KR20220075334A - 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 및 그의 다당류를 위한 가교제로서의 용도 - Google Patents

고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 및 그의 다당류를 위한 가교제로서의 용도 Download PDF

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베네딕티스 빈첸초 마리아 데
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바이오폴리메리 에스.알.엘.
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Abstract

본 발명은 750 내지 15.000 Da의 분자량; 및 183 내지 7.000 g/eq의 에폭시 당량을 갖는 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다당류를 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르와 가교시키는 것에 의해 수득가능한 가교된 다당류에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그들의 제조 방법 및 치료, 미용, 농업 및 식품 분야에서의 용도에 관한 것이다.

Description

고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 및 그의 다당류를 위한 가교제로서의 용도
본 출원은 2019년 10월 1일자에 출원된 유럽 특허 출원 19200803.5의 이익을 주장한다.
본 발명은 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르(hyperbranched polyglycerol polyglycidyl ether), 구체적으로, 750 내지 15.000 Da의 분자량; 및 183 내지 7.000 g/eq의 에폭시 당량을 갖는 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다당류를 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르와 가교시키는 것에 의해 수득가능한 가교된 다당류, 그들의 제조 방법 및 그들의 식품, 제약, 미용, 및 농업 분야에서의 용도에 관한 것이다.
다당류로도 알려진 탄수화물은 지구 상에서 가장 풍부하고, 용이하게 접근가능하며, 값싼 생체분자이고 재생가능한 자원이며, 연간 생산율이 합성 폴리머의 세계 생산율을 10의 수 제곱(some orders of magnitude)배로 초과한다. 탄수화물은 태양의 에너지에 의해 합성되는 지속가능한 물질이고 완전히 생분해성이다. 다당류는 모든 생물체에 존재하고 본래 다양한 특정한 기능을 수행하도록 설계된다.
주요한 화학적 원료 물질로서 및 에너지 생산으로서의 그들의 잠재적 용도 외에, 다당류는 광범위한 복잡한 생물학적 프로세스에서 주요한 역할을 수행하는 것으로 인정되었다. 그들은 단백질 및 기타 생물학적 물질(biological entities)과의 상호작용을 통해 인식(recognition) 프로세스에 관련되며; 세포 인식 프로세스는 세포 성장 조절, 분화, 부착, 암세포 전이, 세포 이동(cellular trafficking), 박테리아 및 바이러스에 의한 염증, 및 면역 반응을 포함한다.
가장 많이 알려진 다당류 중 하나는 셀룰로오스이다. 셀룰로오스는 1/3 이상의 고등 생물의 구성성분이고, 따라서, 확실하게 가장 풍부한 자연발생적 재생가능한 유기 화합물이다. 가장 간단한 형태에서, 셀룰로오스는 상이한 방식으로 배열되어 상이한 형태의 셀룰로오스를 초래할 수 있는, β-1,4-결합 글루칸 사슬로 구성된다. 셀룰로오스의 화학적 구조는 하기 식에 해당한다:
Figure pct00001
.
실제로, 셀룰로오스는 글루칸 사슬이 상호 간에 회합하여 결정질 및 비-결정질 영역을 형성하고 미세섬유(microfibril)와 같은 고차원 구조로 조립되는, 계층적(hierarchical) 방식으로 생산된다. 셀룰로오스는 일반적으로, 글루칸 사슬이 상호 간에 평행하게 정렬된 것인 셀룰로오스 I 결정질 형태로 수득된다. 천연(native) 결정질 폴리머의 2개의 형태, 셀룰로오스 Iα, 및 Iβ가 상이한 소스로부터 수득된 상이한 양으로 존재하는 것으로 확인되었다.
구체적으로, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (NaCMC)는 섬유성 식물 물질의 천연 종류(strain)로부터 직접적으로 수득되는 셀룰로오스의 카르복시메틸 에테르의 소듐 염으로 정의된다. NaCMC 분자는 유리 히드록시기가 카르복시메틸기에 의해 부분적으로 치환된, β-D-글루코오스 단위의 베이스를 갖는 폴리머이다. 그의 화학적 구조는 R이 H 또는 CH2CO2Na인 것인 하기 식에 해당한다:
Figure pct00002
.
셀룰로오스 유도체 NaCMC는 처음에는 전분 및 천연 검의 대체물로 사용되었다. 다량의 이 셀룰로오스 유도체가 종이, 직물 가공, 디터전트, 순환 이수(drilling fluid), 및 보호성 코팅에서 사용된다. 셀룰로오스 검으로 알려진, 정제된 등급은 식품, 제약, 및 화장품 산업에서 널리 사용된다.
또 다른 일반적으로 사용되는 다당류는 전분이고, 전분은 풍부하고 자연발생적이다. 전분은 모든 녹색 식물의 잎 및 대부분의 식물의 종자, 열매, 줄기, 뿌리, 및 괴경에서 발견된다. 대부분의 전분은 2종의 다당류, 아밀로오스로 불리는, 직선형 α-(1→4) 결합 글루칸, 및 아밀로펙틴으로 불리는, 4.2 내지 5.9%의 α-(1→6) 분지 결합(branch linkage)을 갖는 α-(1→4) 결합 글루칸으로 구성된다. 아밀로오스 및 아밀로펙틴 단위의 화학 구조는 각각 하기 식에 해당한다:
Figure pct00003
아밀로오스
Figure pct00004
아밀로펙틴
전분은 광합성의 최종-산물로서 생산되고 지구 상에서 태양의 에너지의 화학적 저장 형태로 작용한다. 인간의 열량 섭취의 60-70%가 전분으로부터 유래되는 것으로 추정된다. 모든 전분은 식물에서 수-불용성 입자 또는 과립으로 잎의 엽록체 및 기타 식물 조직에서 전분체(amyloplast)에 저장된다. 과립은 반-결정 특성을 갖는, 소형(compact) 분자들의 비교적 밀집한 입자들이다.
전분의 α-(1→4) 결합을 가수분해하는 효소의 주요한 카테고리는 α-아밀라아제이다. 이러한 효소는 편재하고, 박테리아, 균류, 식물 및 동물에 의해 생산된다. 포유동물에, 2개의 특이적 출처(source), 이 효소를 구강으로 분비하는 침샘 및 이 효소를 소장으로 분비하는 췌장이 있다. α-아밀라아제는 폴리머성 전분 사슬의 내부를 공격하여, 점도의 빠른 감소를 가져오는 엔도-작용(endo-acting) 효소이다. 이러한 특성 때문에, α-아밀라아제는 종종 액화(liquefying) 효소로 불린다. α-아밀라아제가 전분 사슬을 만나서 α-(1→4) 결합을 가수분해시키는 경우, 그들은 또한 초기에 절단된 2개의 사슬 중 하나에서 다발 공격(multiple attack)이라 불리는 과정에 의해 저분자량 말토덱스트린을 생성한다. 전분은 다수의 식품 및 비-식품 적용에서 널리 사용되는 흔한 성분이다. 그러나, 천연(native) 전분의 적용은 낮은 전단 저항력(shear resistance) 및 열안정성, 열 분해, 및 높은 노화(retrogradation) 경향과 같은 그들의 물리화학적 특성에 있어서의 단점 때문에 종종 제한된다.
전분은 식품 가공을 위한 첨가제로 사용되고, 식품 전분은 일반적으로 식품에서 증점제, 증량제, 에멀젼 안정화제로서 사용되며, 가공육에서 탁월한 결합제이다. 제약 산업에서, 전분은 또한 부형제로서, 정제 붕해제로서, 결합제 및 혈장 증량제(plasma volume expander)로서 사용된다. 전분은 가공 또는 저장 동안 빈번하게 직면하는 조건, 예를 들면, 고열, 고 전단(high shear), 낮은 pH, 동결/해동, 및 냉각에서 전분이 적절하게 기능할 수 있도록 화학적으로 변형될 수 있다. 저항성 전분(resistant starch)은 건강한 개인의 소장에서 소화를 회피하는 전분의 일종이다. 저항성 전분은 그의 건강상 이점 때문에 가공 식품에서 불용성 식이 섬유 및 식이 보충제로 이용된다. 저항성 전분은 인슐린 민감성을 개선하도록 보조하고, 포만감을 증가시키고, 결장 기능(colonic function)의 마커를 개선한다.
또한, 또다른 분지 다당류는 동물, 균류, 및 박테리아에서 에너지 저장의 형태로 작용하는 글루코오스의 다분지(multibranched) 다당류인 글리코겐이다. 다당류 구조는 신체에서 글루코오스의 주요한 저장 형태를 나타내고, 글리코겐은 아밀로펙틴과 유사하나, 보다 광범위하게 분지되고 조밀한 구조를 갖는 전분의 유사체이다.
마지막으로, 히알루로난 또는 소듐 히알루로네이트(sodium hyaluronate)로도 불리는 히알루론산(HA)은 음이온성 비-술페이트화 글리코사미노글리칸(GAG)이다. HA는 교대하는(alternating) β-(1→4) 및 β-(1→3) 글리코시드 결합을 통해 연결된 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민의 반복 단량체로 구성된 선형의 고분자량 다당류이다. 그의 화학적 구조는 하기 식에 해당한다:
Figure pct00005
HA는 인체 전체에 광범위하게 분포되고, 결합 조직, 상피 조직 및 신경 조직의 성분이며, 뇌 세포외 매트릭스(ECM)을 포함한 ECM에서 주요한 요소를 형성하고, 그의 결핍이나 부족은 간질성 질환(epileptic disorder)의 원인일 수 있다. HA는 윤활액 및 안구의 유리체를 포함한 거의 모든 생물 유체(biological fluid)에 존재한다. HA는 특히 관절에서, 윤활제 및 충격 흡수제로서 작용하여, 연골이 지속적으로 노출되는 물리적 스트레스에 의해 유도되는 세포 손상을 예방하여, 건강하게 유지시키는데 기여한다. HA의 최대량은 체내에서 총량의 50%를 초과하는 양을 포함하는 피부에서 발견된다. 정상 상태에서, HA는 유리 폴리머(free polymer)로 존재하나, 일부 경우에, 다른 단백질에 결합되어 프로테오글리칸을 생성하거나 또는 특정한 세포 수용체에 결합된다.
HA의 주요 기능은 부피를 형성하고 조직에 윤활제를 제공하여, 세포 및 기타 ECM 성분들, 예를 들면, 콜라겐 및 엘라스틴 섬유가 단단하게 유지되는, 개방되고, 수화된 안정한 세포외 공간을 유지시킨다. HA는 또한 세포 부착, 세포 이동, 및 세포 증식의 조절을 담당하는 세포 활성에 관련된다. 특히, 고분자량 HA는 항-혈관신생 및 항-염증 활성을 보이나, 저분자량 단편 (<100 kDa)은 반대의 생물학적 활성을 갖는다; 그들은 염증성, 면역-촉진성, 및 혈관신생성이다. 상처 치유, 및 CD44 세포 수용체가 과발현되는 종양 성장 및 암 증식에서 HA 및 HA 단편의 기능이 널리 개시되었다. 인간 조직 중 HA와 매우 유사한, HA의 독특한 생물학적 특성 때문에, HA는 수년 동안 큰 주목과 관심을 얻었다. 이러한 특성들이 HA가 여러 생물의학적 적용, 예를 들면, 상처-치유, 골관절염에서의 윤활, 조직 강화, 및 약물 전달 시스템을 위한 담체에서 사용될 수 있게 하였다. 그러나, 천연 HA는 열등한 기계적 특성 및 인 비보 빠른 분해 때문에 매우 제한적인 적용을 갖는다.
다당류가 현저하게 분해될 수 있다는 것이 당해 기술 분야에서 개시되었다. 다당류, 특히, HA의 분해는 글리코시드 결합 절단에 의해 매개되는 해중합(depolymerization) 과정으로 볼 수 있고; 이는 주로 2개의 메카니즘을 포함한다: 효소 분해(enzymatic degradation) (특이적 효소 히알루로니다아제에 촉진되는 선택적이고 매우 빠른 분해) 및 산화 분해(oxidative degradation) (조직의 염증 동안 존재할 수 있는 자유 라디칼(ROS) 및 산화-촉진성(pro-oxidant) 효소 활성에 의해 촉진되는 비-선택적이고 덜 빠른 분해). 또한, 전술된 메카니즘 외에, 조직에서 물과 전해질 때문에 항상 가수분해성 비-선택적 분해 메카니즘이 존재한다.
특히, HA 분해는 원하는 생물학적 기능을 위한 정확하게 정해진 크기의 HA 단편을 생성하기 위한 고도로 체계적이고 엄격하게 조절되는 과정인 것으로 추정된다. HYAL1 및 HYAL2가 가장 널리 발현되는 히알루로니다아제이다. HYAL2 (세포막에 고정됨)는 고분자량 HA (>1 MDa)를 20 kDa 단편으로 절단하고, HYAL1 (리소좀에서 발견됨)은 후속적으로 이러한 단편을 사당류(tetrasaccharides)로 더 절단하고, 그 후, 이 사당류는 히알루로다아제 패밀리의 여러 효소들 (예를 들면, β-글루쿠로니아다제, β-N-아세틸글루코사미니다아제)에 의해 단당류로 전환된다. 이러한 분해 산물들은 인체에 고유하므로, 그들은 자연적인 제거 과정을 따른다. 전술된 바와 같이, HA는 또한 반응성 산화종(ROS)에 의해 개체 내에서 자연적으로 분해될 수 있다. HA 분해의 메카니즘은 관련된 ROS에 따라 다르다. 정도와 무관하게, 조직 환경에 대한 교란이 신체의 면역계를 활성화시켜서, 일시적 염증 반응을 초래할 수 있다. 필러 주사 동안 바늘의 관통에 의해 유발된 조직에 대한 기계적 손상도 그러한 반응을 초래할 수 있다. 전술된 분해 메카니즘 때문에, 천연 다당류의 주사 후 인 비보 전환율(turnover)은, 이식되는 조직의 특이적 효소 활성에 따라, 매우 짧다. 그러나, 히알루론산의 인 비보 지속기간(duration) 및 결과적으로 그의 치료 효과는 ROS 및 전-염증성 효소의 존재 때문에, 산화적 스트레스에 의한 분해 후에 더 감소될 수 있다.
다당류, 및 특히, HA의 안정성 및 생체적합성과 관련한 이러한 문제를 극복하기 위해, HA의 인 비보 반감기를 연장하기 위해 다당류의 물리적 및 기계적 특성을 조절하는 여러 전략들이 개시되었다.
이러한 전략들 중 하나는 개선된 안정성 및 더 긴 체류 시간 (즉, 더 낮은 분해 속도)을 갖는 가교된 HA와 같은 가교된 다당류의 제조를 수반한다. 가교된 다당류 및 특히, 가교된 HA를 제조하는 여러 방법들이 당해 기술 분야에서 개발되었다. 결과적으로 수득된 가교된 HA는 그의 네트워크 내에 물을 보유하나, 물에 용해되지 않는 공유결합성 가교에 의해 형성된 3차원 (3D) 네트워크 구조를 갖는 가교된 HA 히드로겔이다.
화학적으로 가교된 히드로겔은 안정한 물질이고, HA 사슬과 가교제(cross-linker) 간의 브릿지(bridge) 및 분자간 결합의 형성 때문에 천연 HA보다 효소 분해에 대해 훨씬 더 높은 저항성을 보인다. 또한, 이러한 3D 구조(폴리올)는 그들의 항-염증 활성 때문에 산화 분해에 대한 저항성에도 기여할 수 있다. 히드록실기의 변형을 갖는, 전술된 가교된 HA 히드로겔은 피부 필러의 개발을 위해 이용될 수 있게 한다. 이와 관련하여, 메타크릴아미드, 히드라지드(hydrazide), 카르보디이미드(EDC), 디비닐 술폰(DVS), 에피클로로히드린 및 일부 디에폭시 화합물 및 디글리시딜 에테르, 예를 들면, 1,2,7,8-디에폭시옥탄, 1,4-부탄 디올 디글리시딜 에테르(BDDE), 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르 (PEGDE) 및 글리세롤 디글리시딜 에테르(GDE)를 포함한 여러 화학적 가교제가 가교된 다당류의 제조를 위해 적합한 가교제로서 당해 기술 분야에서 개시되었다.
더 높은 가교도를 갖는 가교된 다당류 (예를 들면, 가교된 HA 히드로겔)이 인 비보에서 그들의 더 높은 수명 및 기계적 강도 때문에 선호되는 것으로 당해 기술 분야에서 알려져 있다. 더 강한 가교된 HA 히드로겔은 또한 조직을 리프팅하고 후속 변형에 저항하는 적절한 힘을 제공할 수 있다. 그러나, 건강 관점에서, HA 변형에서 고함량의 화학적 가교제의 포함은 적합하지 않다. 과량의 가교제는 이식 후에 히드로겔이 접촉하는 세포 및 조직에 종종 유독하다. 또한, 과량의 유독한 가교제는 세포 분화 및 증식을 저해할 수 있고, 또한 그의 제조 동안 히드로겔 매트릭스에 포함된 기타 생활성 성분들(유리 폴리올, 항산화제, 아미노산, 완충제, 마취제, 약물, 등)과 원치않는 반응을 초래할 수 있다.
디비닐 술폰 (DVS)은 BDDE의 도입 전에 시장에서 대부분의 피부 필러의 가교를 위해 사용된 가교제였고 일부 상용 제품에서 현재 여전히 사용된다. 가교제로서의 그의 능력은 분자의 양 말단에 존재하는 활성화된 비닐기의 반응성에서 기인된다. 반응은 다당류 사슬에 존재하는, 알칼리 환경에서 음으로 하전된 히드록시기(친핵체)의 이중 비닐 결합 상으로의 첨가에 의해 일어나서, 결과적으로 에테르 결합의 형성을 가져온다. 상기 반응은 친핵성 첨가(nucleophilic addition)이고, 화학 반응 후에 분자나 작용기가 방출되지 않는다. 그러나, DVS 가교 히알루론산 피부 필러는 일부 효소 분해, 아마도 효소 억제제로 작용하는 술폰기의 존재와 관련된 효소 분해 문제를 보였고, 이식 후 부작용의 경우에, 히알루로니다아제의 주사에 의해 필러를 제거하기가 어렵다. 결과적으로, DVS는 BDDE와 같은 다른 가교제이 선호되어, 점진적으로 포기되었다. 또한, DVS는 합성 기원의 외래 분자이고, BDDE에 비해 훨씬 탁월한 어느 정도의 독성을 가지나, 매우 휘발성이고 자극적이며, 이는 심지어 피부 필터 제조자에게도 문제가 된다.
1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE) 및 그의 HA와의 반응이 당해 기술 분야에서 개시되었다. 구체적으로, HA 용액을 알칼리 조건 하에 BDDE와 혼합하고, 에테르 결합이 형성되었다. 이 반응은 에폭시 개환 (epoxy ring opening) 과정을 포함하고, 알칼리 매질에서 수행되며, 이때, 에폭시 고리는 히드록시기와 우선적으로 반응하여 에테르 결합을 형성한다. BDDE는 현재 시장에서 구입가능한 HA-기반 피부 필러의 제조를 위해 일반적으로 이용된다. 그의 가교 능력은 분자의 양 말단에 존재하는 에폭시기의 반응성에서 기인한다. 미반응 BDDE가 초파리 모델 개체에서 돌연변이를 유발하는 것으로 확인되었으나, 마우스에서 명확한 발암 효과는 관찰되지 않았다. 이러한 점에도 불구하고, 및 그의 돌연변이 유발 가능성 때문에, 피부 필러에서 미반응 BDDE의 양은 미량(즉, 잔류 수준)에서 유지되어야 한다. 이 미량 수준은 FDA(Food Drug Administration) 안전성 위험 평가 후에 안전한 것으로 판단되었다. 반면에, 가수분해된 BDDE는 BDDE 중 에폭시드 기의 가수분해, 또는 가교된 BDDE의 가수분해성 절단으로부터 수득되는 디올-에테르이다. 그러나, 가수분해된 BDDE의 대사는 당해 기술 분야에서 기술되지 않고, 사이토크롬 P450으로 불리는 효소의 패밀리에 의한 에테르 결합 절단을 통해 진행되는 것으로 이해된다. 반면에, 원형(native) BDDE 및 대사된 부탄디올은 모두 합성 기원(석유)이고, 어느 정도의 독성을 갖는 외래 분자이다.
따라서, BDDE 및 그의 대사된 유도체 분자의 잠재적 독성, 및 BDDE의 양의 엄격한 법적 규제(regulatroy control) 때문에. BDDE도 다른 안전한 가교제에 의해 점진적으로 대체되고 있다.
개선된 물리적 및 화학적 특성을 갖는 안전한 가교된 다당류의 제조를 위한 안전한 가교제(safety crosslinker)를 제공하기 위해, 여러 연구가 글리세롤 디글리시딜 에테르 (GDE)의 이용을 개시했다. GDE는 글리세롤의 비스-치환 글리시딜 에테르이다. 구체적으로, GDE의 화학적 구조는 하기 식에 표시된 바와 같이 1,3-GDE 및 1,2-GDE에 해당할 수 있다:
Figure pct00006
그러나, 당해 기술 분야에서, 그의 화학적 구조의 불확정 때문에, GDE는 "폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르(polyglycerol polyglycidyl ether)" 또는 "폴리글리세롤 디글리시딜 에테르(polyglycerol diglycidyl ether)" (PPE)로 잘못되게 지칭되고 있고, 종종 글리세롤의 비스-치환 글리시딜 에테르와 글리세롤의 모노- 및 심지어 트리-치환 글리시딜 에테르와의 혼합물로 시판된다.
GDE의 사용은 글리세롤이 유리 형태로 순환되거나 또는 지방 조직 또는 세포막의 인지질 중 트리글리세리드 형태로 결합되어, 모든 인간 조직에 자연적으로 존재하는 내인성 분자이기 때문에 특히 유리하다. 실제로, 글리세롤은 신체의 대사 및 이화 과정에 관련되고 따라서, 안전한 분자이다. 따라서, DVS 및 BDDE에도 불구하고, GDE 및/또는 그의 주요한 분해 산물 (글리세롤)의 존재는 잠재적인 독성 문제를 암시하지 않는다. 그러나, GDE의 사용의 주요 문제는 결과적으로 수득되는 GDE 가교된 다당류의 분해율을 낮추기 위해, 고 함량의 가교제가 요구된다는 것이다.
그러나, 높은 가교도(cross-linking degree)를 갖는 가교된 다당류는 점도 외에 탄성의 기여로 인해, 부적절하게 열등한 유동 특성을 보이고, 따라서, 그들은 가는 바늘을 통해 압출되기 어렵고, 특히, 주사가능한 적용(미용, 골관절염 치료 등을 위한 필러)에서 사용시 그렇다. 실제로, 당해 기술 분야에서, HA 안정화, 특히, 과량의 가교제로 처리된 HA 필러의 경우, HA 안정화에서 사용되는 화학적 가교제와 연관된 다양한 합병증 및 부작용, 예를 들면, 적용 후 환자에서의 원치않는 통증 및 의사에 의한 서투른 취급이 보고되었다. HA-기반 필러에 의해 유발되는 부작용 또는 알레르기 반응은 제조 동안 제거되지 않은 가교제 및 후속적으로 히드로겔 가수분해 후 인 비보에서 방출된 가교제에 의해 유발되는 것으로 사료된다.
따라서, 이 분야의 연구는 현재 상당한 주목을 받고 있고, 히드로겔 제조(즉, 다당류 가교화)에서 주요한 난제 중 하나가 되었다. 그러나, 가교제의 양이 감소되고, 결과적으로 가교도가 낮아지는 경우, 기계적 특성 및/또는 분해 저항성이 약화되었다. 또한, 화학 반응 속도 관련 이슈 때문에, 낮은 수준의 가교제는 합리적인 시간 내에 화학 반응을 정량적으로 완료할 수 없어서, 폴리머의 유효한 가교 없이 그래프팅(grafting)만 초래하거나, 또는 더 나쁘게는, 히드로겔에 제거하기 어렵고 높은 유독성의 물질을 초래하는 높은 함량의 유리 미반응 가교제를 남기게 되어 환자를 위한 제품의 안전성을 저하시킨다.
따라서, 당해 기술 분야에서 공지된 것으로부터, 적절한 기계적 및/또는 효소/산화 분해 저항성을 가지면서, 저함량의 가교제 및 낮은 가교도를 갖는 안전한 가교된 다당류를 제공해야 하는 요구가 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 적절한 기계적 특성, 낮은 효소/산화 분해율, 및 인 비보 적용에서 사용되기에 적합한 생체적합성(biocompatibility)을 갖는 안전한 가교된 다당류를 제공했다.
구체적으로, 본 발명자들은 750 내지 15.000 Da의 분자량; 및 183 내지 7.500 g/eq의 에폭시 당량을 갖는 본 발명의 고분지 폴리글리세롤 디글리시딜 에테르 (PPE)가 다당류의 히드록시기와 반응할 수 있고 낮은 가교도, 적절한 기계적 특성 및 분해율을 갖고, 동시에 피부로의 적용을 위해 안전한 본 발명의 가교된 다당류의 제조를 가능하게 한다는 것을 발견했다.
이론에 의해 한정되기는 원치 않으면서, 본 발명자들은 본 발명의 PPE 가교된 다당류의 기계적 특성 및 분해 저항성은 본 발명의 고분지 PPE의 구조 및 함량과 다당류와 본 발명의 고분지 PPE 간의 공유결합 및 비-공유결합 상호작용으로부터 유래된 그의 점착성의 조합에 의한 것으로 본다. 본 발명의 고분지 PPE와 다당류의 상호작용은 심지어 낮은 가교도에서도 히드로겔 매트릭스를 온전하게 유지시키고 이식물에 침윤하여 3차원 HA 네트워크를 분해하는 효소의 능력을 제한하는 고밀도(dense) 3차원 HA 네트워크를 생성한다.
본 발명의 고분지 PPE는 출발 물질 (즉, GDE 또는 비-고분지 PPE)의 자기-중합(self-polymerization) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 자기-중합 단계는 GDE 또는 비-고분지 PPE를 본 발명에서 정의된 바와 같은 적절한 분자량 및 에폭시 당량을 가질 수 있게 하는 온도 및 시간의 반응 조건 하에 적용시키는 것을 수반한다.
최종적으로, 본 발명의 PPE 가교된 다당류는 우수한 유동(flow) 특성을 보이고, 따라서, 특히, 주사용 적용에서 사용시에도, 취급 및 가는 바늘을 통한 압출이 용이하다. 또한, 본 발명의 PPE 가교된 다당류의 주사는 그의 적용 동안 및 후에 환자에 의한 통증 인지가 낮거나 또는 없게 한다.
그래서, 본 발명은 낮은 가교도, 낮은 화학적 변형을 갖고, 따라서 천연 다당류와 분자적으로 및 구조적으로 매우 유사하며, 높은 생체적합성 및 안전성 프로파일의 장점을 갖는 다당류 기반 히드로겔을 제공한다. 놀랍게도, 낮은 가교도에도 불구하고, 상기 다당류-기반 히드로겔은 높은 가교도에 따른 적합한 기계적 특성 및 효소 및 산화 분해에 대한 저항성을 보이고, 인 비보에서 긴 수명의 장점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 하기 식 (I)의 고분지 PPE 화합물:
Figure pct00007
또는 대안적으로,
하기 식 (II)의 화합물:
Figure pct00008
로서,
식 중에서,
각 R1은 R2 및 R3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2는
Figure pct00009
이고,
R3은
Figure pct00010
이며,
b는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이고; c는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이며; d는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이고; 액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 750 내지 15.000 Da의 분자량 (Mw); 및 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정(ultrasonication-assisted rapid titration)에 의해 측정된 183 내지 7.000 g/eq의 에폭시 당량(epoxy equivalent weight)을 갖는 것인 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 제2 양태는 하기 식 (III)의 가교된 다당류(crosslinked polysaccharide):
Figure pct00011
또는 대안적으로,
하기 식 (IV)의 가교된 다당류:
Figure pct00012
로서,
식 중에서,
각 R1은 R2 R3, R4 및 R5로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R2은
Figure pct00013
이고,
R3은
Figure pct00014
이며,
R4은
Figure pct00015
이고,
R5은
Figure pct00016
이며,
PS는 다당류이고; 및 상기 가교된 다당류는 0.077 내지 0.450%, 특히, 0.077 내지 0.269%의 가교율(crosslinking percentage)을 갖는 것인 가교된 다당류에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 본 발명의 제1 양태의 식 (I)의 화합물, 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 화합물이 식 (I)의 화합물인 경우, 상기 방법은: a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하거나; 또는 대안적으로, 상기 화합물이 식 (II)의 화합물인 경우, 상기 방법은: c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및 d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제2 양태의 가교된 다당류의 제조 방법으로서, 다당류를 본 발명의 제1 양태에서 정의된 식 (I)의 화합물, 또는 대안적으로, 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는 1종 이상의 본 발명의 제2 양태의 가교된 다당류를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제6 양태는 본 발명의 제1 양태의 고분지 PPE의 가교제로서의 용도에 관한 것이다.
또한, 최종적으로, 본 발명의 제2 양태의 가교된 다당류의 제약, 미용, 식품 및 농업 분야에서의 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 치료에서의 사용을 위한 본 발명의 제2 양태에서 정의된 가교된 다당류로서, 상기 다당류는 히알루론산인 것인 가교된 다당류, 및 본 발명의 제2 양태에서 정의된 가교된 다당류의 피부 필러(dermal filler)로서의 용도로서, 상기 다당류는 히알루론산인 것인 용도는 본 발명의 일부이다.
본 출원에서 명세서에서 사용된 모든 용어는, 달리 기재되지 않으면, 당해 기술 분야에서 공지된 그들의 통상적인 의미로 이해될 것이다. 본 출원에서 사용된 용어의 기타 보다 특이적 정의가 하기에서 설명되며 달리 명시적으로 더 넓은 정의를 제공하는 적으로 기재되지 않으면, 본 명세서 및 청구항 전체에서 동일하게 적용되도록 의도된다.
본 발명의 목적을 위해, 주어진 임의의 범위는 범위의 하한 및 상한 종말점을 모두 포함한다. 온도, 시간, 중량, 등과 같은 주어진 범위는, 구체적으로 기재되지 않으면, 근사치인 것으로 간주되어야 한다.
용어 "중량 기준 퍼센트(%) (percentage (%) by weight)"는 총 중량 대비 각 모이어티 또는 각 성분의 퍼센트을 의미한다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 제1 양태는 식 (I)의 화합물; 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물이다.
상기 식 (I)의 화합물은 본 발명의 방법에서 정의된 바와 같이 1,3-GDE 또는 1,3-GDE로부터 수득된 비-고분지(non-hyperbranched) PPE를 자기-중합 단계에 적용시키는 것에 의해 수득된다. 대안적으로, 상기 식 (II)의 화합물은 본 발명의 방법에서 정의된 바와 같이 1,2-GDE 또는 1,2-GDE로부터 수득된 비-고분지 PPE를 자기-중합 단계에 적용시키는 것에 의해 수득된다.
본 발명의 목적을 위해, 당해 기술 분야에서 공지된 PPE는 분지 PPE이고, 고분지 PPE는 아니다. 당해 기술 분야의 분지 PPE는 글리세롤과 에피클로로히드린의 반응에 의해 제조되고, 그 분자량은 에피클로로히드린의 양을 증가시키는 것에 의해 조정될 수 있다. 그러나, 그 방법들은 본 발명의 방법에서와 같은 자기-중합을 포함하지 않는다. 그 결과, 당해 기술 분야의 분지 PPE(상품명 Denacol®로 구입가능함)는 본 발명의 고분지 PPE와 구조적으로 다르다. 구체적으로, 본 발명의 범위에 속하지 않는, 당해 기술 분야에서 개시된 분지 PPE의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00017
상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물은 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 750 내지 15,000 Da의 분자량; 및 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 183 내지 7.500 g/eq의 에폭시 당량을 갖는다.
용어 "에폭시 당량(epoxy equivalent weight)", "평균 EEW(average EEW)" 및 약어 "EEW"는 동일한 의미를 갖고 그들은 호환적으로 사용된다. EEW는 그램으로 표시된 가교제의 중량이고, 에폭시의 1 그램-당량을 포함한다. EEW는 본 발명에서 개시된 가교제의 1 그램에 존재하는 에폭시기의 함량을 의미하고 g/eq.로 표현된다. EEW는 당해 기술 분야에서 공지된 에폭시드의 신속한 측정을 위한, HCl을 이용한 정량적 초음파-보조 적정(ultrasonication-assisted titration with HCl)을 이용하여 실험적으로 측정하였다 (He, Z., et al., "Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containing epoxy resin". Analytical Methods, 2014, vol. 6(12), pp. 4257-4261).
분자량 및 다분산성 지수의 측정은 액체 크로마토그래피, 구체적으로 광산란 검출기가 구비된 GPC 기기를 이용하여 액체 크로마토그래피에 의해 수행했다.
일 구체예에서, 상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물 은 액체 크로마토그래피에 의한 800 내지 7000 Da의 분자량; 및 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 195 내지 700 g/eq의 에폭시 당량을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물은 액체 크로마토그래피에 의한 900 내지 4500 Da의 분자량; 및 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 200 내지 600 g/eq의 에폭시 당량을 갖는다.
일 구체예에서, 상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물은 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 1.8 이하의 다분산 지수를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물은 액체 크로마토그래피에 의해, 구체적으로 광산란 검출기를 갖춘 GPC 장치를 이용하여 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 1.6 이하의 다분산 지수를 갖는다.
용어 "다분산성 지수(polydispersity index)", "이질성 지수(heterogeneity index)" 및 "분산성(dispersity)"은 동일한 의미를 갖고 호환적으로 사용된다. 그들은 혼합물에서 분자 또는 입자의 크기의 이질성, 구체적으로, 주어진 폴리머 시료 중 분자 질량의 분포의 척도를 의미한다. 이는 기호 Ð로 표시된다. 본 발명의 목적을 위해, 다분산성 지수는 하기 식을 이용하여 계산될 수 있는, 분자 질량(molecular mass)을 의미한다:
Ð M = M w /M n
식 중에서, M w 는 중량-평균 몰 질량(weight-average molar mass)이고 M n 은 수-평균 몰 질량(number-average molar mass)이다.
용어 "분자량(molecular weight)", "평균 분자량(average molecular weight)", "중량-평균 몰 질량(weight-average molar mass)", "질량 평균 몰 질량(mass average molar mass)", "평균 Mw" 및 약어 "MW"은 동일한 의미를 갖고 호환적으로 사용된다. 질량 평균 몰 질량은 하기 식에 의해 계산된다:
Figure pct00018
식 중에서, N i 는 분자 질량 M i 의 분자의 개수이다. 질량 평균 분자 질량은 정적 광산란, 소각 중성자 산란(small angle neutron scattering), X-선 산란, 및 침전 속도(sedimentation velocity)에 의해 결정될 수 있다.
용어 "수-평균 몰 질량(number-average molar mass)" 및 약어 "Mn"은 동일한 의미를 갖고, 그들은 호환적으로 사용된다. Mn은 폴리머의 분자 질량을 결정하는 방식이다. 폴리머 분자, 예를 들면, 다당류, 심지어 동일한 종류의 분자들도 상이한 크기(선형 폴리머의 경우, 사슬 길이)이고, 따라서, 평균 분자 질량은 평균 산출(averaging) 방법에 의존적일 것이다. 수 평균 분자 질량은 개별적인 거대분자의 분자 질량의 통상적인 산술적 평균이다. 이는 n개의 폴리머 분자의 분자 질량을 측정하는 단계, 질량의 합산하는 단계 및 n으로 나누는 단계에 의해 결정된다. Mn은 하기 식에 의해 계산된다:
Figure pct00019
식 중에서, N i 은 분자 질량 M i 의 분자의 개수이다. 폴리머의 수 평균 분자 질량은 겔 투과(gel permeation) 크로마토그래피, (Mark-Houwink 식)을 통한 점도계, 속일적(colligative) 방법, 예를 들면, VPO(vapor pressure osmometry), 말단기 결정(end-group determination), 또는 양성자 NMR에 의해 결정될 수 있다.
상이한 분자량을 갖는 폴리머의 단편들을 GPC 기기를 이용한 액체 크로마토그래피에 의해 사전 분리하고 구비된 광산란 검출기에 의해 밝히거나 검출하고, 각 단편의 중량-평균 몰 질량 "Mw" 및 수-평균 몰 질량 "Mn"의 평가를 장비 자체에 의해, 공인된 Mw를 갖는 표준을 이용하여 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-16의 화합물이고:
Figure pct00020
평균 Mw은 3530 g/몰이고; 평균 EEW는 589 g/eq이며, Mw/Mn은 1.53이다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-22의 화합물이고:
Figure pct00021
평균 Mw은 910 g/몰이고; 평균 EEW는 229 g/eq이며, Mw/Mn은 1.36이다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-23의 화합물이고:
Figure pct00022
평균 Mw은 2400 g/몰이고; 평균 EEW는 404 g/eq이며, Mw/Mn은 1.54이다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-14의 화합물이고:
Figure pct00023
평균 Mw은 940 g/몰이고; 평균 EEW는 234 g/eq이며, Mw/Mn은 1.36이다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-28의 화합물이고:
Figure pct00024
평균 Mw은 990 g/몰이고; 평균 EEW는 247 g/eq이며, Mw/Mn은 1.37이다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-26의 화합물이고:
Figure pct00025
평균 Mw은 2200 g/몰이고; 평균 EEW는 365 g/eq이며, Mw/Mn은 1.47이다.
일 구체예에서, 본 발명의 고분지 PPE는 하기 식 (I)-21의 화합물이고:
Figure pct00026
평균 Mw은 4200 g/몰이고; 평균 EEW는 585 g/eq이며, Mw/Mn은 1.55이다.
본 발명의 또 다른 양태는 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물의 제조 방법이다.
본 발명의 식 (I)의 화합물의 제조 방법은:
a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르 (1,3-DGE)를 함유한 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 수득된 용액을 10 내지 80℃의 온도에서 1분 내지 30일의 시간 동안 유지시키는 단계;를 포함한다.
본 발명의 식 (II)의 화합물의 제조 방법은:
c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르 (1,2-DGE)를 함유한 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득된 용액을 10 내지 80℃의 온도에서 1분 내지 30일의 시간 동안 유지시키는 단계;를 포함한다.
상기 1,3-GDE 및 1,2-GDE는 당해 기술 분야에서 이전에 개시되었고, 그들은 상업적으로 입수 가능하다(실험 섹션 참조).
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 생리적으로 허용가능한 알칼리 금속 또는 암모늄 수산화물 (Na, K), 알칼리 토금속 수산화물 (Mg, Ca, Sr), 생리적으로 허용가능한 중금속 수산화물 (Fe, Al, Co, Cu, Se, Zn, Cr, Ni), 생리적으로 허용가능한 4차 암모늄 양이온 수산화물, 생리적으로 허용가능한 중금속 또는 암모늄 히드로겐 카르보네이트 (NH4, Fe, Al, Co, Cu, Se, Zn, Cr, Ni) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 염기를 포함한다.
용어 "생리적으로 허용가능한(physiologically acceptable)"은 생물학적 시스템, 예를 들면, 세포, 세포 배양물, 조직, 또는 개체와 양립될 수 있는(compatible) 무독성 물질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시스템은 살아있는 개체, 예를 들면, 포유동물, 특히 인간이다.
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 수산화칼륨 (KOH), 수산화나트륨 (NaOH), 수산화암모늄, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 알칼리 금속 또는 암모늄 수산화물; 특히, 수산화나트륨을 포함한다.
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화스트론튬, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 알칼리 토금속 수산화물을 포함한다.
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 수산화 철, 수산화 알루미늄, 수산화 코발트, 수산화 셀레늄, 수산화 주석, 수산화 크로뮴, 수산화 니켈, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 중금속 수산화물을 포함한다.
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 식 HONR6R7R8R9의 4차 암모늄 수산화물을 포함하고, 식 중에서, R6, R7, R8 및 R9 각각은 (C1-C8) 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 대안적으로, R5, R6, R7 및 R9 중 2개는 (C5-C6) 시클로알킬 고리를 형성한다.
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 탄산 수소 철(iron hydrogen carbonate), 탄산 수소 알루미늄, 탄산 수소 코발트, 탄산 수소 구리, 탄산 수소 셀레늄, 탄산 수소 아연, 탄산 수소 크로뮴, 탄산 수소 니켈, 탄산 수소 암모늄 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 중금속 또는 암모늄 히드로겐 카르보네이트; 특히, 탄산 수소 나트륨을 포함한다.
일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 포함한다. 일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 알칼리 수산화물을 포함하고, 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 포함한다. 일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 수산화 칼륨 (KOH), 수산화 나트륨 (NaOH) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 알칼리 수산화물을 포함하고, 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 포함한다. 일 구체예에서, 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)의 알칼리 용액은 수산화 나트륨 (NaOH)을 포함하고, 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)는 실온에서 수행된다. 용어 "실온(room temperature)"은 약 25 내지 35℃의 온도를 의미한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)는 용매의 존재 하에 수행된다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)는 물, (C1-C4) 알킬-OH, (C1-C4) 알킬-CO-(C1-C4) 알킬, (C1-C4) 알킬-CO-O-(C1-C4) 알킬, (C1-C4) 알킬-CN, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 용매의 존재 하에 수행된다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 a) 또는 대안적으로 단계 c)는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 용매의 존재 하에 수행되고, 특히, 상기 용매는 물이다.
용어 "알킬(alkyl)"은 발명의 설명 또는 청구항에서 특정된 탄소 원자의 개수를 포함하는 포화된 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬을 의미한다. 예는 특히, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸을 포함한다.
일 구체예에서, 단계 b) 또는 대안적으로 단계 d)는 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 10 내지 80℃의 온도에 1분 내지 30일의 시간 동안 적용시키는 것에 의해 수행되고, 그 시간 동안 GDE의 자기-중합이 일어난다.
일 구체예에서, 단계 b) 또는 대안적으로 단계 d)는 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 50 내지 80℃ 범위의 온도에 1분 내지 500분의 시간 동안 적용시키는 것에 의해 수행된다. 일 구체예에서, 단계 b) 또는 대안적으로 단계 d)는 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 50 내지 80℃ 범위의 온도에 5분 내지 60분의 시간 동안 적용시키는 것에 의해 수행된다.
일 구체예에서, 단계 b) 또는 대안적으로 단계 d)는 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 10 내지 40℃ 범위의 온도에 1일 내지 30일의 시간 동안 적용시키는 것에 의해 수행된다. 일 구체예에서, 단계 b) 또는 대안적으로 단계 d)는 1,3-GDE 또는 대안적으로 1,2-GDE를 10 내지 40℃의 온도에 2일 내지 7일의 시간 동안 적용시키는 것에 의해 수행된다.
앞서 정의된 자기-중합 단계 b), 또는 대안적으로 단계 d)를 포함하는, 앞서 정의된 방법에 의해 수득가능한 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물도 본 발명의 일부이다.
본 발명의 목적을 위해, 표현 "수득가능한(obtainable)", "수득된(obtained)" 및 그와 동등한 표현은 호환적으로 사용되며, 어느 경우이든, 표현 "수득가능한"은 표현 "수득된"을 포괄한다.
상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물의 제조 방법에 대해 앞서 개시된 모든 구체예는 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 상기 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물에 적용된다.
본 발명의 고분지 PPE의 가교제로서의 용도도 본 발명의 일부이다.
본 발명의 제2 양태는 0.077 내지 0.450%의 가교율을 갖는, 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 0.077 내지 0.360%의 가교율을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 0.077 내지 0.269%의 가교율을 갖는다.
일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.077 내지 0.450%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.077 내지 0.360%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.077 내지 0.269%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.077 내지 0.140%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.140 내지 0.450%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.140 내지 0.360%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.140 내지 0.269%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.270 내지 0.450%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 히알루론산이고, 가교율이 0.270 내지 0.360%인 것인 가교된 다당류이다.
일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 아밀로오스 전분이고, 가교율이 0.124 내지 0.204%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 아밀로오스이고, 가교율이 0.155 내지 0.182%인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 상기 식 (III)의 가교된 다당류, 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류는 상기 다당류가 하기에 정의된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스이고, 가교율이 0.140 내지 0.204%인 것인 가교된 다당류이다.
일 구체예에서, 식 (III) 및 (IV)의 가교된 다당류에서, R2의 양은 식 (III) 및 (IV)의 가교된 다당류의 총 중량에서 R5보다 더 낮다. 일 구체예에서, 식 (III) 및 (IV)의 가교된 다당류에서, R2의 양은 식 (III) 및 (IV)의 가교된 다당류의 총 중량에서 2 ppm 미만이다. R2의 양은 He, Z., et al., "Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containing epoxy resin". Analytical Methods, 2014, vol. 6(12), pp. 4257-4261에서 개시된 에폭시드의 신속한 결정을 위한, HCl을 이용한 정량적 초음파-보조 적정을 이용하여 실험적으로 측정한다.
본 발명의 다당류는 "가교된" 다당류이다. 용어 "가교된(crosslinked)"은 3차원 가교 네트워크를 갖는 다당류로서, 상기 네트워크는 하나 이상의 가교제에 의해 붕괴된(collapsed) 출발 다당류에 의해 형성된 것인 다당류를 의미한다. 용어 "가교형성(crosslinking)"은 폴리머 과학의 분야에서 폴리머(다당류)의 물리적 특성에서 차이를 촉진하는 가교의 이용을 의미한다. 용어 "가교(crosslink)"는 폴리머(다당류)의 히드록시기에 의한 본 발명의 고분지 PPE 가교제의 에폭시드 고리의 개환(aperture)에 의해 형성되는 결합을 의미한다. 본 명세서에서 호환적으로 사용되는 용어 "가교제(crosslinker)" 또는 "가교형성제(crosslinking agent)"는 하나 이상의 폴리머 사슬을 가교하는 능력을 가진 화합물을 의미한다.
용어 "가교율(crosslinking percentage)", "가교의 비율 (%) (percentage (%) of crosslinking)", "가교도(cross-linking degree)" 및 약어 "C.D."는 동일한 의미를 갖고 그들은 호환적으로 사용된다. 그들은 퍼센트로 표현된 비변형 다당류 단량체 단위 대비 PPE 변형 다당류 단량체 단위의 비율을 의미한다. 일반적으로, 물질의 가교도 (C.D.)의 측정은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 여러 방법들을 이용하여 평가될 수 있다. 일부 방법, 예를 들면, 효소 처리 후 폴리머의 단편의 1H NMR 또는 정량적 GPC 분석은 직접적이다. 기타 방법, 유동학적 측정, 압착(compression), 또는 진동(oscillatory) 테스트는 간접적이다. 일반적으로, 모든 이러한 방법은 비교에 의하고, 동일한 폴리머의 패밀리 내에서 상이한 가교도를 구별할 수 있게 한다. 본 발명에서, 가교도 값은 하기 식 1을 이용하여 유동적 측정에 의해 수득된 G'의 값으로부터 수학적으로 계산된다:
Figure pct00027
식 중에서:
MWrep. unit는 다당류 반복 단위의 분자량이고;
히알루론산에 대한 MWrep. unit = 401이며;
아밀로오스/글리코겐에 대한 MWrep. unit = 162 Da이고;
소듐 카르복시메틸 셀룰로오스에 대한 MWrep. unit = 242 Da이다.
Me는 하기 식 2의 역 식(inverse formula)에 의해 수학적으로 계산된다:
Figure pct00028
(식 2)
식 중에서:
G'은 회전 유량계(rotational rheometer)를 이용한 유동학적 측정에 의해 실험적으로 수득되고,
R·T는 열 에너지(thermal energy)이며,
c는 다당류 농도이고,
Mn은 다당류의 수 평균 분자 질량이다.
본 발명에서, 각각의 가교된 다당류 히드로겔에 대한 절대 효소 및 산화 분해율(absolute enzymatic and oxidative degradation rate)은 수학적으로 계산된다. 다당류 기질에 따라, 가교된 다당류 히드로겔의 절대 효소 및 산화 분해율을 모니터링하기 위해 3가지 방법이 이용된다.
제1 방법은 분해 동안 저장 모듈러스(storage modulus) G'과 같은 유동학적 파라미터의 모니터링에 근거하고, 분해율(degradation rate)rheo는 하기 식 3에 의해 계산된다.
Figure pct00029
(식 3)
히드로겔 네트워크의 붕괴(disruption)에 의해 유발된, 저장 모듈러스 G'의 감소, G't<G't0가 가교된 다당류 히드로겔의 붕괴 동안 관찰되고, 이 경우, 음의 부호가 양성 분해율을 갖기 위해 요구된다. 이 제1 방법은 히알루론산, 전분, 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난을 포함하는 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 효소 및 산화 분해율을 결정하기 위해 적합하다.
제2 방법은 분해 동안 동적 점도(dynamic viscosity) η와 같은, 점도 파라미터의 모니터링에 근거하며, 분해율visc은 식 4에 의해 계산된다.
Figure pct00030
(식 4)
폴리머 사슬의 길이의 감소에 의해 유발된, 동적 점도 η의 감소, ηt<ηt0는 가교된 다당류 히드로겔의 분해 동안 관찰되고, 이 경우, 음의 부호가 양성 분해 속도를 위해 요구된다. 이 제2 방법은 히알루론산, 전분, 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난을 포함하는 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 효소 및 산화 분해율을 결정하기 위해 적합하다.
제3 방법은 분해 동안 분광광도계를 이용한 카르바졸(carbazole) 분석에 의한 우론산의 비색(colorimetric) 모니터링에 근거하며, 분해율color은 하기 식 5에 의해 계산된다.
Figure pct00031
(식 5)
폴리머 사슬 길이의 감소 및 우론산의 단량체 단위의 형성에 의해 유발된, 우론산 농도의 증가, [우론산]t>[우론산]t0가 가교된 다당류 히드로겔의 분해 동안 관찰되고, 이 경우, 음의 부호가 양성 분해율을 갖기 위해 요구된다. 이 제3 방법은 히알루론산, 전분, 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트)를 포함하는 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 효소 및 산화 분해율을 결정하기 위해 적합하다.
본 발명에서, 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 효소 및 산화 분해율 간의 비교가 또한 이루어진다. 정해진 기간 동안, 각각의 가교된 다당류 히드로겔에 대한 상대적 효소 및 산화 분해 속도는 기준으로 사용된, 당해 기술분야에서 알려진 GDE에 의해 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 효소 및 산화 분화율에 대한 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 효소 및 산화 분해율의 값의 퍼센트로 계산된다. 따라서, 이는 식 6으로부터 계산된다.
Figure pct00032
(식 6)
식 중에서:
분해율xl은 BDDE, PEGDE 및 PPE와 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 분해율이고,
분해율GDE은 당해 기술 분야에서 알려진 GDE와 가교된 다당류 히드로겔의 절대적 분해율이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 (기준값 및 내부 기준으로 이용되는) 비교(comparative) GDE 가교된 다당류의 효소 분해율의 100% 내지 37%의 상대적 효소 분해율을 갖는다. 내부 값으로 사용되는 GDE 가교된 다당류는 (실험 섹션에 표시된 바와 같이) 다당류를 시판 GDE와 반응시키는 것에 의해 수득된다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 85 내지 40 %의 상대적 효소 분해율을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 0.1528 내지 0.1877 %의 가교율 및 84 내지 37 %의 상대적 효소 분해율을 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 (기준값 및 내부 기준으로 이용되는) 비교 GDE 가교된 다당류의 산화 분해율의 100% 내지 76%의 상대적 산화 분해율을 갖는다. 내부 값으로 사용되는 GDE 가교된 다당류는 (실험 섹션에 표시된 바와 같이) 다당류를 시판 GDE와 반응시키는 것에 의해 수득된다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 90 내지 75 %의 상대적 산화 분해율을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 0.1528 내지 0.1877 %의 가교율 및 76 내지 87 %의 상대적 산화 분해율을 갖는다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 가교된 다당류의 절대 효소 및 산화 분해율은 내부 기준으로 사용된 비교 GDE 가교된 다당류의 절대적 효소 및 산화 분해율과 동일하거나 또는 그보다 낮고, 더 낮은 가교도를 갖는다. 이는 히드로겔의 안정성 및 환자 안전성과 편안함(comfortability)이 증가되기 때문에 유리하다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 0.8 내지 3.5 mmole/h의 절대적 효소 분해율; 및 3.0 내지 4.3 mmole/h의 절대적 산화 분해율을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 0.8 내지 2.6 mmole/h의 절대적 효소 분해율; 및 3.0 내지 3.4 mmole/h의 절대적 산화 분해율을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 0.1528 내지 0.1877 %의 가교율, 0.8 내지 2.7 mmole/h의 효소 분해율; 및 3.0 내지 3.4 mmole/h의 산화 분해율을 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 2개의 가교 기 사이의 평균 거리 (DN)가 21 nm 내지 42 nm인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 2개의 가교 기 사이의 평균 거리 (DN)가 21 nm 내지 27 nm인 것인 가교된 다당류이다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 2개의 가교 기 사이의 평균 거리 (DN)가 27 nm 내지 42 nm와 동일하거나 그보다 큰 것인 가교된 다당류이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류은 다당류의 농도가 1 내지 50 mg/ml인 것인 다당류이다. 다당류의 농도는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에서, 다당류의 농도는 적절한 시간 동안 105℃에서 환기 오븐(ventilated oven)에서 탈수 후에 수득된 건조 잔류물의 중량 측정에 의해 측정된다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 점도가 점도계에 의해 측정된 1 내지 200 Pa·s인 것인 다당류이다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 점도가 점도계에 의해 측정된 10 내지 100 Pa·s인 것인 다당류이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 상기 다당류가 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 가교된 다당류이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 다당류가 히알루론산인 것인 가교된 다당류이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "히알루론산(hyaluronic acid)", "히알루로난(hyaluronan)" 및 약어 "HA"는 동일한 의미를 갖고 호환적으로 사용된다. 그들은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산의 수개의 반복된 이당류 단위로 구성된, CAS 번호 9004-61-9를 갖는 글리코사미노글리칸의 천연, 비-술페이트화 음이온 형태; 및 히알루론산의 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "히알루론산"은 또한 히알루론산의 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염을 포괄한다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 상기 다당류가 히알루론산의 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염인 것인 가교된 다당류이다. 치료 목적으로 사용되는 경우 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 한, 사용될 수 있는 히알루론산 염의 종류에 제한이 없다. 히알루론산 및 그의 염은 일부 물리적 특성에서 다를 수 있으나, 그들은 본 발명의 목적을 위해 균등하고, 히알루론산의 피부-친화적 특성은 그의 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염, 특히, 그의 소듐 염 (또는 소듐 히알루로네이트) 및 포타슘 염 (포타슘 히알루로네이트)까지 확장가능하다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 의약 용도를 위한 조성물의 제조에 대한 제약 기술에서 사용하기에 적합한 염을 의미하고, 본 문서에서 호환적으로 사용되는 용어 "미용적으로 허용가능한 염(cosmetically acceptable salt)" 또는 "피부과학적으로 허용가능한 염(dermatologically acceptable salt)"은 특히, 독성, 비적합성(incompatibility), 불안정성, 부적합한 알레르기 반응 없이 인간 피부 접촉에서 사용하기에 적합한 염을 의미한다. 특히, 용어 "약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염(pharmaceutical or cosmetically acceptable salt)"은 일반적으로 사용되는 염, 예를 들면, 알칼리 금속 염을 포괄한다. 히알루론산의 약학적으로 허용가능한 염의 제조는 당해 기술 분야에서 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명을 위해 적합한 히알루론산의 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염의 비-한정적 예는 소듐 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 포타슘 히알루로네이트, 징크 히알루로네이트 및 코발트 히알루로네이트와 같은 무기 염 및 테트라부틸암모늄 히알루로네이트와 같은 유기 염을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 히알루론산의 약학적으로 또는 미용적으로 허용가능한 염은 소듐염 (CAS No: 9067-32-7) 또는 포타슘 염 (CAS No: 31799-91-4)의 선택된 알칼리 금속의 염이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 다당류가 고분자량 히알루론산인 것인 가교된 다당류이다. 용어 "고분자량 히알루론산(high molecular weight hyaluronic acid)"은 300 kDa 이상의 분자량을 갖는 히알루론산을 의미한다. 일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 상기 다당류가 300 kDa 내지 5000 kDa; 특히, 500 kDa 내지 2000 kDa의 분자량을 갖는 고분자량 히알루론산인 것인 가교된 다당류이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 상기 다당류가 1000 kDa 내지 2000 kDa의 분자량을 갖는 고분자량 히알루론산인 것인 가교된 다당류이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.2688 %의 가교도;
2.8 mmole/h의 효소 분해율; 및
3.3 mmole/h의 산화 분해율;을 갖는 가교된 다당류 (III)-4이고;
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-22이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.1127 %의 가교도;
3.6 mmole/h의 효소 분해율; 및
4.3 mmole/h의 산화 분해율을 갖는 가교된 다당류 (III)-9이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-16이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.1358 %의 가교도;
3.5 mmole/h의 효소 분해율; 및
4.3 mmole/h의 산화 분해율을 갖는 가교된 다당류 (III)-8이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-22이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.1877 %의 가교도;
0.8 mmole/h의 효소 분해율; 및
3.0 mmole/h의 산화 분해율을 갖는 가교된 다당류 (III)-5이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-23이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.1528 %의 가교도;
2.7 mmole/h의 효소 분해율; 및
3.4 mmole/h의 산화 분해율을 갖는 가교된 다당류 (III)-6이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-16이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.3911 %의 가교도;
2.8 mmole/h의 효소 분해율; 및
2.6 mmole/h의 산화 분해율을 갖는 가교된 다당류 (III)-14이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-22이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.3049 %의 가교도;
1.1 mmole/h의 효소 분해율; 및
2.3 mmole/h의 산화 분해율을 갖는 가교된 다당류 (III)-15이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-23이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는:
0.2723 %의 가교도;
2.9 mmole/h의 효소 분해율; 및
2.6 mmole/h의 산화 분해율을 가교된 다당류 (III)-16이고,
상기 다당류는 히알루론산이고, 및
출발 물질로 사용된 고분지 PPE는 화합물 (I)-16이다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 상기 다당류가 전분 또는 그의 유도체인 것인 가교된 다당류이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "전분(starch)"은 글리코시드 결합에 의해 연결된 다수의 글루코오스 단위들로 구성된 다당류 탄수화물을 의미한다. 전분은 모든 초록 식물에서 에너지 저장원(energy store)으로 생산되고, 인간을 위한 주요한 식품 공급원이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "전분 유도체(starch derivative)" 또는 "변형된 전분(modified starch)"은 동일한 의미를 갖고 호환적으로 사용된다. 그들은 특성을 변형시키기 위해 반응된 전분을 의미한다. 전분 유도체의 예는 히드록시알킬 전분, 카르복시알킬화 전분, 알킬카르보닐화 전분, 포스페이트화 전분, 술페이트화 전분, 그래프트 유도체화(graft derivatized) 전분 및 알킬화 전분이다. 일 구체예에서, 상기 전분 유도체는 히드록시프로필 전분, 전분 글리콜산 나트륨(sodium starch glycolate), 및 카르복시메틸 전분으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 본 발명의 가교된 다당류는 다당류가 셀룰로오스 또는 그의 유도체인 것인 가교된 다당류이다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "셀룰로오스(cellulose)"는 β-1,4-글리코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코피라노오스 단위에 의해 형성된 백본을 갖는 다당류를 의미한다. 용어 "변형된 셀룰로오스(modified cellulose)" 또는 "셀룰로오스 유도체(cellulose derivative)"는 동일한 의미를 갖고 호환적으로 사용된다. 그들은 셀룰로오스 백본, 즉, β-1,4-글리코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코피라노오스 단위들의 구조를 갖고, 순수한 셀룰로오스에 포함되지 않는 펜던트(pendant) 모이어티의 도입에 의해 화학적으로 변형된 임의의 화합물을 의미한다. 셀룰로오스 유도체의 비-한정적 예는 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, L-히드록시프로필 셀룰로오스 (저 치환(low substituted)), 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로오스를 포함한다.
본 발명의 가교된 다당류에 대해 개시된 전술된 구체예 모두는 또한 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난인 구체적으로 전술된 다당류 각각에 대해 개별적으로 적용된다.
또한 본 발명의 일 양태는 본 발명의 식 (III) 또는 대안적으로 식 (IV)의 가교된 다당류를 제조하는 방법이다.
일 구체예에서, 본 발명의 식 (III)의 가교된 다당류를 제조하는 방법은 다당류를 본 발명의 제1 양태에서 정의된 식 (I)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 식 (III)의 가교된 다당류를 제조하는 방법은 다당류를 본 발명의 제1 양태에서 정의된 식 (I)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하고; 상기 식 (I)의 화합물은 앞서 정의된 단계 a) 및 b)를 수행하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다. 따라서, 본 발명의 식 (III)의 가교된 다당류를 제조하는 방법은 다당류를 식 (I)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하고; 상기 식 (I)의 화합물은 a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다.
일 구체예에서, 본 발명의 식 (III)의 가교된 다당류를 제조하는 방법은 다당류를 본 발명의 제1 양태에서 정의된 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 식 (IV)의 가교된 다당류를 제조하는 방법은 다당류를 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하고; 상기 식 (II)의 화합물은 앞서 정의된 단계 c) 및 d)를 수행하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다. 따라서, 본 발명의 가교된 다당류를 제조하는 방법은 다당류를 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하고; 상기 식 (II)의 화합물은 c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및 d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다.
다당류, 식 (I)의 화합물, 식 (II)의 화합물 및 가교된 다당류; 및 본 발명의 가교된 다당류의 제조 방법의 단계 a)-d)의 반응 조건에 대해 전술된 모든 구체예는 또한 이 방법에 의해 수득가능한 가교된 다당류에 적용된다.
일 구체예에서, 식 (III)의 가교된 다당류 제조하는 방법은:
e) 다당류를 본 발명의 제1 양태에서 정의된 식 (I)의 화합물과 가교시키는 단계; 및 선택적으로
g) 본 발명의 식 (III)의 가교된 다당류를 단리하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 식 (III)의 가교된 다당류를 제조하는 방법의 단계 e)는:
e1) 상기 다당류의 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 알칼리 용액을 제공하는 단계;
e2) 식 (I)의 화합물을 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
e3) 단계 e1)에서 수득된 용액을 단계 e2)에서 수득된 용액과 혼합하여 상기 다당류와 식 (I)의 화합물을 포함하는 알칼리 용액을 수득하는 단계; 및
e4) 단계 e3)에서 수득된 알칼리 용액을 1 내지 48시간의 시간 동안 20℃ 내지 50℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 식 (IV)의 가교된 다당류를 제조하는 방법은:
f) 다당류를 본 발명의 제1 양태에서 정의된 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계; 및 선택적으로
g) 본 발명의 식 (IV)의 가교된 다당류를 단리하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 식 (IV)의 가교된 다당류를 제조하는 방법의 단계 f)는:
f1) 상기 다당류의 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 알칼리 용액을 제공하는 단계;
f2) 식 (II)의 화합물을 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
f3) 단계 f1)에서 수득된 용액을 단계 f2)에서 수득된 용액과 혼합하여 상기 다당류와 식 (II)의 화합물을 포함하는 알칼리 용액을 수득하는 단계; 및
f4) 단계 f3)에서 수득된 알칼리 용액을 1 내지 48시간의 시간 동안 20℃ 내지 50℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 단계 e3) 또는 대안적으로 단계 f3)의 알칼리 용액은 중량 기준 5 내지 15%의 다당류의 농도를 포함한다.
일 구체예에서, 단계 e3) 또는 대안적으로 단계 f3)에서 수득되는 알칼리 용액은 0.25 내지 0.75M의 알칼리 염기; 특히, 0.40 내지 0.60M의 알칼리 염기를 포함한다.
일 구체예에서, 단계 e3) 또는 대안적으로 단계 f3)에서 수득되는 알칼리 용액은 중량 기준 5 내지 15%의 다당류; 특히 중량 기준 8 내지 10%의 다당류를 포함한다.
일 구체예에서, 단계 e3) 또는 대안적으로 단계 f3)에서 수득되는 알칼리 용액은 중량 기준 0.2 내지 1%의 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물; 특히 중량 기준 0.3 내지 0.5%의 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 구체예에서, 단계 e3) 또는 대안적으로 단계 f3)에서 수득되는 알칼리 용액은 2 내지 40% w/w의 식 (I)의 화합물과 다당류간 중량비, 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물과 다당류간 중량비; 특히, PPE 대 건조 다당류의 중량비로 표현된 2 내지 12.5% w/w를 포함한다. 용어 "중량비(weight ratio)"는 그의 적용 후, 본 발명의 가교된 다당류의 안정성을 증진하고 생체이용율을 증가시키기 위해 필요한 두 성분들의 중량 간의 관계, 구체적으로, 효소/산화 분해율을 감소시키고 가교도를 낮추기 위해 필요한 다당류와 본 발명의 고분지 PPE의 관계를 의미한다.
일 구체예에서, 단계 e4) 또는 대안적으로 단계 f4)에서 수득되는 알칼리 용액은 1 내지 50mg/mL의 다당류를 포함한다.
상기 단리하는 단계 g)는 화합물의 단리에 대해 당해 기술 분야에서 개시되어 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 단리하는 단계는 하기 공정 중 하나 이상에 의해 그들을 제거하는 것을 포함할 수 있다: 증발, 동결건조, 여과, 경사(decantation), 및 원심분리, 또는 기타 당업자에게 알려진 적절한 기법. 일 구체예에서, 상기 단리하는 단계 g)는 단계 e3) 또는 대안적으로 단계 f3)에서 수득되는 알칼리 용액의 pH를 6.5 내지 7.4로 조정하는 단계를 포함한다. pH의 조정은 산, 예를 들면, HCl, H3PO3 또는 이들의 혼합물의 첨가에 의해 수행될 수 있다. pH의 결정은 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 본원의 경우에, pH는 그의 전극을 히드로겔에 침지시킨 pH미터(pHmeter)를 이용하여 pH 값의 직접적인 판독에 의해 결정된다.
본 발명의 또 다른 양태는:
1종 이상의 본 발명의 가교된 다당류, 및
1종 이상의 적합한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 적합한 가교된 다당류 및 적합한 부형제 및/또는 담체, 및 그들의 양은 분야 및 제조되는 제형의 종류에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 가교된 다당류, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 의약 용도를 갖는 제약 기술에서의 사용을 위해 적합한 조성물을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "치료 유효량의 약학적으로 허용가능한 가교된 다당류(therapeutically effective amount of a pharmaceutically acceptable crosslinked polysaccharide)"는 투여된 경우, 대상 질환의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하거나 또는 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기에 충분한, 본 발명의 가교된 다당류의 양을 의미한다. 본 발명에 따라 투여되는 약학적으로 허용가능한 가교된 다당류의 용량은 투여되는 화합물, 투여 경로, 치료 대상 질환, 및 유사한 고려사항(considerations)을 포함한, 해당 케이스를 둘러싼 특정한 상황에 의해 결정될 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "약학적으로 허용가능한 가교된 다당류(pharmaceutically acceptable crosslinked polysaccharide)"는 질병 또는 질환의 진단, 예방, 치료, 치유, 또는 완화에 직접적인(치료적) 효과를 유발하는 조성물 중 활성 성분 또는 중심(central) 성분을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체(pharmaceutically acceptable excipients or carriers)"는 의약 용도를 갖는 조성물을 제조하는 제약 기술에서의 사용을 위해 적학한 부형제 또는 담체를 의미한다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 희석제, 결합제, 활택제, 붕해제, 윤활제, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체를 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 다른 성분들, 예를 들면, 향미제(fragrance), 착색제, 및 당해 기술 분야에서 공지된 기타 성분들을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 가교된 다당류를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 미용적 유효량(cosmetically effective amount)의 1종 이상의 미용적으로 허용가능한 가교된 다당류, 및 1종 이상의 미용적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 미용 조성물이다.
본 발명의 미용 조성물은 피부, 네일, 또는 헤어의 외양을 개선하거나, 피부, 네일, 또는 헤어를 미화시키거나, 보존시키거나, 컨디셔닝(condition)하거나, 세정하거나, 염색(color)하거나, 또는 보호하기 위해 적합한 양("미용 유효량(cosmetically effective amount)")을 신체에 적용하도록 설계된다(Academic press Dictionary of Science and Technology, 1992, pp. 531; A terminological Dictionary of the Pharmaceutical Sciences. 2007, pp.190 참조). 따라서, 전술된 미용 조성물은 형용사적으로(adjectivally) 의약외(non-medical) 적용을 위해 사용된다.
본 명세서에서 호환적으로 사용되는, 용어 "미용적으로 허용가능한(cosmetically acceptable)" 또는 "피부과학적으로 허용가능한(dermatological acceptable)"은 무엇보다 과도한 독성, 비적합성, 불안정성, 알레르기 반응 없이 피부와의 접촉에서 사용하기에 적합한 부형제 또는 담체를 의미한다.
일 구체예에서, 본 발명의 약학적 또는 미용 조성물은 용액, 에어로졸, 및 비-에어로졸 스프레이, 면도 크림, 파우더, 무스, 로션, 겔, 스틱, 연고, 페이스트, 크림, 샴푸, 샤워 젤, 바디 워시, 또는 세안제(face wash)를 포함하나, 그에 한정되지 않는 여러 제형으로 제제화될 수 있는, 국소 조성물이다.
일 구체예에서, 상기 약학적 또는 미용 조성물은 경구 조성물이다. 예를 들면, 고형 조성물은 정제, 과립 및 캡슐이다.
일 구체예에서, 상기 약학적 또는 미용 조성물은 주사(injectable) 조성물이다. 일 구체예에서, 상기 약학적 또는 미용 조성물은 근육내, 피하, 또는 정맥내 적용으로 구성된 군으로부터 선택된 주사 조성물이다. 일 구체예에서, 본 발명의 약학적 또는 미용 조성물은 그들의 신체로의 주사, 주입, 또는 이식에 적합한 비경구 조성물의 제형이다. 앞서 정의된 비경구 조성물은 멸균되고, 발열원-불포함(pyrogen-free)이어야 하며, 그들은 액체, 예를 들면, 용액, 에멀젼, 또는 현탁액의 제형, 또는 사용하기 전에 적절하게 희석되는 단일-용량 또는 복수-용량 용기에 포장된 고체 제형일 수 있다. 비경구 조성물은 용매, 현탁제, 완충제, 제제를 혈액과 등장성이 되게 하는 물질, 안정화제, 또는 항미생물 보존제를 포함하나, 그에 한정되지 않는 약학적 또는 미용 부형제일 수 있는, 비경구 투여를 위한 적합한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 부형제의 첨가는 최소로 유지되어야 한다. 부형제가 사용되는 경우, 그들은 폴리머 및/또는 활성제의 안정성, 생체이용률, 안전성, 또는 효능에 부정적으로 영향을 미치지 않아야 하고, 독성 또는 과도한 국소 자극을 유발하지 않아야 한다. 투여 제형의 성분들 간에 어떠한 부적합성도 없어야 한다.
앞서 정의된 국소 조성물은 피부 장벽 기능 복구제(repairing cutaneous barrier function agent), 수화제(hydrating agent), 연화제(emollient), 유화제(emulsifier), 증점제(thickener), 보습제(humectant), pH-조절제(pH-regulating agent), 항산화제, 보존제, 비히클, 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 그에 한정되지 않는 약학적 또는 미용적 부형제일 수 있는 국소 투여를 위해 적합한 부형제 또는 담체를 포함한다. 사용되는 부형제 또는 담체는 피부에 대한 친화도를 갖고, 잘 수용되고(well tolerated), 안정하고, 원하는 밀도(consistency), 및 적용 용이성(ease application)을 제공하기에 적합한 양으로 사용된다. 추가적으로, 본 발명의 조성물은 기타 성분, 예를 들면, 향미제, 착색제, 및 국소 제형에서의 사용을 위해 당해 기술 분야에서 공지된 기타 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 국소 조성물은 용액, 에어로졸 및 비-에어로졸 스프레이, 크림, 파우더, 무스, 로션, 겔, 스틱, 연고, 페이스트, 및 에멀젼을 포함하나, 그에 한정되지 않는 여러 제형으로 제제화될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미용 조성물은 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 가교된 다당류를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 1종 이상의 식용으로 허용가능한 가교된 다당류, 및 1종 이상의 식용으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 식용 조성물이다.
용어 "식용(edible)"은 중요한 유해한 건강 영향 없이, 인간 또는 동물에 의해 섭취될 수 있는 조성물, 가교된 다당류, 부형제, 및 담체를 의미한다.
용어 "식용으로 허용가능한 부형제 또는 담체(edible acceptable excipients or carriers)"는 유의성 있게 감각수용성(organoleptic properties)을 변화시키지 않는 한, 풍미의 관점에서 실질적으로 중성(neutral)인 부형제 또는 담체를 의미한다. 또한, 그들은 유의하게 유해한 건강 영향 없이 인간에 의해 섭취될 수 있는 조성물의 제조에서 사용하기에 적합하다.
일 구체예에서, 상기 식용 조성물은 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 식용으로 허용가능한 가교된 다당류를 포함한다.
본 발명의 식용 조성물은 고체 또는 액체 제형을 포함하나, 그에 한정되지 않는 여러 형태로 제제화될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 식용 조성물은 기타 성분들, 예를 들면, 착색제 및 내광제(light resistance agent), 및 식용 조성물에서 사용하기 위한 당해 기술 분야에서 알려진 기타 구성 요소들을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 식용 조성물은 인간 식품 또는 동물 식품(사료)이다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 생물학적 유효량(biologically effective amount)의 1종 이상의 농업적으로 허용가능한 가교된 다당류, 및 1종 이상의 농업적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 농업용 조성물이다.
용어 "농업용(agricultural)"은 유의하게 유해한 건강 영향 없이, 식물을 처리하기 위해 식물의 기저부(basal parts) 및/또는 엽부(foliar parts)에 적용될 수 있는 조성물, 가교된 다당류, 부형제 및 담체를 의미한다.
일 구체예에서, 상기 농업용 조성물은 비료, 다량영양소(macronutrients), 미량영양소(micronutrients), 살충제, 식물 성장 조절제, 식물 호르몬, 및 Nod 인자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 유효량(biologically effective amount)"은 식물, 곤충, 또는 식물 해충에 대해 원하는 효과를 생성하기 위해 요구되는 본 발명의 가교된 다당류의 양을 의미한다. 물질의 유효량은 치료 방법, 식물 종, 해충 종, 번식체 타입(propagating material type), 및 환경 조건을 포함한 여러 인자들에 의존적일 것이다. 예를 들면, 살충제의 생물학적 유효량은 손상으로부터 식물을 보호하는 살충제의 양이다. 이 용량은 보호된 식물이 해충으로부터 손상을 받지 않는다는 것이 아니고, 손상이 식물이 농작물의 허용가능한 수확을 산출할 수 있게 하는 수준이라는 것을 의미한다.
상기 농업용 조성물은 수화제(wettable powders), 살포제(dusting powders), 입상 수화제(water dispersible granules), 액상 수화제(suspension concentrates), 유제(emulsifiable concentrates), 정제(tablets), 펠렛(pellets), 액제(liquids) 및 유상 현탁제(oil suspensions)로 구성된 군으로부터 선택된 제형으로 제제화될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 농업용 조성물은 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 농업적으로 허용가능한 가교된 다당류를 포함한다.
본 발명의 가교된 다당류의 용도가 또한 본 발명의 일부이다. 적합한 가교된 다당류 및 적합한 부형제 및/또는 담체, 및 그들의 양은 해당 분야 및 제조되는 제형의 종류에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 약학적 조성물은 제약 분야에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 가교된 다당류 또는 대안적으로 치료에서 사용하기 위한, 그들을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물도 본 발명의 일부이다. 일 구체예에서, 상기 약학적 가교된 다당류 또는 대안적으로 치료에서 사용하기 위한, 그들을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 가교된 HA 또는 치료에서 사용하기 위한, 그를 포함하는 조성물이다.
이 양태는 또한 의약의 제조를 위한 약학적 가교된 다당류의 용도로 기술될 수 있다. 이 양태는 또한 질병을 앓는 포유동물의 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게 앞서 정의된 바와 같은 본 발명의 약학적 가교된 다당류의 치료 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 앞서 정의된 본 발명의 약학적 조성물은 상기 약학적 가교된 다당류가 연조직 확대(augmentation)의 치료에서 사용하기 위한 가교된 다당류인 것인 약학적 조성물이다. 이 양태는 또한 상처 치료용 약제의 제조를 위한, 앞서 정의된 가교된 HA를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물의 용도로 기술될 수 있다. 이 양태는 또한 골관절염을 앓는 포유동물의 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게 앞서 정의된 바와 같은 가교된 HA를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 가교된 다당류 및 약학적 조성물에 대해 앞서 정의된 모든 구체예는 그들의 치료에서의 용도에도 적용된다.
본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물이 미용 분야에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물의 스킨 케어제(skin care agent)로서의 용도로서, 상기 스킨 케어는 하기 중 하나 이상의 증상을 개선하는 것을 포함하는 것인 용도도 본 발명의 일부이다: 거칠기(roughness), 각질화(flakiness), 건조(dehydration), 당김(tightness), 갈라짐(chapping), 및 탄력 부족.
일 구체예에서, 본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물은 보습제(moisturizing agent)이다. 일 구체예에서, 본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물은 스킨 케어제이다. 일 구체예에서, 본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물은 진정제(soothing agent)이다. 상기 진정제는 피부를 진정시키거나(allaying), 안정시키거나(calming), 완화시키거나(composing), 달래거나(lulling), 고요하게 하거나(quieting), 정착시키거나(settling), 안정화시키거나(stilling), 또는 평온하게(tranquilizing)한다. 일 구체예에서, 본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물은 피부 장벽 복구제(skin barrier recovery agent)이다.
일 구체예에서, 본 발명의 미용적 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 미용 조성물은 피부 필러, 구체적으로, 다당류가 HA인 것인 피부 필러이다.
본 발명의 식용 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 식용 조성물이 식품 분야에서 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 식용 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 식용 조성물은 식품 첨가제이다. 일 구체예에서, 본 발명의 식용 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 식용 조성물은 물성 조절제(texture modifying agent), 예를 들면, 검, 증점제, 증량제, 에멀젼 안정화제 및 결합제이다.
일 구체예에서, 본 발명의 식용 가교된 다당류 및 그들을 포함하는 식품 조성물은 식품 첨가제; 구체적으로 물성 조절제(texture modifying agent)이고, 상기 다당류는 HA, 전분 및 그의 유도체, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난이다.
본 발명의 가교된 다당류의 담체로서의 용도도 본 발명의 일부이고, 상기 담체는 약학적 활성 성분, 진단제, 미용 화합물(cosmetic compound), 펩티드, 단백질, 항체, 백신 및 유전자의 전달 시스템이다.
본 발명의 설명 및 청구항 전체에서, 단어 "포함하다(comprise)" 및 그의 변형은 다른 기술적 특징, 첨가제, 성분, 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 또한, 단어 "포함하다"는 "구성된(consisting of)"의 경우를 포괄한다. 본 발명의 추가적인 목적, 장점, 및 특징은 발명의 설명의 검토로부터 당업자에게 자명하거나, 또는 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 하기 실시예 및 도면은 예시로서 제공되며, 그들은 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 도면과 관련되고, 청구항에서 괄호 안에 표시된 참조 부호는 단지 청구항의 명료성을 높이기 위한 것이며, 청구항의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 모든 가능한 구체예를 포함한다.
약어의 목록
HA: 히알루론산(hyaluronic acid)
GAG: 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)
C.D.: 가교도(cross-linking degree)
NaCMC: 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(Sodium carboxymethylcellulose)
HES: 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)
GlcA: D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)
GlcNAc: N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)
ECM: 세포외 기질(extracellular matrix)
ROS: 반응성 산소종(reacting oxygen species)
HYAL: 히알루로니다아제 효소(hyaluronidase enzyme)
IA: 염증성 관절염(inflammatory arthritis)
EDC: 카르보디이미드(carbodiimide)
DVS: 디비닐 술폰(divinyl sulfone)
BDDE: 1,4-부탄 디올 디글리시딜 에테르(1,4-butane diol diglycidyl ether)
PEGDE: 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르(poly(ethylene glycol) diglycidyl ether)
GDE: 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르(1,3-glycerol diglycidyl ether)
PPE: 폴리글리세롤 디글리시딜 에테르(polyglycerol diglycidyl ether)
FDA: 식품의약청(Food and Drug Administration)
EEW: 에폭시 당량(Epoxy Equivalent Weight)
GPC: 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)
SEC: 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)
SANS: 소각 중성자 산란(Small Angle Neutron Scattering)
1H NMR: 양성자 핵 자기 공명(proton nuclear magnetic resonance)
PBS: 인산염 완충 용액(phosphate buffer solution)
IPN: 상호침투 네트워크(interpenetrating networks)
MMPs: 금속 단백질 분해 효소(metalloproteinases)
Mw: 중량-평균 분자량(weight-average molecular weight)
Mn: 수-평균 분자량(number-average molecular weight)
재료
이탈리아, Altergon의 Shyalt 초순수 소듐 히알루로네이트(히알루론산)
Merck의 고 아밀로오스 전분
Merck의 고 아밀로펙틴 전분
소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 0.7 MDa, 0.8-0.9 D.S. AQUALON™, BLANOSE™ 및 BONDWELL™
Merck의 부탄 디올 디글리시딜 에테르 (BDDE), MW=202 Da
Merck의 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (PEGDE), MW=526 Da
하기 명칭, 상품명, 동의어, 및 약어를 갖는 것으로도 알려진 1,3-비스(2-옥시라닐메톡시)-2-프로판올: 1,3-비스(옥시란-2-일메톡시)프로판-2-올; 2-프로판올, 1,3-비스(옥시라닐메톡시); 글리세롤 1,3-디글리시딜 에테르; Nagase Chemtex의 Denacol EX-313, MW=204 Da, EEW=141 g/eq; Merck의 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르, MW=204 Da; 1,3-GDE는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00033
하기 명칭, 상품명, 동의어, 및 약어를 갖는 것으로 알려진 2,3-비스(2-옥시라닐메톡시)-1-프로판올: 2,3-비스(옥시란-2-일메톡시)프로판-1-올, 1-프로판올, 1,2-비스(옥시라닐메톡시); 글리세롤 1,2-디글리시딜 에테르; Merck의 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르, MW=204 Da; 1,2-GDE는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00034
1,3-GDE와 1,2-GDE의 혼합물도 하기 상품명으로 상업적으로 입수가능하다: Nagase Chemtex의 Denacol EX-314, MW=260 Da, EEW=144 g/eq;
Merck의 소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH);
Merck의 염산 37% (HCl);
Merck의 염화나트륨 분말 (NaCl);
Merck의 염화칼륨 분말 (KCl);
Merck의 인산 85% (H3PO4);
Merck의 인산염 완충 염수 (PBS) 펠렛;
Merck의 증류수 (H2O).
방법
평균 Mw, Mn 및 Mw/Mn의 측정 방법은 광산란 검출기가 구비된 크로마토그래피 장치를 이용하여 GPC/SEC 분석에 의해 평가했다.
EEW의 측정 방법은 초음파 보조 적정에 의해 평가했다.
pH의 측정 방법은 히드로겔에 직접 침지된 전극을 구비한 pH 측정기(pHmeter)의 직접적인 판독에 의해 계산했다.
1. 고분지 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르
1.1. 출발물질로서 1,3-GDE의 사용
하기에 기재된 제조 방법들은 또한 1,3-GDE의 출처로서 Nagase로부터 상업적으로 입수가능한 Denacol® EX-313을 이용하여 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 방법들은 또한, Denacol® EX-313 대신 Merck로부터 상업적으로 입수가능한 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르, 또는 1,3-DGE를 포함하는 혼합물인 상표 Denacol® EX-314를 갖는 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 이용하여 수행될 수 있다.
1.1.1. 방법 1
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A).
1,3-GDE (Denacol® EX-313)를 실온에서 용액 A의 분량(portion)에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C1). 그 후, 용액 C1을 1 내지 500분 동안 50 내지 80℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했고, 그 동안 1,3-GDE의 자기-중합이 일어나서, 표 1(실시예 1-13)에 개시된 본 발명의 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르가 생성된다 (용액 C3).
1.1.2. 방법 2
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A).
1,3-GDE (Denacol® EX-313)를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C1). 그 후, 용액 C1을 1 내지 3일 동안 10 내지 40℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했고, 그 동안 1,3-GDE의 자기-중합이 일어나서, 표 1(실시예 14-31)에 개시된 본 발명의 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르(용액 C2)가 생성된다.
1.1.3. 본 발명의 PPE의 규명(characterization)
방법 1 및 2에 따라 수득된 PPE의 분자량 및 출발 GDE의 EEW 퍼센트로 표현된 에폭시 당량(Epoxy Equivalent Weight)으로 측정된 에폭시 함량을 각각 전술된 바와 같이 광산란 검출기가 구비된 GPC 장치 및 HCl에 의한 정량적 적정에 의해 시간의 경과에 따라 분석적으로 모니터링했다. 각 분석 전에, GDE의 자기-중합 반응을 1M 염산 용액 및 PBS를 첨가하여 중단시켜서 알칼리 촉매를 중화시키고, 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 용액의 pH를 7.0으로 복귀시켰다.
온도와 시간의 각 조합에 대한 본 발명의 수득된 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (PPE)의 평균 분자량 (MW)의 값들이 표 1에 보고된다.
Figure pct00035
2. 가교된 다당류
2.1. 가교된 히알루론산
2.1.1. 본 발명의 PPE 가교된 히알루론산
2.1.1.1. 제조 방법
실시예 1-13의 PPE 가교된 히알루론산 (표 2 참조)을 하기에 정의된 방법에 따라 제조했다. 실시예 14-16의 PPE 가교된 히알루론산 (표 2 참조)을 실시예 1-13을 위한 방법과 동일하나, 실시예 1-13에서의 1.00의 농도보다 약 2.5배 높은 가교제 농도를 이용한 방법에 따라 제조했다.
방법 1
A. 섹션 1.1.2에 개시된 방법에 따른 실시예(Ex.) 1-13의 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르의 제조
B. 가교된 다당류의 제조
대안(Alternative) B1
히알루론산 (HA) 건조 분말을 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에(또는 용액 C3에 직접적으로 첨가하여) 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 HA를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B).
그 후, 용액 C3을 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 2 내지 12.5% w/w (건조 다당류에 대한 PPC의 중량비로 표현됨)의 HA와 PPE의 비를 갖는 알칼리 용액을 제공한다.
대안 B2
그 후, 용액 C3를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중에 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도, 총 중량 대비 중량 기준 8 내지 10% 범위의 최종 용액 중 HA의 농도, 및 총 중량 대비 중량 기준 0.2 내지 1%의 최종 용액 중 PPE의 농도를 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 건조 다당류에 대한 PPE의 중량비로 표현된 비는 건조 다당류에 대한 PPE의 중량비로 2 내지 40% w/w이다.
C. 가교된 다당류의 반응 및 단리
결과적으로 수득된, HA, PPE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다.
그 후, PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 표 2에 표시된 바와 같이, PPE-가교된 히알루론산 히드로겔 중 1 내지 50 mg/mL의 HA의 원하는 최종 농도에 도달하게 했다.
PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1, 의료 제품의 멸균 - 습열 파트 1: 의료 장비를 위한 멸균 방법의 개발, 검증, 및 일반 관리의 요건(Sterilization of health care products - Moist heat Part 1: requirements for the development, validation and routine control of a sterilization process for medical device)에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다.
PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 선택적으로 진공 하에 30℃에서 탈수시키거나 동결건조(냉동-건조)시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
방법 2
A. 섹션 1.1.3에 개시된 방법에 따른 실시예 14-31의 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르의 제조
B. 가교된 다당류의 제조
대안 B1
히알루론산 (HA)을 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에(또는 용액 C3에 직접적으로 첨가하여) 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 HA를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B). 그 후, 용액 C3를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중에 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 2 내지 12.5% w/w (건조 다당류에 대한 PPC의 중량비로 표현됨)의 HA와 PPE의 비를 갖는 알칼리 용액을 제공한다.
대안 B2
그 후, 용액 C3를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중에 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도, 총 중량 대비 중량 기준 8 내지 10% 범위의 최종 용액 중 HA의 농도, 및 총 중량 대비 중량 기준 0.2 내지 1% 범위의 최종 용액 중 PPE의 농도를 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 건조 다당류에 대한 PPC의 중량비로 표현된 비는 (건조 다당류에 대한 PPE의 중량비로 표현된) 2 내지 40% w/w이다.
C. 가교된 다당류의 반응 및 단리
결과적으로 수득된, HA, PPE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다.
그 후, PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 표 2에 표시된 바와 같이, PPE-가교된 히알루론산 히드로겔 중 1 내지 50 mg/mL의 HA의 최종 농도에 도달하게 했다.
PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1, 의료 제품의 멸균 - 습열 파트 1: 의료 장비를 위한 멸균 방법의 개발, 검증, 및 일반 관리의 요건(Sterilization of health care products - Moist heat Part 1: requirements for the development, validation and routine control of a sterilization process for medical device)에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 선택적으로 진공 하에 30℃에서 탈수시키거나 동결건조(냉동-건조)시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
2.1.1.2. 본 발명의 PPE 가교된 히알루론산 (PPE 가교된 히알루론산 실시예 1-16)의 규명
본 발명의 PPE로부터 수득된 본 발명의 PPE 가교된 히알루론산의 기계적 특성이 표 2에 개시된다. 표 2의 실시예 1-13에 개시된 PPE 가교된 히알루론산은 22.0 mg/mL의 히알루론산 농도를 가지나, 실시예 14-16은 실시예 1-13의 약 2.5배의 가교제 농도를 갖는다.
Figure pct00036
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 PPE 가교된 HA 중 HA의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 PPE 가교된 HA 중 본 발명의 PPE의 농도.
2.1.2. 가교된 히알루론산 비교예
2.1.2.1. 1,3-GDE 가교된 히알루론산 비교예(GDE-HA 비교예 (Comparative GDE-HA))
하기에서 언급된 GDE-HA 비교예(comparative GDE-HA)는 1,3-GDE의 출처로서 Nagase로부터 상업적으로 입수가능한 Denacol® EX-313을 이용하여 제조한다. 그럼에도 불구하고, 이 방법들은 또한, Denacol® EX-313 대신 Merck로부터 상업적으로 입수가능한 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르, 또는 1,3-DGE를 포함하는 혼합물인 상표 Denacol® EX-314를 갖는 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 이용하여 수행될 수 있다.
비교예 1-5 (표 4 참조)의 비교 GDE 가교된 히알루론산을 하기에 정의된 방법에 따라 제조했다. 비교예 6 (표 4 참조)의 비교 GDE 가교된 히알루론산을 실시예 1-5와 동일한 방법으이나, 1.00의 가교제의 농도 및 0.4037%의 C.D.를 이용하는 것인 방법에 따라 제조했다.
제조 방법
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A). HA를 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 HA를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B).
GDE를 실온에서 증류수에 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 10 퍼센트의 GDE를 포함하는 중성 용액을 제조했다 (용액 C1). 선택적으로, GDE를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 0.2 내지 2 퍼센트의 GDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C2). 그 후, 용액 C (C1/C2)을 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 HA와 GDE의 원하는 비율을 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 결과적으로 수득된, HA, GDE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다.
수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다. 그 후, GDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) 비교예를 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 히드로겔의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 표 4에 표시된 바와 같이, 히드로겔 중 1 내지 50 mg/mL의 HA 농도에 도달하게 했다(GDE 비교예 1-5).
히드로겔을 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. GDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) 비교예를 선택적으로 진공 하에 30℃에서 탈수시키거나 동결건조(냉동-건조)시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
GDE 가교된 히알루론산 비교예(GED-HA 비교예 1-6)의 규명
22.0 mg/mL의 히알루론산 농도를 갖는, 상용 1,3-GDE로부터 수득된 본 발명의 범위에서 벗어나는 GDE 가교된 히알루론산 비교예의 기계적 특성이 표 4에 개시된다.
Figure pct00037
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 GDE 가교된 HA 중 HA의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 GDE 가교된 HA 중 본 발명의 GDE의 농도.
2.1.2.2. BDDE 가교된 히알루론산 비교예 (BDDE-HA 비교예)
제조 방법
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A). 히알루론산을 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 HA를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B).
BDDE를 실온에서 증류수에 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 0.2 내지 2 퍼센트의 BDDE를 포함하는 중성 용액을 제조했다 (용액 C1). 선택적으로, BDDE를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 10 퍼센트의 BDDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C2). 그 후, 용액 C (C1 중성 또는 C2 알칼리)를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 HA와 BDDE의 원하는 비율을 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 결과적으로 수득된, HA, BDDE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 30분 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다.
그 후, BDDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) 비교예를 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 히드로겔의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 하기 표에 표시된 바와 같이, BDDE 가교된 히알루론산(히드로겔) 비교예 중 1 내지 50 mg/mL의 HA 농도에 도달하게 했다(BDDE 비교예 1-5).
BDDE 가교된 히알루론산(히드로겔) 비교예를 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. BDDE 가교된 히알루론산(히드로겔) 비교예를 선택적으로 진공 하에 30℃에서 탈수시키거나 동결건조(냉동-건조)시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
BDDE 가교된 히알루론산 비교예의 규명
22.0 mg/mL의 히알루론산 농도를 갖는, 상용 BDDE로부터 수득된 본 발명의 범위에서 벗어나는 BDDE 가교된 히알루론산 비교예의 기계적 특성이 표 5에 개시된다.
Figure pct00038
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 GDE 가교된 HA 중 HA의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 BDDE 가교된 HA 중 본 발명의 BDDE의 농도.
2.1.2.3. PEGDE 가교된 히알루론산 비교예 (PEGDE-HA 비교예)
제조 방법
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A). 히알루론산을 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 HA를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B). PEGDE를 실온에서 증류수에 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 0.4 내지 4 퍼센트의 PEGDE를 포함하는 중성 용액을 제조했다 (용액 C1). 선택적으로, PEGDE를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 10 퍼센트의 PEGDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C2). 그 후, 용액 C (C1/C2)를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 HA와 PEGDE의 원하는 비율을 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 결과적으로 수득된, HA, PEGDE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다. 그 후, PEGDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) 비교예를 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 히드로겔의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 하기 표에 표시된 바와 같이, PEGDE 가교된 히알루론산(히드로겔) 비교예 중 1 내지 50 mg/mL의 HA 농도에 도달하게 했다(PEGDE 비교예 1-5).
PEGDE 가교된 히알루론산(히드로겔) 비교예를 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. 상기 히드로겔을 선택적으로 진공 하에 30℃에서 탈수시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
PEGDE 가교된 히알루론산 비교예의 규명
22.0 mg/mL의 히알루론산 농도를 갖는, 상용 PEGDE로부터 수득된 본 발명의 범위에서 벗어나는 PEGDE 가교된 히알루론산 비교예의 기계적 특성이 표 6에 개시된다.
Figure pct00039
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 GDE 가교된 HA 중 HA의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 PEGDE 가교된 HA 중 본 발명의 PEGDE의 농도.
2.1.3. 분석
2.1.3.1. 생존력 분석(Viability Assay)
MTT 분석을 이용하여 증식된 3T3 마우스 섬유모세포의 생존력을 평가하였다.
하기를 이용하여 MTT 분석을 수행했다:
BDDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) 비교예 (BDDE-HA 비교예 3),
PEGDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) 비교예 (PEGDE-HA 비교예 3),
본 발명의 PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔) (PPE-HA 실시예 3),
BDDE,
PEGDE, 및
PPE (본 발명의 PPE 실시예 22).
a) 테스트된 히드로겔과 직접적인 접촉 하에 배양된 세포의 MTT 분석.
각각의 테스트 시료 100 mg과 직접적인 접촉 하에 배양된 세포에 대해 MTT 분석을 수행했다. 이 MTT 분석은 대조군(배양 배지로 나타냄) 대비 3종의 테스트된 히드로겔 간에 세포 생존력의 차이를 보여주고, 이는 독성 또는 낮은 생체적합성 조직보다는 주로 히드로겔의 존재에 따른 적은 이용가능 공간에서 기인된다. 구체적으로, 본 발명의 PPE 가교된 히알루론산의 존재시 세포 생존력은 대조군 및 BDDE 및 PEGDE에 의해 가교된 히알루론산 비교예에 비해 훨씬 더 높다.
b) 히드로겔의 추출물에서 배양된 세포에 대한 MTT 분석
테스트(tested) 가교된 히드로겔의 24시간 동안 배양 배지 중 침지에 의해 수득된 테스트 히드로겔의 추출물의 존재 하에 배양된 세포에 대해 MTT 분석을 수행했다.
테스트 히드로겔의 추출물의 존재 하에 배양된 세포에 대해 수행된, MTT 분석은 히드로겔와 대조군 간에 세포 증식력에 차이가 없다는 것을 보여주고, 이는 3종의 테스트 히드로겔 모두가 배양 배지에 24시간 동안 잠겼을 때, 배지에 독성 물질을 방출하지 않았다는 것을 의미한다. 이는 가교 제조 동안, 모든 미반응 원료 및 부산물이 효율적으로 제거된, 우수하고 제어된 제조 공정에서 기인한다.
c) 가교제와의 직접적 접촉 하에 배양된 세포에 대한 MTT 분석
가교제 용액을 포함하는 용액과의 직접적인 접촉 하에 배양된 세포에 대해 MTT 분석을 수행했다. 다당류의 첨가를 제외한, 화학 반응, 세척, 및 멸균과 같은 히드로겔의 제조 방법의 동일한 단계들을 따른 후, 상기 용액은 동일한 에폭시 당량을 포함한다.
MTT 분석은 PPE와 직접적인 접촉 하에 배양된 세포의 생존력이 대조군(NaCl 0.9% 중 배양 배지) 대비 유의성있게 다르지 않다는 것을 보여준다. 현미경 이미지는 PPE와 직접 접촉한 세포들이, 세포 생존력의 유의한 감소 및 악화(suffering)의 징후를 보인 BDDE 및 PEGDE와 직접 접촉 하에 배양된 세포들에 비해 우수한 형태 및 생존력을 갖는다는 것을 보여준다.
2.1.3.2. 효소 분해 분석(Enzymatic degradation assay)
하기를 대상으로 효소 분해율의 평가를 수행했다:
비교 BDDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) BDDE-HA 비교예 3,
비교 PEGDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) PEGDE-HA 비교예 3,
비교 GDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) GDE-HA 비교예 3, 및
본 발명의 PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔) PPE-HA 실시예 4, PPE-HA 실시예 5 및 PPE-HA 실시예 6.
0.2 mL의 각각의 테스트 가교된 히알루론산 (히드로겔)을 소 테스트(bovine test)로부터의 0.1mg/mL의 히알루로니다아제(타입 IV-S; 1040 units/mg solid) 10 ㎕로 처리했다. 테스트 히드로겔을 37℃에서 PBS 중에 16시간 동안 인큐베이션하고, 분해된 히알루로산으로부터의 우론산을 카르바졸(carbazole) 분석을 이용하여 평가했다. 22 mg/mL의 테스트 가교된 히알루론산 히드로겔은 히알루로니다아제에 반응하여 효소 분해로부터 74.4% (대조군인 BDDE 가교된 히알루론산) 내지 26.3%의 유리 우론산의 분해율을 보였다.
비교 BDDE 히드로겔 (BDDE-HA 비교예 3), 비교 PEGDE 히드로겔 (PEGDE-HA 비교예 3) 및 비교 GDE 히드로겔 (GDE-HA 비교예 3) 가교된 히알루론산은 유사한 가교도, 및 따라서, 효소 분해 후에 각각 74.4, 70.8, 및 69.5 %의 유사한 양의 유리 우론산을 보였다.
본 발명의 PPE 히드로겔 (PPE-HA 실시예 4 및 실시예 5)은 가교도의 감소를 보였고, 따라서, 효소 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, 효소 분해 후 유리 우론산의 양이 각각 56.7% 및 26.3%로 감소되어, 효소 분해 저항성의 통계적 유의성 증가를 나타냈다.
PPE 가교된 HA, PPE-HA 실시예 6은, PPE-HA 실시예 4로부터의 PPE 가교된 HA로부터 유래된 유리 우론산과 유사하게 효소 분해 후에 58.0%의 유리 우론산의 양을 보여서, 2종의 히드로겔이 2개의 상이한 C.D.를 가져도, 특히, PPE-HA 실시예 6으로부터의 C.D.가 PPE-HA 실시예 4로부터의 C.D.보다 훨씬 낮은 경우에도(각각 0.2688 및 0.1528%), 효소 분해 저항성이 유사하다(각각 56.7 및 58.0%)는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 PPE의 보호 효과는 GDE, BDDE 및 PEGDE 비교예보다 효소 분해에 대해 훨씬 더 높다. 특히, 고분자량 (즉, 3000 Da 내지 15000 Da)을 갖는 PPE의 보호 효과는, 저분자량 PPE가 더 우수한 기계적 특성을 부여함에도 불구하고, 효소 분해에 대해 저분자량(즉, 750 Da 내지 3000 Da 미만)을 갖는 PPE의 보호 효과보다 더 높다. 실험 51 히드로겔로부터의 22 mg/mL HA는 히알루로니다아제에 의한 인 비트로 효소 분해에 대해 나머지들 보다 더 높은 저항성을 보였다.
BDDE, PEGDE, GDE에 의해 가교된 히알루론산 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 히알루론산의 효소 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00040
(a) C.D.=0.2745; G'= 274.17±9.54 및 DN=27.62±0.23
(b) C.D.=0.1358; G'=85.56±2.94 및 DN=34.92±0.19
(c) C.D.=0.1127; G'=54.09±4.07 및 DN=37.17±0.33
따라서, 전술된 결과에서 표시된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 보호 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 효소 분해 저항성(즉, 상대적 효소 분해율의 더 낮은 퍼센트)을 갖는다. 특히, (상용 GDE, BDDE 및 PEGDE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 범위를 벗어나는 가교된 다당류의 비교예와 유사한 물리적 특성(G'의 값에 의해 및 결과적으로 DN 및 C.D.의 값에 의해 수치적으로 표현됨)을 갖는, (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류는 더 우수한 효소 저항성 (즉, 더 낮은 효소 분해율)을 갖는다는 것이 입증된다.
또한, 전술된 결과는 (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 적은 양의 가교제에 의해 더 높은 효소 저항성을 갖는다는 것을 보여주고, 이는 비교예의 가교된 다당류와 동일한 분해 속도를 가지나, G', DN 및 C.D.의 더 낮은 값을 갖는 것으로 수치적으로 표현된다. 사용된 가교제의 더 낮은 양에 의한 다당류의 더 낮은 화학적 변형은 피부에서 주사 후에 그의 생체적합성 및 안전성을 개선하기 때문에, 이는 유리하다.
2.1.3.3. 산화 분해 분석(Oxidative degradation Assay)
시료:
하기를 대상으로 산화 분해율의 평가를 수행했다:
비교 BDDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) BDDE-HA 비교예 3,
비교 PEGDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) PEGDE-HA 비교예 3,
비교 GDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) GDE-HA 비교예 3, 및
본 발명의 PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔) PPE-HA 실시예 4, PPE-HA 실시예 5 및 PPE-HA 실시예 6.
방법:
산화 분해에 대한 저항성을 당해 기술 분야에서 개시된 방법에 따라 평가했다 (Bitter, T. and H.M. Muir, "A modified uronic acid carbazole reaction. Analytical Biochemistry", 1962, vol. 4(4), pp. 330-334 참조):
0.2 mL의 각각의 테스트 가교된 히알루론산을 펜톤 시약(Fenton's reagent)(5 mL의 PBS 중 10 ㎕의 0.1M Fe+2/H2O2 및 25 ㎕의 0,1M 아스코르브산)으로 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 분해된 히알루로산으로부터의 우론산을 카르바졸 분석을 이용하여 평가했다. 22 mg/mL의 테스트된 가교된 히알루론산은 산화적 분해로부터 88.0% (PEGDE 가교된 히알루론산) 내지 61.6%의 유리 우론산의 분해율을 보였다.
비교 BDDE 가교된 히알루론산 (BDDE-HA 비교예 3), 비교 PEGDE 가교된 히알루론산 (PEGDE-HA 비교예 3) 및 비교 GDE 가교된 히알루론산 (GDE-HA 비교예 3)은 유사한 가교도, 및 따라서, 산화 분해 후에 각각 81.2, 88.0 및 80.2 %의 유사한 양의 유리 우론산을 보였고, PEGDE 가교된 히알루론산이 산화 분해에 가장 민감했다.
본 발명의 PPE 가교된 히알루론산 (PPE-HA 실시예 4 및 실시예 5)은 가교도의 감소를 보였고, 따라서, 산화 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, 산화 분해 후 유리 우론산의 양이 각각 65.9 및 61.6%로 감소되어, 산화 분해 저항성의 통계적 유의성 증가를 나타냈다. PPE-HA 실시예 6으로부터의 본 발명의 PPE 가교된 HA는 산화 분해 후에 PPE-HA 실시예 4 및 PPE-HA 실시예 5로부터의 PPE 가교된 HA로부터 유래된 유리 우론산보다 약간 더 높은 69.6%의 유리 우론산의 양을 보였으나, 실험 3, 8, 및 13보다 통계적 유의성은 더 낮아서, 본 발명의 PPE 가교된 히알루론산의 산화 분해 저항성이 본 발명의 범위에 속하지 않는 비교 BDDE, PEGDE, 및 GDE 가교된 다당류보다 더 높다는 것을 나타낸다.
결과:
BDDE, PEGDE, GDE에 의해 가교된 비교예 히알루론산과 본 발명의 PPE에 의해 가교된 히알루론산의 산화 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00041
(a) C.D.=0.2745; G'= 274.17±9.54; 및 DN=27.62±0.23
(b) C.D.=0.1358; G'=85.56±2.94; 및 DN=34.92±0.19
(c) C.D.=0.1127; G'=54.09±4.07; 및 DN=37.17±0.33
따라서, 전술된 결과에서 표시되고, 효소 분해율에 대해 전술된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 산화 분해 저항성(상대적 산화 분해율의 더 낮은 퍼센트를 의미함)을 갖는다.
또한, 전술된 결과는 (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 적은 양의 가교제에 의해 더 높은 산화 분해 저항성을 갖는다는 것을 보여준다. 사용된 가교제의 더 낮은 양에 의한 다당류의 더 낮은 화학적 변형은 피부에서 주사 후에 그의 생체적합성 및 안전성을 개선하기 때문에, 이는 유리하다.
2.2. 가교된 아밀로오스 전분
2.2.1. 본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분 (PPE-AS)
하기에 기재된 PPE-AS는 1,3-GDE의 출처로서 Nagase로부터 상업적으로 입수가능한 Denacol® EX-313을 이용하여 제조된다. 그럼에도 불구하고, 이 방법들은 또한 Denacol® EX-313 대신 Merck로부터 상업적으로 입수가능한 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르, 또는 1,3-DGE를 포함하는 혼합물인 상표 Denacol® EX-314를 갖는 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 이용하여 수행될 수 있다.
제조 방법
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A). 1,3-GDE 를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C1). 그 후, 용액 C1을 1 내지 30일 동안 10 내지 40℃ 범위의 제어된 온도에서, 또는 대안적으로, 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했고, 그 동안 1,3-GDE의 자기-중합이 일어나서, 표 1에 개시된 분자량 및/또는 비 에폭시 함량(specific expoxy content)을 갖는 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르가 생성된다 (용액 C3).
고함량 아밀로오스 전분을 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 고함량 아밀로오스 전분을 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B). 그 후, 용액 C3을 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중에 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 고함량 아밀로오스 전분과 PPE의 비를 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 결과적으로 수득된, 고함량 아밀로오스 전분, PPE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다.
그 후, PPE 가교된 고함량 아밀로오스 전분 (히드로겔)을 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 히드로겔의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 하기 표에 표시된 바와 같이, PPE-가교된 아밀로오스 전분 (히드로겔) 중 1 내지 50 mg/mL의 고함량 아밀로오스 전분 농도에 도달하게 했다(PPE-AS 실시예 1-3).
PPE 가교된 아밀로오스 전분 히드로겔을 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. PPE 가교된 아밀로오스 전분 히드로겔을 선택적으로 동결건조에 의해 탈수시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
2.2.2. GDE 가교된 아밀로오스 전분 비교예 (GDE-AS 비교예)
섹션 2.1.2.1에서 비교 1,3-GDE 가교된 히알루론산에 대해 개시된 바와 같은 방법에 따라, 그러나, 히알루론산 대신에 아밀로오스 전분을 사용하여 GDE 가교된 아밀로오스 전분 비교예를 제조했다.
2.2.3. 가교된 아밀로오스 전분의 규명
수득된 본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분 (PPE-AS) 및 비교 GDE 가교된 아밀로오스 전분 (GDE-AS 비교예)의 기계적 특성이 하기 표에 개시된다.
Figure pct00042
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 가교된 히드로겔 중 아밀로오스의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 가교된 아밀로오스 중 본 발명의 가교제의 농도.
2.2.4 분석
2.2.4.1 효소 분해 분석
시료:
하기를 대상으로 효소 분해율의 평가를 수행했다:
비교 BDDE 가교된 아밀로오스 전분(히드로겔) GDE-AS 비교예 1, 및
본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분(히드로겔) PPE-AS 실시예 1, PPE-AS 실시예 2 및 PPE-AS 실시예 3.
방법:
0.2 mL의 각각의 테스트 가교된 아밀로오스 전분 (히드로겔)을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus Licheniformis)로부터의 0.1mg/mL의 α-아밀라아제(동결건조 분말, 500-1,500 units/mg 단백질) 10 ㎕로 처리했다. 테스트 히드로겔을 37℃에서 PBS 중에 16시간 동안 인큐베이션하고, 분해된 아밀로오스 전분 히드로겔로부터의 헥소오스 단량체를 카르바졸 분석을 이용하여 평가했다. 22 mg/mL의 테스트 가교된 아밀로오스 전분 히드로겔은 α-아밀라아제에 반응하여 80.3% 내지 41.7%의 상대적 효소 분해율을 보였다.
결과:
비교 GDE 가교된 아밀로오스 전분 (GDE-AS 비교예 1)과 본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분(PPE-AS 실시예 1)은 유사한 가교도를 보이고, 본 발명의 PPE 히드로겔(PPE-AS 실시예 2 및 PPE-AS 실시예 3)은 가교도의 감소를 보여서, 효소 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, 효소 분해 후에 유리 헥소오스 단량체의 양은 각각 41.7% 및 80.0%로 감소되어, 효소 분해 저항성의 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다.
PPE 가교된 HA, PPE-AS 실시예 3은, PPE-AS 실시예 1로부터의 PPE 가교된 전분으로부터 유래된 유리 헥소오스의 양과 유사한, 효소 분해 후 유리 헥소오스의 양을 보여서, 2종의 히드로겔이 2개의 상이한 가교도를 가져도, 특히, PPE-AS 실시예 3으로부터의 C.D.가 PPE-AS 실시예 1로부터의 C.D.보다 훨씬 낮은 경우에도(각각 0.1548 및 0.1981%), 효소 분해 저항성이 유사하다(각각 80.0% 및 80.3%)는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 PPE의 보호 효과는 GDE 비교예보다 효소 분해에 대해 훨씬 더 높다. 특히, 고분자량 (즉, 3000 Da 내지 15000 Da)을 갖는 PPE의 보호 효과는, 저분자량 PPE가 더 우수한 기계적 특성을 부여함에도 불구하고, 효소 분해에 대해 저분자량(즉, 750 Da 내지 3000 Da 미만)을 갖는 PPE의 보호 효과보다 더 높다. PPE-AS 실시예 2로부터의 22 mg/mL AS는 히알루로니다아제에 의한 인 비트로 효소 분해에 대해 나머지들 보다 더 높은 저항성을 보였다.
GDE에 의해 가교된 아밀로오스 전분 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 아밀로오스 전분의 효소 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00043
따라서, 전술된 결과에서 표시된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 효소 분해 저항성(즉, 상대적 효소 분해율의 더 낮은 퍼센트)을 갖는다. 특히, (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류는 더 우수한 효소 저항성 (즉, 더 낮은 효소 분해율)을 갖는다는 것이 입증된다. 또한, 전술된 결과는 (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 적은 양의 가교제에 의해 더 높은 효소 저항성을 갖는다는 것을 보여준다.
2.2.4.2 산화 분해 분석
시료:
하기를 대상으로 산화 분해율의 평가를 수행했다:
비교 GDE 가교된 아밀로오스 전분(히드로겔) GDE-AS 비교예 1, 및
본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분(히드로겔) PPE-AS 실시예 1, PPE-AS 실시예 2 및 PPE-AS 실시예 3.
방법:
산화 분해에 대한 저항성을 당해 기술 분야에서 개시된 방법에 따라 평가했다 (Bitter, T. and H.M. Muir, "A modified uronic acid carbazole reaction. Analytical Biochemistry", 1962, vol. 4(4), pp. 330-334 참조):
0.2 mL의 각각의 테스트 가교된 아밀로오스 전분을 펜톤 시약(5 mL의 PBS 중 10 ㎕의 0.1M Fe+2/H2O2 및 25 ㎕의 0,1M 아스코르브산)으로 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 분해된 아밀로오스 전분 히드로겔로부터의 유리 헥소오스 단량체를 카르바졸 분석을 이용하여 평가했다. 22 mg/mL의 테스트 가교된 아밀로오스 전분은 산화에 반응하여 83.8% 내지 77.4%의 분해율을 보였다.
결과:
비교 GDE 가교된 아밀로오스 전분 (GDE-AS 비교예 1)과 본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분(PPE-AS 실시예 1)은 유사한 가교도를 보이고, 본 발명의 PPE 가교된 아밀로오스 전분(PPE-AS 실시예 2 및 PPE-AS 실시예 3)은 가교도의 감소를 보여서, 산화 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, 산화 분해 후에 유리 헥소오스 단량체의 양은 PPE-AS 실시예 1, PPE-AS 실시예 2, 및 PPE-AS 실시예 3에 대해 각각 83.8, 77.4 및 81.0으로 감소되어, 산소 분해 저항성의 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다.
따라서, 전술된 결과에서 표시되고, 산화 분해율에 대해 전술된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 산화 분해 저항성(상대적 산화 분해율의 더 낮은 퍼센트를 의미함)을 갖는다.
GDE에 가교된 아밀로오스 전분 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 아밀로오스 전분의 산화 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00044
따라서, 전술된 결과에서 표시되고, 효소 분해율에 대해 전술된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 보호 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 산화 분해 저항성(상대적 산화 분해율의 더 낮은 퍼센트를 의미함)을 갖는다. 또한, 전술된 결과는 (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 적은 양의 가교제에 의해 더 높은 산화 분해 저항성을 갖는다는 것을 보여준다.
2.3. 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐
2.3.1. 본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (PPE-ASG)
하기에 기재된 PPE-ASG는 1,3-GDE의 출처로서 Nagase로부터 상업적으로 입수가능한 Denacol® EX-313을 이용하여 제조된다. 그럼에도 불구하고, 이 방법들은 또한 Denacol® EX-313 대신 Merck로부터 상업적으로 입수가능한 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르, 또는 1,3-DGE를 포함하는 혼합물인 상표 Denacol® EX-314를 갖는 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 이용하여 수행될 수 있다.
제조 방법
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A). GDE 를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-GDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C1). 그 후, 용액 C1을 1 내지 30일 동안 10 내지 40℃ 범위의 제어된 온도에서, 또는 대안적으로, 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했고, 그 동안 1,3-GDE의 자기-중합이 일어나서, 표 1에 개시된 분자량 및/또는 비 에폭시 함량을 갖는 본 발명의 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르가 생성된다 (용액 C3).
고함량 아밀로펙틴 전분/글리코겐을 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 고함량 아밀로펙틴 전분/글리코겐을 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B). 그 후, 용액 C3를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중에 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 아밀로펙틴 전분/글리코겐과 PPE의 비를 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 결과적으로 수득된, 고함량 아밀로펙틴 전분/글리코겐, PPE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다.
그 후, 본 발명의 PPE 가교된 고함량 아밀로펙틴 전분 (히드로겔)(PPE-ASG 실시예 1-3)을 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 히드로겔의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 하기 표에 표시된 바와 같이, 1 내지 50 mg/mL의 PPE로 가교된 고함량 아밀로펙틴 전분/글리코겐 농도에 도달하게 했다(PPE-ASG 실시예 1-3).
PPE로 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐을 시린지에 충전시키고, EN ISO 17665-1에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. PPE로 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (히드로겔)을 선택적으로 환기 오븐(ventilated oven)에서 50℃에서 탈수시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
2.3.2. GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 비교예 (GDE-ASG 비교예)
섹션 2.1.2.1에서 비교 GDE 가교된 히알루론산에 대해 개시된 바와 같은 방법에 따라, 그러나, 히알루론산 대신에 아밀로펙틴 전분/글리코겐을 사용하여 GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 비교예 (GDE-ASG 비교예)를 제조했다.
2.3.3. 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐의 규명
22.0 mg/mL의 농도를 갖는, 수득된 본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (PPE-ASG) 및 비교 GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (GDE-ASG 비교예)의 기계적 특성이 하기 표에 개시된다.
Figure pct00045
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 가교된 히드로겔 중 아밀로펙틴 전분/글리코겐의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 중 가교제의 농도.
2.3.4 분석
2.3.4.1 효소 분해 분석
시료:
하기를 대상으로 효소 분해율의 평가를 수행했다:
비교 GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (히드로겔) GDE-ASG 비교예 1, 및
본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (히드로겔) PPE-ASG 실시예 1, PPE-ASG 실시예 2 및 PPE-ASG 실시예 3.
방법:
전술된 섹션 2.2.4.1 효소 분해 분석에서 개시된 방법에 따라 효소 분해에 대한 저항성을 평가했다.
결과:
본 발명의 PPE 히드로겔 (PPE ASG 실시예 2 및 PPE-ASG 실시예 3)은 가교도의 감소를 보여서, 따라서, 효소 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예기치 않게 및 반직관적으로, 효소 분해 후 유리 헥소오스 단량체의 양은 각각 76.0% 및 89.4%까지 감소되어, 통계적으로 유의한 효소 분해 저항성 증가를 나타냈다.
비교 GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (GDE-ASG 비교예 1)과 본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (PPE-ASG 실시예 1)은 유사한 가교도를 보이고, 본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (PPE-ASG 실시예 2 및 PPE-ASG 실시예 3)은 가교도의 감소를 보여서, 산화 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, PPE 가교된 HA PPE-ASG 실시예 3은 효소 분해 후에 PPE-ASG 실시예 1로부터의 PPE 가교된 전분으로부터 유래된 유리 헥소오스 단량체의 양과 유사한 유리 헥소오스 단량체의 양을 보여서, 2종의 히드로겔이 2개의 상이한 가교도를 가져도, 특히, PPE-ASG 실시예 3으로부터의 C.D.가 PPE-ASG 실시예 1로부터의 C.D.보다 훨씬 낮은 경우에도(각각 0.1241 및 0.1708%), 효소 분해 저항성이 유사하다(각각 89.4% 및 85.7%)는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 PPE의 보호 효과는 GDE 비교예보다 효소 분해에 대해 훨씬 더 높다. 특히, 고분자량 (즉, 3000 Da 내지 15000 Da)을 갖는 PPE의 보호 효과는, 저분자량 PPE가 더 우수한 기계적 특성을 부여함에도 불구하고, 효소 분해에 대해 저분자량(즉, 750 Da 내지 3000 Da 미만)을 갖는 PPE의 보호 효과보다 더 높다. PPE-AS 실시예 2로부터의 22 mg/mL AS는 히알루로니다아제에 의한 인 비트로 효소 분해에 대해 나머지들보다 더 높은 저항성을 보였다.
GDE에 의해 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐의 효소 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00046
따라서, 전술된 결과에서 표시된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 보호 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 효소 분해 저항성(즉, 상대적 효소 분해율의 더 낮은 퍼센트)을 갖는다. 특히, (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 높은 효소 분해 저항성(즉, 더 낮은 효소 분해율)을 갖는다는 것이 입증된다. 또한, 전술된 결과는 (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 적은 양의 가교제에 의해 더 높은 효소 저항성을 갖는다는 것을 보여준다.
2.3.4.2 산화 분해 분석
시료:
하기를 대상으로 산화 분해율의 평가를 수행했다:
비교 GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (히드로겔) GDE-ASG 비교예 1, 및
본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (히드로겔) PPE-ASG 실시예 1, PPE-ASG 실시예 2 및 PPE-ASG 실시예 3.
방법:
전술된 섹션 2.2.4.2 산화 분해 분석에서 개시된 방법에 따라 산화 분해에 대한 저항성을 평가했다.
결과:
비교 GDE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (GDE-ASG 비교예 1)과 본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (PPE-ASG 실시예 1)은 유사한 가교도를 보이고, 본 발명의 PPE 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 (PPE-ASG 실시예 2 및 PPE-ASG 실시예 3)은 가교도의 감소를 보여서, 산화 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, PPE-ASG 실시예 1, PPE-ASG 실시예 2 및 PPE-ASG 실시예 3에 대해 산화 분해 후 유리 헥소오스 단량체의 양이 81.2, 74.5 및 87.0으로 감소되어, 통계적으로 유의한 산화 분해 저항성의 증가를 나타냈다.
따라서, 전술된 결과에서 표시되고, 산화 분해율에 대해 전술된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 보호 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 산화 분해 저항성(즉, 상대적 산화 분해율의 더 낮은 퍼센트를 의미함)을 갖는다.
GDE에 의해 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 아밀로펙틴 전분/글리코겐의 산화 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00047
따라서, 전술된 결과에서 표시되고, 효소 분해율에 대해 전술된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 보호 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 산화 분해 저항성(상대적 산화 분해율의 더 낮은 퍼센트를 의미함)을 갖는다. 또한, 전술된 결과는 (본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 수득된) 본 발명의 가교된 다당류가 더 적은 양의 가교제에 의해 더 높은 산화 분해 저항성을 갖는다는 것을 보여준다.
2.4. 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스
2.4.1. 본 발명의 PPE 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 (PPE-CMC)
하기에 기재된 PPE-CMC는 1,3-GDE의 출처로서 Nagase로부터 상업적으로 입수가능한 Denacol® EX-313을 이용하여 제조된다. 그럼에도 불구하고, 이 방법들은 또한 Denacol® EX-313 대신 Merck로부터 상업적으로 입수가능한 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르, 또는 1,3-DGE를 포함하는 혼합물인 상표 Denacol® EX-314를 갖는 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 이용하여 수행될 수 있다.
제조 방법
소듐 히드록시드 펠렛 (NaOH)을 물에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 4 퍼센트의 NaOH (1M)를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 A). 1,3-GDE를 실온에서 용액 A의 분량에 용해시켜서 용액 총 중량에 대해 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 GDE를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 C1). 그 후, 용액 C1을 1 내지 30일 동안 10 내지 40℃ 범위의 제어된 온도에서, 또는 대안적으로, 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했고, 그 동안 1,3-GDE의 자기-중합이 일어나서, 표 1에 개시된 분자량 및/또는 비 에폭시 함량을 갖는 본 발명의 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르가 생성된다 (용액 C3).
소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 (NaCMC)를 실온(25℃)에서 용액 A의 분량에 서서히 용해시켜 용액 총 중량에 대해 중량 기준 5 내지 15 퍼센트의 수화된 NaCMC를 포함하는 알칼리 용액을 제조했다 (용액 B). 그 후, 용액 C3를 용액 B에 첨가하여 최종 용액 중에 0.25 내지 0.75M 범위의 히드록시드 농도 및 NaCMC와 PPE의 비를 갖는 알칼리 용액을 제공한다. 결과적으로 수득된, NaCMC, PPE 및 NaOH로 구성된 알칼리 용액을 실온에서 완전히 혼합한다. 수득된 균질한 용액을 1 내지 48시간 동안 20 내지 50℃ 범위의 제어된 온도에서 반응하도록 방치했다. 그 후, 본 발명의 PPE 가교된 NaCMC (히드로겔)(PPE-CMC)를 48 내지 120시간 동안 산성 수용액(1M 염산 및 PBS)으로 세척하여 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 알칼리 촉매를 중화시키고, 이온 교환에 의해 히드로겔의 pH를 6.5-7.4로 복귀시키고, 하기 표에 표시된 바와 같이, 본 발명의 PPE-가교된 NaCMC (히드로겔) 중 1 내지 50 mg/mL의 NaCMC 농도에 도달하게 했다(PPE-CMC).
본 발명의 PPE 가교된 NaCMC(히드로겔)를 주사기에 충전시키고, EN ISO 17665-1에서 보고된 약전에서 허용된 절차 (예를 들면, 121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에서 증기 멸균시켰다. 상기 히드로겔을 선택적으로 동결건조에 의해 탈수시키고 후속 사용이나 분석을 위해 보관할 수 있다.
2.4.2. GDE 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 비교예 (GDE-CMC 비교예)
섹션 2.1.2.1에서 GDE 가교된 히알루론산에 대해 개시된 바와 같은 방법에 따라, 그러나, 히알루론산 대신에 NaCMC를 사용하여 GDE 가교된 NaCMC 비교예를 제조했다.
2.4.3. 가교된 NaCMC의 특성 규명
22.0 mg/mL의 농도를 갖는, 앞서 수득된 본 발명의 PPE 가교된 NaCMC (PPE-NaCMC 실시예 1-3) 및 비교 GDE 가교된 NaCMC (GDE 비교예)의 기계적 특성이 하기 표에 개시된다:
Figure pct00048
(a) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 가교된 히드로겔 중 NaCMC의 농도.
(b) 총 중량 대비 중량 기준 퍼센트로 표현된 가교된 NaCMC 중 본 발명의 가교제의 농도.
2.4.4 분석
2.4.4.1 효소 분해 분석
시료
하기를 대상으로 효소 분해율의 평가를 수행했다:
비교 GDE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (히드로겔) GDE-CMC 비교예 1, 및
본 발명의 PPE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (히드로겔) PPE-CMC 실시예 1, PPE-CMC 실시예 2 및 PPE-CMC 실시예 3.
방법:
0.2 mL의 각각의 테스트되는 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (히드로겔)을 아스퍼길러스 니게르(Aspergillus Niger)로부터의 0.1mg/mL의 펙티나아제(Pectinase)로 처리했다. 테스트된 히드로겔을 37℃에서 PBS 중에 16시간 동안 인큐베이션하고, 분해된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 히드로겔로부터의 헥소오스 단량체를 카르바졸 분석을 이용하여 평가했다.
결과:
비교 GDE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (GDE-CMC 비교예 1)와 본 발명의 PPE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (PPE-CMC 실시예 1)는 유사한 가교도를 보인다. 본 발명의 PPE 히드로겔 (PPE-CMC 실시예 2 및 PPE-CMC 실시예 3)은 가교도의 감소를 보이고, 따라서, 효소 분해 저항성의 감소가 예상되어야 하나, 예상치 않게 및 반직관적으로, 효소 분해 후 유리 헥소오스 단량체의 양이 PPE-CMC 실시예 2 및 PPE-CMC 실시예 3에 대해 각각 64.6% 및 85.4%로 감소되어, 통계적으로 유의한 효소 분해 저항성 증가를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 PPE의 보호 효과는 GDE 비교예보다 효소 분해에 대해 훨씬 더 높다. 특히, 고분자량 (즉, 3000 Da 내지 15000 Da)을 갖는 PPE의 보호 효과는, 저분자량 PPE가 더 우수한 기계적 특성을 부여함에도 불구하고, 효소 분해에 대해 저분자량(즉, 750 Da 내지 3000 Da 미만)을 갖는 PPE의 보호 효과보다 더 높다. PPE-AS 실시예 2로부터의 22 mg/mL AS는 히알루로니다아제에 의한 인 비트로 효소 분해에 대해 나머지들 보다 더 높은 저항성을 보였다.
GDE에 의해 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스의 효소 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00049
따라서, 본 발명의 PPE의 보호 효과는 GDE 비교예보다 효소 분해에 대해 훨씬 더 높다. 특히, 고분자량 (즉, 3000 Da 내지 15000 Da)을 갖는 PPE의 보호 효과는, 저분자량 PPE가 더 우수한 기계적 특성을 부여함에도 불구하고, 효소 분해에 대해 저분자량(즉, 750 Da 내지 3000 Da 미만)을 갖는 PPE의 보호 효과보다 더 높다.
2.4.4.2 산화 분해 분석
시료:
하기를 대상으로 산화 분해율의 평가를 수행했다:
비교 GDE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 GDE-CMC 비교예 1, 및
본 발명의 PPE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 PPE-CMC 실시예 1, PPE-CMC 실시예 2 및 PPE-CMC 실시예 3.
방법:
전술된 섹션 2.2.4.2 산화 분해 분석에서 개시된 방법에 따라 산화 분해에 대한 저항성을 평가했다.
결과:
비교 GDE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (GDE-CMC 비교예 1)과 본 발명의 PPE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (PPE-CMC 실시예 1)는 유사한 가교도를 보이고, 본 발명의 PPE 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (PPE-CMC 실시예 2 및 PPE-CMC 실시예 3)는 가교도의 감소를 보여서, 산화 분해 저항성의 감소가 예상되나, 예상치 않게 및 반직관적으로, PPE-CMC 실시예 1, PPE-CMC 실시예 2 및 PPE-CMC 실시예 3에 대해 산화 분해 후 유리 헥소오스 단량체의 양이 92.6, 83.7 및 82.5로 감소되어, 통계적으로 유의한 산화 분해 저항성의 증가를 나타냈다.
따라서, 전술된 결과에서 표시되고, 산화 분해율에 대해 전술된 바와 같이, 본 발명의 고분지 PPE를 가교제로 이용하여 제조된 본 발명의 가교된 다당류는 전술된 비교예의 가교제를 이용하여 제조되나, 유사한 물리적 특성을 갖는, 본 발명의 보호 범위에서 벗어나는 가교된 다당류보다 더 우수한 산화 분해 저항성(상대적 산화 분해율의 더 낮은 퍼센트를 의미함)을 갖는다.
GDE에 의해 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 비교예와 본 발명의 PPE에 의해 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스의 산화 분해 분석의 결과가 하기 표에 요약된다:
Figure pct00050
3. 본 발명의 PPE 가교된 다당류의 사전충전형 주사기의 바늘을 통한 주입력(injection force)의 결정
이 테스트는 바늘을 통한 주입력을 결정할 수 있게 한다. 특히, 피크 주입력(peak injection force)은 정지 마찰(static friction)을 극복하기 위해 화합물 또는 조성물에 의해 요구되는 힘을 의미한다. 가교된 다당류와 관련하여, 이 값은 그의 균질성(homogeneity), 주사기의 품질, 및 그의 배럴 윤활(barrel lubrication)에 의존적이다. 따라서, 주입력의 더 낮은 값은 주입 속도를 증가시키지 않으면서 더 낮은 통증 인지를 제공한다.
테스트 시료:
비교 BDDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) BDDE-HA 비교예 5,
비교 PEGDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) PEGDE-HA 비교예 5,
비교 GDE 가교된 히알루론산 (히드로겔) GDE-HA 비교예 5, 및
본 발명의 PPE 가교된 히알루론산 (히드로겔) PPE-HA 실시예 10, PPE-HA 실시예 11 및 PPE-HA 실시예 12.
바늘을 통한 주입의 효과를 주사 시료에 대해 테스트를 수행하는 것에 의해 평가했다. 게이지 길이 27G 및 30G, 및 일반적인 정확한 바늘의 선택은 히드로겔의 물리화학적 및 기계적 특성에 의해 영향을 받는다. 주입력은 1mL 주사기를 사용하여, 10 mm/min (0.2 mL/min)의 속도로 50 mm의 거리에 대해 27G 및 30G 니들을 통해 히드로겔을 주입하기 위해 필요한 힘 (N)으로 Texture Analyzer (Stable Micro Systems, TA. XT Plus)에서 측정했다.
표준 방법을 이용한, BDDE, PEGDE 및 GDE에 의해 가교된 비교 히알루론산 (히드로겔) 및 본 발명의 PPE에 의해 가교된 히알루론산 (히드로겔) (모든 가교제는 다당류에 첨가시 동일한 에폭시 당량을 가짐)의 27G 바늘을 통한 피크 주입력 및 평균 주입력의 비교가 하기 표에 개시된다:
Figure pct00051
전술된 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 가교된 다당류는 본 발명의 범위에 속하지 않는 비교 가교된 다당류(가교된 다당류 비교예)보다 더 낮은 값의 피크 주입력을 갖는다. 이는 주입 속도를 손상시키지(증가시키지) 않으면서, 본 발명의 가교된 다당류가 주사를 더 용이하게 하고, 통증 인식 및 피부 외상을 감소시키기 때문에 유리하다. 또한, 실시자를 위한 본 발명의 가교된 다당류의 편리함이 증가되므로 유리하다.
인용 목록
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완전성의 이유 때문에, 본 발명의 다양한 양태가 하기 번호가 부여된 항목에 기재된다:
항목 1. 하기 식 (I)의 화합물:
Figure pct00052
(I)
또는 대안적으로,
하기 식 (II)의 화합물로서:
Figure pct00053
식 중에서,
각 R1은 R2 및 R3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R2는
Figure pct00054
이고,
R3은
Figure pct00055
이며,
b는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이고;
c는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이며;
d는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이고;
액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 750 내지 15.000 Da의 분자량 (Mw)을 갖고; 및
HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 183 내지 7.000 g/eq의 에폭시 당량을 갖는 것인 화합물.
항목 2. 항목 1에 있어서,
상기 분자량 (Mw)은 액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 800 내지 7.000 Da이고; 및
상기 에폭시 당량은 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 195 내지 700 g/eq인 것인 화합물.
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서,
상기 분자량은 액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 900 내지 4500 Da이고; 및
상기 에폭시 당량은 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 200 내지 600 g/eq인 것인 화합물.
항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 1.8 이하의 다분산성 지수 (MW/Mn)를 갖는 것인 화합물.
항목 5. 하기 식 (III)의 가교된 다당류:
Figure pct00056
또는 대안적으로,
하기 식 (IV)의 가교된 다당류로서:
Figure pct00057
식 중에서,
각 R1은 R2 R3, R4 및 R5로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R2은
Figure pct00058
이고,
R3은
Figure pct00059
이며,
R4은
Figure pct00060
이고,
R5은
Figure pct00061
이며,
PS는 다당류이고; 및
상기 가교된 다당류는 0.077 내지 0.450%의 가교율을 갖는 것인 가교된 다당류.
항목 6. 항목 5에 있어서,
상대적 효소 분해율은 100% 내지 37.9 %이고; 및
상대적 산화 분해율은 100% 내지 76.8 %인 것인 가교된 다당류.
항목 7. 항목 5 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 다당류는 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 가교된 다당류.
항목 8. 항목 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 2개의 가교기 사이의 평균 거리(DN)는 27nm 내지 42nm인 것인 가교된 다당류.
항목 9. 항목 5 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 다당류의 농도는 1 내지 50 mg/ml인 것인 가교된 다당류.
항목 10. 항목 5 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 다당류를 항목 1 내지 4 중 어느 하나에서 정의된 식 (I)의 화합물, 식 (II)의 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 것인 가교된 다당류.
항목 11. 항목 10에 있어서, 상기 다당류를 식 (I)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고, 상기 식 (I)의 화합물은:
a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되거나;
또는 대안적으로,
상기 다당류를 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고, 상기 식 (II)의 화합물은:
c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되거나;
또는 대안적으로,
상기 다당류를 식 (I)의 화합물과 식 (II)의 화합물의 혼합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고,
상기 식 (I)의 화합물은:
a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되고; 및
상기 식 (II)의 화합물은:
c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 가교된 다당류.
항목 12. 항목 11에 있어서,
단계 a)에서, 상기 알칼리 용액은 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하고; 및
단계 c)에서, 상기 알칼리 용액은 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 것인 가교된 다당류.
항목 13. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에서 정의된 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물을 제조하는 방법으로서,
상기 화합물이 식 (I)의 화합물인 경우, 상기 방법은:
a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하거나;
또는 대안적으로,
상기 화합물이 식 (II)의 화합물인 경우, 상기 방법은:
c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
항목 14.
1종 이상의 항목 5 내지 12에 정의된 가교된 다당류, 및
1종 이상의 적합한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
항목 15. 항목 14에 있어서, 치료 유효량의 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 항목 5 내지 12에 정의된 가교된 다당류 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물인 것인 조성물.
항목 16. 항목 14에 따른 조성물의 용도로서, 미용 유효량의 1종 이상의 미용적으로 허용가능한 항목 5 내지 12 중 어느 하나에 정의된 가교된 다당류 및 1종 이상의 미용적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 스킨 케어제, 구체적으로, 피부 필러로 사용하기 위한 미용 조성물인 것인 용도.

Claims (18)

  1. 하기 식 (I)의 화합물:
    Figure pct00062

    (I)
    또는 대안적으로,
    하기 식 (II)의 화합물로서:
    Figure pct00063

    식 중에서,
    각 R1은 R2 및 R3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2는
    Figure pct00064
    이고,
    R3은
    Figure pct00065
    이며,
    b는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이고;
    c는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이며;
    d는 1 내지 70으로 구성된 군으로 선택된 정수이고;
    액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 750 내지 15.000 Da의 분자량 (Mw)을 갖고; 및
    HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정(ultrasonication-assisted rapid titration)에 의해 측정된 183 내지 7.000 g/eq의 에폭시 당량(epoxy equivalent weight)을 갖는 것인 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 분자량 (Mw)은 액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 800 내지 7.000 Da이고; 및
    상기 에폭시 당량은 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 195 내지 700 g/eq인 것인 화합물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 분자량은 액체 크로마토그래피에 의한 방법에 의해 측정된 900 내지 4500 Da이고; 및
    상기 에폭시 당량은 HCl에 의한 초음파-보조 신속 적정에 의해 측정된 200 내지 600 g/eq인 것인 화합물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 1.8 이하의 다분산성 지수(polydispersity index) (MW/Mn)를 갖는 것인 화합물.
  5. 하기 식 (III)의 가교된 다당류:
    Figure pct00066

    또는 대안적으로,
    하기 식 (IV)의 가교된 다당류로서:
    Figure pct00067

    식 중에서,
    각 R1은 R2 R3, R4 및 R5로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R2은
    Figure pct00068
    이고,
    R3은
    Figure pct00069
    이며,
    R4은
    Figure pct00070
    이고,
    R5은
    Figure pct00071
    이며,
    PS는 다당류이고; 및
    상기 가교된 다당류는 0.077 내지 0.450%의 가교율을 갖는 것인 가교된 다당류.
  6. 청구항 5에 있어서, PS는 다당류이고, 상기 가교된 다당류는 0.077 내지 0.269%의 가교율을 갖는 것인 가교된 다당류.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 R2의 양은 식 (III) 및 (IV)의 가교된 다당류의 총중량에 대해 2 ppm 미만인 것인 가교된 다당류.
  8. 청구항 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상대적 효소 분해율(relative enzymatic degradation rate)은 100% 내지 37.9 %이고; 및
    상대적 산화 분해율(relative oxidative degradation rate)은 100% 내지 76.8 %인 것인 가교된 다당류.
  9. 청구항 5 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다당류는 히알루론산, 전분 및 그의 유도체, 글리코겐, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 펙틴, 리그닌, 이눌린, 구아 검, 잔탄검, 알긴산 (알기네이트), 헤파린, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 글루쿠로난, 글루코만난, 갈락토만난, 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 히알루론산인 것인 가교된 다당류.
  10. 청구항 5 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 가교기 사이의 평균 거리 (DN)는 27nm 내지 42nm인 것인 가교된 다당류.
  11. 청구항 5 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다당류의 농도는 1 내지 50 mg/ml인 것인 가교된 다당류.
  12. 청구항 5 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다당류를 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에서 정의된 식 (I)의 화합물, 식 (II)의 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 것인 가교된 다당류.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 다당류를 식 (I)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고, 상기 식 (I)의 화합물은:
    a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되거나;
    또는 대안적으로,
    상기 다당류를 식 (II)의 화합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고, 상기 식 (II)의 화합물은:
    c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
    d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되거나;
    또는 대안적으로,
    상기 다당류를 식 (I)의 화합물과 식 (II)의 화합물의 혼합물과 가교시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고,
    상기 식 (I)의 화합물은:
    a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되고; 및
    상기 식 (II)의 화합물은:
    c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
    d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 가교된 다당류.
  14. 청구항 13에 있어서,
    단계 a)에서, 상기 알칼리 용액은 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하고; 및
    단계 c)에서, 상기 알칼리 용액은 중량 기준 1 내지 50 퍼센트의 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 것인 가교된 다당류.
  15. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에서 정의된 식 (I)의 화합물 또는 대안적으로 식 (II)의 화합물을 제조하는 방법으로서,
    상기 화합물이 식 (I)의 화합물인 경우, 상기 방법은:
    a) 1,3-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하거나;
    또는 대안적으로,
    상기 화합물이 식 (II)의 화합물인 경우, 상기 방법은:
    c) 1,2-글리세롤 디글리시딜 에테르를 포함하는 알칼리 용액을 제공하는 단계; 및
    d) 단계 c)에서 수득된 용액을 1분 내지 30일의 시간 동안 10 내지 80℃의 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 1종 이상의 청구항 5 내지 14에 정의된 가교된 다당류, 및
    1종 이상의 적합한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 치료 유효량의 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 청구항 5 내지 14 중 어느 한 항에 정의된 가교된 다당류 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물인 것인 조성물.
  18. 청구항 16에 따른 조성물의 용도로서, 미용 유효량(cosmetically effective amount)의 1종 이상의 미용적으로 허용가능한(cosmetically acceptable) 청구항 5 내지 14 중 어느 한 항에 정의된 가교된 다당류 및 1종 이상의 미용적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 스킨 케어제, 특히, 피부 필러로 사용하기 위한 미용 조성물인 것인 용도.
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