CN102580162A - 羟基磷灰石/plga/壳聚糖三维多孔支架的制备方法 - Google Patents

羟基磷灰石/plga/壳聚糖三维多孔支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的制备方法，包括以下步骤：将PLGA的二氯甲烷溶液与将羟基磷灰石混匀，得到羟基磷灰石/PLGA混合液；将壳聚糖溶于醋酸水溶液，再加入聚乙烯醇水溶液中，得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；将羟基磷灰石/PLGA混合液加入壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，室温下搅拌，水洗后冷冻干燥得到复合微球；将复合微球填充到模具中，保温定型，冷却到室温，脱模，制得羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架。本发明制备的三维多孔支架具有良好的生物相容性及降解性，具有三维连通的多孔结构，且孔结构均匀，强度高、孔隙率高；表面有一定粗糙度，有利于细胞黏附增殖；可用于骨组织缺损的修复和重建。

Description

羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的制备方法
技术领域
 本发明属于生物医学材料的制备技术领域，涉及用于骨组织工程修复的三维多孔支架的制备方法，具体涉及羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的制备方法。
背景技术
骨组织工程是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架或称细胞外基质上的技术。组织工程支架在组织工程中的作用主要是作为细胞及生物因子的载体以及为新组织提供支撑，其不仅对细胞、组织起物理连接和支持作用，而且还调节细胞的的各种功能活动。这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的三维支架上生长，然后将这种细胞杂化材料植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。
通常骨组织工程支架需具备以下性能：（1）优良的降解性能：与组织再生速度匹配的降解性能，且在缺损部位完全修复后能够完全降解；（2）三维立体的多孔结构：具有三维联通的孔结构，提供足够的空间满足细胞的生长增殖，细胞外基质的沉淀以及必要的营养物质和氧气的传输，血管的长入；（3）适当的机械性能及良好的可加工性能：支架与修复组织的机械性能相匹配；（4）支架具备骨传导性能，有利于引导骨组织的长入。
目前国内外已有专利和文献报道骨组织工程支架的制备技术：如中国专利200610035107.5公开的复合三维多孔骨组织工程支架材料及其制备方法和应用；中国专利201010140115.2公开的一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方法；Francis H.等[Francis H. Shen; Qing Zeng; Qing Lv; Luke Choi; Gary Balian; Xudong Li; Cato T. Laurencin.Osteogenic differentiation of adipose-derived stromal cells treated with GDF-5 cultured on a novel three-dimensional sintered microsphere matrix,The Spine Journal.2006.6.615-623]报道了用GDF-5处理的脂肪间充质干细胞在一种新型三维微球支架上的成骨分化；Jiang T等 [Jiang T, Abdel Fattah WI, Laurencin CT. In vitro evaluation of chitosan/poly (lactic acid-glycolic acid) sintered microsphere scaffolds for bone tissue engineering,Biomaterials. 2006.27. 4894-4903]报道的骨组织工程用壳聚糖/PLGA微球支架的体外评价。但这些目前研究的动物模型的骨缺损范围基本都较小，而较大的临床骨缺损，要求增大支架材料的尺寸。因此，对支架材料的强度、孔隙交通率将有更高的要求。
羟基磷灰石（简称：HA）是生物骨骼和牙齿的主要无机成分，与硬组织有良好的生物相容性、亲和性和骨传导性；对很多分子具有一定的吸附性，特别是多孔结构的羟基磷灰石。聚乙交酯-丙交酯（简称：PLGA）是商业上应用最广范的生物高分子之一，也是最早经过美国食品药品局认证可用于人体的生物材料之一。壳聚糖作为天然高分子材料，具有良好的生物相容性,有利于细胞的粘附、增殖和分化，具有一定的生物活性，可生物降解，降解产物无毒。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺点，提供用于骨组织工程修复的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的制备方法。本发明将羟基磷灰石、PLGA和壳聚糖三者复合，首先用具有生物相容性、降解性良好的高分子材料PLGA包覆具有吸附小分子药物性能的羟基磷灰石，在最外层再包覆具有一定生物活性的和降解性的壳聚糖，制备羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架。该支架同时具有骨传导性、生物相容性、降解性、细胞粘附性好、高强度和高空隙率等优点，不仅可以符合较大的临床骨缺损的支架材料的要求，而且还具有载药释药性能；其制备工艺简单，易于产业化。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将PLGA溶解于二氯甲烷中，得到PLGA溶液；
（2）将羟基磷灰石与步骤（1）得到的PLGA溶液混合均匀，得到羟基磷灰石/PLGA混合液；
（3）将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液加入聚乙烯醇水溶液中，得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；
（4）将步骤（2）得到的羟基磷灰石/PLGA混合液加入到步骤（3）得到的壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，室温下搅拌，用去离子水洗涤后冷冻干燥得到羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球；
（5）将步骤（4）得到的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球填充到圆柱型模具中，保温定型，冷却到室温，脱模，制得羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架。
本发明步骤（1）中，所述PLGA与二氯甲烷的质量体积比为（0.5~2）：10 g/mL。
本发明步骤（2）中，所述羟基磷灰石与PLGA溶液的质量体积比为（0.5~2）：10 g/mL。
本发明步骤（3）中，所述壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比为（0.1~1）：10 g/mL；所述壳聚糖与聚乙烯醇水溶液质量体积比为（0.1~1）：100 g/mL。
本发明步骤（4）中，所述醋酸水溶液中醋酸与去离子水的体积比为（1~3）：100；所述聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇与去离子水的质量体积比为（0.2~1）:10 g/mL。
本发明步骤（4）中，所述搅拌的转速为150~600r/min，时间为5~20h；所述冷冻干燥的时间为24~72h。
本发明步骤（5）中，所述保温定型的温度为90~130℃，时间为6~10h。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明制备的磷酸钙盐/六方介孔硅/PLGA组织工程三维多孔骨支架强度高、孔隙率高，且具有三维连通的开孔结构，能够提供足够的空间；
（2）本发明制备的支架表面有一定粗糙度，有利于细胞黏附增殖；
（3）本发明的制备方法工艺简单，对设备要求低，原料价格低廉易得，利于产业化。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的磷酸钙盐/六方介孔硅/PLGA微球的扫描电镜图。
图2为本发明实施例1制备的磷酸钙盐/六方介孔硅/PLGA三维多孔支架的Micro-CT三维重建图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但是本发明要求保护的范围并不仅限于此。
实施例1
将0.8g PLGA溶解于10mL二氯甲烷中，得到10mLPLGA溶液；将0.5g 羟基磷灰石粉末与10mL PLGA溶液混合均匀，得到10mL 羟基磷灰石/PLGA混合液；将0.1g壳聚糖溶于10mL 3%的稀醋酸水溶液中，得到10mL壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到100mL 2%的聚乙烯醇水溶液中，得到110mL壳聚糖/聚乙烯醇溶液；将羟基磷灰石/PLGA混合液加入到壳聚糖/聚乙烯醇水溶液中，室温150r/min持续搅拌20h，用去离子水洗涤后冷冻干燥24h得到羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球。将微球填充到圆柱型模具中，设定温度130℃保温6h后，冷却到室温，脱模，制得羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖组织工程三维多孔骨支架。
实施例2
将2.0 g PLGA溶解于10mL二氯甲烷中，得到10mLPLGA溶液；将2.0g 羟基磷灰石粉末与10mL PLGA溶液混合均匀，得到10mL 羟基磷灰石/PLGA混合液；将1.0g壳聚糖溶于10mL 1%的稀醋酸水溶液中，得到10mL壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到100mL 10%的聚乙烯醇水溶液中，得到110mL壳聚糖/聚乙烯醇溶液；将羟基磷灰石/PLGA混合液加入到壳聚糖/聚乙烯醇水溶液中，室温600r/min持续搅拌10h，用去离子水洗涤后冷冻干燥72h得到羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球。将微球填充到圆柱型模具中，设定温度105℃保温10h后，冷却到室温，脱模，制得羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖组织工程三维多孔骨支架。
实施例3
将0.5g PLGA溶解于10mL二氯甲烷中，得到10mLPLGA溶液；将0.6g 羟基磷灰石粉末与10mL PLGA溶液混合均匀，得到10mL 羟基磷灰石/PLGA混合液；将0.3g壳聚糖溶于10mL 2%的稀醋酸水溶液中，得到10mL壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到100mL 5%的聚乙烯醇水溶液中，得到110mL壳聚糖/聚乙烯醇溶液；将羟基磷灰石/PLGA混合液加入到壳聚糖/聚乙烯醇水溶液中，室温270r/min持续搅拌5h，用去离子水洗涤后冷冻干燥48h得到羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球。将微球填充到圆柱型模具中，设定温度90℃保温7h后，冷却到室温，脱模，制得羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖组织工程三维多孔支架。
表1为实施例1~3制备的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的孔隙参数，由表1可知，本发明制备的三维多孔支架的孔隙率高，几乎完全贯通，孔径大小适中。
表1 实施例制备的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的孔隙参数
Figure 2012100347639100002DEST_PATH_IMAGE001
图1为本发明实施例1制备的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球的扫描电镜图。由图1可知，本发明的微球形状规整、粒径分布较窄，表面有一定的粗糙度。
图2为本发明实施例1制备的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的Micro-CT三维重建图。由图2可知，本发明的支架孔隙多，分布均匀，且表面有一定的粗糙度。

Claims (7)

1.羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将PLGA溶解于二氯甲烷中，得到PLGA溶液；
（2）将羟基磷灰石与步骤（1）得到的PLGA溶液混合均匀，得到羟基磷灰石/PLGA混合液；
（3）将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液，再将壳聚糖溶液加入聚乙烯醇水溶液中，得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；
（4）将步骤（2）得到的羟基磷灰石/PLGA混合液加入到步骤（3）得到的壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，室温下搅拌，用去离子水洗涤后冷冻干燥得到羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球；
（5）将步骤（4）得到的羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖微球填充到圆柱型模具中，保温定型，冷却到室温，脱模，制得羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述PLGA与二氯甲烷的质量体积比为（0.5~2）：10 g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述羟基磷灰石与PLGA溶液的质量体积比为（0.5~2）：10 g/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比为（0.1~1）：10 g/mL；所述壳聚糖与聚乙烯醇水溶液质量体积比为（0.1~1）：100 g/mL。
5.根据权利要求1~4之一所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述醋酸水溶液中醋酸与去离子水的体积比为（1~3）：100；所述聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇与去离子水的质量体积比为（0.2~1）:10 g/mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述搅拌的转速为150~600r/min，时间为5~20h；所述冷冻干燥的时间为24~72h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述保温定型的温度为90~130℃，时间为6~10h。
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