CN112354013B - 一种仿生胶原水溶液及其制备方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料领域，具体的，涉及一种仿生胶原水溶液，及其制备方法和使用方法。本发明通过添加模拟体液成份，调控胶原水溶液的离子成份和离子强度，进一步调控pH值，模拟组织微环境；通过添加连接分子提高胶原分子与组织的结合，增强胶原水溶液的生物相容性。该胶原水溶液的浓度为大于0.1wt.％但小于等于10wt.％，可以敷料形式覆盖在皮肤表面使用，也可以注射的方式应用于体内。本发明的仿生胶原水溶液模拟预修复组织的某些特征，具有良好的生物相容性，使用中胶原分子降解性有所延缓，利于组织修复再生。

Description

一种仿生胶原水溶液及其制备方法和使用方法
技术领域
本发明涉及一种生物材料的制备及其使用方法，具体涉及一种仿生胶原水溶液，及其制备方法和使用方法。
背景技术
胶原蛋白是结缔组织主要的结构蛋白，广泛分布于人体骨骼、皮肤、血管、韧带、软骨、肌肉和肌腱等组织、器官中，占动物总蛋白的25％～30％。迄今为止，共发现了20余种胶原蛋白，其中I型胶原蛋白含量最高，约为90％。在皮肤中胶原蛋白分布于真皮层，含量约为70％，主要为I(85％)、III和V型。然而，由于离子成份、离子强度、pH值等因素的影响，胶原在组织修复过程中的生物相容性、降解性等性能仍有待改进。
例如，胶原材料在体内容易降解，影响皮肤修复效果，为了延缓胶原体内降解，常常使用戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷等化学交联剂对胶原水溶液进行交联处理，其中戊二醛是应用最广泛的试剂，然而大量实验证明，戊二醛能与胶原分子快速反应，提供有效交联，但有细胞毒性，且其用量难以控制，另外，随着交联度的增加，吸水能力和膨胀度却会降低，影响使用效果。
针对以上胶原水溶液在使用过程中的问题，本发明从仿生的角度开发一种仿生胶原水溶液：(1)采用高浓度胶原模拟预修复组织组成，通过添加模拟体液成份调控溶液环境(如离子成份、离子强度等)，进一步调控溶液pH值，形成稳定的可流动的胶原水溶液，模拟预修复组织的微环境；(2)添加连接分子，利于胶原水溶液在使用过程中与周围组织的结合，增强其生物相容性，同时延缓胶原分子的降解性。所开发的高浓度仿生胶原水溶液可以敷料的形式覆盖于预修复创伤表面或以注射的方式应用于体内，促进组织修复再生。
发明内容
本发明提供一种仿生胶原水溶液，及其制备方法和使用方法。
一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将固体胶原材料置入水中，搅拌过程中添加酸性溶液溶解胶原形成均质水溶液，胶原水溶液的浓度为大于0.1wt.％但小于等于10wt.％；
(2)低温条件下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入模拟体液成份，充分溶解；
(3)低温条件下，通过碱性溶液或酸性溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至大于等于6但小于等于8，形成均质溶液；
(4)低温条件下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入连接分子溶液搅拌均匀后制备完成，制备完成后，在低温条件下保存。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，低温条件的范围为大于等于0℃但小于等于5℃；所述步骤(3)中，通过碱性溶液或酸性溶液调节胶原水溶液pH值至大于等于7.0但小于等于7.5；所述步骤(4)中，加入连接分子溶液搅拌均匀后，低温条件下胶原溶液的保存时间为大于等于0min但小于等于30min。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，所述步骤(1)和所述步骤(3)中的酸性溶液包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙酸和甲酸中的至少一种；所述步骤(3)中的碱性溶液包括三乙胺、四甲基乙二胺、吡啶、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氨水、磷酸氢二钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述酸性溶液、碱性溶液的浓度为大于等于0.01M但小于10M。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，所述步骤(1)中的酸性溶液是为了充分溶解固体胶原材料添加的，为微量添加，不显著改变其中胶原浓度，以溶解胶原形成均质溶液为准。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，所述步骤(3)中添加碱性溶液或酸性溶液是为了调节胶原水溶液的pH值，为微量添加，不显著改变其中胶原浓度，以水溶液达到预设pH值且形成均质溶液为准。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，模拟体液成份包括Na+、K+、Mg2+、Ca2 +、Cl-、HCO3 -、HPO4 2-、SO4 2-、CO3 2-、PO4 3-、H2PO4 -中的一种或两种以上的组合。添加模拟体液成份是为了使胶原水溶液的离子环境与预修复组织的微环境相适应，为微量添加，不显著改变其中胶原浓度。在仿生胶原水溶液中各离子的最终离子浓度范围为0.1-500mM，最终总离子浓度范围为0.1-1000mM。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，连接分子为异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、环氧化物、芳基卤化物、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、氟苯基酯、原花青素、京尼平中的一种或两种以上的混合物。添加连接分子是为了增强胶原分子与预修复组织的结合，连接分子溶液的添加不显著改变其中胶原浓度，所述连接分子在仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于10wt.％。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，所述连接分子在仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于1wt.％。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，所述连接分子在仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.0001wt.％但小于等于0.1wt.％。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，所述连接分子在仿生胶原水溶液中的最终浓度为大于等于0.001wt.％但小于等于0.01wt.％。
使用本发明任意一种仿生胶原水溶液的制备方法所制备的仿生胶原水溶液。
使用本发明仿生胶原水溶液的方法，其中，采用以敷料的形式覆盖与预修复创伤表面或以注射的方式应用于体内。
本发明一种仿生胶原水溶液的制备方法，其中，由于添加了连接分子，在仿生胶原水溶液未使用前，有可能会发生胶原分子与连接分子发生反应的情况，从而影响胶原溶液的流动性，不利于其使用，尤其不利以注射的方式应用于体内。同时，高浓度胶原在中性条件下也容易形成不具有流动性的水凝胶结构。因此，在制备方法中，添加连接分子后仿生胶原水溶液的保存时间为大于等于0min但小于等于30min，以不影响其流动性和使用效果。
本发明是针对高浓度胶原溶液在使用过程中生物相容性差等问题从仿生角度提出的解决方案。为了增强高浓度胶原的生物相容性，本发明主要进行如下优化：(1)按照预修复组织体液中离子的成份和含量以及pH环境，在溶液中添加模拟体液成份，调控溶液环境(如离子强度、渗透压等)，并进一步调控pH值，使胶原溶液与预修复组织的微环境相匹配：(2)本发明在胶原溶液中添加了连接分子成份，连接分子可以同时与胶原溶液中的胶原分子和预修复组织中的胶原成份发生反应，而且反应温和，从而促进胶原分子与预修复组织的结合。
本发明的仿生胶原水溶液中溶液环境与预修复组织的微环境更接近，其生物相容性比常规胶原溶液更好，连接分子的添加也可以延缓胶原分子的降解性，发挥其生物活性，促进组织修复再生。
附图说明
图1胶原水溶液中活/死细胞染色情况效果图(图1A是实施例1样品，图1B是实施例2样品，图1C是实施例3样品，图1D是实施例4样品，图1E是对比例1样品，图1F是对比例2样品)
图2胶原水溶液植入大鼠体内的HE染色情况效果图(图2A是实施例1样品，图2B是实施例2样品，图2C是实施例3样品，图2D是实施例4样品，图2E是对比例1样品，图2F是对比例2样品)
具体实施方式
实施例1
一种仿生胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将2g胶原材料置入100g去离子水中，搅拌过程中添加0.01M乙酸溶液溶解胶原形成均质水溶液；
(2)在0℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入1g Na2HPO4和0.2gKH2PO4，充分溶解；
(3)在5℃下，通过0.1M NaOH溶液或0.01M乙酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至7.4，形成均质溶液；
(4)在2℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入0.001wt.％原花青素溶液和0.02wt.％异氰酸酯，搅拌均匀。
仿生胶原水溶液配制5min后，将其以敷料的形式均匀覆盖于烧伤皮肤表面。
实施例2
一种仿生胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将5g胶原材料置入200g去离子水中，搅拌过程中添加0.1M盐酸溶液溶解胶原形成均质水溶液；
(2)在4℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入1g KCl和3gNa2HPO4，充分溶解；
(3)在4℃下，通过1M KOH溶液或1M甲酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至6，形成均质溶液；
(4)在0℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入1wt.％乙二醛和2wt.％NHS酯溶液，搅拌均匀。
仿生胶原水溶液配制0min后，将其以注射的方式用于软组织修复。
实施例3
一种仿生胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将3g胶原材料置入200g去离子水中，搅拌过程中添加1M酒石酸溶液溶解胶原形成均质水溶液；
(2)在5℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入2g NaH2PO4和1gKCl，充分溶解；
(3)在5℃下，通过2M氢氧化钾溶液或1M甲酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至8，形成均质溶液；
(4)在4℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入2wt.％异硫氰酸酯溶液，搅拌均匀。
仿生胶原水溶液配制30min后，将其以注射的方式用于软骨组织修复。
实施例4
一种仿生胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)将1g胶原材料置入1000g去离子水中，搅拌过程中添加0.1M草酸溶液溶解胶原形成均质的胶原水溶液；
(2)在3℃下，胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入3g K2SO4和5g KHCO3，充分溶解；
(3)在0℃下，通过2M氨水溶液或5M柠檬酸溶液调节胶原水溶液pH值至7.0，形成均质溶液；
(4)在5℃下，在胶原水溶液中加入10wt.％环氧乙烷溶液和0.5wt.％京尼平溶液，搅拌均匀。
仿生胶原水溶液配制15min后，将其以敷料的形式均匀覆盖于烫伤皮肤表面。
实施例5
仿生胶原水溶液效果比较试验
一、对比胶原水溶液的制备
对比例1：一种胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
将2g胶原材料置入200g去离子水中，搅拌过程中添加1M酒石酸溶液溶解胶原形成均质水溶液；
上述制备的胶原水溶液以注射的形式应用于软组织修复。
对比例2：一种胶原水溶液的制备及其使用方法，其中，依次包括如下步骤：
将1g胶原材料置入1000g去离子水中，搅拌过程中添加0.1M乙酸溶液溶解胶原形成均质水溶液；
上述制备的胶原水溶液以敷料形式应用烧伤皮肤表面。
二、效果试验对比
(1)三维细胞培养比较试验：制备实施例1-4以及对比例1-2中的胶原水溶液，分别取2mL与7×106大鼠血管内皮细胞(中国科学院上海细胞库)混合，在37℃条件下形成胶原水凝胶包裹细胞进行三维培养实验。培养基为高糖DMEM(HyClone)培养基，其中含10％(v/v％)的胎牛血清，1％的链霉素和青霉素，培养基每天更换一次。培养箱(STERI 371，ThermoElectron Corporation)温度设定为37℃，含有5％(v/v％)CO2的湿空气。培养7d后，水凝胶中的细胞经活/死细胞染色处理，染色液为2mmol/L的calcein-AM(Sigma)溶液(染活细胞，发绿色荧光)和2mmol/L的EthD-1(Sigma)溶液(染死细胞，发红色荧光)，样品在A1激光共聚焦显微镜上观察(Nikon)，绿色激发光波长为488nm，红色激发光波长为562nm。胶原水凝胶中活/死细胞染色情况见图1。由图1可知，由于实施例1-4中的胶原溶液与体内组织微环境更接近，其形成的胶原水凝胶更适宜细胞的生长，在实施例样品图1A-1D中代表活细胞的绿色荧光信号更强，说明细胞在其中可以正常生长，材料的生物相容性也更好。然而，在对比例1-2中，胶原水凝胶不适宜细胞生长，在对比例样品图1E-1F中代表死细胞的红色荧光信号更强，细胞无法在其中正常生长，材料的生物相容性很差。因此，实施例中模拟体液成份的添加和pH值的调控更利于细胞生长，胶原溶液也表现出更好的生物相容性。
(2)组织相容性比较试验：在大鼠肌肉分别植入实施例1-4以及对比例1-2制备的胶原水溶液，经1个月后处死实验大鼠，取出植入材料，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，进行HE染色。
具体步骤如下：
(1)将样品放在石蜡包埋机里进行包埋，然后用切片机进行切片，将切好的片子放入60℃的水浴锅里，用载玻片小心插入靠近切片的水里，将漂浮的石蜡切片转移到载玻片上，若有水泡，用针头挑出。
(2)二甲苯脱水5min，两次，100％酒精、95％酒精、85％酒精、70％酒精、50％酒精依次冲洗，自来水冲洗，苏木精染色5min，自来水冲洗使颜色变蓝。
(3)放入1％盐酸乙醇溶液褪色2-10s，颜色变红并较浅，自来水冲洗恢复蓝色。
(4)再放入50％酒精、70％酒精、80％酒精各5min，0.5％伊红酒精溶液对比染色1-3min。
(5)将切片放入95％酒精中洗去多余红色，然后放入100％酒精中3-5min，吸水纸吸取多余酒精，将切片放入二甲苯I、II各3-5min。
(6)用中性树胶封存，固定。
不同样品的HE染色结果见图2。由图2可知，由于实施例中(图2A-2D)的胶原水溶液与大鼠体内组织的微环境更接近，材料植入体内后能很快与周围组织融合，只发现少量炎症细胞，而对比例中(图2E-2F)则发现大量炎症细胞，材料的组织相容性很差。因此，实施例中模拟体液成份的添加、pH值的调控、连接分子的添加可以明显提高胶原溶液在体内的组织相容性。
结合上述试验可知，实施例1-4与对比例1-2比较，对比例1-2中的胶原材料溶解在强酸环境中，不利于其使用及组织修复的功效，实施例1-4中的胶原材料的使用环境可以根据体内微环境的变化进行调控，如pH环境、离子成份、离子强度等，使胶原材料利于体内组织修复使用；同时，由于添加了连接分子，溶液中的胶原分子可以通过连接分子与周围组织进行紧密结合，更利于胶原材料的组织修复功效。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
(1)将3g胶原材料置入200g去离子水中，搅拌过程中添加1M酒石酸溶液溶解胶原形成均质水溶液；
(2)在5℃下，将步骤(1)所得胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入2g NaH2PO4和1gKCl，充分溶解；
(3)在5℃下，通过2M氢氧化钾溶液或1M甲酸溶液调节步骤(2)所得胶原水溶液pH值至8，形成均质溶液；
(4)在4℃下，在步骤(3)所得胶原水溶液中加入2wt.％异硫氰酸酯溶液，搅拌均匀。
2.一种仿生胶原水溶液的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
(1)将1g胶原材料置入1000g去离子水中，搅拌过程中添加0.1M草酸溶液溶解胶原形成均质的胶原水溶液；
(2)在3℃下，胶原水溶液在搅拌过程中缓慢加入3g K2SO4和5g KHCO3，充分溶解；
(3)在0℃下，通过2M氨水溶液或5M柠檬酸溶液调节胶原水溶液pH值至7.0，形成均质溶液；
(4)在5℃下，在胶原水溶液中加入10wt.％环氧乙烷溶液和0.5wt.％京尼平溶液，搅拌均匀。
3.使用如权利要求1或2所述的仿生胶原水溶液的制备方法所制备的仿生胶原水溶液。
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