WO2022089295A1 - 仿生胶原水溶液的制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域，具体的，涉及一种仿生胶原水溶液及其制备方法和使用方法。本发明通过添加模拟体液成份，调控胶原水溶液的离子成份和离子强度，进一步调控pH值，模拟组织微环境；通过添加连接分子提高胶原分子与组织的结合，增强胶原水溶液的生物相容性。该胶原水溶液的浓度为大于0.1wt.％但小于等于10wt.％，可以敷料形式覆盖在皮肤表面使用，也可以注射的方式应用于体内。本发明的仿生胶原水溶液模拟预修复组织的某些特征，具有良好的生物相容性，并且在使用过程中胶原分子的降解性有所延缓，从而利于组织修复再生。
Description
本发明涉及一种生物材料及其制备方法和使用方法，具体涉及一种仿生胶原水溶液的制备方法和使用方法。
胶原蛋白是结缔组织主要的结构蛋白，广泛分布于人体骨骼、皮肤、血管、韧带、软骨、肌肉和肌腱等组织、器官中，占动物总蛋白的25％～30％。迄今为止，共发现了20余种胶原蛋白，其中I型胶原蛋白含量最高，约为90％。在皮肤中胶原蛋白分布于真皮层，含量约为70％，主要为I(85％)、III和Ⅴ型。然而，由于离子成份、离子强度、pH值等因素的影响，胶原在组织修复过程中的生物相容性、降解性等性能仍有待改进。
例如，胶原材料在体内容易降解，影响皮肤修复效果。为了延缓胶原在体内降解，常常使用戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷等化学交联剂对胶原水溶液进行交联处理。其中戊二醛是应用最广泛的试剂。然而大量实验证明，戊二醛能与胶原分子快速反应，提供有效交联，但戊二醛具有细胞毒性，且其用量难以控制。另外，随着交联度的增加，胶原材料的吸水能力和膨胀度会降低，这也影响了胶原材料的使用效果。
发明内容
针对以上胶原水溶液在使用过程中的问题的至少一个方面，本发明从仿生的角度开发一种仿生胶原水溶液：(1)采用高浓度胶原模拟预修复组织组成，通过添加模拟体液成份调控溶液环境(如离子成份、离子强度等)，进一步调控溶液pH值，形成稳定的可流动的胶原水溶液，模拟预修复组织的微环境；(2)添加连接分子，利于胶原水溶液在使用过程中与周围组织的结合，增强其生物相容性，同时延缓胶原分子的降解性。所开发的高浓度仿生胶原水溶液可以敷料的形式覆盖于预修复创伤表面或以注射的方式应用于体内，促进组织修复再生。
本发明提供一种仿生胶原水溶液及其制备方法和使用方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将固体胶原材料置入水中，在搅拌过程中添加酸性溶液溶解固体胶原材料形成均质 水溶液，胶原水溶液的浓度为大于0.1wt.％但小于等于10wt.％；
(2)低温条件下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入模拟体液成份，充分溶解；
(3)低温条件下，通过碱性溶液或酸性溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至大于等于6但小于等于8，形成均质溶液；
(4)低温条件下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入连接分子溶液搅拌均匀后制备完成，在制备完成后，在低温条件下保存所述仿生胶原水溶液。
在本发明的实施例中，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中的低温条件的范围为大于等于0℃但小于等于5℃；在所述步骤(3)中，通过碱性溶液或酸性溶液调节胶原水溶液pH值至大于等于7.0但小于等于7.5；在所述步骤(4)中，加入连接分子溶液搅拌均匀后，低温条件下仿生胶原溶液的保存时间为大于等于0分钟(min)但小于等于30min。
在本发明的实施例中，在步骤(1)和步骤(3)中的所述酸性溶液同为包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙酸和甲酸中的至少一种；所述步骤(3)中的碱性溶液包括三乙胺、四甲基乙二胺、吡啶、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氨水、磷酸氢二钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述酸性溶液、碱性溶液的浓度为大于等于0.01M但小于10M。
在本发明的实施例中，所述步骤(1)中的酸性溶液是为了充分溶解固体胶原材料而添加的，为微量添加，不显著改变其中胶原浓度，以溶解胶原形成均质溶液为准。
在本发明的实施例中，在所述步骤(3)中添加碱性溶液或酸性溶液是为了调节胶原水溶液的pH值，为微量添加，不显著改变其中胶原浓度，以水溶液达到预设pH值且形成均质溶液为准。
在本发明的实施例中，所述模拟体液成份包括Na
+、K
+、Mg
2+、Ca
2+、Cl
-、HCO
3
-、HPO
4
2-、SO
4
2-、CO
3
2-、PO
4
3-、H
2PO
4
-中的一种或两种以上的组合。添加模拟体液成份是为了使胶原水溶液的离子环境与预修复组织的微环境相适应，为微量添加，不显著改变其中胶原浓度。在仿生胶原水溶液中，各离子的最终离子浓度范围为0.1–500mM，最终总离子浓度范围为0.1–1000mM。
在本发明的实施例中，连接分子为异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺酰氯、醛、环氧化物、芳基卤化物、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、氟苯基酯、原花青素、京尼平中的一种或两种以上的混合物。添加连接分子是为了增强胶原分子与预修复组织的结合，连接分子溶液的添加不显著改变其中胶原浓度，所述连接分子在 所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于10wt.％。
在本发明的实施例中，连接分子在所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于1wt.％。
在本发明的实施例中，连接分子在所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于0.1wt.％。
在本发明的实施例中，连接分子在所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.001wt.％但小于等于0.01wt.％。
根据本发明的另一方面，提供了一种仿生胶原水溶液的使用方法，所述仿生胶原水溶液是根据前述实施例中的任一个所述的仿生胶原水溶液的制备方法所制备得到的。
在本发明的实施例中，在制备完成仿生胶原水溶液后三十分钟内，采用以敷料的形式覆盖于预修复创伤表面或以注射的方式应用于体内。
在本发明实施例的仿生胶原水溶液的制备方法中，由于添加了连接分子，在仿生胶原水溶液未使用前，有可能会发生胶原分子与连接分子发生反应的情况，从而影响胶原溶液的流动性，不利于其使用，尤其不利于以注射的方式应用于体内。同时，高浓度胶原在中性条件下也容易形成不具有流动性的水凝胶结构。因此，在本发明实施例的制备方法中，添加连接分子后仿生胶原水溶液的保存时间为大于等于0min但小于等于30min，以不影响其流动性和使用效果。
本发明的实施例是针对高浓度胶原溶液在使用过程中生物相容性差等问题从仿生角度提出的解决方案。为了增强高浓度胶原的生物相容性，本发明主要进行如下优化：(1)按照预修复组织体液中离子的成份和含量以及pH环境，在溶液中添加模拟体液成份，调控溶液环境(如离子强度、渗透压等)，并进一步调控pH值，使胶原溶液与预修复组织的微环境相匹配；(2)本发明在胶原溶液中添加了连接分子成份，连接分子可以同时与胶原溶液中的胶原分子和预修复组织中的胶原成份发生反应，而且反应温和，从而促进胶原分子与预修复组织的结合。
本发明的仿生胶原水溶液中溶液环境与预修复组织的微环境更接近，其生物相容性比常规胶原溶液更好，连接分子的添加也可以延缓胶原分子的降解性，发挥其生物活性，促进组织修复再生。
图1为根据本发明的实施例的仿生胶原水溶液中的活/死细胞染色情况效果图(图1A是 实施例1样品，图1B是实施例2样品，图1C是实施例3样品，图1D是实施例4样品，图1E是对比例1样品，图1F是对比例2样品)；
图2为根据本发明的实施例的仿生胶原水溶液植入大鼠体内的HE染色(苏木精—伊红染色)情况效果图(图2A是实施例1样品，图2B是实施例2样品，图2C是实施例3样品，图2D是实施例4样品，图2E是对比例1样品，图2F是对比例2样品)。
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。在说明书中，相同或相似的附图标号指示相同或相似的部件。下述参照附图对本发明实施方式的说明旨在对本发明的总体发明构思进行解释，而不应当理解为对本发明的一种限制。
实施例1
一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将2g胶原材料置入100g去离子水中，在搅拌过程中添加0.01M乙酸溶液溶解胶原材料形成均质水溶液；
(2)在0℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入1g Na
2HPO
4和0.2g KH
2PO
4，充分溶解；
(3)在5℃下，通过0.1M NaOH溶液或0.01M乙酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至7.4，形成均质溶液；
(4)在2℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入0.001wt.％原花青素溶液和0.02wt.％异氰酸酯，搅拌均匀。
一种仿生胶原水溶液的使用方法，所述仿生胶原水溶液是根据上述制备方法制备得到的，所述使用方法包括：在配制所述仿生胶原水溶液5min后，将其以敷料的形式均匀覆盖于烧伤皮肤表面。
实施例2
一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将5g胶原材料置入200g去离子水中，在搅拌过程中添加0.1M盐酸溶液溶解胶原材料形成均质水溶液；
(2)在4℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入1g KCl和3g Na
2HPO
4， 充分溶解；
(3)在4℃下，通过1M KOH溶液或1M甲酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至6，形成均质溶液；
(4)在0℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入1wt.％乙二醛和2wt.％NHS酯溶液，搅拌均匀。
一种仿生胶原水溶液的使用方法，所述仿生胶原水溶液是根据上述制备方法制备得到的，所述使用方法包括：在配制所述仿生胶原水溶液0min后，将其以注射的方式用于软组织修复。
实施例3
一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将3g胶原材料置入200g去离子水中，在搅拌过程中添加1M酒石酸溶液溶解胶原材料形成均质水溶液；
(2)在5℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入2g NaH
2PO
4和1g KCl，充分溶解；
(3)在5℃下，通过2M氢氧化钾溶液或1M甲酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至8，形成均质溶液；
(4)在4℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入2wt.％异硫氰酸酯溶液，搅拌均匀。
一种仿生胶原水溶液的使用方法，所述仿生胶原水溶液是根据上述制备方法制备得到的，所述使用方法包括：在配制所述仿生胶原水溶液30min后，将其以注射的方式用于软组织修复。
实施例4
一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将1g胶原材料置入1000g去离子水中，在搅拌过程中添加0.1M草酸溶液溶解胶原材料形成均质的胶原水溶液；
(2)在3℃下，胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入3g K
2SO
4和5g KHCO
3，充分溶解；
(3)在0℃下，通过2M氨水溶液或5M柠檬酸溶液调节胶原水溶液pH值至7.0，形成均质溶液；
(4)在5℃下，在胶原水溶液中加入10wt.％环氧乙烷溶液和0.5wt.％京尼平溶液，搅 拌均匀。
一种仿生胶原水溶液的使用方法，所述仿生胶原水溶液是根据上述制备方法制备得到的，所述使用方法包括：在配制所述仿生胶原水溶液15min后，将其以敷料的形式均匀覆盖于烫伤皮肤表面。
实施例5
仿生胶原水溶液效果比较试验
一、对比胶原水溶液的制备
对比例1：一种胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
将2g胶原材料置入200g去离子水中，在搅拌过程中添加1M酒石酸溶液溶解胶原材料形成均质水溶液；
上述制备的胶原水溶液以注射的形式应用于软组织修复。
对比例2：一种胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
将1g胶原材料置入1000g去离子水中，在搅拌过程中添加0.1M乙酸溶液溶解胶原材料形成均质水溶液；
上述制备的胶原水溶液以敷料形式应用于烧伤皮肤表面。
二、效果试验对比
(1)三维细胞培养比较试验：根据实施例1-4以及对比例1-2中的制备方法制备胶原水溶液，分别取2mL与7×10
6大鼠血管内皮细胞(中国科学院上海细胞库)混合，在37℃条件下形成胶原水凝胶包裹细胞进行三维培养实验。培养基为高糖DMEM(HyClone)培养基，其中含10％(v/v％)的胎牛血清，1％的链霉素和青霉素，培养基每天更换一次。培养箱(STERI371,Thermo Electron Corporation)温度设定为37℃，含有5％(v/v％)CO
2的湿空气。培养7天(d)后，水凝胶中的细胞经活/死细胞染色处理，染色液为2mmol/L的calcein-AM(钙黄绿素乙酰氧基甲酯溶液，Sigma)(用于染活细胞，发射绿色荧光)和2mmol/L的EthD-1溶液(溴乙啡锭二聚体1，Sigma)(用于染死细胞，发射红色荧光)，在A1激光共聚焦显微镜(Nikon)上观察样品，绿色激发光波长为488nm，红色激发光波长为562nm。胶原水凝胶中活/死细胞染色情况见图1。由图1可知，由于实施例1-4中的胶原溶液与体内组织微环境更接近，其形成的胶原水凝胶更适宜细胞的生长，在实施例样品图1的A-图1的D中代表活细胞的荧光信号(例如绿色荧光信号)更强，这说明细胞在其中可以正常生长，材料的生物相容性也更好。然而，在对比例1-2中，胶原水凝胶不适宜细胞生长，在对比例样品图1的 E和图1的F中代表死细胞的荧光信号(例如红色荧光信号)更强，这表明细胞无法在其中正常生长，材料的生物相容性很差。因此，在本公开的实施例中，模拟体液成份的添加和pH值的调控更利于细胞生长，胶原溶液也表现出更好的生物相容性。
(2)组织相容性比较试验：在大鼠肌肉分别植入根据实施例1-4以及对比例1-2的制备方法制备的胶原水溶液，经1个月后处死实验大鼠，取出植入材料，并使用4wt.％的多聚甲醛固定液固定，进行HE染色。
具体步骤如下：
(1)将样品放在石蜡包埋机里进行包埋，然后用切片机进行切片，将切好的片子放入60℃的水浴锅里，用载玻片小心插入靠近切片的水里，将漂浮的石蜡切片转移到载玻片上，若有水泡，则使用针头挑出。
(2)使用二甲苯脱水5min并进行两次，使用100％酒精、95％酒精、85％酒精、70％酒精、50％酒精依次进行冲洗，再使用自来水冲洗，然后使用苏木精染色5min，再使用自来水冲洗使颜色变蓝。
(3)放入1％盐酸乙醇溶液中褪色2-10秒(s)，颜色变红并较浅，再使用自来水冲洗恢复蓝色。
(4)再分别放入50％酒精、70％酒精、80％酒精中并分别持续5min，再使用0.5％伊红酒精溶液对比染色1-3min。
(5)将切片放入95％酒精中洗去多余红色，然后放入100％酒精中3-5min，再使用吸水纸吸取多余酒精，并将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各3-5min。
(6)使用中性树胶封存并进行固定。
不同样品的HE染色结果见图2。由图2可知，由于实施例中(图2的A-图2的D)的胶原水溶液与大鼠体内组织的微环境更接近，所以材料植入体内后能很快与周围组织融合，只发现少量炎症细胞，而对比例中(图2的E-图2的F)则发现大量炎症细胞，材料的组织相容性很差。因此，在本公开的实施例中，模拟体液成份的添加、pH值的调控、连接分子的添加可以明显提高胶原溶液在体内的组织相容性。
结合上述试验可知，实施例1-4与对比例1-2相比，对比例1-2中的胶原材料溶解在强酸环境中，不利于其使用及组织修复的功效；实施例1-4中的胶原材料的使用环境可以根据体内微环境的变化进行调控，如pH环境、离子成份、离子强度等，使胶原材料利于体内组织修复使用；同时，由于添加了连接分子，溶液中的胶原分子可以通过连接分子与周围组织进行紧密结合，更利于胶原材料的组织修复功效。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
- 一种仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：(1)将固体胶原材料置入水中，在搅拌过程中添加酸性溶液溶解固体胶原材料形成均质水溶液，胶原水溶液的浓度为大于0.1wt.％但小于等于10wt.％；(2)低温条件下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入模拟体液成份，充分溶解；(3)低温条件下，通过碱性溶液或酸性溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至大于等于6但小于等于8，形成均质溶液；(4)低温条件下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入连接分子溶液搅拌均匀后制备完成，在制备完成后，在低温条件下保存所述仿生胶原水溶液。
- 如权利要求1所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中的低温条件的范围为大于等于0℃但小于等于5℃；在所述步骤(3)中，通过碱性溶液或酸性溶液调节胶原水溶液pH值至大于等于7.0但小于等于7.5。
- 如权利要求2所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，所述模拟体液成份包括Na +、K +、Mg 2+、Ca 2+、Cl -、HCO 3 -、HPO 4 2-、SO 4 2-、CO 3 2-、PO 4 3-、H 2PO 4 -中的一种或两种以上的组合。
- 如权利要求3所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(3)中的所述酸性溶液同为包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙酸和甲酸中的至少一种；所述步骤(3)中的碱性溶液包括三乙胺、四甲基乙二胺、吡啶、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氨水、磷酸氢二钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述酸性溶液、碱性溶液的浓度为大于等于0.01M但小于10M。
- 如权利要求4所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，连接分子为异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酰氯、醛、环氧化物、芳基卤化物、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、氟苯基酯、原花青素、京尼平中的一种或两种以上的混合物，所述连接分子在所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于10wt.％。
- 如权利要求5所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，连接分子在所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于1wt.％。
- 如权利要求6所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，连接分子在所述仿 生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于0.1wt.％。
- 如权利要求7所述的仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，连接分子在所述仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.001wt.％但小于等于0.01wt.％。
- 一种仿生胶原水溶液的使用方法，所述仿生胶原水溶液是根据权利要求1至8中任一项所述的仿生胶原水溶液的制备方法所制备得到的。
- 如权利要求9所述的仿生胶原水溶液的使用方法，其特征在于，在制备完成仿生胶原水溶液后三十分钟内，采用以敷料的形式覆盖于预修复创伤表面或以注射的方式应用于体内。
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