CN113286623A - 包封固体颗粒的水凝胶组合物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含水凝胶和固体颗粒的组合物及其用途。更具体地，所提出的技术涉及用于制造包含包封在形成水凝胶颗粒的交联多糖分子内的固体颗粒的组合物的方法，所述方法包括在pH介于5和9之间的水悬浮液中，混合包含一个或多个羧基的水溶性多糖分子，水不溶性固体颗粒，双亲核或多亲核官能交联剂和偶联剂，以形成包含包封所述固体颗粒的交联多糖分子的水凝胶的组合物。本公开包括所述组合物，制备所述组合物的方法和所述组合物作为皮肤填充剂的用途。

Description

包封固体颗粒的水凝胶组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年12月21日提交的EP申请号EP18215076的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及包含水凝胶和固体颗粒的组合物及其用途。更具体地，所提出的技术涉及用于制造包含包封在交联多糖分子内形成水凝胶颗粒的固体颗粒的组合物的方法。本公开包括所述组合物，制备所述组合物的方法和所述组合物作为皮肤填充剂的用途。

背景技术

吸水凝胶或水凝胶广泛用于生物医学领域，例如在粘性手术期间和作为皮肤填充剂。它们通常通过将聚合物化学交联成无限网络来制备。虽然许多多糖吸收水直到它们完全溶解，但是相同多糖的交联凝胶通常可以吸收一定量的水直到它们饱和，即它们具有有限的液体保留能力或溶胀度。水凝胶具有许多医疗和美容应用，并且通常用作通过注射治疗施用的皮肤填充剂。

可注射的美容皮肤填充剂是用于非手术再生治疗的广泛认可的产品，并且通常用于面部治疗。面部填充物是诸如胶原蛋白，透明质酸和羟基磷灰石钙的产品，其通过面部注射减少或消除皱纹，升高疤痕凹陷，增强嘴唇和代替软组织体积损失来复原面部皮肤。此类填充剂最为广泛接受的成分之一包括通过交联透明质酸(也称为透明质酸)形成的水凝胶。

透明质酸(HA)是一种天然存在于哺乳动物组织中的线性多糖。它由重复的双糖组成，→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→，并且由于其特性，HA在许多医学(制药)和美学方面的应用，如皮肤填充和组织增强等，已经变得非常重要。HA的另一个重要特性是它具有很强的结合和保持水分的能力。

为了改善机械性能并延长HA在体内的持续时间，一种常用的方法是通过将HA聚合物链共价交联成三维网络来形成水凝胶。通过交联形成的HA水凝胶已成为许多医学和美学应用的重要组成部分。目前市场上常用的将HA交联成水凝胶的方法是与1,4-丁二醇二缩水甘油醚，BDDE在碱性条件下反应以在HA和交联剂之间产生稳定的共价醚键。在反应中，HA的亲核基团与BDDE的环氧基团反应。去质子化的羟基是比阴离子羧基和酰胺两者都强得多的亲核试剂。因此羟基是最可能的反应位点，与交联剂形成稳定的醚键。

由于基于HA的填充剂由天然聚合物制成，它们具有生物相容性，但也可生物降解，即填充剂会随着时间的推移而降解，必须重复处理以保持结果。因此，填料的增强和延长的结果将是优选的。因此，本领域需要进一步改进皮肤填充剂的组成以增强注射治疗的结果。

发明内容

本公开的目的是提供寻求在现有技术中单独地或以任何组合减轻，缓解或消除上述缺陷和缺点的方法和产品。在一些方面，所述目的通过用于美容和药物治疗的组合物获得，所述组合物包含包封固体颗粒的多糖水凝胶，其中固体颗粒存在于水凝胶的凝胶颗粒内。

在一些方面，本公开通常涉及一种制造包含交联糖胺聚糖水凝胶的组合物的方法，所述水凝胶包含包埋水凝胶中的固体颗粒，所述方法包括：(a)在pH介于5和9之间的水悬浮液中混合以下物质：(i)包含一个或多个羧基的糖胺聚糖分子，(ii)水不溶性固体颗粒，(iii)双亲核或多亲核官能交联剂，和(iv)偶联剂，从而用偶联剂活化所述糖胺聚糖分子；(b)交联所述活化的糖胺聚糖分子；和(c)将所述固体颗粒包埋在所述交联的糖胺聚糖分子中以形成包含包埋有所述固体颗粒的糖胺聚糖水凝胶的组合物。

在一些方面，糖胺聚糖是透明质酸。在一些方面，水不溶性固体颗粒包含一种或多种聚合物。在一些方面，一种或多种聚合物是均聚物，杂聚物或共聚物。在一些方面，一种或多种聚合物是聚乳酸。在一些方面，不溶性固体聚合物是多孔的。在一些方面，不溶性固体聚合物是无孔的。在一些方面，水凝胶中的水不溶性固体聚合物以重量计为0.1％-10％。

在一些方面，所述方法进一步包括将所述水凝胶分成更小的部分。在一些方面，更小的部分是水凝胶颗粒。在一些方面，水凝胶颗粒的尺寸在0.01mm-5mm之间。在一些方面，所述方法进一步包括向所述组合物中加入局部麻醉剂。

在一些方面，所述方法进一步包括将所述组合物消毒。在一些方面，将组合物消毒包括热消毒。

在一些方面，所述方法进一步包括预活化所述固体颗粒的表面，其中所述预活化的表面使固体颗粒在混合时接枝到所述糖胺聚糖分子上。在一些方面，预活化固体颗粒的表面包括用羧基预装载所述固体颗粒的表面，其中所述固体颗粒通过酰胺键接枝到糖胺聚糖分子上。在一些方面，预活化表面包括用双亲核或多亲核官能接枝剂预装载固体颗粒的表面，其中所述固体颗粒通过接枝剂和糖胺聚糖分子之间的酰胺键接枝。

在一些方面，交联剂包括二氨基衍生物。在一些方面，二氨基衍生物是脂族或芳族二氨基衍生物，肽或肽序列或二氨基碳水化合物。在一些方面，二氨基碳水化合物选自：二氨基海藻糖、二氨基透明质酸四糖、二氨基透明质酸六糖、二氨基乳糖、二氨基麦芽糖、二氨基蔗糖、壳二糖或二氨基棉子糖。

在一些方面，偶联剂是三嗪类偶联剂。在一些方面，三嗪类偶联剂选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)或2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。

在一些方面，本公开涉及一种组合物，其包含包埋有由本文所述的任何一种或多种方法产生的固体颗粒的糖胺聚糖水凝胶。

在一些方面，本公开涉及包含包埋在水凝胶的凝胶颗粒内的水不溶性固体颗粒的组合物，所述水凝胶包含含有羧基的交联糖胺聚糖，其中糖胺聚糖分子通过酰胺键交联。

在一些方面，糖胺聚糖选自：透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素或其组合。在一些方面，糖胺聚糖是透明质酸。在一些方面，水不溶性固体颗粒包含一种或多种聚合物。在一些方面，一种或多种聚合物是均聚物，杂聚物或共聚物。在一些方面，一种或多种聚合物是聚乳酸。在一些方面，不溶性固体聚合物是多孔的。在一些方面，不溶性固体聚合物是无孔的。在一些方面，水凝胶中的水不溶性固体聚合物以重量计为0.1％-10％。在一些方面，凝胶颗粒的尺寸在0.01mm-5mm之间。

在一些方面，组合物还包含局部麻醉剂。在一些方面，局部麻醉剂是利多卡因。在一些方面，组合物是消毒的。

在一些方面，固体颗粒被接枝到糖胺聚糖分子上。在一些方面，固体颗粒通过酰胺键接枝到糖胺聚糖分子上。在一些方面，固体颗粒通过接枝剂和糖胺聚糖分子之间的酰胺键接枝。

在一些方面，本公开通常涉及一种皮肤填充方法，所述方法包括将本文所述的任何一种或多种组合物注射到受试者的真皮中。在一些方面，注射组合物包括在多于一个注射部位注射。在一些方面，与安慰剂对照相比，所述方法减少皱纹和细纹的出现。

附图说明

图1A-1C是固体颗粒相对于水凝胶颗粒分布的各种方式的图示。图1A描述现有技术的解决方案，其中在将已经交联的水凝胶与固体颗粒混合之后，固体颗粒存在于凝胶颗粒的外部和内部。图1B描绘由本公开的方法产生的凝胶颗粒，其中在水溶性多糖与存在的固体颗粒交联之后，固体颗粒包埋在凝胶颗粒内。图1C描绘由本公开的方法产生的凝胶颗粒，其中在水溶性多糖与存在的固体颗粒交联后，固体颗粒包埋在凝胶颗粒内，但一些固体颗粒也存在于凝胶颗粒之外。

图2描述本公开的一个方面，其中水溶性多糖(在这种情况下为透明质酸)与交联剂(在这种情况下为二氨基海藻糖(DATH))和固体颗粒(在这种情况下为聚-L-乳酸(PLLA)和偶联剂(在这种情况下为DMTMM)，以形成包封固体PLLA颗粒的交联HA水凝胶颗粒。

图3描述了本公开的一个方面，其中聚合物颗粒被预处理以提高颗粒表面的羧酸盐密度，例如通过添加或释放羧基。在此描述中，在将颗粒与水溶性多糖(HA)、交联剂(DATH)和偶联剂DMTMM混合(未图示)之前，使用马来酸酐添加羧基(其在固体颗粒表面提供羧基)，或使用部分水解释放/暴露羧基。

图4描绘本公开的一个方面，其中通过在将颗粒与水溶性多糖(HA)，交联剂(DATH)和偶联剂DMTMM混合之前，在该实例中使用DATH作为接枝剂，通过用胺的表面预负载颗粒来预处理固体颗粒。在该方面中，在混合步骤之前，首先用马来酸酐处理固体颗粒，以添加与接枝剂DATH偶联的酸酐，从而在预处理的颗粒表面上提供胺的表面。

图5描绘本公开的一个方面，一种制造包封固体颗粒的交联多糖分子的组合物的方法的流程图。

图6描绘本公开的一个方面的流程图，一种制造可注射产品的方法，所述可注射产品包含包封固体颗粒的交联多糖分子的组合物。

图7是根据实施例1中描述的方法在高压消毒前获得的凝胶图像。

图8是根据实施例2中描述的方法在高压消毒后获得的凝胶图像。

图9是根据实施例4-2中描述的方法在高压消毒后获得的凝胶(样品4-2)图像。

具体实施方式

本公开的其他方面和优选实施例通过以下详细公开和所附权利要求书是清楚的

水凝胶和制备水凝胶的方法

本公开通过提供复合生物材料的组合物提供了上述问题和缺点的解决方案，所述复合生物材料包含包封/包埋并均匀分布在交联多糖水凝胶颗粒内的固体颗粒。

数十年来，市场上的大部分皮肤填充剂基于透明质酸，并且通过公知的BDDE/NaOH技术交联以获得具有用于皮肤注射的合适性质的产品。最近，SCULPTRA也被FDA批准作为皮肤填充剂。与大多数基于透明质酸的填充剂品牌相反，SCULPTRA是基于聚-L-乳酸(PLLA)的产品。然而，由于即时皱纹和体积增加，优选具有基于多糖水凝胶的产品，而且还包括颗粒的胶原刺激效果，例如将颗粒掺入水凝胶产品中的组合物。

聚乳酸(PLA)或聚丙交酯是衍生自可再生资源(例如玉米淀粉，木薯根，屑或淀粉或甘蔗)的可生物降解和生物活性热塑性脂族聚酯。由于乳酸的手性性质，存在几种不同形式的聚丙交酯，聚-L-丙交酯(PLLA)是由L,L-丙交酯(也称为L-丙交酯)的聚合产生的产物。由于PLA/PLLA颗粒的生物相容性，生物降解性和胶原新合成性质，将它们包含在水凝胶填充剂产品中将是有利的，以增强水凝胶的性质并延迟填充剂产品的降解。

在CN104258470中描述了一种在水凝胶产品中掺入颗粒的方法，其中通过将交联的HA与PLA颗粒混合来形成产品。然而，该产品有缺乏PLA颗粒的均匀和均匀分布的风险，这可能造成微球在凝胶颗粒外部聚集的极大风险，以及由于PLA颗粒的不均匀分布而增加在注射期间堵塞针的风险。这种不均匀分布和堵塞的基础是由于PLLA是水不溶性的，并且亲脂性相互作用导致簇形成。

PLA和PLLA是可生物降解的聚酯，由于水解而对碱性条件敏感。由于这些性质，考虑到在碱交联过程中存在PLA/PLLA水解和乳酸释放的风险，将PLA或PLLA颗粒掺入到基于透明质酸的水凝胶中是个挑战。因为HA的交联通常使用与BDDE在碱性条件下的反应进行，所以在没有考虑交联之前添加PLA或PLLA颗粒。

然而，已经开发了使用亲核官能交联剂交联HA的新方法，并且与BDDE方法相反，该方法可以在中性或基本上中性的条件下进行，即中性pH。因此，测试了在交联步骤之前已经添加颗粒，即允许它们在交联过程中存在，这导致颗粒被包封或包埋在水凝胶或水凝胶颗粒中。这是可能的，因为这种新的交联方法不需要使颗粒降解的碱性条件，而是可以在基本上中性的条件下进行。因此，获得了颗粒的均匀和均匀分布。对于“基本上中性的条件”或“中性pH”，意指在制造过程(交联步骤)期间在pH5和pH9之间的范围，其在最终产物(组合物1)中得到在pH6和pH8之间的pH范围。

因此，本公开包括包封在交联多糖分子内的固体颗粒的组合物。在一个方面，本公开描述可注射的复合生物材料，其包含主要包埋(包封)并均匀分布在基于聚合物的水凝胶颗粒内的固体聚合物颗粒，所述固体聚合物颗粒又具有能够填充到注射器中并通过针或套管的总平均尺寸。本公开涉及水凝胶组合物，其特征在于其保留大量水或水性溶剂(例如磷酸盐缓冲液)的能力，其中每个水凝胶颗粒平均含有多个固体聚合物颗粒。

所述产物的组合物是通过水溶性多糖(例如HA)在水不溶性固体颗粒(例如由生物相容性和生物可降解聚酯(例如聚乳酸)组成的固体聚合物颗粒)存在下的共价交联获得的。在一些方面，所述组合物包含互连的凝胶相和固相。在一些方面，水凝胶材料通常含有麻醉剂，例如利多卡因，以使注射期间的疼痛最小化。在一些方面，含有包埋的固体颗粒的水凝胶然后可以在与麻醉剂混合之前物理地分成适当尺寸的部分，随后填充到注射器中并通过例如加热消毒。

在一些方面，包埋的固体聚合物颗粒在固体聚合物颗粒和水凝胶之间的界面处共价键合至周围的水凝胶网络，然而颗粒和水凝胶主要保持为分离的不同相。这可以通过预活化固体颗粒的表面来实现，然后所述固体颗粒可以接枝到水凝胶网络中的多糖分子上。当水凝胶基于交联的HA时，该网络可通过酶(透明质酸酶或软骨素酶)降解。

仅通过在交联过程期间存在固体聚合物颗粒，它们可变得均匀分布并完全包封和包埋在水凝胶内，并且仅通过在中性条件下交联多糖，固体聚合物颗粒可被包埋而没有降解风险。因此，优选使用多官能胺(例如二氨基海藻糖，DATH)和偶联剂，优选通过三嗪介导的酰胺化，使用例如DMTMM作为偶联剂，在水中进行交联。

因此，本公开的方法提供了包含交联多糖分子的水凝胶的组合物，其将固体聚合物颗粒包封在水凝胶的凝胶颗粒内。该产品与先前公开的基于透明质酸的水凝胶相比具有许多优点，所述基于透明质酸的水凝胶在凝胶形成后与PLLA的颗粒混合，其中所有颗粒以簇的形式位于凝胶的外部。例如，本公开的组合物具有较低的在注射材料的组织中形成结节或隆起的风险，和较低的在注射期间由于均匀分布而堵塞针的风险，以及由于包埋的颗粒在它们较慢地暴露于组织时的延长效果。当前组合物与通过将已交联的水凝胶与固体颗粒混合而获得的产物之间的差异示于图1A-1C中。图1A-1C示出许多包含交联多糖分子的凝胶颗粒。图1A示出现有技术的实施例，其中由于将固体颗粒与已经交联的多糖水凝胶混合，固体颗粒分布在凝胶颗粒之间。图1B示出本公开的实施例，其中由于在交联步骤期间存在颗粒，所以固体颗粒被包封在凝胶颗粒内。一些固体颗粒也可以位于凝胶颗粒的外部，如图1C所示。在该实施例中，PLLA颗粒(40-60μm)将包埋在凝胶网络中。透明质酸的降解将释放未修饰的PLLA颗粒。此外，PLLA表面上的末端羧酸酯(-COOH)可以通过二氨基交联剂(DATH)共价地进一步将PLLA颗粒结合到凝胶网络中。然而，这些在未改性PLLA中是如此少以致在该实施例中不认为PLLA是接枝的。

聚乳酸和透明质酸的固体颗粒作为本公开的产品的组合使用在本领域中之前没有描述。然而，文献WO200633698描述HA和PLA聚合物在熔融物或浓缩溶液中的用途，而不是作为固体颗粒。WO200633698描述一种基质，其中聚酯聚合物(例如聚乳酸)与多糖(例如透明质酸)通过缠结结合，其中缠结是指聚合物在熔融物或浓缩溶液中的状态。因此，与本公开的组合物和方法相比，其是完全不同的产品和制造所述产品的完全不同的方法。

在本公开中，涉及包埋在水凝胶内的固体颗粒，两种不同的聚合物种类之间的缠结是不期望的，并且由于固体聚合物颗粒的差的水溶解性而不期望发生，所述固体聚合物颗粒既不应该熔融也不溶解，而是从工艺开始直到获得最终产物保持完整和固体。此外，最终材料由两种不同的相组成，一种是由在大量水中溶胀的交联多糖网络组成的水凝胶，和另一种是包埋在水凝胶内的固体聚合物颗粒，而不是单相固体材料。最终得到的材料可以通过使用注射器装置通过针注射施用到哺乳动物组织中，这不是关于缠结基质的情况。

US7767806B2公开由透明质酸组成的微粒，所述透明质酸通常通过HA羧基上的酰胺键共价键合至合成的可生物降解的和生物相容性聚酯(例如PLA或PGA)。微粒被描述为限定的单一单元，在一些情况下由涂覆有HA的聚合物核组成，其可分散在水性溶剂中并且具有能够通过针注射的平均尺寸，其中胶体分散根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)定义为其中任何性质(例如固体，液体或气体)的胶体尺寸的颗粒分散在不同组成(或状态)的连续相中的体系。

与本公开相比，US7767806B2中的微粒不含有均匀分布在基于HA的水凝胶内的多个固体颗粒，而是由HA和聚酯两者制成的单相颗粒或涂覆有HA的单核聚合物颗粒组成。包含微粒(包含HA和聚合物两者)的分散体在经受水性溶剂时将(根据定义主要地)构成细分相域的一种相，而溶剂将是连续相。这种分散体将预期含有过量的水性溶剂；然而，连续(水)相不包含水凝胶。本公开的组合物(包埋在水凝胶内的固体聚合物颗粒)不由分散在水溶液/溶剂中的固体聚合物颗粒组成。此外，US7767806B2不涉及使用基于糖的连接基(或间隔臂，例如DATH)将HA结合至聚合物。

先前已经发现，可以使用含有游离胺基的短糖链作为连接基/间隔物来制备水溶性多糖凝胶/水凝胶，例如糖胺聚糖(GAG)凝胶，如透明质酸凝胶，该构思可以用于本公开的方法中。通过包含选自二糖，三糖，四糖和低聚糖的间隔基团的交联剂的交联使交联对所提供的水凝胶中的透明质酸的天然性质的干扰最小化。间隔基团可以例如由胺化海藻糖，麦芽糖，乳糖或纤维二糖组成，其中二氨基海藻糖(DATH)是优选的交联剂/间隔基团。

与高效缩合反应一起使用交联剂使产物以受控方式组装。通过用偶联剂活化HA的羧基，可以使用可包含间隔基团的双亲核或多亲核体官能交联剂经由HA分子的活化羧基交联HA分子，以获得交联的HA分子。优选的偶联剂是三嗪类偶联剂，例如DMTMM或CDMT。

使用DMTMM用于活化羧酸酯和随后与二氨基结构(例如DATH、赖氨酸、HMDA、二氨基蔗糖等)缩合已经显示是生产由交联的多糖分子(例如DATH、赖氨酸、HMDA、二氨基蔗糖等)组成的水凝胶的有效方法，例如GAGs。该反应可以在中性pH下，在缓冲或非缓冲体系中进行，并且在这些条件下，与熟知的BDDE/NaOH体系方法相反，观察到碱性敏感性生物聚合物(如PLLA和透明质酸)的微小降解。

HA，软骨素和硫酸软骨素是熟知的生物相容性聚合物。它们是属于GAG组的天然存在的多糖。所有GAG均为带负电的杂多糖链，其具有吸收大量水的能力。HA是用于医疗和美容用途的最广泛使用的生物相容性聚合物之一。硫酸软骨素(CS)是在哺乳动物的结缔组织中发现的非常丰富的GAG，其中它与其它硫酸化的GAG一起作为部分蛋白聚糖与蛋白质结合。先前已经表明，含有CS的水凝胶由于其与天然细胞外基质的相似性而可以成功地用于生物医学应用。糖胺聚糖的交联延长构成网络的可降解聚合物的持续时间，这在许多应用中是有用的。然而，交联也可降低GAG的天然性质。因此，通常需要通过有效交联保持低程度的修饰以保存糖胺聚糖本身的天然性质和作用。这是使用本公开的交联概念获得的。

本公开提供了包封在水凝胶产品内的固体聚合物颗粒的组合物，所述水凝胶产品包含作为可溶胀聚合物的包含羧酸/基团的水溶性多糖分子，例如糖胺聚糖分子，其中所述水溶性多糖分子例如通过包含间隔基团的交联共价交联，所述间隔基团选自二糖，三糖，四糖和低聚糖。

通过包含选自由二糖，三糖，四糖和低聚糖组成的组的间隔基团的交联剂的交联提供了完全基于碳水化合物类型结构或其衍生物的水凝胶产物，其使交联对水溶性多糖的天然性质的干扰最小化。所述二糖，三糖，四糖或低聚糖优选在结构和分子量方面被很好地限定。优选地，间隔物选自一种特定的二糖，三糖，四糖或低聚糖结构。

优选地，所述二糖，三糖，四糖或低聚糖是单分散的或具有窄的分子量分布。使用定义明确的二糖，三糖，四糖或低聚糖基交联剂以及高效缩合反应允许产物以受控方式组装。交联剂本身也可有助于保持或增加水凝胶的性质，例如当与透明质酸相关的结构(例如二氨基透明质酸四糖)交联时或当与具有高水保留性质的结构(例如海藻糖)交联时。

所述水溶性多糖可以是GAG，例如硫酸化或非硫酸化糖胺聚糖，例如透明质酸，软骨素或硫酸软骨素，硫酸乙酰肝素，类肝素，肝素，硫酸皮肤素和硫酸角质素，或其混合物。在一些实施方案中，GAG是透明质酸，软骨素或硫酸软骨素。在一个优选的实施方案中，GAG是透明质酸。在一个优选的实施方案中，GAG是透明质酸。与本公开的方法和组合物相关使用的GAG优选为天然存在的GAG。GAG优选以其天然状态使用，即GAG的化学结构优选未通过添加官能团等改变或修饰。优选使用天然状态的GAG，因为这将提供更接近于天然分子的交联结构，这保存了GAG自身的天然性质和作用，并且当交联的GAG被引入体内时可以使免疫应答最小化。

共价交联的水溶性多糖或GAG分子优选由包封固体颗粒的碳水化合物型结构或其衍生物组成，或基本上由包封固体颗粒的碳水化合物型结构或其衍生物组成。这意味着交联的GAG分子优选不含，或基本上不含合成的非碳水化合物结构或连接基。这可以通过使用处于其天然状态的GAG与交联剂一起实现，所述交联剂由碳水化合物型结构或其衍生物组成，或基本上由碳水化合物型结构或其衍生物组成。交联剂的官能团然后直接共价键合至GAG的羧基。因此，共价交联的GAG的交联优选由或基本上由二糖，三糖，四糖和低聚糖间隔基团组成。

在一个实施方案中，本公开提供了制造或制备组合物例如消毒的可注射组合物的方法或工艺，所述组合物包含包封在包含交联的水溶性多糖的水凝胶产品内的固体颗粒，其中所述水溶性多糖包含羧酸/基团，所述方法包括以下步骤：

a)提供水溶性多糖分子和水不溶性固体聚合物颗粒的悬浮液；

b)添加包含双亲核或多亲核体官能交联剂和偶联剂的反应溶液，由此活化所述水溶性多糖分子上的羧基并且使用所述交联剂经由所述活化的水溶性多糖分子的活化羧基交联所述活化的水溶性多糖分子，所述交联剂任选地包含选自由二糖，三糖，四糖和低聚糖组成的组的间隔基团，以获得主要在凝胶颗粒内包封固体颗粒的交联水溶性多糖分子的组合物；

c)将所述组合物分成适于通过针注射的较小部分；

d)向所述组合物中加入局部麻醉剂；和

e)将该组合物消毒，例如使用热消毒，如高压消毒。

共价交联的水溶性多糖或GAG分子优选由碳水化合物型结构或其衍生物组成，或基本上由碳水化合物型结构或其衍生物组成。

在一个实施方案中，活化和交联同时进行，并且制造方法或工艺作为一锅法进行，其中所有成分在反应容器中混合以提供组合物。因此，本公开提供了用于制备包含固体颗粒的交联多糖分子的简单一锅/一步制造方法。该一锅/一步制造方法减少了制造该组合物的过程中的步骤的数目，并且因此是与例如两步法相比更简单的方法。从而此方法节约时间和金钱。然而，由于多糖分子，特别是透明质酸的加工和改性通常导致聚合物骨架的一定程度的降解，减少加工和改性步骤的数量也可导致改善的，较少降解的多糖产物。

本公开的方法和组合物的一个实施方案示于图2中，其中将固体颗粒，水溶性多糖，交联剂和偶联剂(未示出)在基本上中性的水基悬浮液中混合使交联剂与水溶性多糖链结合，从而使水溶性多糖链彼此交联，形成交联的多糖水凝胶，其中固体颗粒被包封在交联的多糖分子的凝胶颗粒内。在该实施方案中，固体颗粒基本上不含固体颗粒和多糖链之间的键，因此固体聚合物颗粒被称为未接枝到水凝胶上。因此，该实施方案的固体颗粒主要包封在组合物的凝胶颗粒内。

在一些实施方案中，如图3和图4所示，在步骤(a)之前预处理固体聚合物颗粒，其中在混合/交联步骤期间在水溶性多糖主链和固体颗粒之间形成共价键，使得固体颗粒接枝到多糖分子上。在预处理中，固体颗粒的表面通过例如向表面预装载羧基/羧酸盐来预活化，如图3所示，例如通过使用例如马来酸酐或酸酐衍生物添加羧基，或通过使用部分水解释放羧基。在一个实施方案中，固体颗粒表面的预处理包括用接枝剂装载表面。所述表面可以预先装载接枝剂，所述接枝剂为双亲核或多亲核官能分子，例如本公开的交联剂。这可以使用两步法进行，首先添加羧基，例如使用马来酸酐，然后添加接枝剂如DATH，以用胺装载表面，如图4所示。固体颗粒表面的这种预活化诱导颗粒与水溶性多糖链之间的键的形成，即在固体颗粒变得包埋在凝胶颗粒内基本上同时将固体颗粒接枝到水溶性多糖上。这些经预处理的固体聚合物颗粒因此被称为接枝到水凝胶的交联多糖链。在一些实施方案中，交联和接枝在多糖分子和交联剂之间以及在多糖分子和接枝剂之间提供酰胺键。酰胺键是不易水解的稳定共价键。因此，根据本公开的组合物(其中交联和接枝均通过酰胺键实现)将比其中交联或接枝通过较弱的键实现的类似产物对降解敏感更小。在交联和接枝中使用相同类型的键也可提供产物的更可预测的降解行为。这些实施方案的固体颗粒因此都被包封在组合物的凝胶颗粒内，并且接枝到交联的多糖上，其中接枝可以通过接枝剂与多糖分子之间，或固体颗粒表面上所添加的羧基与多糖分子之间的酰胺键进行。

因此，可以通过在混合步骤之前将固体颗粒与双亲核或多亲核官能分子预装载来预处理/预活化固体颗粒。一个实例是用DATH预装载固体颗粒，这可以使用两步法进行，首先使用例如马来酸酐预装载具有羧基的表面，然后用DATH水解以形成胺涂覆的颗粒。

在另一个实施方案中，为了增加水凝胶和包封/包埋的固体颗粒之间的共价键，可以通过添加或释放羧基来活化固体颗粒的表面。羧基可以使用例如羧酸盐(马来酸酐)的树状网络活化，或例如释放固体颗粒表面上的羧基的乙醇(etanolic)碱溶液活化。活化的颗粒可以与多糖，交联剂和偶联剂混合以形成组合物。

本公开涉及水溶性多糖分子通过共价键(优选酰胺键)的交联，通常使用偶联剂作为水溶性多糖分子骨架上的羧基的活化剂和双亲核或多亲核试剂官能交联剂，所述交联剂可包含选自由二糖，三糖，四糖和低聚糖组成的组的间隔基团。根据本发明的方法的交联可以通过温和且有效的途径实现，例如在中性pH下，导致高产率，同时使固体颗粒和水溶性多糖分子的降解最小化。

所述双亲核或多亲核体官能交联剂可含有间隔基团，所述间隔基团选自二糖，三糖，四糖和低聚糖，其保留在所述水溶性多糖分子之间的交联中。所述双亲核或多亲核体官能二糖，三糖，四糖和低聚糖包含至少两个与其连接的亲核体官能团。所述至少两个亲核官能团优选由选自以下的间隔基隔开：二糖，三糖，四糖和低聚糖。所述双亲核或多亲核体官能交联剂包含两个或更多个能够与所述水溶性多糖的官能羧基反应的官能团，导致形成共价键，优选酰胺键。所述亲核体官能团优选能够与所述水溶性多糖分子上的羧基反应以形成酰胺键。在一些实施方案中，所述二糖，三糖，四糖和低聚糖的亲核官能团选自伯胺，肼，酰肼，肼基甲酸酯(carbazate)，氨基脲(semi-carbazide)，氨基硫脲，硫代肼基甲酸酯和氨氧基。

所述双亲核或多亲核体官能二糖，三糖，四糖和低聚糖可以衍生自亲核体官能多糖，例如衍生自几丁质的壳二糖。所述双亲核或多亲核体官能二糖，三糖，四糖和低聚糖也可以是已经通过引入两个或更多个亲核体官能团而修饰的二糖，三糖，四糖和低聚糖。一组优选的双亲核或多亲核体官能交联剂包括同双官能或异双官能伯胺，肼，酰肼，肼基甲酸酯，氨基脲，氨基硫脲，硫代肼基甲酸酯和氨氧基。

在一个优选的实施方案中，偶联剂是肽偶联剂。优选的肽偶联剂是基于三嗪的偶联剂，包括与NMM反应的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)，或其前体2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。

本公开提供包封在水凝胶产品中的固体聚合物颗粒的组合物，其用作药物，例如用于治疗软组织病症。提供了通过向患者施用治疗有效量的组合物来治疗患有软组织病症的患者的方法。还提供了一种通过给予患者治疗有效量的组合物来为患者提供矫正或美学治疗的方法。

在一个实施例中，该方法进一步包括通过提供具有在0.01-5mm，优选地0.1-0.8mm范围内的平均尺寸的该组合物的颗粒将该组合物分成更小的部分。将包含聚合物颗粒的水凝胶物理地分成小到足以能够填充到注射器中并通过针挤出的部分。

凝胶部分，凝胶(有时也称为凝胶含量或凝胶c)是对作为凝胶网络的一部分的多糖的百分比的描述。90％的数目意味着仅10％的多糖不是网络的一部分。最终组合物的水含量可以例如在98-80％的范围内，其中所有的水必须也存在于水凝胶网络中，即不应该存在与水凝胶相分离的水相。溶胀度(Swc)相对于每克多糖的总吸液量(凝胶部分未校正)应在2-20mL/g范围内，如2-10mL/g。最终产物中的多糖浓度(交联的和/或非交联的)可以在5-50mg/mL的范围内，例如10-30mg/mL，并且最终产物中的固体颗粒的量可以在按重量计0.01-10％的范围内，例如0.1-5％。

在一些方面，最终产物中交联多糖的最终浓度为10-50mg/mL，10-45mg/mL，10-40mg/mL，10-35mg/mL，10-30mg/mL，10-25mg/mL，10-20mg/mL，10-15mg/mL，15-40mg/mL，15-40mg/mL，15-35mg/mL，15-30mg/mL，15-25mg/mL，15-20mg/mL，20-50mg/mL，20-45mg/mL，20-40mg/mL，20-35mg/mL，20-30mg/mL，20-25mg/mL，25-50mg/mL，25-45mg/mL，25-40mg/mL，25-35mg/mL，25-30mg/mL，30-50mg/mL，30-45mg/mL，30-40mg/mL，30-35mg/mL，35-50mg/mL，35-45mg/mL，35-40mg/mL，40-50mg/mL，或40-45mg/mL。

在一些方面，最终产物中的最终交联多糖浓度为约10-约50mg/mL，约10-约45mg/mL，约10-约40mg/mL，约10-约35mg/mL，约10-约30mg/mL，约10-约25mg/mL，约10-约20mg/mL，约10-约15mg/mL，约15-约40mg/mL，约15-约40mg/mL，约15-约35mg/mL，约15-约30mg/mL，约15-约25mg/mL，约15-约20mg/mL，约20-约50mg/mL，约20-约45mg/mL，约20-约40mg/mL，约20-约35mg/mL，约20-约30mg/mL，约20-约25mg/mL，约25-约50mg/mL，约25-约45mg/mL，约25-约40mg/mL，约25-约35mg/mL，约25-约30mg/mL，约30-约50mg/mL，约30-约45mg/mL，约30-约40mg/mL，约30-约35mg/mL，约35-约50mg/mL，约35-约45mg/mL，约35-约40mg/mL，约40-约50mg/mL，或约40-约45mg/mL。

在一些方面，最终产物中的最终交联和非交联多糖浓度为10-50mg/mL，10-45mg/mL，10-40mg/mL，10-35mg/mL，10-30mg/mL，10-25mg/mL，10-20mg/mL，10-15mg/mL，15-40mg/mL，15-40mg/mL，15-35mg/mL，15-30mg/mL，15-25mg/mL，15-20mg/mL，20-50mg/mL，20-45mg/mL，20-40mg/mL，20-35mg/mL，20-30mg/mL，20-25mg/mL，25-50mg/mL，25-45mg/mL，25-40mg/mL，25-35mg/mL，25-30mg/mL，30-50mg/mL，30-45mg/mL，30-40mg/mL，30-35mg/mL，35-50mg/mL，35-45mg/mL，35-40mg/mL，40-50mg/mL，或40-45mg/mL。

在一些方面，最终产物中的最终交联和非交联多糖浓度为约10-约50mg/mL，约10-约45mg/mL，约10-约40mg/mL，约10-约35mg/mL，约10-约30mg/mL，约10-约25mg/mL，约10-约1020mg/mL，约10-约15mg/mL，约15-约40mg/mL，约15-约40mg/mL，约15-约35mg/mL，约15-约30mg/mL，约15-约25mg/mL，约15-约20mg/mL，约20-约50mg/mL，约20-约45mg/mL，约20-约40mg/mL，约20-约35mg/mL，约20-约30mg/mL，约20-约25mg/mL，约25-约50mg/mL，约25-约45mg/mL，约25-约40mg/mL，约25-约35mg/mL，约25-约30mg/mL，约30-约50mg/mL，约30-约45mg/mL，约30-约40mg/mL，约30-约35mg/mL，约35-约50mg/mL，约35-约45mg/mL，约35-约40mg/mL，约40-约50mg/mL，或约40-约45mg/mL。

在一些方面，最终产物中固体颗粒的量以重量计在0.01％-10％的范围内。在一些方面，最终产物中固体颗粒的量以重量计在0.1-5％重量的范围内。在一些方面，最终产物中固体颗粒的量按重量计在以下范围内：0.01％-10％，0.05％-10％，0.1-10％，0.5％-10％，1％-10％，2％-10％，3％-10％，4％-10％，5％-10％，8％-10％，0.01％-8％，0.05％-8％，0.1-8％，0.5％-8％，1％-8％，2％-8％，3％-8％，4％-8％，5％-8％，0.01％-10％，0.05％-10％，0.1-10％，0.5％-10％，1％-10％，2％-10％，3％-10％，4％-10％，5％-10％，8％-10％，％-5％，0.05％-5％，0.1-5％，0.5％-5％，1％-5％，2％-5％，3％-5％，4％-5％，0.01％-4％，0.05％-4％，0.1-4％，0.5％-4％，1％-4％，2％-4％，3％-4％，0.01％-3％，0.05％对3％，0.1-3％，0.5％-3％，1％-3％，2％-3％，0.01％-2％，0.05％-2％，0.1-2％，0.5％-2％ο1％-2％，0.01％-1％，0.05％-1％，0.1-1％，0.5％-1％，0.01％-0.1％，0.05％-0.1％，或0.01％-0.05％。

在一些方面，最终产物中固体颗粒的量按重量计为：大于0.01％，大于0.025％，大于0.05％，大于0.075％，大于0.1％，大于0.2％，大于0.3％，大于0.4％，大于0.5％，大于0.6％，大于0.7％，大于0.8％％，大于0.9％，大于1.5％，大于2％，大于2.5％，大于3％，大于3.5％，大于4％，大于4.5％，大于5％，大于5.5％，大于6％，大于6.5％，大于7％，大于7.5％，大于8％，大于8.5％，大于9％，但小于或等于10％。

在一些方面，最终产物中固体颗粒的量按重量计为：大于约0.01％，大于约0.025％，大于约0.05％，大于约0.075％，大于约0.1％，大于约0.2％，大于约0.3％，大于约0.4％，大于约0.5％，大于约0.6％，大于约0.7％，大于约0.8％，大于约0.9％，大于约1.5％，大于约2％，大于约2.5％，大于约3％，大于约3.5％，大于约4％，大于约4.5％，大于约5％，大于约5.5％，大于约6％，大于约6.5％，大于约7％，大于约7.5％，大于约7.5％大于约8％，大于约8.5％，大于约9％；但小于或等于10％。

在一些方面，组合物还包含氯化钠。在一些方面，组合物显示0.9％w/v的氯化钠浓度。在一些方面，当利多卡因存在于组合物中时，所述组合物表现出0.7％的氯化钠浓度。在一些方面，当组合物中不存在利多卡因时，所述组合物表现出0.9％的氯化钠浓度。在一些方面，组合物还包含磷酸盐缓冲液。在一些方面，组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些方面，组合物还包含氯化钠，磷酸盐缓冲液和药学上可接受的载体。在一些方面，磷酸盐缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲液)。

在一些方面，所述组合物包含一种或多种密度增强剂。在一些方面，密度增强剂可以选自山梨糖醇，甘露糖醇和果糖。

在一些方面，组合物包含缓冲剂。缓冲剂是添加到溶液中以使溶液抵抗由于稀释或少量添加酸或碱而导致的pH变化的化合物。有效的缓冲系统使用含有大且大约相等浓度的共轭酸-碱对(或缓冲剂)的溶液。本文使用的缓冲剂可以是药学上可接受的任何这样的化合物，包括但不限于磷酸盐和柠檬酸盐(共轭酸和/或碱)。在一些方面，缓冲剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)或替代的磷酸盐缓冲剂。

水凝胶网络中交联剂的量通常由所需产物性质(即溶胀能力)和多糖浓度决定，并且与多糖重复单元的量相比，应在0.1-10mol-％，例如0.5-5mol-％的范围内。水凝胶颗粒的尺寸可以有很大变化，其中水凝胶颗粒的平均尺寸通常在1-1000μm的范围内，并且其中每个水凝胶颗粒通常含有多个固体颗粒，即两个或更多个固体颗粒。通过流变学测定的该产品的弹性模量(G波数)应该在50-5000Pa的范围内，例如100-2500Pa。

在一些方面，包含所述组合物的产品可以进一步包含治疗相关浓度的局部麻醉剂。局部麻醉剂是引起可逆局部麻醉和伤害感受丧失的药物。当用于特定神经通路(神经阻滞)时，可以实现诸如止痛(痛觉丧失)和麻痹(肌力丧失)的效果。所述局部麻醉剂可以添加到所述组合物中以减少患者由于所述注射程序而经历的疼痛或不适。根据某些实施方案，局部麻醉剂选自酰胺和酯型局部麻醉剂，例如布比卡因、布坦卡因(butanilicaine)、卡替卡因(carticaine)、辛可卡因(地布卡因)、氯丁卡因(clibucaine)、对哌啶基乙酰氨基苯甲酸乙酯、依替卡因、利多卡因(lignocaine,lidocaine)、甲哌卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、丙胺卡因、罗哌卡因、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、伐多卡因(vadocaine)、阿替卡因、左旋布比卡因、阿米卡因、可卡因、丙泮卡因(propanocaine)、氯美卡因(clormecaine)、环甲卡因(cyclomethycaine)、丙美卡因(proxymetacaine)、丁卡因(amethocaine,tetracaine)、苯佐卡因、布他卡因、丁托西卡因(butoxycaine)、氨基苯甲酸丁酯、氯普鲁卡因、丁美卡因(拉罗卡因)、奥布卡因(oxybuprocaine)、哌罗卡因(piperocaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙氧卡因、三卡因或其组合。

在一些方面，局部麻醉剂是利多卡因。利多卡因是一种众所周知的物质，其在可注射制剂如透明质酸组合物中广泛用作局部麻醉剂。酰胺或酯类局部麻醉剂的浓度可以是技术人员在每个具体局部麻醉剂或其组合的治疗相关浓度范围内的。在一些由实施方案选择的实施方案中，所述局部麻醉剂的浓度在0.1-30mg/ml的范围内。

在一些方面，所述组合物中的局部麻醉剂的浓度在1-5mg/mL之间。在一些方面，所述组合物中的局部麻醉剂的浓度在约1-约5mg/mL之间。在一些方面，所述组合物中的局部麻醉剂的浓度在2-4mg/mL之间。在一些方面，所述组合物中的局部麻醉剂的浓度在约2-约4mg/mL之间。在一些方面，所述组合物中局部麻醉剂的浓度为0.5mg/mL，1mg/mL，1.5mg/mL，2mg/mL，2.5mg/mL，3mg/mL，3.5mg/mL，4mg/mL，4.5mg/mL或5mg/mL。在一些方面，所述组合物中局部麻醉剂的浓度为约0.5mg/mL，约1mg/mL，约1.5mg/mL，约2mg/mL，约2.5mg/mL，约3mg/mL，约3.5mg/mL，约4mg/mL，约4.5mg/mL，或约5mg/mL。

在一些方面，组合物是无菌的。在一些方面，组合物是消毒的。在一些方面，组合物通过过滤消毒，加热消毒或辐射消毒来消毒。在一些方面，本文所述的方法可进一步涉及通过例如高压消毒对产品进行消毒，即使用饱和蒸汽进行消毒。因此，在一些实施方案中，水凝胶产品已经通过高压消毒进行消毒。高压消毒可以在F₀-值>4下进行。高压消毒可以优选在10-50范围内的F₀-值下进行。饱和蒸汽消毒过程的F₀值是在121℃的温度℃下根据具有10的Z-值的微生物通过该过程递送至其最终容器中的产品的以分钟计的等效时间表示的致死率。

在一些方面，组合物的组分在混合或形成整个组合物之前消毒，由此产生包含两种或更多种在形成组合物之前消毒的组分的组合物。

在一些方面，组合物或产品可以预填充的注射器的形式提供，即用可注射组合物预填充并高压消毒的注射器。在一些方面，所述组合物或产品可以以预填充的小瓶的形式提供。

在一些方面，所述组合物是可注射的。在一些方面，可注射组合物是可注射植入物。在一些方面，本公开涉及包含本文公开的组合物中的任一种的可注射植入物。在一些方面，可注射植入物用于真皮下，真皮内，皮下，肌肉内，肌肉下，牙龈内注射。

在一些方面，所述组合物是可生物再吸收的。在一些方面，所述水凝胶是可生物再吸收的。在一些方面，所述组合物在约1年-约3年的时间段内被生物再吸收。在一些方面，所述组合物在1年-3年的时间段内被生物再吸收。在一些方面，所述水凝胶在约1年-约3年的时间段内被生物再吸收。在一些方面，所述水凝胶在1年-3年的时间段内被生物再吸收。

在一些方面，试剂盒包括包含本文公开的组合物中的任一种的预填充注射器。在一些方面，试剂盒包括预填充的小瓶，注射器和一个或多个皮下注射针，所述预填充的小瓶包括本文公开的组合物中的任一种。在一些方面，试剂盒包括用于给予注射部位的抗微生物组合物。

在一些方面，考虑了用于实践本文所述的方法的试剂盒。在一些方面，试剂盒包含足以实施本文所述方法的所有溶液，缓冲液，化合物，容器和/或说明书。

如本文所用，“对照”是实验中用于比较目的的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。本文所用的“对照样品”或“参考样品”是指用作与实验样品比较的对照的样品或参考物。例如，实验样品在小瓶中包含化合物A，B和C，并且对照可以是与实验样品相同处理的相同类型的样品，但缺少化合物A，B或C中的一种或多种。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致一种或多种结果的预防或一种或多种结果的增加的量。

如本文所用，术语“个体”，“患者”或“受试者”可以是个体生物体，脊椎动物，哺乳动物或人。在优选的方面，个体，患者或受试者是人。

如本文所用，短语“软组织”是指连接，支撑或包围身体的其它结构和器官的组织。软组织包括肌肉，纤维组织和脂肪。

如本文所用，短语“软组织增大”是指软组织的任何类型的体积增大，包括但不限于面部轮廓(例如，更显著的面颊，下巴或嘴唇)，凹陷畸形的矫正(例如，创伤后或HIV相关的脂肪萎缩)和与年龄深度相关的面部褶皱的矫正。因此，软组织增大可用于美容目的或用于医疗目的，例如创伤或退化性疾病之后的那些目的。软组织增大还涉及皮肤填充，身体塑形和牙龈填充。

如本文所用，短语“非动物来源”是指不包括动物但包括诸如酵母，细菌或合成来源的来源。

如本文所用，术语“可生物再吸收的”是指一种或多种降解事件-可生物再吸收的物质可以溶解，可以被吞噬，或可以在一段时间内仅仅降解，使得所述物质在一段时间内从身体，器官，组织，部位或细胞中清除。这些物质或其降解产物可以被代谢，掺入到其他分子或化合物中，或被排泄。

如本文所用，术语“无菌”是指不含或不含病原微生物的某物。

如本文所用，术语“无菌”是指不含活的生物体，通常不含活的微生物的某物。

如本文所用，术语“可注射”是指通过针注射本公开的组合物的能力。

如在此使用的，如在此使用的术语“水溶性多糖”是指水溶性的并且含有羧酸基(羧酸基)的多糖。多糖分子的羧基可用于将多糖交联成凝胶颗粒的水凝胶。这些水溶性多糖或水溶性多糖分子可以是例如糖胺聚糖分子(GAGs)，如透明质酸，软骨素，硫酸软骨素，肝素，硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素，或它们的混合物，优选透明质酸。平均多糖分子量可以在1-10000kDa的范围内选择，例如10-5000kDa，优选200kDa-3000kDa。

除非另外提供，否则如本文所用，术语“透明质酸”涵盖各种链长和电荷状态以及各种化学修饰(包括交联)的透明质酸，透明质酸盐或透明质烷的所有变体和变体的组合。即，该术语还包括具有各种反离子的透明质酸的各种透明质酸盐，例如透明质酸钠。该术语还包括透明质酸的各种修饰，例如氧化，例如将-CH2OH基团氧化成-CHO和/或-COOH；将邻位羟基高碘酸盐氧化，任选随后还原，例如将-CHO还原为-CH2OH或与胺偶联以形成亚胺，随后还原为仲胺；硫酸化；脱酰胺化，任选随后脱氨基或用新酸形成酰胺；酯化；交联；用各种化合物取代，例如使用交联剂或碳二亚胺辅助偶联；包括将不同分子(例如蛋白质，肽和活性药物组分)偶联-透明质酸；脱乙酰化。改性的其它实例是异脲，酰肼，溴化氰，单环氧化物和单砜偶联。透明质酸可从各种动物和非动物来源获得。非动物来源的来源包括酵母，优选细菌。单个透明质酸分子的分子量通常在0.1-10MDa的范围内，但其它分子量也是可能的。

如本文所用，术语“固体聚合物颗粒”是指选自任何生物相容性(无定形或半结晶)聚合物或由任何生物相容性聚合物制成的固体颗粒，所述聚合物在整个制造过程中保持固体，并且不溶于水。所述固体聚合物颗粒可以是固体合成脂族聚酯颗粒或其共聚物，优选选自聚乳酸(PLA)，聚己内酯(PCL)，聚乙醇酸(PGA)或其共聚物，优选聚-L-乳酸(PLLA)。固体聚合物颗粒通常是可生物降解的并且在酸性或碱性pH(例如PLA，PLLA，PCL或PGA)中易于降解。固体聚合物颗粒也可以是无机性质的，例如磷酸钙，或者是各自由不同聚合物制成的颗粒的混合物。在一些方面，固体聚合物颗粒可以包含两种不同的固体聚合物颗粒的混合物，每种包含不同的聚合物-混合物，所述不同的聚合物-混合物包含第一固体聚合物颗粒和第二固体聚合物颗粒。在一些方面，固体聚合物颗粒可以包含三种不同的固体聚合物颗粒的混合物，每种固体聚合物颗粒包含不同的聚合物-包含第一固体聚合物颗粒，第二固体聚合物颗粒和第三聚合物颗粒的混合物。这些颗粒还可以被称为微球，并且它们的形状可以是不规则的或限定的，如圆柱形，或球形，并且既是多孔的也是非多孔的。

在一些方面，固体聚合物颗粒的平均尺寸的直径范围为0.5-100μm，例如5-100μm。在一些方面，固体聚合物颗粒的平均尺寸范围为0.5-100μm，1-100μm，5-100μm，10-100μm，25-100μm，50-100μm，0.5-50μm，1-50μm，5-50μm50μm，10-50μm，25-50μm，0.5-25μm，1-25μm，5-25μm，10-25μm，0.5-10μm，1-10μm，5-10μm，0.5-5μm或1-5μm。

在一些方面，固体聚合物颗粒的平均尺寸范围为约0.5-约100μm，约1-约100μm，约5-约100μm，约10-约100μm，约25-约100μm，约50-约100μm，约0.5-约50μm，约1-约50μm，约5-约50μm，约10-约50μm，约25-约50μm，约0.5-约25μm，约1-约25μm，约5-约25μm，约10-约25μm，约0.5-约10μm，约1-约10μm，约5-约10μm，约0.5-约5μm，或约1-约5μm。

在一些方面，水溶性多糖分子，固体颗粒和所得最终组合物优选全部是生物相容性的。这意味着在被治疗的个体中没有或者仅仅非常轻微的免疫应答发生，即在被治疗的个体中没有或者仅仅非常轻微的不期望的局部或全身作用发生。所述组合物的组分和最终组合物也是可生物再吸收的，意味着所述组分是可生物降解的。一旦注射，可生物降解的填充剂应该维持其机械特性一段时间，然后被身体吸收，因此不留下痕迹。

如本文所用，术语“交联”是指涉及现有大分子上的位点或基团或现有大分子之间的相互作用的反应，所述反应导致在大分子中形成至少四个链从中发出的小区域。线性大分子的反应链端与另一线性大分子的内部反应位点的反应导致形成支化点或接枝，但不认为是交联反应。

在一些方面，多糖的交联可以通过用交联剂改性来实现。在一些方面，通过多糖分子的酰胺偶联实现多糖的交联。使用双亲核或多亲核官能交联剂与偶联剂一起进行酰胺偶联是制备可用于水凝胶产物的交联多糖分子的有吸引力的途径。因此，多糖的交联可以例如使用交联剂在水性介质中实现，所述交联剂包含至少两个能够通过涉及使用偶联剂的反应直接与多糖分子的羧酸基团形成共价键的亲核官能团，例如胺基。

如本文所用，术语“交联剂”是指在水中可溶且稳定的双亲核或多亲核官能分子。关于本文所述的制备水凝胶产物的组合物的本发明方法，术语“交联剂”可以指具有两个或更多个官能团，特别是亲核体官能团的分子，其可以连接到非反应性间隔基团，例如二糖，三糖，四糖或低聚糖，包括双氨基官能化的烷烃，环氧乙烷低聚物和聚合物，以及羧酸盐。所述两个或更多个官能团中的每一个能够与水溶性多糖分子上的羧酸基团反应以形成稳定的共价键。

在一些方面，交联剂由两个或更多个官能团和间隔基组成。可以使用基于非碳水化合物的双或多亲核交联剂例如六亚甲基二胺(HMDA)或基于碳水化合物的双亲核或多亲核交联剂例如二氨基海藻糖(DATH)与糖胺聚糖一起实现交联。还可以使用单独的或与第二种糖胺聚糖组合的至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖来实现交联，由此脱乙酰化的糖胺聚糖本身充当双亲核或多亲核交联剂。所使用的交联剂通常包含二氨基结构/衍生物，例如包含两种或更多种伯胺并且不含羧基。所述二氨基结构可以是脂族/芳族二氨基结构，肽结构如赖氨酸，或二氨基碳水化合物，其可选自二氨基海藻糖、二氨基透明质酸四糖、二氨基透明质酸六糖、二氨基乳糖、二氨基麦芽糖、二氨基蔗糖、壳二糖和二氨基棉子糖。

如本文所用，关于包含所公开的水凝胶产物的组合物，术语“交联”是指交联后水溶性多糖分子通过其共价连接的交联剂的部分或残基。交联通常由i)间隔基团和ii)在交联剂的官能团与水溶性多糖上的羧酸基团反应时形成的结合基团组成。间隔基团可以例如由透明质酸四糖，透明质酸六糖，海藻糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，纤维二糖或棉子糖残基组成。所述交联的水溶性多糖包含所述水溶性多糖分子链之间的交联，其产生通过所述共价交联保持在一起的水溶性多糖分子的连续网络。

在一些方面，交联剂本身有助于保持或增加水凝胶的性质，例如当与透明质酸相关的结构(例如，二氨基透明质酸四糖)交联时，或当与具有高保水性质的结构(例如，海藻糖)交联时。

在一些方面，水溶性多糖例如GAGs共价交联。在一些方面，共价交联的水溶性多糖分子由碳水化合物型结构或其衍生物组成，或基本上由碳水化合物型结构或其衍生物组成。在一些方面，交联的水溶性多糖或水凝胶不含或基本上不含合成的非碳水化合物结构或连接基。这可以通过使用处于其天然状态的水溶性多糖与交联剂一起实现，所述交联剂包含碳水化合物型结构或其衍生物，由碳水化合物型结构或其衍生物组成，或基本上由碳水化合物型结构或其衍生物组成。在一些方面，交联剂的官能团直接共价键合至水溶性多糖的羧基。在一些方面，共价交联的水溶性多糖的交联包括，由或基本上由二糖，三糖，四糖和低聚糖间隔基团组成。

在一些方面，交联的水溶性多糖包含在水溶性多糖分子链之间的交联，其产生通过共价交联保持在一起的水溶性多糖分子的连续网络。

在一些方面，当经受液体，通常为水性液体时，交联的水溶性多糖形成水不溶性的凝胶或水凝胶，但基本稀释的水溶性多糖的交联体系。

因此，所述水凝胶产品可以是可注射的水凝胶组合物。术语“可注射”意指组合物以适于肠胃外注射的形式提供，例如注射到受试者或患者的软组织如皮肤中。

在一些方面，该水溶性多糖(如GAG)具有50kDa，100kDa，200kDa，300kDa，400kDa，500kDa，600kDa，700kDa，800kDa，900kDa，1000kDa，1100kDa，1200kDa，1300kDa，1400kDa，1500kDa，1600kDa，1700kDa，1800kDa，1900kDa，2000kDa，2500kDa，3000kDa，3500kDa，4000kDa，4500kDa，5000kDa，5500kDa，6000kDa，6500kDa，7000kDa，7500kDa，8000kDa，8500kDa，9000kDa，9500kDa，或10000kDa的分子量。

在一些方面，该水溶性多糖具有约50kDa，约100kDa，约200kDa，约300kDa，约400kDa，约500kDa，约600kDa，约700kDa，约800kDa，约900kDa，约1000kDa，约1100kDa，约1200kDa，约1300kDa，约1400kDa，约1500kDa，约1600kDa，约1700kDa，约1800kDa，约1900kDa，约2000kDa，约2500kDa，约3000kDa，约3500kDa，约4000kDa，约4500kDa，约5000kDa，约5500kDa，约6000kDa，约6500kDa，约7000kDa，约7500kDa，约8000kDa，约8500kDa，约9000kDa，约9500kDa，或约10000kDa的分子量。

通过酰胺键交联的水凝胶可以交联，使得凝胶中至少90％，例如至少95％，例如至少99％的交联是酰胺键。在某些方面，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少89％所述凝胶中至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的所述交联是酰胺键。

例如，交联剂可以是二氨基海藻糖(DATH)。二氨基海藻糖(DATH)可以通过描述于《主链中含有海藻糖残基的合成碳水化合物聚合物：制备和特性(SyntheticCarbohydratePolymersContainingTrehaloseResiduesintheMainChain:PreparationandCharacteristic Properties)》KeisukeKurita,*NaokoMasuda,SadafumiAibe,KaoriMurakami,ShigeruIshii,和Shin-IchiroNishimurat；Macromolecules1994,27,7544-7549中的内容来制备。在一些方面，DATH可以有利地与DMTMM一起用作偶联剂。

如本文所用，术语“包封的”或“包埋的”可互换使用。包封颗粒意指描述被交联多糖分子包围的颗粒，通常包封/包埋在水凝胶的交联多糖分子的凝胶颗粒内。由于在水溶性多糖水凝胶的交联期间存在，固体聚合物颗粒变得包埋在水凝胶内，例如水凝胶的凝胶颗粒内，如例如在图7和图8中所示。与现有技术中描述的缠结相比，一旦形成凝胶，包封/包埋是不可逆的(在凝胶降解时颗粒将释放)。

技术人员认识到，本公开的包埋或包封的固体颗粒不仅用GAG或其它水溶性多糖包被，然后交联。所述水凝胶必然是本文所述产品的主要重量组分。在一些方面，最终产品中的水凝胶按重量计大于50％。在一些方面，最终产品中的水凝胶按重量计不小于50％。

在一些方面，最终产品中的水凝胶按重量计为：大于15％，大于20％，大于25％，大于30％，大于35％，大于40％，大于45％，大于50％，大于55％，大于60％，大于65％，大于70％，大于75％，大于80％，大于85％，大于90％，大于91％，大于92％，大于93％，大于94％，大于95％，大于96％，大于97％，大于98％，或大于99％。

在一些方面，最终产品中的水凝胶按重量计为：大于约15％，大于约20％，大于约25％，大于约30％，大于约35％，大于约40％，大于约45％，大于约50％，大于约55％，大于约60％，大于约65％约70％，大于约75％，大于约80％，大于约85％，大于约90％，大于约91％，大于约92％，大于约93％，大于约94％，大于约95％，大于约96％，大于约97％，大于约98％，或大于约99％。

在一些方面，最终产物中固体颗粒的量按重量计为：大于0.01％，大于0.025％，大于0.05％，大于0.075％，大于0.1％，大于0.2％，大于0.3％，大于0.4％，大于0.5％，大于0.6％，大于0.7％，大于0.8％％，大于1.5％，大于2％，大于2.5％，大于3％，大于3.5％，大于4％，大于4.5％，大于5％，大于5.5％，大于6％，大于6.5％，大于7％，大于7.5％，大于8％，大于8.5％，大于9％，但小于或等于10％。

在本公开的一些方面，提供了可通过本文所述的方法获得的水凝胶产品。水凝胶产品可以是消毒的可注射水凝胶组合物，例如以预填充的注射器(即，用可注射水凝胶组合物预填充并高压消毒的注射器)的形式提供的消毒的可注射水凝胶组合物。

如本文所用，术语“偶联剂”是指活化水溶性多糖的羧基以使其可与交联剂形成键(优选酰胺键)的肽偶联剂。在一些方面，偶联剂是基于三嗪的偶联剂/试剂，如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)。此外，DMTMM的前体2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)也可用于酰胺偶联。CDMT可以与N-甲基吗啉(NMM)反应以形成DMTMM。另一种优选的偶联剂是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组合的碳二亚胺偶联剂，优选N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)。

如本文所用，术语“接枝剂”是装载到固体颗粒表面上以活化颗粒表面，即使得颗粒结合(变成接枝)到水溶性多糖主链上的分子。该接枝剂可以是双-或多-亲核官能分子，如本公开的上述交联剂，并且可以例如具有游离胺的表面，其中固体颗粒可以经由接枝剂通过酰胺键接枝到多糖分子，因此所述接枝剂作为连接分子。

如本文所用，术语“接枝”是指其中一种或多种物质连接到大分子的主链作为侧链的反应，所述侧链具有不同于主链中的那些侧链的组成或构型特征。术语“接枝”，如在本公开的“接枝到”或“接枝到...上”中，是指在水溶性多糖分子与固体颗粒之间形成结合。这种结合特别是由于在混合/交联步骤之前对固体颗粒的表面进行预活化/预装载而形成的。由于未改性的固体颗粒上天然存在的羧基，例如PLLA颗粒上的羧基，可能形成一些键，然而，这些太少以至于未改性的颗粒被认为是未接枝的。固体颗粒与多糖分子的接枝或多或少地与多糖分子的交联同时发生。因此，通过使用例如接枝剂的预活化步骤，固体颗粒变得接枝和包封在最终组合物内。术语“活化”颗粒/分子的表面意指使表面具有反应性，例如通过添加或暴露在接触时与其它组分反应的基团。

在一些方面，填充剂用于多种医学或美容处理，例如用于复原处理的可注射的皮肤填充剂。然而，由于填充剂随时间降解，因此必须重复这些注射以保持结果。因此，为了延长处理的结果，需要延迟填充剂在注射后的降解。

制备包含固体颗粒的水凝胶的方法

参考图5和图6进一步更详细地描述所提出的方法。应当理解，图5和图6包括用实线边界示出的一些操作和模块以及用虚线边界示出的一些操作和模块。以实线示出的操作和模块是包括在最宽实施方案中的操作。用虚线边界示出的操作和模块是可以被包括在更宽泛的示例性实施例的操作和模块中或作为其一部分的示例性实施例，或者是除了更宽泛的示例性实施例的操作和模块之外还可以采用的其他实施例。应当理解，操作不需要按顺序进行，因此不需要逐步过程。此外，应当理解，并非所有操作都需要被执行。

图5示出制造包含交联多糖分子的水凝胶的组合物的方法，所述交联多糖分子包封固体颗粒，所述方法包括：S0提供包含一个或多个羧基的水溶性多糖分子，水不溶性固体颗粒，双亲核或多亲核官能交联剂和偶联剂，并且在一些实施方案中，所述方法还包括S1预活化所述固体颗粒的表面，其中所述预活化表面使所述固体颗粒在后续混合步骤中接枝到所述多糖分子。在一些实施方式中，S1a预活化所述表面包括用羧基预装载所述固体颗粒的表面，其中所述颗粒通过酰胺键接枝至所述水溶性多糖分子。这可以例如通过使用例如马来酸酐添加羧基或通过在表面上释放羧基的水解来进行。

在其它实施方式中，S1b预活化表面包括用双亲核或多亲核官能接枝剂预装载固体颗粒的表面，其中固体颗粒经由接枝剂和多糖分子之间的酰胺键接枝。接枝剂可以例如使用两步法添加，其中首先使用例如在S1a中的马来酸酐活化羧基，然后使用接枝剂水解以形成涂覆有接枝剂的固体颗粒。

所述方法还包括S2将所述多糖分子，所述预处理或未处理的固体颗粒，所述双-或多-亲核官能交联剂和所述偶联剂在基本上中性pH(即5-9的pH)的水悬浮液中混合，从而用所述偶联剂活化所述多糖分子，交联所述活化的多糖分子并包封所述固体颗粒，以形成包含包封所述固体颗粒的交联多糖分子的水凝胶的组合物。因此，将多糖分子与偶联剂混合活化多糖分子，然后可以使用交联剂交联形成交联的多糖分子的水凝胶。通过存在固体颗粒，这些固体颗粒被包封在形成的水凝胶的凝胶颗粒内。所述制造方法，即混合和随后的交联/包封过程可以作为一锅法在单个反应容器中进行

该方法进一步包括S3将所形成的组合物分成适合于通过针注射的更小的部分。这可以使用本领域已知的任何合适的方法进行，例如通过使形成的组合物穿过限定尺寸的钢网，或者可以在共混机中将组合物切片。一种选择是在混合步骤期间添加用于搅拌组合物的锋利刀片，在这种情况下步骤S2和S3将同时进行。

所述方法还包括S4，向所述组合物中加入局部麻醉剂，以及S5对所述组合物进行灭菌，例如使用热灭菌，例如高压灭菌。

在该方法中使用的水溶性多糖分子可以是糖胺聚糖分子，例如透明质酸，软骨素或硫酸软骨素，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，或它们的混合物，优选透明质酸。

所述双亲核-或多亲核官能交联剂可包含二氨基衍生物，其中所述二氨基衍生物为脂族或芳族二氨基衍生物，或肽或肽序列，例如赖氨酸，或二氨基碳水化合物，优选选自二氨基海藻糖，二氨基透明质酸四糖，二氨基透明质酸六糖，二氨基乳糖，二氨基麦芽糖，二氨基蔗糖，壳二糖，二氨基棉子糖，赖氨酸，二氨基肽，或二氨基序列，优选二氨基海藻糖，DATH。

在该方法中使用的偶联剂可以是基于三嗪的偶联剂，如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)或2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)，优选DMTMM。

用于该方法的固体颗粒可以是固体聚合物颗粒，例如固体合成脂族聚酯颗粒或其共聚物，优选选自聚乳酸，聚己内酯，聚乙醇酸或其共聚物，优选聚-L-乳酸，PLLA。

在由所述组合物获得的产品中使用的所述局部麻醉剂可以是选自由酰胺和酯型局部麻醉剂组成的组的麻醉剂，例如布比卡因、布坦卡因(butanilicaine)、卡替卡因(carticaine)、辛可卡因(地布卡因)、氯丁卡因(clibucaine)、对哌啶基乙酰氨基苯甲酸乙酯、依替卡因、利多卡因(lignocaine,lidocaine)、甲哌卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、丙胺卡因、罗哌卡因、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、伐多卡因(vadocaine)、阿替卡因、左旋布比卡因、阿米卡因、可卡因、丙泮卡因(propanocaine)、氯美卡因(clormecaine)、环甲卡因(cyclomethycaine)、丙美卡因(proxymetacaine)、丁卡因(amethocaine,tetracaine)、苯佐卡因、布他卡因、丁托西卡因(butoxycaine)、氨基苯甲酸丁酯、氯普鲁卡因、丁美卡因(拉罗卡因)、奥布卡因(oxybuprocaine)、哌罗卡因(piperocaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙氧卡因、三卡因或其组合，优选利多卡因。

图6示出用于制造包含本公开的组合物的产品的方法。所述方法包括S10交联，其中将所述组分混合以发生交联，所述方法包括输入以下原料：多糖，交联剂(相对于羧酸为0.5-5摩尔％)，偶联剂(相对于羧酸为0.5-50摩尔％)，固体聚合物颗粒(最终产物中的量为0.01-10％重量)，以及水或水性溶剂(缓冲液)，条件为：温度5-50℃，时间4-48小时，pH5-9，以及在搅拌或不搅拌的情况下，进一步进行所述方法包括S11成形，即通过使凝胶本体通过一个或多个筛目(孔径大小为0.1-5mm，如果超过一个筛目，则以最大筛目开始并以最小筛目结束逐渐减小尺寸)或通过在交联步骤中或之后在共混机中混合本体来分割凝胶。

该方法进一步包括S12纯化，通过在乙醇中沉淀，然后在空气或真空中干燥，或通过透析。如果杂质分布足够低，则不需要纯化。该方法进一步包括S13a调节凝胶浓度和pH，以及S13b添加局部麻醉剂，通过添加水或缓冲液(S13a)(任选的，如果需要的话)和麻醉剂(S13b，例如利多卡因)，以在时间2-48h，温度10-80℃，pH6-8的条件下获得5-50mg/mL的多糖浓度和0.01-10重量-％的固体聚合物颗粒量和1-5mg/mL的麻醉剂浓度。该方法进一步包括S14用组合物填充注射器，其手动或自动进行。该方法进一步包括S15消毒，通过例如热如蒸汽将该产品(包含该组合物的注射器)。

在一个方面，本公开涉及包含包封在水凝胶的凝胶颗粒内的水不溶性固体颗粒的组合物，所述水凝胶由包含羧基的交联水溶性多糖分子组成，其中所述多糖分子通过酰胺键交联。在一些实施方案中，当已经包括颗粒的预处理时，固体颗粒经由酰胺键接枝至组合物中的多糖分子。

所述组合物的多糖分子可选自糖胺聚糖分子，例如透明质酸，软骨素或硫酸软骨素，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素或其混合物，优选透明质酸。

组合物的固体聚合物颗粒可以是固体聚合物颗粒，例如合成的脂族固体聚酯颗粒，优选选自聚乳酸，聚己内酯，聚乙醇酸或它们的共聚物，优选聚-L-乳酸，PLLA。

所述组合物可以进一步包括局部麻醉剂，所述局部麻醉剂为选自酰胺和酯型局部麻醉剂的麻醉剂，例如布比卡因、布坦卡因(butanilicaine)、卡替卡因(carticaine)、辛可卡因(地布卡因)、氯丁卡因(clibucaine)、对哌啶基乙酰氨基苯甲酸乙酯、依替卡因、利多卡因(lignocaine,lidocaine)、甲哌卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、丙胺卡因、罗哌卡因、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、伐多卡因(vadocaine)、阿替卡因、左旋布比卡因、阿米卡因、可卡因、丙泮卡因(propanocaine)、氯美卡因(clormecaine)、环甲卡因(cyclomethycaine)、丙美卡因(proxymetacaine)、丁卡因(amethocaine,tetracaine)、苯佐卡因、布他卡因、丁托西卡因(butoxycaine)、氨基苯甲酸丁酯、氯普鲁卡因、丁美卡因(拉罗卡因)、奥布卡因(oxybuprocaine)、哌罗卡因(piperocaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙氧卡因、三卡因或其组合，优选利多卡因。

水凝胶的使用方法

在一些方面，本公开包括进行修复性或美容性皮肤病治疗的方法。在一些方面，所述修复性或美容性皮肤病学治疗包括向受试者注射本文公开的组合物。在一些方面，所述注射是真皮下，真皮内，皮下，肌肉内，肌肉下或牙龈内注射。

可注射水凝胶组合物可有利地用于运输或施用以及各种药物或化妆品的缓慢或控制释放。该消毒的可注射水凝胶组合物可以通过将该组合物注射到患者或受试者的软组织中来用于医疗以及非医疗(例如纯美容)程序。所述组合物可用于例如通过透明质酸凝胶注射增加软组织例如填充皱纹。所述组合物可以用于美容处理，在本文中称为皮肤再生，由此将少量透明质酸组合物在分布在待治疗的皮肤区域上的多个注射部位注射到真皮中，导致改善的肤色和皮肤弹性。皮肤再生是一个简单的过程，并且与该过程相关的健康风险非常低。

水凝胶产品如水凝胶组合物可用于例如各种皮肤病治疗。具体地，提供了用于皮肤病治疗的如上所述的可注射透明质酸组合物，所述皮肤病治疗选自由以下组成的组：伤口愈合，干性皮肤状况或阳光损害的皮肤的治疗，色素沉着过度病症的治疗，脱发的治疗和预防，以及具有炎症作为疾病过程的组成部分的状况的治疗，例如银屑病和干性湿疹。换句话说，提供了如上所述的可注射透明质酸组合物，其用于制备用于皮肤病学治疗的药物，所述皮肤病学治疗选自由以下组成的组：伤口愈合，干性皮肤病症或阳光损害的皮肤的治疗，色素沉着过度病症的治疗，脱发的治疗和预防，以及具有炎症作为疾病过程的组成部分的病症的治疗，如银屑病，干性湿疹。

根据本文说明的其它方面，本公开涉及如上所述的可注射水凝胶组合物通过将组合物注射到受试者的皮肤中来用于受试者的美容的非医学治疗的用途。作为本公开的另一方面，提供了化妆处理皮肤的方法，其包括向皮肤施用根据上述第二方面的水凝胶产品。

美容的非医学治疗的目的可以是改善皮肤外观，预防和/或治疗脱发，填充皱纹或塑造受试者的面部或身体。美容的非医学用途不涉及任何形式的疾病或医学病症的治疗。改善皮肤外观的实例包括但不限于治疗晒伤或老化的皮肤，皮肤再生，皮肤变白和治疗色素沉着过度病症如老年斑，黄褐斑(melisma)和霞(nephelines)。

在一些方面，本公开的方法涉及齿龈内注射以填充齿龈作为退行齿龈的结果。在一些方面，涉及将组合物注射到口腔的一个或多个组织中的方法。

在一些方面，所述注射用于皮肤填充，身体塑形，面部塑形和牙龈填充。

在一些方面，本文公开的组合物的注射用于皮肤填充。在一些方面，皮肤填充的方法包括注射组合物以填充皮肤裂缝。在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充面部，颈部，手，脚，膝盖和肘中的细线。在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充面部，颈部，手，脚，膝盖和肘中的细纹。在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充面部，颈部，手，脚，膝盖和肘中的细线。

在一些方面，注射本文公开的组合物用于皮肤再生，由此将少量组合物例如透明质酸组合物在分布在待治疗的皮肤区域上的多个注射部位注射到真皮中，导致改善的肤色和皮肤弹性。皮肤再生是一个简单的过程，并且与该过程相关的健康风险非常低。

在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充疤痕。在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充凹陷的疤痕。在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充肥厚性疤痕。在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以填充瘢痕疙瘩疤痕。

在一些方面，皮肤填充的方法包括注射组合物以恢复和/或校正具有人免疫缺陷病毒(HIV感染)的人的面部脂肪损失(脂肪萎缩)的迹象。

在一些方面，皮肤填充方法包括将组合物注射到手的背部或脚的顶部。

在一些方面，皮肤填充方法包括注射组合物以增强减弱的声带。

在一些方面，皮肤填充的方法包括注射组合物以恢复由于年龄，疾病或损伤导致的身体部分的体积损失。

在一些方面，皮肤填充的方法包括将组合物注射到表皮，真皮，皮下组织，皮肤和/或皮下组织的伤口中以帮助伤口愈合。

在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以修改面部轮廓。在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到嘴唇以增大嘴唇的尺寸和/或形状。

在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以增加面部对称性。在一些方面，面部造型的方法包括注射组合物以将面部的形状改变为椭圆形，圆形，方形，三角形，倒三角形，矩形或椭圆形。在一些方面，面部造型的方法包括注射组合物以增加面部的总宽度。在一些方面，面部造型的方法包括注射组合物以增加面部的总长度。

在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以增加前额和/或颊骨宽度。在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以增加颌骨的长度。

在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以改变下巴的尺寸和/或形状。在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以改变前额的尺寸和/或形状。在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以改变面颊的尺寸和/或形状。在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以改变眉毛的尺寸和/或形状。

在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以改变与后颌相关的外观。在一些方面，面部造型的方法包括将组合物注射到面部以改变与颌前突相关的外观。

在一些方面，身体塑形的方法包括将组合物注射至身体以改变身体的各个方面的尺寸和形状。在一些方面，身体塑形的方法包括将组合物注射至身体以改变身体方面的尺寸和形状以增加对称性。

在一些方面，身体塑形的方法包括将组合物注射至身体以改变乳房，臀部，骶骨，腹股沟，臀部，腹部，胸部，脚，腿，膝盖，腘肌，大腿，手臂，手，肘和/或前肘的尺寸和形状。

在一些方面，身体塑形的方法包括将组合物注射至身体以填充凹陷畸形。在一些方面，所述凹陷畸形是年龄，疾病，损伤或诱因的结果。在一些方面，身体塑形的方法包括将组合物注射至身体以减少脂肪团的出现。

本技术不限于本申请中描述的特定方面，其旨在作为本技术的个别方面的单个说明。在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对于本领域的技术人员是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前述描述中将是显而易见的。这样的修改和变化旨在落入本技术的范围内。应当理解，本技术不限于特定的方法，试剂，化合物组合物或生物系统，其当然可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而意图不是限制性的

术语“一个”或“一种”可以指一个或多个该实体，即可以指多个指代物。因此，术语“一个”或“一种”，“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。此外，不定冠词“一”或“一个”对“一个元素”的引用并不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且仅存在一个元素。

在整个说明书中对“一个实施例”，“实施例”，“一个方面”或“方面”的引用意味着结合该实施例描述的特定特征，结构或特性包括在本公开的至少一个实施例中。因此，在本说明书各处出现的短语“在一个实施例中”或“在实施例中”不一定都指同一实施例。此外，特定特征，结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施例中。

如本文所用，当在数值之前时，术语“约”或“大约”指示该值加上或减去该值的10％的范围。

如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分地描述并且使得相同的范围被分解成至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。如本领域的技术人员还将理解的，诸如“高达…”“至少…”，大于…“，小于…”等的所有语言包括所列举的数字并且是指可以随后被分解成如以上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个单元的基团是指具有1，2或3个单元的基团。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1，2，3，4或5个细胞的组等。

列举的实施方案列表

1.一种制造包含包封固体颗粒的交联多糖分子的水凝胶的组合物的方法，所述方法包括：(S2)混合包含一个或多个羧基的水溶性多糖分子，水不溶性固体颗粒，双亲核-或多亲核官能交联剂和偶联剂，从而用偶联剂活化多糖分子，交联活化的多糖分子并包封固体颗粒，以形成包含包封固体颗粒的交联多糖分子的水凝胶的组合物。

2.根据实施方案1所述的方法，进一步包括(S0)提供包含一个或多个羧基的水溶性多糖分子，水不溶性固体颗粒，双亲核或多亲核官能交联剂和偶联剂。

3.根据实施方案1-2所述的方法，进一步包括(S3)将所形成的组合物分割成适合于经由针注射的更小的部分。

4.根据实施方案1-3所述的方法，所述方法还包括(S4)向所述组合物中加入局部麻醉剂。

5.根据实施方案1-4所述的方法，进一步包括(S5)将所述组合物消毒，例如使用热消毒，如高压消毒。

6.根据实施方案1-2所述的方法，其中所述制造方法作为一锅法进行。

7.根据实施方案1-5所述的方法，进一步包括(S1)预活化所述固体颗粒的表面，其中所述预活化的表面使所述固体颗粒在所述混合步骤中接枝到所述多糖分子。

8.根据实施方案7所述的方法，其中(S1a)预活化所述表面包括向这些固体颗粒的表面预装载羧基基团，其中这些颗粒经由酰胺键接枝到该水溶性多糖分子上。

9.根据实施方案7-8所述的方法，其中(S1b)预活化所述表面包括用双亲核或多亲核官能接枝剂预装载所述固体颗粒的表面，其中所述固体颗粒经由所述接枝剂和所述多糖分子之间的酰胺键被接枝。

10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中该多糖分子是糖胺聚糖分子，如透明质酸，软骨素或硫酸软骨素，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，或其混合物，优选透明质酸。

11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述交联剂包括二氨基衍生物，其中所述二氨基衍生物是脂族或芳族二氨基衍生物，或肽或肽序列，例如赖氨酸，或二氨基碳水化合物，优选选自二氨基海藻糖，二氨基透明质酸四糖，二氨基透明质酸六糖，二氨基乳糖，二氨基麦芽糖，二氨基蔗糖，壳二糖，二氨基棉子糖，赖氨酸，二氨基肽或二氨基序列，优选二氨基海藻糖，DATH。

12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中该偶联剂是基于三嗪的偶联剂，如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)或2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)，优选DMTMM。

13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述固体颗粒是固体聚合物颗粒，例如固体合成脂族聚酯颗粒或其共聚物，优选选自聚乳酸，聚己内酯，聚乙醇酸或其共聚物，优选聚-L-乳酸，PLLA。

14.根据实施方案4-13所述的方法，其中所述局部麻醉剂是选自由以下组成的组的麻醉剂：酰胺和酯型局部麻醉剂，例如布比卡因、布坦卡因(butanilicaine)、卡替卡因(carticaine)、辛可卡因(地布卡因)、氯丁卡因(clibucaine)、对哌啶基乙酰氨基苯甲酸乙酯、依替卡因、利多卡因(lignocaine,lidocaine)、甲哌卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、丙胺卡因、罗哌卡因、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、伐多卡因(vadocaine)、阿替卡因、左旋布比卡因、阿米卡因、可卡因、丙泮卡因(propanocaine)、氯美卡因(clormecaine)、环甲卡因(cyclomethycaine)、丙美卡因(proxymetacaine)、丁卡因(amethocaine,tetracaine)、苯佐卡因、布他卡因、丁托西卡因(butoxycaine)、氨基苯甲酸丁酯、氯普鲁卡因、丁美卡因(拉罗卡因)、奥布卡因(oxybuprocaine)、哌罗卡因(piperocaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙氧卡因、三卡因或其组合，优选利多卡因。

15.通过实施方案1-14中任一项的方法获得的组合物。

16.一种包含包封在水凝胶的凝胶颗粒内的水不溶性固体颗粒的组合物，所述水凝胶由包含羧基的交联水溶性多糖分子组成，其中所述多糖分子经由酰胺键交联。

17.根据实施方案16所述的组合物，其中这些固体颗粒通过酰胺键接枝到这些多糖分子上。

18.根据实施方案16-17所述的组合物，其中所述多糖分子选自糖胺聚糖分子，例如透明质酸，软骨素或硫酸软骨素，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素或其混合物，优选透明质酸。

19.根据实施方案16-18所述的组合物，其中所述固体聚合物颗粒是固体聚合物颗粒，如合成的脂肪族固体聚酯颗粒，优选地选自下组，该组由以下各项组成：聚乳酸，聚己内酯，聚乙醇酸或其共聚物，优选聚-L-乳酸，PLLA。

20.根据实施方案16-19所述的组合物，其中所述组合物还包括局部麻醉剂，所述局部麻醉剂是选自由以下组成的组的麻醉剂：酰胺和酯型局部麻醉剂，例如布比卡因、布坦卡因(butanilicaine)、卡替卡因(carticaine)、辛可卡因(地布卡因)、氯丁卡因(clibucaine)、对哌啶基乙酰氨基苯甲酸乙酯、依替卡因、利多卡因(lignocaine,lidocaine)、甲哌卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、丙胺卡因、罗哌卡因、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、伐多卡因(vadocaine)、阿替卡因、左旋布比卡因、阿米卡因、可卡因、丙泮卡因(propanocaine)、氯美卡因(clormecaine)、环甲卡因(cyclomethycaine)、丙美卡因(proxymetacaine)、丁卡因(amethocaine,tetracaine)、苯佐卡因、布他卡因、丁托西卡因(butoxycaine)、氨基苯甲酸丁酯、氯普鲁卡因、丁美卡因(拉罗卡因)、奥布卡因(oxybuprocaine)、哌罗卡因(piperocaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙氧卡因、三卡因或其组合，优选利多卡因。

21.实施方案15-20中任一项的组合物作为皮肤填料的化妆品应用的用途。

实施例

期望将固体颗粒如PLLA掺入水凝胶中以在例如用作皮肤填充剂时增强水凝胶产物的性质。然而，在水凝胶中掺入这些颗粒的问题是生产水凝胶的碱性条件，其降解颗粒。由本文报道的实验数据证明的该问题的解决方案是，在中性pH下微小降解的一锅法中，使用DATH/DMTMM化学物质使PLLA/透明质酸混合物交联。该方法递送核-壳颗粒，其中不溶性PLLA颗粒包埋在透明质酸凝胶颗粒中。用于本文所述方法的交联剂不限于DATH和其它二氨基碳水化合物，也可以是其它二氨基结构如赖氨酸和其它肽/序列，以及其它脂族/芳族二氨基结构。

通过调整交联方法，可以在该方法和粒度减小(PSRI)之后，配制凝胶以获得用于皮肤病学用途的合适的HA浓度，例如5-50mg/mL，具有不同的PLLA加载量，但保留在过量盐水中溶胀的能力。由于其核-壳结构，其中PLLA颗粒包埋在交联的透明质酸网络中，凝胶将是均质的并且在储存时不沉淀。该制剂的另外益处可能是PLLA颗粒在组织中的可控释放，其中PLLA的释放速率最可能取决于PLLA/HA比率，HA凝胶网络的性质，粒度等。

以下给出了实施本公开的方法的实例，其涉及用于以下的方法：(1)交联和包封/包埋，(2)在包埋之前用羧基(释放或添加)预装载颗粒的表面，和(3)在包埋之前用接枝剂(例如胺)装载颗粒的表面的预处理，其可以作为两步反应进行，其中在装载胺之前首先添加羧基。

在不希望限于此的情况下，以下将通过以下实验实例来说明本公开。

实施例1-在PLLA-DATH(0.9mol-％/HA)和47％重量PLLA的存在下交联HA

在去离子水中新鲜制备两种储备溶液，DMTMM和交联剂(DATH)。将DMTMM(7.65mol.％/HA)和DATH(0.9mol.％/HA)分别加入到去离子水中制备一种反应溶液。将反应溶液混合并直接加入到反应容器中的预称重的HA(1MDa)和PLLA中。比例为按重量计53％的HA和47％的PLLA。将混合物充分混合3.5min并孵育。24小时后，将获得的材料挤压通过1mm钢网，随后加入去离子水。将该材料在环境温度下搅拌1h，然后将该混合物加热至70℃持续约20小时，并且随后在通过添加EtOH进行沉淀之前使用3x315μm过滤器使其经受粒度减小(PSR)。将获得的粉末在真空下干燥过夜并在7mM磷酸盐中用0.7％NaCl和3mg/g利多卡因-HCl重建，填充在注射器中并随后使用23的F₀值(F₀23)消毒，其中F₀意指在121℃或250℉下以分钟计的当量时间，其已通过消毒过程递送至产品。该反应顺序给出了具有包埋的PLLA颗粒的交联的水凝胶。在这个实例中的凝胶的特性(粘弹性参数)可以在表1中看到，其中G'是弹性(储存)模量并且G'是粘性(损失)模量，并且tanδ是材料阻尼的剪切，a量度，其中tanδ是作为G'计算的。获得的凝胶在高压消毒前的图像对应于样品1-1，参见图7。

表1：对应于实施例1的凝胶性质。

样品	pH	G’(Pa)	G”(Pa)	Tanδ	备注
						1-1	7.1	816	67	0.08	高压消毒前的凝胶
1-2	7.0	561	46	0.08	高压消毒后的凝胶

实施例2-在PLLA-DATH(1.2mol-％/HA)和50％重量PLLA的存在下交联HA

在去离子水中新鲜制备两种储备溶液，DMTMM和交联剂(DATH)。将DMTMM(7.65mol.％/HA)和DATH(1.2mol.％/HA)分别加入到去离子水中制备一种反应溶液。将反应溶液混合并直接加入到反应容器中的预称重的HA(1MDa)和PLLA中。比例为按重量计50％的HA和50％的PLLA。将混合物充分混合3.5min并孵育。24小时后，将获得的材料挤压通过1mm钢网，随后加入去离子水。将该材料在环境温度下搅拌1h，然后将该混合物加热至70℃持续约20小时，并且随后在通过添加EtOH进行沉淀之前使用3x315μm过滤器使其经受粒度减小(PSR)。将获得的粉末在真空下干燥过夜，并在含有0.7％NaCl和3mg/g利多卡因-HCl的7mM磷酸盐中重构，填充在注射器中，随后消毒(循环F₀23)。该反应顺序给出了具有包埋的PLLA颗粒的交联的水凝胶。在图8中看到高压消毒后获得的凝胶的图像。

实施例3-在PLLA存在下使用DATH(0.9mol-％/HA)和50％重量PLLA交联HA

在去离子水中新鲜制备两种储备溶液，DMTMM和交联剂(DATH)。将DMTMM(7.65mol.％/HA)和DATH(0.9mol.％/HA)分别加入到去离子水中制备一种反应溶液。将反应溶液混合并直接加入到反应容器中的预称重的HA(1MDa)和PLLA中。比例为按重量计50％的HA和50％的PLLA。将混合物充分混合3.5min并孵育。24小时后，将获得的材料挤压通过1mm钢网，随后加入去离子水。将该材料在环境温度下搅拌1h，然后将该混合物加热至70℃持续约20小时，并且随后在通过添加EtOH进行沉淀之前使用3x315μm过滤器使其经受粒度减小(PSR)。将获得的粉末在真空下干燥过夜，并在含有0.7％NaCl和3mg/g利多卡因-HCl的7mM磷酸盐中重构，填充在注射器中，随后消毒(循环F₀23)。该反应顺序给出了具有包埋的PLLA颗粒的交联的水凝胶。

实施例4-1-在PLLA存在下使用DATH(1.5mol-％/HA)和67％重量PLLA交联HA (1MDa)

在去离子水中新鲜制备两种储备溶液，DMTMM和交联剂(DATH)。将DMTMM(12.75mol.％/HA)和DATH(1.5mol.％/HA)分别加入到去离子水中制备一种反应溶液。将反应溶液混合并直接加入到反应容器中的预称重的HA(1MDa)和PLLA中。比例为按重量计33％的HA和67％的PLLA将混合物充分混合3.5min并孵育。24小时后，将获得的材料挤压通过1mm钢网，随后加入去离子水。将该材料在环境温度下搅拌1h，然后将该混合物加热至70℃持续约20小时，并且随后在通过添加EtOH进行沉淀之前使用3x315μm过滤器使其经受粒度减小(PSR)。将获得的粉末在真空下干燥过夜，并在含有0.7％NaCl的7mM磷酸盐和3mg/g利多卡因-HCl中重构，填充在注射器中，随后灭菌。反应顺序产生具有包埋的PLLA颗粒的交联水凝胶。

实施例4-2-将PLLA加入到包埋的PLLA/HA-凝胶中

将PLLA(1g)加入到实施例1中分离的凝胶粉末(1g/L)中。将所得粉末混合物在含有0.7％NaCl的7mM磷酸盐和3mg/g利多卡因-HCl(50mL/次)中重构，填充在注射器中并随后灭菌。反应顺序得到PLLA颗粒既包埋在凝胶颗粒中又未包埋PLLA的交联水凝胶。获得的对应于实施例4-2(样品4-2)的凝胶在高压消毒后的图像参见图9。

表2：对应于实施例4-1和4-2的凝胶性质。

样品	SwF(mL/g)	G’(Pa)	G”(Pa)	Tanδ
					4-1	4.6	362	22	0.10
4-2	ND	494	33	0.07

ND＝未测定

实施例5-在交联HA-凝胶中共价包埋PLA

为了增加水凝胶与包埋的固体聚合物颗粒之间的共价键，根据Wang等人(PolymInt52:1892–1899,2003)，通过乙醇碱性溶液预活化PLA以在PLA表面上释放羧酸酯。在去离子水中制备两种储备溶液，DMTMM和交联剂(DATH)。通过混合DMTMM和DATH的溶液制备一种反应溶液，随后用去离子水稀释至所需体积。将反应溶液直接加入到反应容器中的预称重的HA和预活化的PLLA中。该比例是按重量计50％的HA和50％的PLA。将混合物充分混合3.5min并孵育。24小时后，将获得的材料挤压通过1mm钢网，然后加入去离子水。将该材料在环境温度下搅拌1h，然后将该混合物加热至70℃持续约20小时，并且随后在通过添加EtOH进行沉淀之前使用3x315μm过滤器使其经受粒度减小(PSR)。将所得粉末真空干燥过夜，并在7mM磷酸盐中用0.7％NaCl和利多卡因-HCl3mg/g重构，填充在注射器中，随后消毒(F₀20-30)。该反应序列给出了具有共价连接(接枝)至HA-凝胶的嵌入的PLA颗粒的交联的水凝胶。

实施例6-通过二胺预涂覆PLLA和将PLA共价包埋在交联的HA-凝胶中

根据如Luo等人(J.Biomed.Mater.Res.PartB:AppliedBiomaterials；Volume74,Issue1,476-480；7/2005；Pan,Jun；Wang,Yuanliang；Qin,Suhua；Zhang,Bingbing；Luo,Yanfeng)所述的两步法用DATH预涂覆PLA。PLA与马来酸酐在BPO催化剂下反应以形成MPLA，所述酸酐随后通过DATH水解以形成氨基涂布的颗粒。在去离子水中制备两种储备溶液，DMTMM和交联剂(DATH)。通过混合DMTMM和DATH的溶液制备一种反应溶液，随后用去离子水稀释至所需体积。将反应溶液直接加入到反应容器中的预称重的HA和氨基包被的颗粒中。该比例是按重量计50％的HA和50％的氨基涂覆的PLA。将混合物充分混合3.5min并孵育。24小时后，将获得的材料挤压通过1mm钢网，然后加入去离子水。将该材料在环境温度下搅拌1h，然后将该混合物加热至70℃持续约20小时，并且随后在通过添加EtOH进行沉淀之前使用3x315μm过滤器使其经受粒度减小(PSR)。将所得粉末真空干燥过夜，并在7mM磷酸盐中用0.7％NaCl和利多卡因-HCl3mg/g重构，填充在注射器中，随后消毒(F₀20-30)。该反应序列给出了具有共价连接至HA-凝胶的包埋的PLA颗粒的交联的水凝胶。

本文说明性描述的方法可在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素，一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括”，“包含”等应被广义而非限制性地理解。另外，本文所使用的术语和表达已被用作描述而非限制的术语，并且使用这些术语和表达并非意图排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分。应认识到，在所要求保护的本公开的范围内各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案和任选特征具体公开了本公开，但是本领域技术人员可以对本文所公开的内容进行修改和变化，并且认为这些修改和变化在本公开的范围内。

本文已经广泛地和一般性地描述了本公开。每一个属于一般公开内容的较窄种类和亚类分组的也形成方法的一部分。这包括任何主题从其类别中除去附带条件或负面限制的方法的一般描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。本技术不受在本申请中描述的特定实施例的限制，所述特定实施例意图作为本技术的个别方面的单个说明。在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对于本领域的技术人员是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前述描述中将是显而易见的。这样的修改和变化旨在落入本技术的范围内。应当理解，本技术不限于特定的方法，试剂，化合物组合物或生物系统，其当然可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不意图是限制性的。

本领域的技术人员容易理解，本公开很好地适于实现所述目的并获得所提及的以及其中固有的结果和优点。本领域技术人员将想到其中的修改和其它用途。这些修改涵盖在本公开的精神内并且由阐述本公开的非限制性实施例的权利要求的范围限定。

此外，在本公开的特征或方面以马库什组的形式描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此以马库什组的任何单独的成员或成员的亚组的形式描述。

本文引用的所有参考文献，文章，出版物，专利，专利出版物和专利申请出于所有目的通过引用整体并入。

然而，本文引用的任何参考文献，文章，出版物，专利，专利出版物和专利申请不是，也不应被认为是它们构成了有效的现有技术或形成世界任何国家的公知常识的一部分的确认或任何形式的建议。

Claims (42)

1.一种制造包含交联的糖胺聚糖水凝胶的组合物的方法，所述交联的糖胺聚糖水凝胶包含包埋在所述水凝胶中的固体颗粒，所述方法包括：

(a)在pH介于5和9之间的水悬浮液中混合以下物质：

(i)包含一个或多个羧基的糖胺聚糖分子，

(ii)水不溶性固体颗粒，

(iii)双亲核或多亲核官能交联剂，和

(iv)偶联剂，

从而用偶联剂活化所述糖胺聚糖分子；

(b)交联所述活化的糖胺聚糖分子；和

(c)将所述固体颗粒包埋在所述交联的糖胺聚糖分子中以形成包含包埋有所述固体颗粒的糖胺聚糖水凝胶的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖胺聚糖为透明质酸。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述水不溶性固体颗粒包含一种或多种聚合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种聚合物是均聚物，杂聚物或共聚物。

5.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物是聚乳酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述不溶性固体聚合物是多孔的。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述不溶性固体聚合物是无孔的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述水凝胶中的水不溶性固体聚合物以重量计为0.1％-10％。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其进一步包括将所述水凝胶分成更小的部分。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述更小的部分是水凝胶颗粒。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述水凝胶颗粒的尺寸在0.01mm至5mm之间。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其进一步包括向所述组合物中添加局部麻醉剂。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，进一步包括将所述组合物消毒。

14.根据权利要求13所述的方法，其中将所述将组合物消毒包括热消毒。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其进一步包括预活化所述固体颗粒的表面，其中所述预活化的表面使固体颗粒在混合时接枝到所述糖胺聚糖分子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中预活化所述固体颗粒的表面包括用羧基预装载所述固体颗粒的表面，其中所述固体颗粒通过酰胺键接枝到所述糖胺聚糖分子。

17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中预活化所述表面包括用双亲核或多亲核功能接枝剂预装载所述固体颗粒的表面，其中所述固体颗粒通过所述接枝剂与所述糖胺聚糖分子之间的酰胺键接枝。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述交联剂包含二氨基衍生物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述二氨基衍生物是脂族或芳族二氨基衍生物，肽或肽序列或二氨基碳水化合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述二氨基碳水化合物选自由以下各项组成的组：二氨基海藻糖、二氨基透明质酸四糖、二氨基透明质酸六糖、二氨基乳糖、二氨基麦芽糖、二氨基蔗糖、壳二糖或二氨基棉子糖。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述偶联剂是三嗪类偶联剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述三嗪类偶联剂选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)或2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。

23.一种组合物，其包含由权利要求1-22中任一项所述的方法生产的所述包埋有固体颗粒的糖胺聚糖水凝胶。

24.一种包含包埋在水凝胶的凝胶颗粒内的水不溶性固体颗粒的组合物，所述水凝胶包含含有羧基的交联糖胺聚糖，其中所述糖胺聚糖分子通过酰胺键交联。

25.根据权利要求24的组合物，其中所述糖胺聚糖选自由以下各项组成的组：透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素或其组合。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述糖胺聚糖是透明质酸。

27.根据权利要求24-26中任一项所述的组合物，其中所述水不溶性固体颗粒包含一种或多种聚合物。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述一种或多种聚合物是均聚物，杂聚物或共聚物。

29.根据权利要求27-28中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚合物是聚乳酸。

30.根据权利要求24-29中任一项所述的组合物，其中所述不溶性固体聚合物是多孔的。

31.根据权利要求24-29中任一项所述的组合物，其中所述不溶性固体聚合物是无孔的。

32.根据权利要求24-31中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶中的所述水不溶性固体聚合物以重量计为0.1％-10％。

33.根据权利要求34-32中任一项所述的组合物，其中所述凝胶颗粒的尺寸在0.01mm至5mm之间。

34.根据权利要求34-33中任一项所述的组合物，其进一步包含局部麻醉剂。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述局部麻醉剂是利多卡因。

36.根据权利要求24-31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是消毒的。

37.根据权利要求24-36中任一项所述的组合物，其中所述固体颗粒接枝到所述糖胺聚糖分子。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述固体颗粒通过酰胺键接枝到所述糖胺聚糖分子。

39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述固体颗粒通过接枝剂与所述糖胺聚糖分子之间的酰胺键接枝。

40.一种皮肤填充方法，所述方法包括将根据权利要求24-39中任一项所述的组合物注射到受试者的真皮中。

41.根据权利要求40所述的方法，其中注射所述组合物包括在多于一个注射部位注射。

42.根据权利要求40-41中任一项所述的方法，其中与安慰剂对照相比，所述方法减少皱纹和细纹的出现。

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