CN110917386A - 干细胞海绵支架及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种干细胞海绵支架及制备方法和应用，涉及生物材料技术领域，本发明提供的干细胞海绵支架，包括纳米纤维海绵及负载于所述纳米纤维海绵上的干细胞，该干细胞海绵支架具有良好的压缩回弹性能，可以大量吸收伤口渗出液，保持伤口湿润，起到防护、止血、促进伤口愈合的作用。并且，三维纤维结构具有良好的网孔连通性、更大的内表面积和孔径，可以提高干细胞的负载数量。此外，本发明提供的干细胞海绵支架具有良好的生物活性、生物降解性和生物相容性，不引起炎症反应或过敏反应。

Description

干细胞海绵支架及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料和干细胞技术领域，尤其是涉及一种干细胞海绵支架及制备方法和应用。
背景技术
在战争、交通事故及其他突发事件引起的意外伤害中，难以控制的出血是造成死亡的重要原因，及时有效的止血在创伤急救和外科手术中十分重要。
传统的海绵支架包括纱布，止血带，绷带等，只能用于短时间内急救，对于大血管或大面积伤口的出血几乎无效。目前，市面上的海绵支架包括无机盐类、明胶类、氧化纤维素类、纤维胶原类等，但存在不足，如无机盐类海绵支架吸收水分后放热，不能体内降解；明胶类粘附性与机械性能较差；氧化纤维素类可能引起炎症反应；纤维胶原类可能引起过敏等不良症状等。常用的用于伤口愈合的聚合物包括聚环氧乙烷，聚氨酯和聚乳酸等，此类敷料可保持伤口的水分，保护组织免受机械损伤，但不能激活细胞反应，分泌细胞因子，促进伤口愈合，也不具备抗菌能力。目前对于能够快速止血，有效促进伤口愈合的静电纺丝纳米材料的研究仍比较少。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种干细胞海绵支架，以缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述干细胞海绵支架的制备方法，该方法简单易操作，塑形方便，制备得到的干细胞海绵支架具有较高的比表面积和孔隙率，可以提高干细胞的负载数量，便于应用。
本发明的第三个目的在于提供上述干细胞海绵支架或制备方法在制备创伤组织工程修复的产品中的应用。
本发明提供了一种干细胞海绵支架，所述干细胞海绵支架包括纳米纤维海绵及负载于所述纳米纤维海绵上的干细胞，所述纳米纤维海绵具有三维层状结构。
进一步的，所述纳米纤维海绵中纳米纤维的直径为144nm-311nm。
进一步的，所述干细胞海绵支架压缩至本体积的至多40％后，仍可恢复原状。
优选地，所述干细胞的负载量为103-105/cm2；
优选地，所述干细胞海绵支架还包括生长因子或牛血清白蛋白。
优选地，所述纳米纤维海绵包括以聚合物和生物来源材料为主要原料制备得到的纳米纤维海绵；
所述聚合物包括聚乳酸、聚己内酯或聚乙二醇中的一种或多种；
所述生物来源材料包括壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐或胶原蛋白中的一种或多种。
本发明还提供了上述的干细胞海绵支架的制备方法，在所述纳米纤维海绵上接种干细胞，得到所述干细胞海绵支架。
进一步的，将纳米纤维膜浸入发泡剂中进行发泡，得到具有三维层状结构的纳米纤维海绵；
优选地，将壳聚糖溶液和聚乳酸溶液混合均匀后将得到的混合溶液进行静电纺丝，得到纳米纤维膜；
优选地，将壳聚糖溶解于酸性溶液中，得到所述壳聚糖溶液；
优选地，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2％-5％；
优选地，所述壳聚糖的黏度为200-400mPa.s；
优选地，所述聚乳酸的重均分子量为30-40万；
优选地，所述酸性溶液为弱酸溶液，弱酸优选包括乙酸、碳酸、亚硝酸或次氯酸，更优选为乙酸，进一步优选为90％w/w-70％w/w的乙酸；
优选地，将聚乳酸溶于有机溶剂中，得到聚乳酸溶液；
优选地，所述聚乳酸溶液中聚乳酸的质量浓度为7％-10％；
优选地，所述混合溶液按质量百分含量包括壳聚糖溶液20％-40％和聚乳酸溶液60％-80％；
优选地，所述混合溶液中还含有生长因子和/或牛血清白蛋白；
优选地，每10mL混合溶液中含有10-20μg生长因子或质量比为1％-10％的牛血清白蛋白；
优选地，所述静电纺丝满足如下工艺条件中的至少一个：
电压为18KV-30KV，接收距离为10cm-20cm，流速为0.5-2ml/h。
进一步的，在发泡前将所述纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联；交联时间优选为8-12小时；
优选地，将交联后的纳米纤维膜进行干燥处理，然后再进行发泡。
进一步的，所述发泡剂包括硼氢化钠水溶液；
优选地，所述发泡的时间为5-12小时；
优选地，发泡后还依次包括去除发泡剂、干燥及杀菌的步骤，得到所述干细胞海绵支架。
进一步的，将干细胞悬浮液填充进纳米纤维海绵中接种干细胞；
优选地，将填充有干细胞悬浮液的纳米纤维海绵在细胞培养基中进行孵育。
另外，本发明还提供了上述的干细胞海绵支架或制备方法在制备创伤组织工程修复的产品中的应用。
本发明提供的干细胞海绵支架，包括纳米纤维海绵及负载于所述纳米纤维海绵上的干细胞，该干细胞海绵支架具有良好的压缩回弹性能，可以大量吸收伤口渗出液，保持伤口湿润，同时能为负载于纳米纤维海绵上的干细胞提供理想的微环境，提高干细胞的分泌活性和定向诱导分化能力，进而进一步起到防护、止血、促进伤口愈合的作用。并且，该干细胞海绵支架中纳米纤维海绵具有三维层状结构，三维纤维结构具有良好的网孔连通性、更大的内表面积和孔径，层与层之间的大孔直径可达100-400μm，可以提高干细胞的负载数量。此外，本发明提供的干细胞海绵支架具有良好的生物活性、生物降解性和生物相容性，不易引起炎症反应或过敏反应。因此，本发明提供的干细胞海绵支架在慢性创面修复领域具有非常好的应用前景。
本发明提供的上述干细胞海绵支架的制备方法，在所述纳米纤维海绵上接种干细胞，即可得到所述干细胞海绵支架。该方法工艺简单、操作方便，且原料来源广泛，适于大规模生产应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的干细胞海绵支架的三维层状结构示意图；
图2为本发明提供的干细胞海绵支架的层状部分和连接部分的电镜结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种干细胞海绵支架，所述干细胞海绵支架包括纳米纤维海绵及负载于所述纳米纤维海绵上的干细胞，所述纳米纤维海绵具有三维层状结构。
需要说明的是，本发明中的纳米纤维海绵指的是形状立体具有弹性，整体由纳米纤维组成的海绵，其可以为常规市售的纳米纤维海绵或本领域通常所述的纳米纤维海绵，例如以聚乳酸和壳聚糖为主要原料制备得到的纳米纤维海绵，本发明对此不作限定。
干细胞具有自我更新和多向分化能力，对组织有重建功能，并且由于其免疫源性弱，不易与宿主产生免疫排斥反应。将其负载于纳米纤维海绵上能够帮助伤口快速愈合，同时有效避免过敏或炎症反应。在本发明中，对负载的干细胞不做限定，例如可以为牙髓干细胞、脐带干细胞、脂肪干细胞或骨髓干细胞。由于脂肪来源的干细胞的来源充足、分离容易、产量高具有多向分化的潜能，由此优选负载脂肪干细胞。当干细胞的负载量为103-105/cm2时，能够最大化保证细胞的功能及响应。
与二维纳米纤维海绵材料相比，三维纤维结构具有良好的网孔连通性，与更大的内表面积和孔径。因此，三维纤维结构具有良好的物理性能、空间几何结构及生物相容性。本发明中的纳米纤维海绵为三维纳米纤维(如图1所示)，其三维结构一体成型，层与层之间高度连续，且每一单层都具有纳米纤维网状结构(如图2所示)，干细胞可负载于支架中的每一层上，使得该干细胞海绵支架可在例如神经再生、血管支架和骨再生等组织工程中具有重要作用。
本发明提供的干细胞海绵支架，具有良好的压缩回弹性能，可以大量吸收伤口渗出液，保持伤口湿润，同时能为负载于纳米纤维海绵上的干细胞提供理想的微环境，提高干细胞的分泌活性和定向诱导分化能力，进而进一步起到防护、止血、促进伤口愈合的作用。并且，该干细胞海绵支架中的三维纤维结构具有良好的网孔连通性、更大的内表面积和孔径，可以提高干细胞的负载数量。此外，本发明提供的干细胞海绵支架具有良好的生物活性、生物降解性和生物相容性，不易引起炎症反应或过敏反应。因此，本发明提供的干细胞海绵支架在慢性创面修复领域具有非常好的应用前景。
在一些优选的实施方式中，所述纳米纤维海绵中纳米纤维的直径为144nm-311nm，例如可以为，但不限于144nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm、280nm、300nm或311nm。该三维层状结构中，每层的纳米纤维在特定的直径范围下构成网状结构，具有较高的孔隙率。
相比较于普通的二维纳米纤维海绵支架，本发明提供的干细胞海绵支架具有良好的拉伸性能和弹性性能，优选压缩至本体积至多的40％后，仍可恢复原状。需要说明的是，上述压缩指的是纵向压缩，纵向是指垂直于具有层层形貌的方向；上述恢复原状指的是，压缩50个循环后，塑性应变至多为4.6％。
在一些优选的实施方式中，所述纳米纤维海绵包括以聚合物和生物来源材料为主要原料制备得到的纳米纤维海绵；
所述聚合物包括聚乳酸、聚己内酯或聚乙二醇中的一种或多种；
所述生物来源材料包括壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐或胶原蛋白中的一种或多种。
可以理解的是，纳米纤维海绵可以以聚乳酸和壳聚糖为主要原料制备得到，或者以聚己内酯和丝素蛋白为主要原料制备得到，或者以聚乙二醇和海藻酸盐为主要原料制备得到，或者以聚乳酸、聚己内酯和胶原蛋白为主要原料制备得到，或者以聚乳酸、聚己内酯和聚乙二醇与壳聚糖、丝素蛋白和海藻酸盐为主要原料制备得到等，凡是能够包含聚合物和生物来源材料作为原料进行制备的均在本发明的保护范围之内。
根据本发明的第二个方面，提供的上述干细胞海绵支架的制备方法，该方法包括在所述纳米纤维海绵上接种干细胞，得到所述干细胞海绵支架。
该方法工艺简单、操作方便，且原料来源广泛，适于大规模生产应用。
在一些优选的实施方式中，将纳米纤维膜浸入发泡剂中进行发泡，得到具有三维层状结构的纳米纤维海绵；
通过发泡反应将纳米纤维膜浸制备为具有三维层状结构的纳米纤维海绵，二维结构整体发泡为三维层状结构，不需要额外的材料做支撑，使得干细胞海绵支架的整体都是由纳米纤维组成，不仅综合了纳米纤维膜原料的优良功能和生物活性，还能够有效增加干细胞海绵支架的比表面积，每1mm厚度的纳米纤维膜可扩展为3.71-28.81mm的海绵支架，从而有效提高干细胞海绵支架的孔隙率和孔的连通性，改善营养物质运输和细胞的粘附、增殖、活性及其他功能。
在一些优选的实施方式中，将壳聚糖溶液和聚乳酸溶液混合均匀后得到的混合溶液进行静电纺丝，得到纳米纤维膜。
壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是由自然界中广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的一种阳离子多糖。壳聚糖分子表面带有正电荷，可以促进带负电荷的血小板与血红细胞的快速聚集，加速伤口处血液凝固。壳聚糖还具有良好的生物相容性与降解性，有一定的抗菌能力，无免疫源性。聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分而且可以再生。聚乳酸对人体有高度安全性并可生物降解被组织吸收，同时，聚乳酸还具有优良的物理机械性能。使用壳聚糖和聚乳酸作为原料制备纳米纤维膜，具有良好的生物活性、生物降解性和生物相容性，不易引起炎症反应或过敏反应。
静电纺丝是一种通过电场作用于聚合物溶液或熔体，产生直径低至纳米范围的聚合物纤维的过程。合成的纳米纤维具有较高的比表面积、孔隙率、拉伸强度和气体渗透性，具有较好的保湿作用，可以促进细胞呼吸，为伤口愈合提供优良环境。
优选地，将壳聚糖溶解于酸性溶液中，得到所述壳聚糖溶液。
对酸性溶液不做限定，通常优选为弱酸溶液，弱酸例如可以为，但不限于乙酸、碳酸、亚硝酸或次氯酸，更优选为乙酸，进一步优选为90％w/w-70％w/w的乙酸。
优选地，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2％-5％，例如可以为，但不限于2％、3％、4％或5％。
优选地，所述壳聚糖的黏度为200-400mPa.s，例如可以为，但不限于200mPa.s、220mPa.s、250mPa.s、280mPa.s、300mPa.s、320mPa.s、350mPa.s、380mPa.s或400mPa.s。
优选地，所述聚乳酸的重均分子量为30-40万，例如可以为，但不限于30万、32万、35万、38万或40万。
优选地，将聚乳酸溶于有机溶剂中，得到聚乳酸溶液。
对有机溶剂不做限定，本领域可接受的常规有机溶剂均可，例如苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚和三乙醇胺等，优选使用六氟异丙醇作为有机溶剂溶解聚乳酸。
优选地，所述聚乳酸溶液中聚乳酸的质量浓度为7％-10％，例如可以为，但不限于7％、8％、9％或10％。
通过对原料壳聚糖溶液和聚乳酸溶液进行进一步的限定，可以使得制备得到的纳米纤维膜具有更好的机械性能和愈伤能力。
优选地，所述混合溶液按质量百分含量包括壳聚糖溶液20％-40％和聚乳酸溶液60％-80％。在本实施方式中，混合溶液可以只含有壳聚糖溶液和聚乳酸溶液，且壳聚糖溶液和聚乳酸溶液的质量百分比之和为100％，例如壳聚糖溶液的质量百分含量例如可以为，但不限于20％、25％、30％、35％或40％，相对应地，聚乳酸溶液的质量百分含量例如可以为，但不限于80％、75％、70％、65％或60％。此外该混合溶液也可以除壳聚糖溶液和聚乳酸溶液外还含有其他的有助于提升干细胞海绵支架性能或愈伤功能的物质，例如生长因子和/或牛血清白蛋白，此时壳聚糖溶液、聚乳酸溶液和其他物质的质量百分比之和为100％。
通过对原料壳聚糖溶液和聚乳酸溶液的用量进行进一步的限定，可以使得制备得到的纳米纤维膜具有更好的机械性能和愈伤能力。
优选地，每10mL混合溶液中含有10-20μg生长因子，例如可以为，但不限于10μg、12μg、15μg、18μg或20μg，典型的生长因子如，碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子或转化生长因子中的一种或多种。或者，每10mL混合溶液中含有质量比为1％-10％的牛血清白蛋白，例如可以为，但不限于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在混合溶液中添加生长因子或牛血清白蛋白，能够进一步提高负载的干细胞的增值能力及活性，有助于坏损组织的修复。
静电纺丝装置包括高压电源、注射器、注射泵、针头、接收装置。将配制好的混合溶液置于注射器中，连接好电路。调整针头和收集装置的距离，调整施加的高压电压。当电压超过某个临界值后，溶液从针头呈丝状喷出，并迅速固化成纳米纤维膜，纳米纤维膜由铝箔纸作为收集装置收集。
优选地，所述静电纺丝满足如下工艺条件中的至少一个：
电压为18KV-30KV，接收距离为10cm-20cm，流速为0.5-2ml/h。
所述静电纺丝对混合溶液进行电喷丝的电压例如可以为，但不限于18KV、20KV、22KV、25KV、28KV或30KV；接收距离例如可以为，但不限于10cm、12cm、15cm、18cm或20cm；流速例如可以为，但不限于0.5ml/h、0.8mL/h、1mL/h、1.2mL/h、1.5mL/h、1.8mL/h或2mL/h。
在一些优选的实施方式中，在发泡前将所述纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联；交联时间优选为8-12小时，例如可以为，但不限于8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。
优选地，将交联后的纳米纤维膜进行干燥处理，以去除残留溶液，然后再进行发泡。对干燥处理的方式不做限定，本领域可接受的常规干燥方式均可，优选放入真空干燥箱中进行干燥。
优选地，所述发泡剂包括硼氢化钠水溶液，硼氢化钠在水溶液中先产生微小的气泡并扩散在单根的纳米纤维上，随后气泡逐渐变大以撑起每一单层的纳米纤维网络，采用硼氢化钠水溶液作为发泡剂进行发泡，发泡效果更好，能够得到层与层之间高度连续、且每一单层都具有纳米纤维网状结构的三维层状结构。优选采用0.1mol/L-1mol/L的硼氢化钠水溶液作为发泡剂。
优选地，所述发泡的时间为5-12小时，例如可以为，但不限于5小时、8小时、10小时或12小时。
优选地，发泡后还依次包括去除发泡剂、干燥及杀菌的步骤。具体地，可用去离子水冲洗数次去除发泡剂，将去除发泡剂后的三维层状纳米纤维海绵放入冷冻真空干燥机中干燥12-24小时，用该方法制备的干细胞海绵支架具有三维层状结构并且具有弹性。然后将干燥好的三维层状纳米纤维海绵经过紫外杀菌4小时。
在一些优选的实施方式中，将细胞悬浮液填充进纳米纤维海绵中接种。
优选地，将填充有干细胞悬浮液的纳米纤维海绵在细胞培养基中进行孵育，优选使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，在37℃，5％CO2下进行孵育。
此外，本发明还提供了上述的干细胞海绵支架或制备方法在制备创伤组织工程修复的产品中的应用。
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.2g黏度为200mPa.s的壳聚糖加入10mL 85％w/w的乙酸中溶解，将0.7g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比4：6混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为0.5mL/h，针头和接受装置的距离为10cm，二者之间的电压为18KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，10小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为20.34mm，纤维直径为144nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例2
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.4g黏度为200mPa.s的壳聚糖加入10mL 85％w/w的乙酸中溶解，将0.7g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1.5mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为27KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，5小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为16.66mm，纤维直径为247nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将骨髓来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例3
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.2g黏度为400mPa.s的壳聚糖加入10mL 85％w/w的乙酸中溶解，将0.7g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1.5mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为18KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，5小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为10.31mm，纤维直径为291nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例4
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.2g黏度为400mPa.s的壳聚糖加入10mL 90％w/w的乙酸中溶解，将0.7g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1.5mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为20KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，1小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为3.71mm，纤维直径为200.9nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将骨髓来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例5
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.2g黏度为300mPa.s的壳聚糖加入10mL 3％w/w的盐酸中溶解，将0.8g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1.5mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为20KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，5小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为9.32mm，纤维直径为274.2nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例6
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.5g黏度为300mPa.s的壳聚糖加入10mL 90％w/w的乙酸中溶解，将1g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比2:8混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为2mL/h，针头和接受装置的距离为20cm，二者之间的电压为30KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，10小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为25.7mm，纤维直径为167.3nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例7
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.5g黏度为200mPa.s的壳聚糖加入10mL 90％w/w的次氯酸中溶解，将0.7g重均分子量为40万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比2:8混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为0.5mL/h，针头和接受装置的距离为20cm，二者之间的电压为18KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联8小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入1mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，5小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为12.5mm，纤维直径为201nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将牙髓来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例8
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.2g黏度为400mPa.s的壳聚糖加入10mL 70％w/w的乙酸中溶解，将1g重均分子量为30万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比4:6混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为2mL/h，针头和接受装置的距离为10cm，二者之间的电压为30KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联12小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.5mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，12小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为28.1mm，纤维直径为311nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将骨髓来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例9
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.3g黏度为300mPa.s的壳聚糖加入10mL 80％w/w的乙酸中溶解，将0.5g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为25KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.5mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，8小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为18.7mm，纤维直径为4.12nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
实施例10
本实施例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.5g黏度为150mPa.s的壳聚糖加入10mL 60％w/w的乙酸中溶解，将0.5g重均分子量为45万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比1:1混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为2.5mL/h，针头和接受装置的距离为25cm，二者之间的电压为15KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联15小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入1.5mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，3小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为10.21mm，纤维直径为311nm的三维层状纳米纤维海绵。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
对比例1
本对比例提供了一种干细胞海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.3g黏度为300mPa.s的壳聚糖加入10mL 80％w/w的乙酸中溶解，将0.5g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为25KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出，得到厚度为1mm，纤维直径为4.12nm的纳米纤维膜。
(e)将脂肪来源的干细胞悬浮液填充进干细胞海绵支架中，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的培养基，并在37℃，5％CO2下进行孵育，三天后移植入皮肤缺损部位。
对比例2
本对比例提供了一种海绵支架，由如下步骤制备得到：
(a)将0.3g黏度为300mPa.s的壳聚糖加入10mL 80％w/w的乙酸中溶解，将0.5g重均分子量为35万聚乳酸溶于10mL六氟异丙醇中搅拌溶解。
(b)壳聚糖溶液和聚乳酸溶液按照重量比3:7混合均匀后注入注射器中，调节注射器的推进速度为1mL/h，针头和接受装置的距离为15cm，二者之间的电压为25KV，电纺一个小时后得到平面结构的纳米纤维膜。
(c)将得到的平面结构的纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联，交联10小时。将交联好的纳米纤维放入真空干燥箱中进行干燥，3天后取出。
(d)将干燥好的纳米纤维膜放入0.5mol/L的硼氢化钠水溶液中进行发泡，8小时后取出，取出后用去离子水冲洗数次，将去除硼氢化钠溶液的纳米纤维膜放入冷冻真空干燥机中干燥12小时，得到厚度为11.7mm，纤维直径为4.12nm的三维层状纳米纤维海绵。
实验例1通过使用血红蛋白测试试剂盒，观察体外凝血时间
将实施例1-10及对比例1提供的海绵支架切成直径约15mm的圆形，并放置培养皿。将100μL血液(含有10％柠檬酸钠)分配到每个样品的表面上。含有上述样品的培养皿在37℃温育5分钟。然后，从边缘向培养皿中加入50mL去离子水。未被血凝块捕获的红细胞将在水中溶血。用血红蛋白测试试剂盒测量每个样品血红蛋白的含量。结果如表1所示：
Figure BDA0002310096000000181
Figure BDA0002310096000000191
本发明提供的干细胞海绵支架上的血液可以完全凝固，漂洗水的颜色几乎没有变化。冲洗水颜色较浅意味着凝结速度更快。这意味着干细胞海绵支架可进一步缩短凝血时间。
血红蛋白浓度越高，血液凝固越强。其中参考值设为100μL血液中的血红蛋白的浓度。干细胞海绵支架血凝块中的血红蛋白浓度几乎等于100μL血液。因此，这在数值上证明了本发明提供的干细胞海绵支架增加了血液凝结的效果。
实验例2伤口愈合效果评估
通过覆盖小鼠全缺损的皮肤来评估实施例1-10及对比例1提供的海绵支架的伤口愈合效果。使用C57BL/6小鼠，体重约20-25g。对照组小鼠未用海绵支架覆盖，只用纱布隔离外界环境。
给小鼠腹膜内注射麻醉剂。剃去皮毛并用70％酒精消毒的皮肤。在每只小鼠的背上创建直径为1cm的圆形全层创伤。第一组为对照组(未治疗)。第二组在小鼠创面植入海绵支架。纱布被用来固定敷料。将动物单独关在笼子中，并以正常饮食喂食，随意饮水。
十天后，本实施例牺牲动物。通过示踪片追踪伤口闭合程度，并测量伤口闭合百分比。实验小鼠从正常喂养的其他人中分离出来。用数码相机观察伤口愈合情况。对于组织形态学分析，在第10天切除小鼠的创伤组织，用4％多聚甲醛固定并且石蜡包埋。将组织切成4μm切片并用苏木精和伊红染色。
本发明实施例1-10提供的干细胞海绵支架治疗小鼠皮肤创面愈合良好，无瘢痕形成，新生皮肤未见炎症坏死。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种干细胞海绵支架，其特征在于，所述干细胞海绵支架包括纳米纤维海绵及负载于所述纳米纤维海绵上的干细胞，所述纳米纤维海绵具有三维层状结构。
2.根据权利要求1所述的干细胞海绵支架，其特征在于，所述纳米纤维海绵中纳米纤维的直径为144nm-311nm；
优选地，所述干细胞海绵支架压缩至本体积的至多40％后，仍可恢复原状。
3.根据权利要求1所述的干细胞海绵支架，其特征在于，所述干细胞的负载量为103-105/cm2；
优选地，所述干细胞海绵支架还包括生长因子和/或牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述的干细胞海绵支架，其特征在于，所述纳米纤维海绵包括以聚合物和生物来源材料为主要原料制备得到的纳米纤维海绵；
所述聚合物包括聚乳酸、聚己内酯或聚乙二醇中的一种或多种；
所述生物来源材料包括壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐或胶原蛋白中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的干细胞海绵支架的制备方法，其特征在于，在所述纳米纤维海绵上接种干细胞，得到所述干细胞海绵支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将纳米纤维膜浸入发泡剂中进行发泡，得到具有三维层状结构的纳米纤维海绵；
优选地，将壳聚糖溶液和聚乳酸溶液混合均匀后得到的混合溶液进行静电纺丝，得到纳米纤维膜；
优选地，将壳聚糖溶解于酸性溶液中，得到所述壳聚糖溶液；
优选地，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2％-5％；
优选地，所述壳聚糖的黏度为200-400mPa.s；
优选地，所述聚乳酸的重均分子量为30-40万；
优选地，所述酸性溶液为弱酸溶液，弱酸优选包括乙酸、碳酸、亚硝酸或次氯酸，更优选为乙酸，进一步优选为90％w/w-70％w/w的乙酸；
优选地，将聚乳酸溶于有机溶剂中，得到聚乳酸溶液；
优选地，所述聚乳酸溶液中聚乳酸的质量浓度为7％-10％；
优选地，所述混合溶液按质量百分含量包括壳聚糖溶液20％-40％和聚乳酸溶液60％-80％；
优选地，所述混合溶液中还含有生长因子和/或牛血清白蛋白；
优选地，每10mL混合溶液中含有10-20μg生长因子或质量比为1％-10％的牛血清白蛋白；
优选地，所述静电纺丝满足如下工艺条件中的至少一个：
电压为18KV-30KV，接收距离为10cm-20cm，流速为0.5-2mL/h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在发泡前将所述纳米纤维膜放入戊二醛蒸汽中进行交联；交联时间优选为8-12小时；
优选地，将交联后的纳米纤维膜进行干燥处理，然后再进行发泡。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发泡剂包括硼氢化钠水溶液，优选为0.1mol/L-1mol/L的硼氢化钠水溶液；
优选地，所述发泡的时间为5-12小时；
优选地，发泡后还依次包括去除发泡剂、干燥及杀菌的步骤，得到所述干细胞海绵支架。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，将干细胞悬浮液填充进纳米纤维海绵中接种干细胞；
优选地，将填充有干细胞悬浮液的纳米纤维海绵在细胞培养基中进行孵育。
10.如权利要求1-4任一项所述的干细胞海绵支架或权利要求5-9任一项所述的制备方法在制备创伤组织工程修复的产品中的应用。
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