅. Rekombinanter humaner VEGF₁₆₅, humaner VEGF₁₂₁ und Maus-VEGF sind von R&D Systems aus Minneapolis, MN, erhältlich. Ebenso beinhaltet der hierin erwähnte „VEGF" VEGF-Proteine, die durch chemische Additionen zum Proteinmolekül durch kovalente oder nicht kovalente Bindung modifiziert wurden.
Mit standardmäßigen Techniken der Molekularbiologie (siehe z.B. Sambrook, Frisch und Maniatis, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, (1989)) können rekombinante modifizierte Formen natürlicher VEGF-Polypeptide hergestellt werden. Diese unkomplizierten Modifikationen beinhalten eine Addition von Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus. Außerdem können Modifikationen durch Substituieren von Aminosäuren entlang der Polypeptidkette vorgenommen werden. Einige Modifikationen können die Aktivität des Proteins zerstören. Es ist einfach, inaktivierende Modifikationen durch Testen nach Aktivität in Zellkultursystemen zu beseitigen. Aktive Formen dieser modifizierten Polypeptide liegen innerhalb unserer allgemeinen Definition von „VEGF".
C. Verbinden von VEGF mit einem Substrat
Das Verbinden von VEGF mit einem Substrat kann eine direkte Anlagerung, das Aufbringen einer Beschichtung, einschließlich eines Klebstoffs, oder eine chemische Bindung beinhalten. VEGF kann mit nur einem Abschnitt eines Substrats oder mit dem gesamten Substrat verbunden werden. Wird VEGF an einen Abschnitt des Substrats gebunden, dann können sich Zellen noch immer mit anderen Abschnitten des Substrats assoziieren, die nicht mit VEGF verbunden sind, da VEGF auf einem Teil des Substrats vorliegt.
Eine direkte Anlagerung erfordert das Kombinieren des Substrats, wie ein Gewebesubstrat, mit einer Lösung des VEGF. Im Speziellen wurde entdeckt, dass sich der VEGF mit Glutaraldehyd-vernetztem biologischem Gewebe assoziieren kann, so dass der VEGF nicht ohne weiteres abgewaschen wird. Diese direkte Anlagerung ist besonders effektiv, wenn das Gewebe vor der Inkubation mit VEGF über einen Zeitraum von weniger als einen Monat in 0,5% Glutaraldehyd inkubiert wird. Die anschließende Bindung des VEGF an Glutaraldehyd-vernetztes Gewebe scheint zumindest über angemessene Zeiträume von bis zu einem Monat oder länger anzudauern, wenn das Gewebe mit einer Pufferlösung in Kontakt ist. Es gibt Hinweise, wie im Beispiel 1 unten dargelegt, dass eine Behandlung mit Ethanol vor dem Kontakt mit VEGF die Assoziation von VEGF mit fixiertem Gewebe reduziert. Die Reduzierung der Assoziation von VEGF, die sich aus der Inkubation des Gewebes mit Ethanol ergibt, könnte möglicherweise in der Beseitigung von VEGF-Bindungsstellen, der Inaktivierung von VEGF-Bindungsstellen oder in der Bindung von Ethanol an VEGF-Bindungsstellen begründet sein.
Für eine direkte Anlagerung von VEGF an ein Substrat, wie Glutaraldehyd-vernetztes Gewebe, wird das Substrat oder ein Abschnitt davon mit einer Lösung von VEGF in einer Konzentration von im Allgemeinen etwa 1 ng/ml bis etwa 1 μg/ml und vorzugsweise von etwa 25 ng/ml bis etwa 250 ng/ml kombiniert. Im Laufe der Inkubation mit dem VEGF wird die Lösung vorzugsweise z.B. auf etwa 4°C gekühlt. Das Substrat bleibt vorzugsweise etwa 24 Stunden lang bis zu etwa 14 Tage oder länger bei etwa 4°C in der VEGF-Lösung. Die VEGF- Lösung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8,5 und bevorzugter von etwa 6,3 bis etwa 7,4 gepuffert. Geeignete Puffer können z.B. auf den folgenden Verbindungen basieren: Phosphat, Borat, Bicarbonat, Carbonat, Kakodylat, Citrat und andere organische Puffer wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES) und Morpholinpropansulfonsäuren (MOPS).
Alternativ kann VEGF mit dem Substrat durch die Verwendung eines Bindemittels oder Klebstoffs assoziiert werden. Der VEGF und der Klebstoff bilden eine Beschichtung auf dem Substrat. Zu bevorzugten Klebstoffen gehören z.B. biologische Leime wie Fibrinleim und dergleichen. Fibrinleim kann bei der Polymerisation von Fibrinogen und Thrombin gebildet werden. Geeignete Fibrinleime sind z.B. von Immuno AG, Österreich, und Zymogenetics, Seattle, WA, erhältlich.
Zum Aufbringen des VEGF mit einem Fibrinleim kann eine kleine Menge Thrombin am Substrat absorbiert werden. VEGF kann mit einer Fibrinogen-haltigen Lösung vermischt werden, um eine Lösung mit einer VEGF-Konzentration zu erhalten, die vorzugsweise von etwa 1 ng/ml–10 μg/ml reicht. Anschließend kann das Fibrinogen/VEGF-Gemisch über die Oberfläche des Substrats mit absorbiertem Thrombin gestrichen werden, oder das Gewebe mit absorbiertem Thrombin kann in die Fibrinogen/VEGF-Lösung getaucht werden. Die VEGF-Klebstoff-Beschichtung kann auf das gesamte Substrat oder nur auf einen Teil davon aufgetragen werden. Bei synthetischen Substraten kann der VEGF auch in das Substratmaterial eingebaut werden, wenn das Substrat geformt wird.
Fibrinleime und ähnliche Leime werden vom Patienten nach dem Auftragen langsam resorbiert. VEGF kann mit anderen resorptionsfähigen Polymeren vermischt und auf einem Substrat zu einer Beschichtung ausgebildet werden. Zu geeigneten resorptionsfähigen Polymeren gehören z.B. Dextran, Hydroethylstärke, Gelatine, Derivate von Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Poly[N-(2-ydroxypropyl)methacylamid], Polyglykole, Polyester, Poly(orthoester), Poly(esteramide), Polyanhydride. Zu resorptionsfähigen Polyestern gehören z.B. oly(hydroxysäuren) und Copolymere davon, Poly(ε-caprolacton), Poly(dimethylglykolsäure) und Pl1y(hydroxybutyrat). Bevorzugte resorptionsfähige Polymere sind z.B. D,L-Polymilchsäure, L-Polymilchsäure, Poly(glykolsäure) und Copolymere von L-Milchsäure, D-Milchsäure und Glykolsäure. Ferner kann der VEGF in Zwischenräumen einer Polymermatrix gespeichert werden. Die Polymermatrix kann resorptionsfähig sein, um das VEGF-Material freizusetzen, oder eine angemessene Porosität haben, so dass der VEGF allmählich aus dem Substrat diffundieren kann.
Die verschiedenen Ansätze auf der Basis natürlicher oder synthetischer bioresorptionsfähiger Polymere haben den Vorteil, dass ein Konzentrationsgradient von VEGF aufgebaut wird, so dass der VEGF als chemotaktisches Mittel fungieren kann, das Zellen signalisiert, in Richtung auf eine höhere Konzentration von VEGF zu migrieren. Zudem kann eine präzisere Dosis über einen begrenzten Zeitraum geliefert werden.
In anderen Ausgestaltungen beinhaltet die Assoziation von VEGF mit dem Substrat eine chemische Bindung. Eine chemische Bindung beinhaltet z.B. eine kovalente Bindung, eine Mehrzahl nicht kovalenter chemischer Interaktionen oder sowohl kovalente als auch nicht kovalente Interaktionen. Nicht kovalente chemische Interaktionen sind z.B. Wasserstoffbindungen, Van-der-Waals-Interaktionen, ionische Interaktionen und molekulare Umordnungen, die z.B. Antikörper-Antigen-, spezifische Bindungsprotein-Rezeptor- und Enzym-Substrat-Assoziationen charakterisieren. Mit anderen Worten, zur Bildung einer direkten chemischen Interaktion zwischen dem VEGF und dem Substrat werden Reaktanten oder Bindungsmittel verwendet, möglicherweise unter Einbeziehung eines Linkermoleküls. Die chemische Bindung des VEGF findet vorzugsweise bei oder nahe dem physiologischen pH-Wert statt, der vorzugsweise bei ca. 6 bis ca. 8,5 und bevorzugter bei ca. 6,3 bis ca. 7,4 liegt.
Die chemische Bindung von VEGF kann die kovalente Bindung an die Oberfläche des Substrats mit reaktiven Mitteln wie Glutaraldehyd und andere allgemeine Vernetzungsmittel beinhalten. Ein typisches Verfahren zur chemischen Bindung von VEGF an die Oberfläche eines Gewebes macht von Glutaraldehyd Gebrauch, das Proteine durch zwei Aldehydgruppen vernetzt. Da Glutaraldehyd typischerweise zum Fixieren einiger biokompatibler Materialien verwendet wird, kann die unspezifische Vernetzung zum Binden des VEGF an das biokompatible Material gleichzeitig mit dem Fixieren des Gewebes durchgeführt werden. Alternativ kann die unspezifische Vernetzung zum kovalenten Binden des VEGF als ein separater Schritt vor oder nach Abschluss eines Fixierungsvorgangs erfolgen, unter der Annahme, dass ein Fixierungschritt stattfindet. Zu anderen chemischen Reagenzien zur kovalenten Bindung von VEGF an ein Substrat gehören zum Beispiel Epoxidharze.
Vorzugsweise findet die Bindung von VEGF an ein Substrat mit einem Vernetzungsmittel unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen statt, um eine Inaktivierung des VEGF zu vermeiden. Speziell findet die Vernetzung vorzugsweise mit einer verdünnten Lösung des Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, statt. Die Vernetzung erfolgt vorzugsweise mit einer Konzentration des Vernetzungsmittels von weniger als etwa 0,1% Vernetzungsmittel, vorzugsweise von weniger als etwa 0,05% Vernetzungsmittel und bevorzugter von etwa 0,005% bis etwa 0,02% Vernetzungsmittel. Gemäß dem konventionellen Gebrauch in der Technik basieren die Prozentwerte auf einer Volumen-pro-Volumen-Verdünnung einer konzentrierten Volumenprozent-Stammlösung, im Allgemeinen eine 50 Vol.-% Stammlösung.
Die Vernetzung kann wenigstens etwa 5 Minuten lang stattfinden und wird gewöhnlich etwa 15 Minuten lang bis etwa 24 Stunden oder länger durchgeführt. Insbesondere kann die Vernetzung von VEGF mit dem Substrat vorzugsweise über einen Zeitraum von weniger als etwa 1 Stunde und bevorzugter zwischen etwa 15 Minuten und etwa 30 Minuten stattfinden. Es wurde beobachtet, dass sich das Ausmaß der VEGF-Bindung, wie anhand der Fähigkeit von VEGF zur Stimulierung der Endothelzellproliferation in vitro nachgewiesen, mit Bezug auf die Vernetzungszeit relativ schnell einpendelt. Bevorzugte Vernetzungszeiten können empirisch anhand der vorliegenden Offenbarung beurteilt werden.
Unter den hierin beschriebenen bevorzugten milden Bedingungen wird das Gewebe gewöhnlich nicht wesentlich fixiert. Auf Wunsch kann eine Größenausschlussmembran wie ein Dialyseschlauch während der simultanen Inkubation von VEGF und Glutaraldehyd verwendet werden. Es kann z.B. ein Dialyseschlauch mit einer molekularen Ausschlussgrenze von 10.000 verwendet werden, um das Substrat und die VEGF-Lösung in einem relativ kleinen Volumen zu halten. Der Schlauch mit dem Substrat und dem VEGF kann in eine verdünnte Glutaraldehydlösung eingetaucht werden. Das Glutaraldehyd kann den Dialyseschlauch durchdringen, aber die VEGF-Lösung bleibt aufgrund ihrer größeren Molekülgröße innerhalb des Schlauchs. Dieses verfahren ermöglicht die Verwendung eines kleinen Volumens von VEGF und eines relativ größeren Volumens der Vernetzungslösung.
Andererseits kann die chemische Bindung von VEGF an das Substrat spezifische Bindungsinteraktionen einschließen. Bei einer entsprechenden Auswahl können die spezifischen Bindungsinteraktionen zum Targetieren bestimmter Orte innerhalb des Substrats verwendet werden. Das Targetieren bestimmter Orte kann zum Beispiel von Nutzen sein, wenn bestimmte Orte gegen eine Besiedelung von Endothelzellen resistent sind oder wenn eine Besiedelung durch Endothelzellen an bestimmten Orten besonders vorteilhaft ist. Ein Beispiel für einen möglichen Zielort wären die Flügel einer Herzklappenprothese.
Ein Verfahren zum Targetieren eines speziellen Ortes schließt die Verwendung von Linkern ein, die bestimmte zelluläre oder extrazelluläre Bindungsorte innerhalb eines natürlichen Gewebes targetieren. In bestimmten Ausgestaltungen wird der Linker kovalent an das VEGF-Molekül gebunden und der Linker assoziiert sich mit dem Gewebe durch eine Mehrzahl nicht kovalenter Interaktionen. Alternativ kann der Linker kovalent an das Gewebe gebunden werden und der VEGF kann mit dem Linker über eine Mehrzahl nicht kovalenter Interaktionen assoziiert werden. Es kann eine Auswahl an handelsüblichen Antikörpern und anderen spezifischen Bindungsreagenzien als Linker verwendet werden. Alternativ können Antikörper durch konventionelle Techniken präpariert werden.
Ein VEGF-Polypeptid mit einem angelagerten Antikörper oder irgendeinem anderen vergleichbaren Targetierungsmolekül oder eine konstruierte Chimäre des VEGF-Polypeptids und Targetierungsmoleküls wird im Hinblick auf die vorliegende Anmeldung als ein VEGF-Molekül angesehen. Die chemische Bindung von Verbindungen an Antikörper sowie die Entwicklung von Chimären ist allgemein anerkannt, besonders dort, wo die Verbindung ein Protein ist. Es können empirische Anpassungen vorgenommen werden, um zu gewährleisten, dass die Aktivität des VEGF-Moleküls nicht wesentlich beeinträchtigt wird.
In einer alternativen Ausgestaltung kann eine fotochemische Kopplung zur kovalenten Kopplung verwendet werden. Die fotochemische Kopplung basiert auf der Verwendung von hochenergetischem Licht, z.B. ultraviolettes Licht, um reaktive Intermediate bestimmter funktioneller Gruppen zu bilden. Diese reaktiven Intermediate können Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen zwei Zusammensetzungen bilden. Funktionelle Arylketongruppen sind in dieser Hinsicht besonders nützlich.
Die fotochemische Kopplung kann zum Anlagern von VEGF an Gewebe verwendet werden (siehe z.B. Dunkirk et al., J. Biomaterials Applications 6: 131–156 (1991)), hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Das Gewebe kann separat vernetzt werden oder auch nicht, da die fotochemische Kopplung das Gewebe gewöhnlich auch vernetzt, d.h. Fotofixierung. Alternativ kann die fotochemische Kopplung verwendet werden, um einen Linker entweder vor, nach oder während der Bindung des Linkers an das VEGF-Polypeptid anzulagern.
Unabhängig von der Art der Interaktion, befindet sich der gebundene VEGF im Allgemeinen im Gleichgewicht zu ungebundenen Molekülen. Folglich kann der VEGF schließlich an die umliegende Lösung verloren gehen, wenn die Lösung nachgefüllt wird. In einigen Anwendungsbereichen kann es ausreichen, wenn der VEGF über einen relativ kurzen Zeitraum, wie Stunden oder Tage, gebunden wird, wenn genügend lebensfähige Endothelzellen auf dem Gewebe im Laufe der relevanten Zeit proliferieren. In anderen Situationen kann eine längerfristige Bindung des VEGF an das Gewebe, wie über Monate oder Jahre, erwünscht sein. Die Art der Assoziation des VEGF mit dem Gewebe kann entsprechend ausgewählt werden.
D. Andere Modifizierer
Es kann wünschenswert sein, zusätzlich zu VEGF andere Moleküle mit dem Substrat zu assoziieren, um die Leistung des Substrats in einer Prothese zu verbessern. Eine Endothelisation infolge der Verbindung von VEGF mit dem Substrat kann das Auftreten einer Kalzifizierung und Infektion reduzieren. Dennoch kann, da die Kalzifizierung eine Hauptausfallart für bioprothetisches Gewebe ist, VEGF in Verbindung mit einer biokompatiblen Antikalzifizierungsbehandlung verwendet werden. Es kann daher erwünscht sein, Agenzien einzubeziehen, deren Aufgabe es ist, die Kalzifizierung und/oder mikrobielle Infektion weiter zu reduzieren.
Ethanol ist eine bewährte Antikalzifizierungsbehandlung, wie in Vyavahare et al., Circulation 95: 479–488 (1997) und im US-Patent 5,746,775 von Levy et al. beschrieben ist. Zusammen verwendet, können Ethanol und VEGF die Produktion eines langfristig lebensfähigen Gewebes erleichtern, wobei Ethanol einen frühen Kalzifizierungsbeginn hinauszögert und VEGF die Endothelschicht stimuliert. Beispiel 4 demonstriert die Fähigkeit der Ethanolbehandlung, die Kalzifizierung von Glutaraldehyd-vernetzten Schweineaortenklappenflügeln in einem subkutanen Implantationsmodell mit Jungratten zu inhibieren. Dieses Beispiel zeigt außerdem, dass eine Behandlung dieser Flügel mit VEGF zusätzlich zu Ethanol die Kalzifizierung weiter abschwächen kann. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Aluminium-, Eisen- und Magnesiumionen die Kalzifizierung reduzieren. Diese mehrwertigen Ionen können direkt mit Gewebe assoziiert werden, wie im US-Patent 5,094,661 von Levy et al. beschrieben ist.
In bestimmten bevorzugten Ausgestaltungen werden die mehrwertigen Kationen mit nur einem Abschnitt des Substrats assoziiert. Vor allem für Gewebeherzklappen kann es erwünscht sein, die Ionen nur mit der Klappenwand zu assoziieren, wie die Aortenwand für eine Aortenklappe, während die Flügel nicht mit den Ionen behandelt werden. Vorzugsweise würde die gesamte Gewebeklappe mit dem VEGF behandelt. Eine Behandlung nur eines Abschnitts einer Prothese mit einer Lösung, wie eine Lösung, die mehrwertige Kationen enthält, ist weiter in der gleichzeitig anhängigen und ebenfalls im Besitz der Anmelderin befindlichen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/850.812 von Williams et al. mit dem Titel „Differential Treatment of Prosthetic Devices" beschrieben.
Alternativ können die mehrwertigen Ionen mit exogenen Speicherstrukturen assoziiert werden, die wiederum mit dem Substrat assoziiert sind. Die Verwendung exogener Speicherstrukturen zur Speicherung von Antikalzifikationsmetallionen ist in den mitanhängigen und ebenfalls im Besitz der Anmelderin befindlichen Patentanmeldungen Serien-Nr. 08/595,402 und 08/690,661 beschrieben. Ebenso wurden bestimmte Metalle wie Silber mit antimikrobieller Aktivität in Zusammenhang gebracht. Exogene Speicherstrukturen können zum Speichern geeigneter antimikrobieller Metallionen in Verbindung mit einem Substrat verwendet werden, wie in der mitanhängigen und ebenfalls im Besitz der Anmelderin befindlichen Patentanmeldung Serien-Nr. 08/787,139 beschrieben ist. Bevorzugte exogene Speicherstrukturen beinhalten z.B. Ferritin und andere Metallspeicherproteine. Die exogenen Speicherproteine können mit dem Substrat auf Arten und Weisen assoziiert werden, die denen für VEGF angewendeten ähnlich sind. Die Aktivitäten sollten sich nicht gegenseitig behindern.
E. In-vitro-Anlagerung von Endothelzellen
Das Wachstum lebensfähiger Endothelzellen auf Prothesen vor der Implantation in einen Patienten kann in vitro durch Verbinden von VEGF mit einem Substrat unterstützt werden. Zum Reduzieren der Möglichkeit einer Transplantatabstoßung, sind die zur In-vitro-Endothelisation verwendeten Endothelzellen vorzugsweise autologe Zellen, d.h. Zellen vom endgültigen Empfänger. Geeignete Zellen könnten zum Beispiel von Fettgewebe des Patienten geerntet werden. Der Ernteprozess kann eine Fettabsaugung, gefolgt von einem Kollagenaseverdau und einer Reinigung von mikrovaskulären Endothelzellen beinhalten. Ein geeigneter Prozess ist ausführlicher in S. K. Williams „Endothelial Cell Transplantation", 4: 401–410 (1995) und in den US-Patenten 4,883755, 5, 372, 945 und 5,628,781 beschrieben. Gereinigte Endothelzellen können in einem angemessenen Wachstumsmedium wie M199E (z.B. Sigma Cell Culture, St. Louis, MO) unter Zugabe von autologem Serum suspendiert werden.
Prothetisches Gewebe mit gebundenem VEGF kann in einer gerührten Zellsuspension über einen Zeitraum von Stunden bis Tage inkubiert werden, um eine Endothelzellimpfung zu ermöglichen. Eine Zellimpfung erbringt eine zufällige Anlagerung von Endothelzellen, die proliferieren, um die Oberfläche des prothetischen Substrats entweder vor oder nach der Implantation in den Patienten zu überziehen. Alternativ kann das prothetische Substrat unter einem Druckgradient über einen Zeitraum von Minuten inkubiert werden, um eine Zelldurchtränkung zu fördern. Ein geeignetes Verfahren zur Zelldurchtränkung kann von einem für Gefäßtransplantate im S. K. Williams Artikel, supra, beschriebenen Verfahren adaptiert werden. Die Zelldurchtränkung kann eine Monolayer von Zellen auf der Oberfläche des prothetischen Gewebes hervorrufen.
Darüber hinaus kann das prothetische Gewebe in ein Kultursystem gesetzt werden, wo die Endothelzellen des Patienten auf die Oberfläche des prothetischen Substrats von angrenzenden Kunststoffgewebekulturflächen migrieren können. Findet unter Bedingungen mit physiologischer Scherspannung eine Anlagerung oder Migration von Endothelzellen statt, dann können die die Oberfläche des Substrats besiedelnden Endothelzellen angemessene Adhäsionsproteine exprimieren, die es den Zellen ermöglichen, nach der Implantation fester zu adhärieren.
F. Lagerung, Verpackung, Vertrieb und Gebrauch
Nach dem Binden des VEGF an das Substrat kann das möglicherweise zu einer Prothese geformte Substrat gelagert werden. Das Substrat weist vorzugsweise kein Einwachsen lebensfähiger Zellen auf, wenn das Substrat für eine längere Lagerung vorgesehen ist. Bevorzugte Lagerungstechniken minimieren das Risiko einer mikrobiellen Kontamination. Das modifizierte Substrat kann zum Beispiel in einem verschlossenen Behälter mit sterilem Puffer und/oder Salzlösung aufbewahrt werden.
In einem verschlossenen Behälter wird das modifizierte Substrat keiner kontinuierlichen Fluidzufuhr ausgesetzt. Dennoch sollte ein mögliche Verlust von VEGF oder VEGF-Aktivität vom Substrat bei der Lagerung in Erwägung gezogen werden. Besteht die Möglichkeit eines übermäßigen Verlusts, dann kann die Lagerungsdauer angemessen begrenzt werden, um den Verlust auf einem akzeptablen Niveau zu halten.
Für den Vertrieb werden die Prothesen gewöhnlich in verschlossene und sterile Behälter gegeben. Die Behälter können mit einem Datum versehen werden, das die maximale empfohlene Lagerungsdauer unter Berücksichtigung eines möglichen Verlusts oder Abbaus von VEGF-Aktivität reflektiert. Die Behälter werden an Angehörige des medizinischen Berufs zur operativen Implantation der Prothesen vertrieben. Eine In-vitro-Assoziation von Zellen mit einer VEGF-modifizierten Prothese findet vorzugsweise in Krankenhäusern statt, in denen die Zellen des Patienten entnommen werden können, um in einem Zellkultursystem verwendet zu werden.
Als Alternative zur obigen Lagerungs- und Vertriebsmethode kann die VEGF-Modifikation bei Bedarf in einem Krankenhaus oder einem anderen vom Herstellungsort getrennten Ort durchgeführt werden. In diesen Situationen wird die zur VEGF-Modifikation hergestellte Prothese vertrieben und die VEGF-Assoziation wird zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt. Nach dem Modifizieren der Prothese mit VEGF kann sie implantiert, für eine angemessene Zeitdauer (bis zu einem Monat oder länger) gelagert oder in ein Zellkultursystem eingeführt werden, um Zellen, vorzugsweise autologe Zellen, an die VEGF-modifizierte Prothese anzugliedern.
In bestimmten spezifischen bevorzugten Ausgestaltungen werden die präparierte Prothese, eine VEGF-Lösung und eine Vernetzungslösung (bei Bedarf) in getrennten Behältern entweder als Kit, um zusammen verwendet zu werden, oder als getrennte Artikel zur Verwendung in gewünschten Kombinationen ausgeliefert. Insbesondere kann die VEGF-Lösung mit Instruktionen zur Modifizierung eines Substrats mit dem VEGF ausgeliefert werden. Die Prothese und die Lösungen werden unmittelbar vor dem Gebrauch kombiniert.
Nach einer Inkubation der Prothese in den Lösungen über den vorgegebenen Zeitraum wird die Prothese aus der Lösung genommen, mit einer sterilen Salzlösung abgespült und in den Patienten implantiert.
Der Einbau von VEGF in eine Prothese zur Förderung der Endothelisation eines Substrats müsste die Biokompatibilität des Substrats nach der Implantation verbessern. Insbesondere kann eine ruhende Endothelzellmonolayer als eine Barriere gegen Infektion, Inflammation und Kalzifikation dienen. Die Endothelisation einer Prothese kann auch eine weitere Rezellularisierung der Prothese mit Zellen unterstützen, die das Gewebe reparieren und ummodellieren können. Folglich können Haltbarkeit und Langlebigkeit einer Prothese wesentlich verbessert werden. Schließlich kann eine Rezellularisierung eine Prothese hervorbringen, die einem nativen, biologisch kompetenten Gewebe ähnlicher ist.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Direkte VEGF-Assoziation
Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit von VEGF zur Assoziation mit vernetztem Gewebe und die entsprechende Wirksamkeit von VEGF zur Stimulierung der Angliederung lebensfähiger Endothelzellen an das Gewebe.
Es wurden mehrere Lösungen zubereitet. Die Glutaraldehydlösung wurde in einem 5-Liter-Volumen durch Zugabe von 19,3 g NaCl, 70,0 g Natriumcitrat, 2,5 g Zitronensäure, 50 ml von 50 Vol.-% Glutaraldehyd (Electron Spectroscopy Sciences, Fort Washington, PA) und ausreichend im Umkehrosmoseverfahren gereinigtes Wasser (RO-Wasser) zubereitet. Eine VEGF-Lösung wurde durch Verdünnen einer 50 μg/ml Stammlösung von VEGF (humaner rekombinanter VEGF₁₆₅, R&D Systems, Minneapolis, MN) mit 5 ml einer 30 mM HEPES-gepufferten Salzlösung (HBSS von Clonetics, San Diego, CA) auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml zubereitet. Eine HEPES-gepufferte Salzlösung wurde durch Zugabe von 17,4 g NaCl und 35,7 g HEPES-freier Säure zu drei Liter RO-Wasser hergestellt. Eine 80%ige Ethanollösung wurde zubereitet, indem 1,8 g NaCl, 3,8 g HEPES-freie Säure, 1684 ml 95%iges Ethanol (Worum Chemical, Saint Paul, MN, Katalog Nr. 200115) und 316 ml RO-Wasser zur Herstellung von 2 Liter Lösung kombiniert wurden. Alle Lösungen wurden vor dem Gebrauch sterilfiltriert.
Zum Präparieren der Proben wurden 75 Schweineherzklappenflügel von geernteten Schweineherzklappen entfernt. Die Flügel wurden über Nacht bei 4°C in 0,9%iger steriler Salzlösung aufbewahrt. Dann wurden die Flügel in Citrat-gepufferter Glutaraldehydlösung mindestens 6 Tage lang Glutaraldehyd-vernetzt. Die Glutaraldehydlösung wurde im Laufe des Vernetzungsverfahrens zweimal gewechselt, nach 24 Stunden und nach drei Tagen. Die vernetzten Flügel wurden in HEPES-gepuffertem Glutaraldehyd bei Raumtemperatur entweder 5 Tage lang, gefolgt von einer Behandlung mit Ethanol (35 Flügel), oder 46 Tage lang (40 Flügel) aufbewahrt.
Wie oben erwähnt, wurden fünfunddreißig Flügel aus dem Glutaraldehyd genommen und mit Ethanol behandelt. Nach der Entnahme aus dem Glutaraldehyd wurden diese Flügel in 500 ml HEPES-gepufferter Salzlösung 10 Minuten lang inkubiert. Diese Salzlösung wurde abgegossen und die Flügel wurden in 500 ml frischer HEPES-gepufferter Salzlösung zusätzliche 15 Minuten inkubiert. Nach der Beseitigung der zweiten Salzlösung wurden die Flügel einmal mit 80% Ethanol abgespült und dann in 500 ml einer 80%igen Ethanollösung 15 Minuten lang getränkt. Anschließend wurde die erste Ethanollösung durch entsprechende frische 500 ml einer 80%-Ethanollösung ersetzt und die Flügel wurden in der zweiten Ethanollösung etwa 24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach 24 Stunden in Ethanol wurden die Flügel mit HEPES-gepufferter Salzlösung abgespült und dann in HEPES-gepufferter Salzlösung 15 Minuten lang getränkt. Nach dem Wechseln der Lösung wurden die Flügel in HEPES-gepufferter Salzlösung 24 Stunden lang getränkt. Die Flügel wurden dann in einen Aufbewahrungsbehälter gegeben, der HEPES-gepufferte Salzlösung enthielt. Die Flügel im Aufbewahrungsbehälter wurden einer Gammasterilisation durch SteriGenics (Charlotte, SC) unterzogen. Durch die Gammabestrahlung wurden die Flügel in HEPES-gepufferter Salzlösung braun. Nach der Sterilisation wurden die Flügel in diesem Behälter bei 4°C bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt.
Sowohl mit Ethanol behandelte als auch nicht mit Ethanol behandelte, Glutaraldehyd-vernetzte Flügel wurden aus der Lagerung genommen und halbiert. Die zerschnittenen Flügel wurden dreimal mit 100 ml einer 0,9%igen sterilen Salzlösung abgespült. Nach den Spülungen wurden sechs der mit Ethanol behandelten und sechs der nicht mit Ethanol behandelten Flügelhälften in HBSS mit 100 ng/ml VEGF inkubiert. Die Flügel wurden in der VEGF-Lösung über Nacht bei 4°C inkubiert.
Vier Sechs-Well-Platten wurden mit 2% Gelatine (Sigma Chemical, St. Louis, MO) und EGM-Medium (Clonetics, San Diego, CA) präpariert, um das Zellwachstum zu fördern. Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) von Clonetics (Chargen-Nr. 2803) wurden in den jeweiligen 24 Wells bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Vierundzwanzig Stunden nach dem Erreichen von Konfluenz wurde ein sterilisierter Gummiwischer zum Abschaben der Zellen vom Zentrum jedes Wells verwendet. Medium, das die Zellbruchstücke enthielt, wurde entfernt und durch frisches EGM-Medium ersetzt. Jedes Well wurde durch Lichtmikroskopie untersucht, um sicherzustellen, dass Zellen vom Zentrum der jeweiligen Wells entfernt waren.
Flügelhälften wurden in das freigeschabte Zentrum jeder Platte gesetzt und entweder normales EGM-Medium oder EGM-Medium mit 10 ng/ml VEGF wurde gemäß dem folgenden Protokoll zugegeben:

1) kein Flügel, Medium ohne VEGF (3 Wells);
2) kein Flügel, Medium mit VEGF (3 Wells);
3) mit Ethanol behandelter Flügel, Medium ohne VEGF (4 Wells);
4) mit Ethanol behandelter Flügel, Medium mit VEGF (4 Wells);
5) mit Ethanol und VEGF behandelter Flügel, Medium ohne VEGF (4 Wells);
6) nicht mit Ethanol behandelter Flügel, Medium ohne VEGF (2 Wells); und
7) mit VEGF behandelter, nicht mit Ethanol behandelter Flügel, Medium ohne VEGF (4 Wells).

Flügelhälften, die nicht mit VEGF vorbehandelt wurden, wurden dreimal mit steriler Salzlösung abgespült, wie zuvor beschrieben. Die mit VEGF vorbehandelten Flügel waren vor der Behandlung mit VEGF abgespült worden und erhielten vor dem Platzieren in ein Well keine zusätzlichen Spülungen.
Es wurde eine fünfte Sechs-Well-Platte verwendet, in der HUVECs auf der oberen Membran von Gewebekulturinserts kultiviert wurden, die in die jeweiligen Wells gesetzt wurden. Nachdem die Zellen auf dieser Membran Konfluenz erreicht hatten, wurde mit einem sterilen Skalpell ein Loch in das Zentrum jeder Insertmembran geschnitten. Ein Flügel wurde auf den Boden jedes Wells gesetzt und das Insert wurde über den Flügel gesetzt, so dass die Ränder des Lochs in der Insertmembran auf dem Flügel ruhten. Jedes Well wurde mit 2 ml EGM-Medium befüllt. Auf dieser Platte waren zwei der Flügel mit Ethanol behandelt und nicht mit VEGF behandelt, zwei Flügel waren mit Ethanol behandelt und dann mit VEGF behandelt und zwei Flügel waren mit VEGF behandelt, aber nicht mit Ethanol.
Nach etwa 5 Stunden wurde das Medium in allen Wells der fünf Platten ausgetauscht. Man ließ die Zellen dann insgesamt etwa fünf Tage lang wachsen, wobei jeden zweiten Tag frisches Medium zugegeben wurde. Nach vier Tagen wurden alle Wells mit einem Lichtmikroskop untersucht. Da die Flügel undurchsichtig sind, ließ diese Technik keine Visualisierung von an den Flügeln angelagerten Zellen zu. Es konnten auch keine auf der Oberseite der Inserts gewachsenen Zellen gesehen werden, da diese Membranen ebenfalls undurchsichtig waren. In Anbetracht dieser Beschränkungen wurden die folgenden Beobachtungen gemacht:

1) in Wells ohne Flügel gewachsene Zellen waren weiter gewachsen, bedeckten den freigeschabten Bereich und waren wieder fast konfluent;
2) die meisten Zellen in den Wells mit Glutaraldehyd-Flügeln ohne weitere Behandlungen waren tot; und
3) mit Ethanol behandelte Flügel schienen nicht zytotoxisch zu sein.

Nach fünf Tagen wurde die Hälfte der Gewebeproben zweimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (Gibco BRL, Grand Island, NY) abgespült. Die abgespülten Proben wurden mit 3%iger Formaldehydlösung wenigstens fünf Minuten lang fixiert. Die fixierten Proben wurden dreimal mit RO-Wasser und einmal mit 0,25 M Saccharose abgespült.
Eine 5 mM Stammlösung einer fluoreszierenden, lipophilen Sonde, Dioctadecyltetramethylindocarbocyaninperchlorat (Dil) von Molecular Probes Inc., Eugene, OR (Katalog Nr. D-282), wurde durch Zugabe von 0,00467 g Dil-Pulver zu 1 ml Dimethylsulfat (DMS) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt. Dil ist ein Zellmembranfärbemittel. Das Röhrchen wurde zum Auflösen des Pulvers verwirbelt. Das Röhrchen wurde bei Raumtemperatur in Aluminiumfolie gewickelt und fern von Lichtquellen gelagert. Eine 50 μM Lösung von Dil wurde durch Zugabe von 150 μl der 5 mM Stammlösung zu 15 ml einer 0,25 M Saccharoselösung in einem Zentrifugenröhrchen hergestellt. Das Röhrchen wurde verwirbelt, um die Lösung zu mischen. Die verdünnte Dil-Lösung wurde am Tag des Gebrauchs frisch zubereitet.
Die Gewebeproben wurden durch Bedecken jedes abgespülten Flügels in seinem Well mit ausreichend 50 μM Dil-Lösung fluoreszierend gefärbt. Die Platten wurden mit Aluminiumfolie bedeckt, um Lichteinwirkung zu verhindern. Die Flügel wurden wenigstens etwa 15 Minuten lang, aber nicht mehr als etwa 25 Minuten lang gefärbt. Anschließend wurden die Proben viermal mit RO-Wasser abgespült. Nach dem Abspülen wurde 0,9%ige Salzlösung zu jeder Probe gegeben, um sie vor dem Austrocknen zu schützen, und die Proben wurden mit Aluminiumfolie bedeckt, um Bleichen vor der Untersuchung zu verhindern. Die gefärbten Gewebeproben wurden mit einem Tetramethylrhodaminisothiocyanat-(TRITC)-Filter abgebildet und fotografiert.
Es wuchsen keine Zellen auf den mit Ethanol behandelten Flügeln und keine Zellen wuchsen auf den unbehandelten Flügeln, mit Ausnahme von ein paar Zellen, die auf einer Probe in Kontakt mit einem Membraninsert wuchsen. Ebenso stimulierten 10 ng/ml VEGF in Lösung nicht die Angliederung von Zellen an das Gewebe. Es wurde lediglich Hintergrundfluoreszenz bei Flügeln ohne Zellen im Rahmen der Untersuchung durch den TRITC-Filter beobachtet. Flügel mit an der Oberfläche adsorbiertem VEGF wiesen Kolonien von hell fluoreszierenden Zellen auf, die an die Flügel angelagert waren, was auf eine Stimulation von Endothelzellmigration in Richtung auf den Flügel und Adhärenz am Flügel hinwies. Dies ist in 1 für einen repräsentativen Flügel in direktem Kontakt zu Endothelzellen auf einem Membraninsert und in 2 für einen repräsentativen Flügel dargestellt, der in einen Abschnitt eines Wells platziert wurde, der anfänglich frei von Endothelzellen war. Durch die Verwendung eines Inserts wurden die Ergebnisse nicht qualitativ verändert.
Ähnliche Ergebnisse wurden in anderen Experimenten erhalten, in denen Glutaraldehyd-vernetzte Flügel in 100 ng/ml VEGF inkubiert wurden. Insbesondere erhöhte VEGF sowohl die Besiedelung der Flügel mit HUVEC als auch mit humanen Aortenendothelzellen über einen Zeitraum von fünf bis dreißig Tagen in Kultur. Zusätzliche Experimente zeigten außerdem, dass VEGF überaus effektiv war, wenn er an Flügel adhäriert wurde, die vor der Inkubation mit VEGF weniger als einen Monat lang in HEPES-gepufferter Gutaraldehydlösung aufbewahrt wurden.
Beispiel 2 – Glutaraldehyd-Vernetzung von VEGF mit ethanolbehandeltem, vernetztem Gewebe
Dieses Beispiel zeigt, dass eine schwach konzentrierte Glutaraldehydlösung VEGF effektiv mit ethanolbehandeltem, Glutaraldehyd-vernetztem Gewebe vernetzt, ohne dass die Fähigkeit von VEGF zur Stimulation der Endothelzellproliferation und -chemotaxis verloren geht.
Alle Lösungen wurden am Tag des Gebrauchs frisch zubereitet und durch einen 0,25-μm-Filter filtriert. Eine HEPES-gepufferte Salzlösung bestand aus 0,1 M NaCl und 50 mM HEPES in im Umkehrosmoseverfahren gereinigtem Wasser (RO-Wasser). Der pH-Wert der HEPES-gepufferten Salzlösung wurde auf 7,4 eingestellt. Eine 0,01% Glutaraldehydlösung wurde durch Zugabe von 20 μl einer 50 Vol.-% Stammlösung von Glutaraldehyd (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) zu 100 ml HEPES-gepufferter Salzlösung zubereitet. Eine VEGF/Glutaraldehydlösung wurde durch Zugabe von 2 μg VEGF (humaner rekombinanter VEGF₁₆₅, R&D Systems, Minneapolis, MN) zu 20 ml der 0,01% Glutaraldehydlösung hergestellt, woraus eine Lösung mit 100 ng/ml VEGF und 0,01% Glutaraldehyd hervorging.
Acht Glutaraldehyd-vernetzte und mit Ethanol behandelte Flügel wurden wie im Beispiel 1 beschrieben präpariert und mit steriler Salzlösung abgespült. Drei Flügel wurden in der VEGF/Glutaraldehydlösung 15 Minuten lang inkubiert und drei Flügel wurden in der VEGF/Glutaraldehydlösung 30 Minuten lang inkubiert. Die restlichen zwei Flügel wurden in HEPES-gepufferter Salzlösung aufbewahrt und dienten als Kontrollen. Nach den Inkubationsperioden wurden die Flügel dreimal in steriler 0,9%iger Salzlösung zwei Minuten lang pro Spülung abgespült.
Mehrere Tage vor der Inkubation der behandelten Flügel wurden zwei Sechs-Well-Gewebekulturplatten, die mit 2% Gelatine beschichtet waren, mit humanen Aortenendothelzellen (Clonetics, San Diego, CA) beimpft. Die Endothelzellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, wobei jeden zweiten Tag frisches Endothelwachstumsmedium (EGM) (Clonetics, San Diego, CA) zugegeben wurde. Vor der Zugabe der Gewebeprobe zu den Gewebekulturplatten wurde der mittlere Abschnitt jedes Gewebekulturwells durch Abschaben von Endothelzellen befreit. Jedes Well wurde zweimal mit EGM abgespült, um Zellbruchstücke zu entfernen.
Unmittelbar nach der VEGF-Inkubation und Abspülung der Flügel wurden die Flügel in den freigeschabten Abschnitt der Wells gesetzt – jeweils ein Flügel pro Well. Sterile Gewebekulturinserts (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden über die Flügel gesetzt, um sie am Aufschwimmen zu hindern. Frisches EGM wurde jeden zweiten Tag zu den Wells gegeben. Nach fünf Tagen wurden die Flügel in 3%iges Formaldehyd gegeben, um eventuelle Zellen zu fixieren, die an der Oberfläche der Flügel adhärierten. Die Flügel wurden dann mit einer fluoreszierenden lipophilen Sonde, Dioctadecyltetramethylindocarbocyaninperchlorat (Molecular Probes, Eugene, OR), wie im Beispiel 1 beschrieben gefärbt.
Die gefärbten Proben wurden mit einem Tetramethyl-Rhodaminisothiocyanatfilter abgebildet und fotografiert. Die entweder 15 Minuten (3B) oder 30 Minuten (3C) lang in der VEGF/Glutaraldehydlösung inkubierten Flügel wiesen eine signifikante Anzahl von Endothelzellen auf, die die Oberfläche der Flügel im Vergleich zu den Kontrollflügeln (3A) besiedelten. Folglich schien die Verwendung von 0,01% Glutaraldehyd zum Vernetzen von VEGF mit der Oberfläche eines ethanolbehandelten Flügels auf Endothelzellen, die diesen Flügel besiedelten, keine zytotoxische Wirkung zu haben. Darüber hinaus unterstützte VEGF die Endothelzellbesiedelung des behandelten Gewebes. Es ist signifikant, dass die Ethanolbehandlung der Flügel die Bindung von VEGF unter diesen Umständen nicht verhinderte, da zuvor gezeigt wurde, dass eine Ethanolbehandlung von Glutaraldehyd-vernetztem Gewebe die Biokompatiblität verbessert und die Kalzifizierung des Gewebes nach der Implantation hemmt.
Ähnliche Ergebnisse wurden in anderen Experimenten erzielt, in denen In-vitro-Assays für einen Vergleich der Fähigkeit humaner Aortenendothelzellen zur Besiedelung von unbehandeltem oder behandeltem, Glutaraldehyd-vernetztem Gewebe verwendet wurden. Glutaraldehyd-vernetztes Gewebe ohne Ethanol- oder VEGF-Behandlung war ein schlechtes Substrat für humanes Endothelzellwachstum, wie in den 4A und 5A dargestellt ist. Die Mikrofotografien in 4 wurden nach dem Fixieren von Zellen, die am Gewebe adhärierten, mit 3% Formalin und fluoreszierendem Färben erhalten. Die Mikrofotografien in 5 wurden nach dem Fixieren von am Gewebe adhärierten Zellen mit phosphatgepufferter, 2%iger Glutaraldehydlösung über einen Zeitraum von mindestens 24 Stunden erhalten. Anschließend wurde das Gewebe seriell dehydratisiert mit Ethanol und mit einer abschließenden Dehydratisierung mit Hexamethyldisilizan. Proben wurden an SEM-Stutzen befestigt und mit Goldpalladium beschichtet. Die Gewebeproben wurden mit einem Hitachi^TM 450 Rasterelektronenmikroskop abgebildet.
Eine Inkubation von Glutaraldehyd-vernetztem Gewebe in 80% Ethanol, wie im Beispiel 1 beschrieben, verbessert die Biokompatibilität, so dass das ethanolbehandelte Gewebe größere Kolonien von Endothelzellen trägt, wie die 4B und 5B zeigen. Rasterelektronenmikrofotografien dieser Proben zeigen jedoch, dass die an ethanolbehandeltem Gewebe adhärierenden Endothelzellen eine runde Morphologiecharakteristik von lose adhärierten oder sterbenden Zellen haben (5B). Wenn die ethanolbehandelten Flügel einer zusätzlichen 30-minütigen Inkubation in einer Lösung aus 100 ng/ml VEGF/0,01% Glutaraldehyd wie oben beschrieben unterzogen werden, dann ist das VEGF-behandelte Gewebe zu einer schnelleren und kompletteren Endothelisation in der Lage, wie in den 4C und 5C dargestellt ist. Im Gegensatz zu den Zellen, die in den anderen Behandlungsgruppen erkennbar sind, zeigen Rasterelektronenmikrofotografien, dass Endothelzellen, die an VEGF-behandeltem Gewebe adhärieren, wesentlich stärker ausgebreitet sind (5C). Diese ausgebreitete Morphologie weist auf eine gesündere Endothelzellauskleidung hin.
Beispiel 3 – Glutaraldehyd-Vernetzung von VEGF mit frischem Gewebe
Dieses Beispiel demonstriert, dass eine schwach konzentrierte (0,01%) Glutaraldehydlösung verwendet werden kann, um VEGF an frisches Schweineaortenflügelgewebe anzulagern, ohne dass die Fähigkeit von VEGF zur Stimulation der Endothelzellproliferation und -chemotaxis verloren geht.
Eine HEPES-gepufferte Salzlösung, eine 0,01%ige Glutaraldehydlösung und eine VEGF/Glutaraldehydlösung wurden wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Sechs Schweineaortenflügel wurden mit einer sterilen Operationstechnik geerntet und in 0,9%iger steriler Salzlösung gespült. Zwei der Flügel wurden in 10 ml HEPES-gepufferter Salzlösung inkubiert. Zwei andere Flügel wurden in 10 ml einer 0,01%igen Glutaraldehydlösung inkubiert. Die übrigen zwei Flügel wurden in 10 ml VEGF/Glutaraldehydlösung inkubiert. Alle Flügel wurden in ihren jeweiligen Lösungen 30 Minuten lang inkubiert. Am Ende der 30-minütigen Inkubationsperiode wurden die Flügel dreimal in 100 ml einer 0,9%igen sterilen Salzlösung gespült. Jeder Spülvorgang wurde zwei Minuten lang durchgeführt.
Mehrere Tage vor der Behandlung der Flügel wurde eine mit 2% Gelatine beschichtete Sechs-Well-Gewebekulturplatte mit humanen Aortenendothelzellen (Clonetics, San Diego, CA) beimpft. Man ließ die Endothelzellen bis zur Konfluenz wachsen und jeden zweiten Tag wurde frisches EGM (Clonetics, San Diego, CA) zu den Wells gegeben. Im Laufe der 30-minütigen Inkubationsperiode für die Flügel wurde der mittlere Abschnitt jedes Gewebekulturwells durch Abschaben von Endothelzellen befreit. Die Wells wurden dann mit frischem EGM abgespült, um Zellbruchstücke zu entfernen. Unmittelbar nach der 30-minütigen Inkubationsperiode und den folgenden Spülungen wurde ein Flügel in den freigeschabten Teil jedes Gewebekulturwells gesetzt. Sterile Gewebekulturinserts (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden über die Flügel gesetzt, um sie am Aufschwimmen zu hindern. Frisches EGM wurde zugegeben und die Gewebekulturplatte wurde zurück in einen Gewebekulturinkubator gegeben.
Frisches EGM wurde jeden zweiten Tag zu den Wells gegeben. Die Inkubation wurde fünf Tag lang fortgesetzt. Am Ende der fünftägigen Periode wurden Zellen, die an der Oberfläche der Flügel adhärierten, mit 3% Formaldehyd fixiert. Die Flügel wurden dann mit einer fluoreszierenden lipophilen Sonde, Dioctadecyltetramethylindocarbocyaninperchlorat (Molecular Probes, Eugene, OR), wie im Beispiel 1 beschrieben gefärbt.
Die gefärbten Gewebeproben wurden mit einem Tetramethylrhodaminisothiocyanatfilter abgebildet und fotografiert. Die Fotografien sind in den 6A–6C dargestellt. Einige Kolonien von Endothelzellen wurden auf Gewebe beobachtet, das entweder in HEPES-gepufferter Salzlösung oder in 0,01% Glutaraldehyd inkubiert worden war. Flügel, die in der VEGF/Glutaraldehydlösung inkubiert wurden, wiesen weit mehr Endothelzellen auf, die das Gewebe besiedelten, wie bei einem Vergleich von 6C mit 6A und 6B zu sehen ist. Folglich hatte die Inkubation in einer gepufferten Lösung aus 0,01%igem Glutaraldehyd mit 100 ng/ml VEGF keinen negativen Effekt auf das Überleben humaner Aortenendothelzellen und beschleunigte die Endothelzellbedeckung von Schweinaortengewebe.
Beispiel 4 – VEGF-induzierte Inhibition einer Flügelkalzifizierung
Dieses Beispiel demonstriert, dass eine kombinierte Behandlung von Glutaraldehyd-vernetzten Schweineaortenklappenflügeln mit sowohl VEGF als auch Ethanol die Kalzifizierung dieser Flügel inhibieren kann, wie anhand eines subkutanen Implantationsmodells mit Jungratten beurteilt wurde.
Es hat sich gezeigt, dass ein subkutanes Implantationsmodell mit Jungratten einer klinisch relevanten Herzklappenkalzifizierung sehr ähnlich ist (Levy et al., Am. J. Pathol. 113: 143–155 (1983)). Folglich wird das Modell zum Beurteilen des Kalzifizierungspotentials von Flügeln verwendet, die verschiedenen Prozessen oder Oberflächenmodifikationen ausgesetzt werden.
Die Herstellung aller Lösungen und die Behandlung der Flügel in diesen Lösungen erfolgten wie ausführlich in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Kurz, 45 Flügel wurden von Schweineaortenklappen geerntet und in 0,5% Citratgepuffertem Glutaraldehyd vernetzt. Fünfzehn dieser Flügel (die Kontrollgruppe) wurden in HEPES-gepufferter Salzlösung bis kurz vor der Implantation aufbewahrt. Die restlichen 30 Flügel wurden in einer 80%igen Ethanollösung 24 Stunden lang inkubiert und dann durch Gammabestrahlung sterilisiert. Während und nach der Gammabestrahlung wurden die Flügel in HEPES-gepufferter Salzlösung aufbewahrt. Fünfzehn der mit Ethanol behandelten Flügel (die Ethanol- und VEGF-Gruppe) wurden am Tag der Implantation in einer Lösung aus 0,01%igem Glutaraldehyd/100 ng/ml VEGF-Lösung 30 Minuten lang inkubiert.
Vor der Implantation wurden alle Flügel dreimal in 100 ml steriler 0,9%iger Salzlösung etwa zwei Minuten lang pro Spülung gespült. Mit einer aspetischen Technik wurden die Flügel dann mit sterilem, farbigem Nahtmaterial kodiert, um die Flügel der jeweiligen drei Gruppen voneinander zu unterscheiden (weiß = Kontrollgruppe, grün = Ethanolgruppe, schwarz = Ethanol- und VEGF-Gruppe). Die kodierten Flügel wurden in steriler Salzlösung aufbewahrt und zum Ramsey Animal Laboratory im Regions Hospital in Saint Paul, MN geschickt, wo die subkutane Implantation stattfand.
Die Operationsverfahren fanden unter aseptischen Bedingungen statt. Drei Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden durch interperitoneale Injektion von Ketaminhydrochlorid anästhesiert und vier subkutane Taschen mit einem Durchmesser von mindestens 2 cm wurden in die mittlere Abdominalwand jeder Ratte geschnitten. Vier Flügel wurden in die subkutanen Taschen jeder Ratte implantiert – ein Flügel pro Tasche. Jede Ratte erhielt wenigstens einen, aber nicht mehr als zwei Flügel von jeder Behandlungsgruppe. Die Wunden wurden mit chirurgischen Klammern verschlossen, dann ließ man die Ratten sich erholen. Die Flügel wurden entweder 21 Tage (10 Flügel in jeder Behandlungsgruppe) oder 63 Tage (5 pro Behandlungsgruppe) lang implantiert. Am Ende der Implantationsperiode wurden die Proben den Ratten entnommen. Die gewonnen Proben wurden in steriler Salzlösung aufbewahrt und zur Analyse verschickt.
Jede Gewebeprobe wurde entlang der Radialachse in der Hälfte durchgeschnitten. Eine Hälfte der Gewebeprobe wurde von Wirtsgewebe, das aus der Einkapselungsreaktion während der Implantation resultierte, gereinigt und dehydratisiert. Die dehydratisierten Proben wurden einer Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES) zur Bestimmung des Calciumgehalts unterzogen. Die zweite Hälfte jeder Gewebeprobe wurde in 10% Formalin gegeben und den American Histo Labs (Gaithersburg, MD) für eine histologische Probenpräparation unter Verwendung von Von-Kossa-Färbemittel übergeben, um Calciumphosphatkristalle speziell zu färben.
7 ist ein Plot der durchschnittlichen Ergebnisse des ICP-AES Assays mit Bezug auf den Calciumgehalt. Die Ethanolbehandlung inhibierte sowohl bei 21 als auch 63 Tagen signifikant die Kalzifizierung. Durch Zugabe von VEGF zur Ethanolbehandlung wurde die Kalzifizierung weiter abgeschwächt. 8 zeigt repräsentative Fotografien aus der histologischen Analyse von Gewebeproben im Hinblick auf Calciumphosphat unter Verwendung von Von-Kossa-Färbemittel. Die Fotografien in 8 bestätigen die Inhibition der Kalzifizierung durch Ethanol und die synergistische Inhibition der Kalzifizierung durch die Ethanol/VEGF-Kombination.
Die oben beschriebenen Ausgestaltungen sollen illustrativ und nicht begrenzend sein. Zusätzliche Ausgestaltungen liegen im Rahmen der Ansprüche. Die vorliegende Erfindung wurde zwar mit Bezug auf bevorzugte Ausgestaltungen beschrieben, doch wird die Fachperson erkennen, dass Änderungen an Form und Detail möglich sind.

Claims

Prothese, die ein Gewebe und einen vaskulären Endothelwachstumsfaktor umfasst, wobei der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor kovalent an das Gewebe unter Verwendung von Vernetzungsmitteln gebunden wird, wobei der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor die Assoziation von lebensfähigen Zellen mit dem Gewebe stimuliert.
Prothese nach Anspruch 1, wobei das Gewebe menschliches Gewebe umfasst.
Prothese nach Anspruch 1, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus Schweinegewebe, Rindergewebe, Kängurugewebe, Hundegewebe und Kombinationen davon.
Prothese nach Anspruch 1 für einen menschlichen Patienten, wobei das Gewebe Allograftgewebe, Xenograftgewebe oder synthetisches Gewebe umfasst.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Assoziation zwischen dem Gewebe und dem vaskulären Endothelwachstumsfaktor spezifische Bindungsinteraktionen einschließt.
Prothese nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Assoziation zwischen dem Gewebe und dem vaskulären Endothelwachstumsfaktor unspezifische Bindungsinteraktionen einschließt.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Gewebe vernetztes Gewebe umfasst.
Prothese nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Gewebe nicht vernetztes Gewebe umfasst.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor ein Protein umfasst, das ausgewählt ist aus bVEGF164, bVEGF120, bVEGF165, hVEGF121, VEGF II, hVEGF80, VEGF-B, VEGF2, modifizierten aktiven Formen davon und Kombinationen davon.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor ein Virusprotein umfasst.
Prothese nach Anspruch 10, wobei das Virusprotein ein Tat-Protein umfasst.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, die eine Herzklappenprothese umfasst.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Vernetzung Glutaraldehydanteile einschließt.
Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel bifunktionelle Aldehyde umfasst.
Prothese nach Anspruch 14, wobei das bifunktionelle Aldehyd Glutaraldehyd umfasst.
Prothese nach den Ansprüchen 1 bis 13, wobei das Vernetzungsmittel Epoxidharze umfasst.
Ex-vivo-Verfahren zum Assoziieren von Endothelzellen mit einer Prothese, das das Inkontakbringen einer Prothese nach einem der vorherigen Ansprüche mit einer Zellkultur beinhaltet, die Endothelzellen umfasst.