CN114377194A - 一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料及其应用。该绷带或敷料含有干细胞外泌体和水凝胶，水凝胶通过特定基团与外泌体相连。该绷带或敷料中含有的水凝胶表面进行了修饰，使得干细胞外泌体能够通过化学结合的方式黏附在水凝胶表面，在不增加水凝胶的厚度的基础上，显著提高外泌体在水凝胶表面的吸附量，外泌体与水凝胶的结合更加牢固，能够延缓外泌体的脱落、流失以及释放，提高其持续作用效果，能够更好地应用在口腔等狭窄褶皱的部位，在制备用于预防和/或治疗与皮肤损伤有关的适应症的面膜、眼膜、敷贴中具有极其重要的作用，这些适应症包括放射性皮炎、放射性黏膜炎、皮肤光老化中的至少一种。

Description

一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料及其应用
技术领域
本发明涉及医疗绷带或敷料领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料及其应用。
背景技术
皮肤作为人体免疫系统的第一道屏障，在保护身体免受外部侵害方面发挥着重要作用。然而，在日常生活中，皮肤容易因各种原因的损害导致创伤的发生，例如由于放射线照射引起的放射性皮炎和放射性黏膜炎、紫外线照射导致的皮肤光老化等。放射线照射引起的放射性皮炎和放射性黏膜炎会引起皮肤和粘膜坏死，最终导致溃疡的形成，并严重影响接受放射性治疗患者和从事放疗工作者的健康，常用的治疗方法主要包括用含抗菌物质、激素等的洗剂和软膏进行清洗和涂抹。紫外线照射导致的皮肤光老化会直接引起弹力纤维和胶原纤维变质，导致皮肤出现皱纹、松弛和斑点等，目前常用的治疗方法主要包括射频、强脉冲光和化学剥脱、物理磨削、软组织填充、肉毒素注射、中胚层疗法等。然而，上述这些治疗方法仅能缓解症状，均存在疗效差、疗程长、损伤大等副作用，对皮损的预防和修复效果有限。
水凝胶是由天然或合成聚合物组成的含水三维网络，其具有多孔性和亲水性结构，能够确保气体交换和流体平衡，为伤口提供水分，改善伤口愈合环境进而促进细胞增殖分化，并最终使伤口重新上皮化。同时，水凝胶可以模仿细胞外基质的结构，是支持组织向内生长并使得伤口最终愈合的优良支架。
目前，水凝胶材料已广泛应用于绷带或敷料中。有研究将外泌体悬液和水凝胶混匀制备得到含有外泌体的水凝胶敷料，使外泌体能够在水凝胶降解的过程中进行缓释，通过这种方法制备的水凝胶敷料中的外泌体浓度很低，在其接触皮肤黏膜的表面时，对皮肤黏膜的修复效果较差，为了提高外泌体的浓度通常会增加水凝胶的厚度来包载更多的外泌体，这会限制了水凝胶在口腔等狭窄褶皱部位的使用。也有研究将外泌体物理性滴加于水凝胶表面，外泌体由于缺乏固定，使得水凝胶表面吸附的外泌体量有限，外泌体容易从水凝胶中脱落或流失，起不到缓释作用，浪费了宝贵的外泌体，并且作用效果受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料及其应用，该绷带或敷料上含有的干细胞外泌体浓度高，并且外泌体是通过化学键合的方式吸附在水凝胶上的，能够可克服物理吸附引起的外泌体容易脱落和流失的问题，延缓了外泌体的释放。
根据本发明的第一个方面，提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，该绷带或敷料含有干细胞外泌体和水凝胶，水凝胶通过含有如下通式Ⅰ的基团与外泌体相连，
Figure 564036DEST_PATH_IMAGE001
，式Ⅰ；
基团含有Y，Y的末端含有用于与干细胞外泌体键合的基团。
本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料中含有干细胞外泌体和水凝胶，对水凝胶表面进行修饰，使得干细胞外泌体和水凝胶能够通过化学结合的方式黏附在水凝胶表面，显著提高外泌体在水凝胶表面的吸附量，并且外泌体与水凝胶的结合更加牢固，能够延缓外泌体的脱落和流失，进而延缓外泌体的释放，提高外泌体的持续作用效果。
优选地，水凝胶为聚乙烯醇水凝胶。
本方案采用的水凝胶为聚乙烯醇（PVA）水凝胶，与其他的水凝胶相比，PVA水凝胶的结构更加稳定，其在水中吸收大量水分后发生溶胀的同时还能维持其原有结构，具有良好的生物相容性。而与其他的生物材料相比，PVA水凝胶在性质上类似细胞外基质，吸水后对周围组织的摩擦和机械作用减小，其生物学性能得到显著的改善。
优选地，Y的末端含有用于与干细胞外泌体键合的氨基或环氧基。
本方案涉及的Y的末端含有氨基或环氧基，能够与外泌体表面的基团化学键合，使得外泌体能够固定在水凝胶上，不易从水凝胶的表面脱落。
优选地，上述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料还含有无纺纤维膜，水凝胶包括两个背对设置的第一表面和第二表面，无纺纤维膜与水凝胶的第一表面相复合，外泌体与第二表面的Y的末端键合。
本方案通过在用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料下方加固无纺纤维膜，能够增加水凝胶敷料的机械强度，特别是当水凝胶的厚度变薄时，容易导致断裂和破损，通过在水凝胶的下方复合无纺纤维膜，能够克服水凝胶用于绷带或敷料中时存在的机械强度低的缺陷。
优选地，无纺纤维膜通过以下步骤与水凝胶的第一表面相复合：向用于制备水凝胶的原料中加入去离子水，加热溶解后滴加于无纺纤维膜的其中一个表面上，以使无纺纤维膜的其中一个表面上复合水凝胶。
本方案采用滴加的方式在无纺纤维膜上复合水凝胶，与直接在制备好的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的下方直接复合无纺纤维膜相比，本方案提供的方式能够降低绷带或敷料在与无纺纤维膜复合过程中水凝胶出现断裂和破损的风险，并且使水凝胶与无纺纤维膜的复合效果更好。
优选地，上述绷带或敷料的厚度≤120μm。
优选地，上述绷带或敷料的厚度≤100μm
本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料无需增加水凝胶的厚度也能够吸附大量的干细胞外泌体，其水凝胶以及得到的绷带或敷料的厚度均较薄，可以更好地应用在口腔等狭窄褶皱的部位。
根据本发明的第二个方面，提供上述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料在制备用于预防和/或治疗与皮肤损伤有关的适应症的产品中的应用，适应症包括放射性皮炎、放射性黏膜炎、皮肤光老化中的至少一种。
将本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷贴应用于制备治疗放射性皮炎和放射性黏膜炎的预防、促进光老化皮肤年轻化、皮肤损伤的修复和再生的产品中，能够有效预防由于放射线照射引起的放射性皮炎和放射性黏膜炎，促进光老化皮肤恢复年轻化，同时还能够避免医源性皮肤损伤的发生，对各种因素导致的皮肤损伤具有良好的预防和修复作用。
优选地，上述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料中含有的干细胞外泌体为工程化外泌体。
优选地，上述工程化外泌体含有与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA。
本方案将与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA电转进入干细胞外泌体中或者利用其构建得到表达载体，利用表达载体和lipo3000转染干细胞，使得干细胞分泌的外泌体中含有与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA，将上述两种方法得到的工程化外泌体用于本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料中，能够提高其对皮肤损伤的预防和修复效果，并且能够进一步促进光老化皮肤恢复年轻化。
优选地，上述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料在制备用于预防和/或治疗与皮肤损伤有关的适应症的产品中的应用中，产品包括面膜、眼膜、敷贴中的至少一种。
根据本发明的第三个方面，提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备水凝胶；
（2）将硅烷偶联剂和乙醇混合均匀，得到混合液；
（3）将干细胞外泌体与PBS缓冲液混合均匀，得到干细胞外泌体悬液；
（4）将水凝胶浸入步骤（2）制得的混合液中至硅烷偶联剂负载在水凝胶上，得到表面含有偶联基团的改性水凝胶，偶联基团的通式为：
Figure 654614DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，水凝胶与偶联基团的硅氧键相连，偶联基团含有Y，Y的末端含有用于与干细胞外泌体键合的基团；
（5）将改性水凝胶浸入干细胞外泌体悬液中，以使干细胞外泌体通过与偶
联基团键合负载在改性水凝胶上，得到用于预防和/或治疗皮肤损伤的敷料。
优选地，在步骤（2）中，硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷或γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
本方案采用的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷或γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，两者分别含有氨基和环氧基，有利于与干细胞外泌体表面上的基团进行键合，提高外泌体在水凝胶表面的吸附稳定性。
优选地，在步骤（1）中，水凝胶包括两个背对设置的第一表面和第二表面，水凝胶的第一表面上复合有无纺纤维膜，水凝胶的第一表面与无纺纤维膜通过以下方式进行复合：向用于制备水凝胶的原料中加入去离子水，加热溶解后滴加于无纺纤维膜的其中一个表面上，以使水凝胶的第一表面上复合有无纺纤维膜。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料上含有的干细胞外泌体浓度高，并且外泌体是通过化学键合的方式吸附在水凝胶上的，能够解决物理吸附导致的外泌体容易脱落和流失的问题，延缓了外泌体的释放，提高了外泌体的持续作用效果；
2.本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料能够起到促进软、硬组织的修复和再生、预防放射性皮炎/黏膜炎以及使光老化皮肤年轻化的作用，在制备用于皮肤损伤的预防和修复的产品中具有极其重要的意义；
3.本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的厚度≤120μm，在膜较薄的情况下依然能够吸附大量的干细胞外泌体，作用效果好，并且可以更好地应用在口腔等狭窄褶皱的部位；
4.本发明通过无纺纤维膜对薄层水凝胶进行加固，在不增加水凝胶厚度的基础上提高了绷带或敷料的机械强度，使其能够更好地应用于绷带或敷料中；
5.本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或胶敷料的制备工艺简单，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备流程图；
图2为干细胞外泌体的提取流程图；
图3为用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料（接枝氨基）的制备原理图；
图4为改性聚乙烯醇水凝胶的红外光谱图；
图5为改性聚乙烯醇水凝胶的染色图；
图6为改性聚乙烯醇水凝胶的蛋白吸附性能图；
图7为用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的扫描电镜图；
图8为用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的共聚焦显微镜图；
图9为通过放疗诱导的口腔出现黏膜炎溃疡模型应用本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料后的修复情况图；
图10为大鼠口腔黏膜炎溃疡应用本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料进行修复后的残余创面和伤口愈合率统计图；
图11为用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料（接枝环氧基）的制备原理图；
图12为加固了无纺纤维膜的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的结构示意图；
其中，1表示水凝胶，2表示无纺纤维膜；
图13为干细胞外泌体对细胞内和光老化相关的酶的表达水平的影响图；
图14为对干细胞进行转染分泌得到工程化外泌体的原理图；
图15为对干细胞外泌体进行电转得到工程化外泌体的原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其制备流程如图1所示，具体包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇（PVA-1779）加入去离子水中，使得PVA的浓度达到7%，煮沸溶解后于-20℃下冷冻12小时，室温解冻4小时，重复冷冻和解冻操作5次，得到聚乙烯醇水凝胶；
（2）利用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和乙醇制备得到混合液；
（3）利用戊二醛和去离子水配制得到质量分数为50%的戊二醛水溶液；
（4）将来源于脂肪干细胞的外泌体与PBS缓冲液混合均匀，得到干细胞外泌体悬液；
其中，来源于脂肪干细胞的外泌体是利用超高速离心进行提取得到的，提取流程如图2所示，具体包括以下步骤：利用无外泌体的血清制备的培养基培养脂肪干细胞48小时，收集上清液，300g离心10分钟并去除漂浮细胞，2000g离心10分钟去除死细胞，10000g离心30分钟去除细胞碎片，100000g离心70分钟后去除培养基，加入PBS缓冲液后100000g离心70分钟，收集的沉淀即为来源于脂肪干细胞的外泌体；
（5）将聚乙烯醇水凝胶放入步骤（2）制得的混合液中浸泡12小时，然后将浸泡后的聚乙烯醇水凝胶用乙醇清洗5次，将聚乙烯醇水凝胶放入步骤（3）制得的戊二醛水溶液中浸泡6小时，最后将聚乙烯醇水凝胶用去离子水清洗5次，得到改性聚乙烯醇水凝胶；
（6）将步骤（5）制得的改性聚乙烯醇水凝胶放入步骤（4）制得的干细胞外泌体悬液中浸泡24小时，得到用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料；
上述绷带或敷料的厚度为100μm。
上述聚乙烯醇水凝胶经过APTES修饰后，使得PVA分子上接枝了大量的氨基，之后将其浸泡于干细胞外泌体悬液中，水凝胶表面的氨基能够与外泌体表面的基团进行化学键合，从而实现外泌体在水凝胶上的固定，其原理如图3所示。
测试例1
本测试例的参试对象为实施例1中步骤（5）所制得的改性聚乙烯醇水凝胶（PVA-NH2），并以未经改性的聚乙烯醇水凝胶作为对照（PVA），对参试对象进行红外光谱分析和茚三酮染色。
为了验证聚乙烯醇水凝胶经过APTES修饰后是否在材料的表面成功接枝氨基，对步骤（5）制得的改性聚乙烯醇水凝胶进行红外光谱分析，结果如图4所示。由图4可知，在1563cm-1处出现了-NH2的面外弯曲伸缩振动峰，证明聚乙烯醇水凝胶的表面成功接枝了氨基。
此外，还利用茚三酮对改性聚乙烯醇水凝胶进行染色，染色结果如图5所示。由图5可知，改性聚乙烯醇水凝胶经茚三酮染色后呈现明显的蓝色，而未经APTES修饰的聚乙烯醇水凝胶则仍然保持透明、未见蓝染，进一步说明经过APTES修饰后的聚乙烯醇水凝胶的表面具有氨基。
测试例2
本测试例的参试对象为实施例1中步骤（5）所制得的改性聚乙烯醇水凝胶，对参试对象进行蛋白吸附性能检测。
在利用APTES对聚乙烯醇水凝胶进行修饰前，利用牛血清白蛋白（BSA）先对未经改性的聚乙烯醇水凝胶的蛋白吸附能力进行检测，发现聚乙烯醇水凝胶表面上含有的基团能够与BSA中的蛋白进行键合，使得BSA中的蛋白能够吸附在聚乙烯醇水凝胶的表面，说明聚乙烯醇水凝胶具有一定的蛋白吸附能力，再进行后续的实验，对聚乙烯醇水凝胶表面进行改性，接枝大量的氨基，发现经过改性的聚乙烯醇水凝胶表面由于含有大量的氨基，使得其吸附的蛋白量显著增加，上述结果如图6所示。由图6可知，未经改性的聚乙烯醇水凝胶（PVA）对BSA的吸附量为1.69μg/mg胶，改性聚乙烯醇水凝胶（PVA-NH2）对BSA中的蛋白吸附量为3.83μg/mg胶，这说明本发明利用APTES对聚乙烯醇水凝胶进行修饰后，能够增强蛋白在水凝胶上的吸附，进而说明聚乙烯醇水凝胶经过改性后能够吸附更多的外泌体，增加水凝胶表面的外泌体浓度。
测试例3
本测试例的参试对象为实施例1制得的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，利用扫面电镜对参试对象进行表面形貌观察。
利用扫面电镜对实施例1制得的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的表面形貌进行观察，结果如图7所示，其中，各扫描电镜图的参数设置如下：
a：Regulus 3.0kV 8.5mm×5.00kV SE(UL)；
b：Regulus 5.0kV 11.1mm×2.50k SE(UL)；
c：Regulus 5.0kV 10.2mm×5.00k SE(UL)；
d：Regulus 5.0kV 11.1mm×10.0k SE(UL)；
e：Regulus 5.0kV 10.2mm×20.0k SE(UL)。
图7的a表示未经APTES修饰的聚乙烯醇水凝胶表面形貌，图7的b、c、d、e分别表示经过APTES修饰的聚乙烯醇水凝胶与外泌体结合后在放大倍数为2.5k、5k、10k、20k下的表面形貌图，可见大量的外泌体吸附于经过APTES修饰的聚乙烯醇水凝胶材料的表面。
测试例4
为了研究在不同浓度的外泌体悬液下，外泌体与改性聚乙烯醇水凝胶的结合情况，分别采用外泌体浓度为107、108、109、1010个/mL（每mL外泌体悬液中含有的外泌体个数）的外泌体悬液与改性聚乙烯醇水凝胶结合，利用荧光共聚焦显微镜进行观察，结果如图8所示，图8的a、b、c、d分别表示浓度为107、108、109、1010个/mL的外泌体与改性聚乙烯醇水凝胶结合时的结果，可见随着外泌体浓度的增加，与改性聚乙烯醇水凝胶结合的外泌体数量也随之增加，这表明本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料虽然厚度薄，但是其含有的水凝胶表面能够吸附大量的外泌体，不易从膜上脱落或流失，能够起到很好的缓释作用。
测试例5
本测试例以大鼠作为模型动物，对大鼠进行放疗后诱导口腔黏膜炎溃疡，作为口腔黏膜溃疡模型，将实施例1所制得的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料应用于大鼠口腔黏膜炎溃疡部位，作为实验组，同时将未经APTES修饰、未结合外泌体的聚乙烯醇水凝胶应用于大鼠口腔黏膜炎溃疡部位，作为对照组。
实验结果如图9所示，图9的a和e分别表示正常大鼠的口腔，b和f分别表示通过放疗诱导后大鼠口腔出现黏膜炎的溃疡表面，c和d分别表示应用了实施例1所制得的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料第1天和第7天的溃疡表面，g和h分别表示应用未经APTES修饰、未结合外泌体的聚乙烯醇水凝胶第1天和第7天的溃疡表面。由图9可知，应用本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料后，在第7天时，大鼠口腔溃疡表面基本上恢复到正常状态，说明本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料对溃疡表面的修复效果显著优于普通的水凝胶。
此外，对大鼠口腔黏膜炎溃疡修复效果（残余创面和伤口愈合率）进行了统计，结果如图10所示。由图10可知，应用本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料第7天，溃疡部位的残余创面＜20%，并且伤口愈合率＞95%；而应用未经APTES修饰、未结合外泌体的聚乙烯醇水凝胶第7天，溃疡部位的残余创面接近60%，伤口愈合率仅达到40%左右。上述结果进一步说明，与未经APTES修饰、未结合外泌体的聚乙烯醇水凝胶相比，应用本发明提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料对皮肤损伤的修复效果显著。
实施例2
本实施例提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，制备方法包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇（PVA-1779）加入去离子水中，使得PVA的浓度达到7%，煮沸溶解后于-20℃下冷冻12小时，室温解冻4小时，重复冷冻和解冻操作5次，得到聚乙烯醇水凝胶；
（2）利用γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH560）和乙醇制备得到体积分数为2%的KH560溶液；
（3）将来源于脂肪干细胞的外泌体与PBS缓冲液混合均匀，得到干细胞外泌体悬液；
（4）将聚乙烯醇水凝胶浸入步骤（2）制得的KH560溶液中，调节pH=3~5，在80℃下反应2小时，反应结束后将聚乙烯醇水凝胶用乙醇清洗5次以洗净残余的未反应物质，得到改性聚乙烯醇水凝胶；
（5）将步骤（4）制得的改性聚乙烯醇水凝胶放入步骤（3）制得的干细胞外泌体悬液中浸泡24小时，得到用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料；
上述绷带或敷料的厚度为100μm。
上述聚乙烯醇水凝胶经过KH560修饰后，使得PVA分子上接枝大量的环氧基团，之后将其浸泡于干细胞外泌体悬液中，水凝胶表面的环氧基团能够与外泌体表面蛋白化学键合，从而实现外泌体在水凝胶上的固定，其原理如图11所示。
实施例3
本实施例提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其模式图如图12所示，制备方法具体包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇（PVA-1779）加入去离子水中，使得PVA的浓度达到7%，煮沸溶解后滴加于无纺纤维膜表面，然后于-20℃下冷冻12小时，室温解冻4小时，重复冷冻和解冻操作5次，得到一面复合有无纺纤维膜的聚乙烯醇水凝胶；
（2）利用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和乙醇制备得到混合液；
（3）利用戊二醛和去离子水配制得到质量分数为50%的戊二醛水溶液；
（4）将来源于脂肪干细胞的外泌体与PBS缓冲液混合均匀，得到干细胞外泌体悬液；
（5）将一面复合有无纺纤维膜的聚乙烯醇水凝胶放入步骤（2）制得的混合液中浸泡12小时，然后将浸泡后的聚乙烯醇水凝胶用乙醇清洗5次，将聚乙烯醇水凝胶放入步骤（3）制得的戊二醛水溶液中浸泡6小时，最后将聚乙烯醇水凝胶用去离子水清洗5次，得到改性聚乙烯醇水凝胶；
（6）将步骤（5）制得的改性聚乙烯醇水凝胶放入步骤（4）制得的干细胞外泌体悬液中浸泡24小时，得到用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料；
上述绷带或敷料的厚度为120μm。
本实施例先在聚乙烯醇水凝胶的下方加固无纺纤维膜，再利用APTES对聚乙烯醇水凝胶进行改性，使得PVA分子上接枝了大量的氨基，之后将其浸泡于干细胞外泌体悬液中，水凝胶表面的氨基能够与外泌体表面的基团进行化学键合，从而实现外泌体在水凝胶上的固定。本实施例由于在绷带或敷料的下方加固了无纺纤维膜，在基本不增加水凝胶的厚度的基础上提高了绷带或敷料的机械强度，特别是当水凝胶的厚度变薄时，容易导致断裂和破损，通过在水凝胶的下方复合无纺纤维膜，能够克服水凝胶用于绷带或敷料中存在的机械强度低的缺陷，使得水凝胶能够更好地应用于绷带或敷料中。
测试例6
本测试的参试对象为实施例1中所使用的的来源于脂肪干细胞的外泌体，旨在证明干细胞外泌体对细胞内和光老化相关的酶的表达水平的影响。将成纤维细胞置于紫外线光照下一段时间，然后向其中加入干细胞外泌体，随后利用qPCR对和光老化相关的氧还原蛋白过氧化物酶1（PRDX1）、氧还原蛋白过氧化物酶2（PRDX2）、超氧化物歧化酶1（SOD1）以及过氧化氢酶（CAT）的表达水平进行检测，结果如图13所示，其中，正常的成纤维细胞作为对照组，经过紫外线照射的成纤维细胞作为实验组1，经紫外线照射的成纤维细胞加入干细胞外泌体处理作为实验组2。由图13可知，正常的成纤维细胞经过紫外线照射后，PRDX1、PRDX2、SOD1、CAT的表达下降，而在加入干细胞外泌体后，PRDX1、PRDX2、SOD1、CAT的表达增高。上述结果说明，干细胞外泌体能够使和光老化相关的PRDX1、PRDX2、SOD1、CAT的表达增高，将干细胞外泌体应用于绷带或敷料的制备中，使得绷带或敷料具有促进光老化皮肤恢复年轻化的作用。
实施例4
本实施例提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其与实施例1所制得的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的区别在于：本实施例使用的来源于脂肪细胞的外泌体为工程化外泌体，其制备原理如图14所示，具体操作步骤为：使用无抗生素的Opti-MEM培养基对脂肪干细胞进行培养，待细胞融合度达到50~60%时，在培养基中加入lipo3000、过表达cicrRNA质粒、miRNA mimics对脂肪干细胞进行转染，每24小时进行换液，一周之内进行超速离心提取得到工程化外泌体。
本实施例提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备过程中使用的外泌体为工程化外泌体，将与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA构建在质粒上，得到表达质粒，然后将表达质粒与lipo3000加入到干细胞培养体系中对干细胞进行转染，使得干细胞分泌的外泌体中含有与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA，将这种方法制得的工程化外泌体用于绷带或敷料的制备中，使其在皮肤损伤方面具有更加优异的预防和修复效果，将吸附有上述工程化外泌体的水凝胶用于绷带或敷料中，能够促进成纤维细胞的增殖和迁移，调节成纤维细胞的分化，从而加速皮肤黏膜的修复，减轻瘢痕组织的形成，并且能够提高与皮肤损伤、光老化相关的酶的表达水平。
实施例5
本实施例提供一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其与实施例1所制得的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的区别在于：本实施例使用的来源于脂肪细胞的外泌体为工程化外泌体，其制备原理如图15所示，具体操作步骤为：通过超速离心获取干细胞外泌体，将cicrRNA质粒和miRNA mimics加入到由磷酸钾、氯化钾和Opti-MEM培养基混合得到的电转缓冲液中，向其中加入干细胞外泌体，置于Gene Pulser X cell电转系统中进行电转，得到工程化外泌体。
本实施例提供的用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备过程中使用的外泌体为工程化外泌体，将与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA通过电转的方式转入干细胞外泌体中，使得干细胞外泌体中含有与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA，将这种方法制得的工程化外泌体用于绷带或敷料的制备中，使其在皮肤损伤方面具有更加优异的预防和修复效果，将吸附有上述工程化外泌体的水凝胶应用于绷带或敷料的制备中，能够促进成纤维细胞的增殖和迁移，调节成纤维细胞的分化，从而加速皮肤黏膜的修复，减轻瘢痕组织的形成，并且能够提高与皮肤损伤、光老化相关的酶的表达水平。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其特征在于：所述绷带或敷料含有干细胞外泌体和水凝胶，所述水凝胶通过含有如下通式Ⅰ的基团与所述外泌体相连，
Figure 899192DEST_PATH_IMAGE001
，式Ⅰ；
所述基团含有Y，所述Y的末端含有用于与所述干细胞外泌体键合的基团。
2.如权利要求1所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其特征在于：所述水凝胶为聚乙烯醇水凝胶。
3.如权利要求1所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其特征在于：所述Y的末端含有用于与所述干细胞外泌体键合的氨基或环氧基。
4.如权利要求1所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其特征在于：所述绷带或敷料还含有无纺纤维膜，所述水凝胶包括两个背对设置的第一表面和第二表面，所述无纺纤维膜与所述水凝胶的所述第一表面相复合，所述外泌体与所述第二表面的所述Y的末端键合。
5.如权利要求4所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其特征在于，所述无纺纤维膜通过以下步骤与所述水凝胶的所述第一表面相复合：向用于制备所述水凝胶的原料中加入去离子水，加热溶解后滴加于所述无纺纤维膜的其中一个表面上，以使所述无纺纤维膜的其中一个所述表面上复合所述水凝胶。
6.如权利要求1所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料，其特征在于：所述绷带或敷料的厚度≤120μm。
7.如权利要求1～6任意一项所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料在制备用于预防和/或治疗与皮肤损伤有关的适应症的产品中的应用，所述适应症包括放射性皮炎、放射性黏膜炎、皮肤光老化中的至少一种。
8.如权利要求7所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料在制备用于预防和/或治疗与皮肤损伤有关的适应症的产品中的应用，其特征在于：所述干细胞外泌体为工程化外泌体，所述工程化外泌体含有与促软组织生成和皮肤年轻化相关的cicrRNA和/或miRNA。
9.如权利要求7所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料在制备用于预防和/或治疗与皮肤损伤有关的适应症的产品中的应用，其特征在于：所述产品包括面膜、眼膜、敷贴中的至少一种。
10.一种用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备水凝胶；
（2）将硅烷偶联剂和乙醇混合均匀，得到混合液；
（3）将干细胞外泌体与PBS缓冲液混合均匀，得到干细胞外泌体悬液；
（4）将所述水凝胶浸入所述步骤（2）制得的混合液中至所述硅烷偶联剂负载在所述水凝胶上，得到表面含有偶联基团的改性水凝胶，所述偶联基团的通式为：
Figure 597021DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，所述水凝胶与所述偶联基团的硅氧键相连，所述偶联基团含有Y，所述Y的末端含有用于与所述干细胞外泌体键合的基团；
（5）将所述改性水凝胶浸入所述干细胞外泌体悬液中，以使所述干细胞外泌体通过与所述偶联基团键合负载在所述改性水凝胶上，得到所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料。
11.如权利要求10所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备方法，其特征在于：在所述步骤（2）中，所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷或γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
12.如权利要求10所述用于预防和/或治疗皮肤损伤的绷带或敷料的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，所述水凝胶包括两个背对设置的第一表面和第二表面，所述水凝胶的所述第一表面上复合有无纺纤维膜，所述水凝胶的所述第一表面与所述无纺纤维膜通过以下方式进行复合：向用于制备所述水凝胶的原料中加入去离子水，加热溶解后滴加于所述无纺纤维膜的其中一个表面上，以使所述水凝胶的所述第一表面上复合有无纺纤维膜。
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