CN107991494A - 一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒，其中四种活化的荧光磁性微球分别偶联了经过表达、纯化并验证的小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV‑N)、水泡性口炎病毒核蛋白(VSV‑N)、施马伦贝格病毒核蛋白(SBV‑N)和蓝舌病病毒核蛋白(BTV‑VP7)。本发明提供的试剂盒可同时检测小反刍兽疫、水泡性口炎、施马伦贝格病和蓝舌病这四种外来和新发动物疫病，具有平行检测高通量的特点，每次可完成近100份样本的约400个项目检测；操作简单且用时短，1个多小时即可完成检测；样本用量少，只需0.1～1μL血清即可完成多项检测；该试剂盒具有良好的特异性和灵敏度。

Description

一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂 盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及液相蛋白芯片的技术领域，尤其是涉及用于同时检测多种动物疫病的液相蛋白芯片技术。
背景技术
小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)俗称羊瘟，又名小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎，是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants Virus，PPRV)引起的一种急性、热性和高度传染性的烈性传染病，主要感染山羊和绵羊，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。牛呈隐形感染，感染后也不会传染其它动物。羊发病后一般一般预后不良，多为死亡。该病和牛瘟发病症状和病理变化具有高度相似性。
水泡性口炎(Vesicular Stomatitis,VS)又名伪口疮，该病是通过弹状病毒科(Rhabdoviridae)水泡病毒属(Vesiculovirus)的水泡性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus,VSV)引起的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病，VSV具有高度的嗜上皮性，是引起多种哺乳动物水泡性口炎的重要病原，其中以感染马、牛、猪等最为普遍，临床上以在感染动物的口腔薄膜、舌、唇、乳头和蹄冠等部位的皮肤、薄膜发生水泡为特征，与口蹄疫(Foot and mouth disease,FMDV)临床症状不易区别。此外，VSV可因接触而感染人，出现流感样临床症状，因此该病也是一种高度接触性人兽共患传染病。
水泡性口炎在世界许多国家和地区广泛流行，给畜牧业造成了严重的经济损失，世界动物卫生组织Office International Des Epizooties(OIE)将该病列为动物A类传染病，由于该病在我国出现较少，因此我国为二类进境动物传染病。随着近年来入境活动物及动物产品量的增加，该病传入我国的风险也随之上升，因此更需要直接、高通量的检测方法提供技术支持。
蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)，属呼肠孤病毒科、环状病毒属、蓝舌病病毒亚群(Bluetinguevirus subgroup)，BTV引起的蓝舌病(BT)是由虫媒传播的非接触性反刍动物急性传染病，尤其对纯种细毛羊敏感，死亡率高达35％，OIE将其列为实时通报疫病，我国将其规定为一类动物传染病。该病分布范围不断扩大，危害也日趋严重。我国于1979年发现该病存在，现已从全国29省检出BTV血清阳性家畜。
2011年夏秋季节，德国和荷兰一些牛场出现一种未知疾病，成年病牛出现发热(＞40℃)、体质下降、食欲不振、腹泻和产奶量下降(高达50％)等临床症状，怀孕母牛出现流产、产畸形胎、死胎或弱胎等症状。2011年11月，德国弗里德里希洛弗勒研究所利用宏基因组学和病毒分离技术最终确证导致此次疫情的病原体为一种新的布尼亚病毒，并根据分离地名将其命名为“施马伦贝格病毒”(Schmallenberg virus，SBV)，将其引起的疫病称为“施马伦贝格病”。2012年1月4日，荷兰首先向世界动物卫生组织(OIE)通报该国出现施马伦贝格病疫情，随后，比利时、德国、英国、法国、卢森堡、意大利和西班牙等国家相继向OIE通报疫情。随着疫情的变化和科学研究的逐渐深入，欧盟方面认为施马伦贝格病对畜牧业生产的影响有限，并坚持认为将该病列为OIE通报性疫病有违疫病名录收录标准。因此，从2012年9月起OIE不再通报施马伦贝格病疫情。尽管已有研究表明，该病对非怀孕期的成年牛、羊等家畜影响有限，但易造成怀孕母畜流产、产死胎或畸形胎儿。虽然中国尚未出现施马伦贝格病疫情，但是考虑到该病的传播媒介——库蠓在中国分布广泛、种类繁多，加之中国牛、羊等家畜养殖量大、饲养密度高，该病对中国畜牧业生产具有潜在威胁。
目前，能够检测上述四种疫病抗体水平的技术主要有免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验等方法。这些方法有一个共同的缺点：一次试验只能检测一种病原抗体水平，无法实现对多种病原抗体的实时监测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有不足，提供一种能同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒，可实现一份微量样本同时检测数个动物疫病，血清用量少、检测时间短、灵敏度高、操作简单。
本发明一方面是提供制备一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒的技术方案，所述试剂盒包括直径和材料相同但编码不同的四种用于偶联抗原的微球，所述偶联抗原的微球包括第一微球、第二微球、第三微球和第四微球，其中，
所述第一微球、第二微球、第三微球和第四微球为直径6.5μm的具有单一编码的荧光磁性微球。
优选的，所述第一微球、第二微球、第三微球和第四微球均为羧基活化的荧光磁性微球，以便偶联抗原蛋白。
所述液相蛋白芯片试剂盒，还包括偶联了抗原的捕获微球，所述偶联了抗原的捕获微球包括第一捕获微球、第二捕获微球、第三捕获微球和第四捕获微球，其中，
所述第一捕获微球为偶联了抗原小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV-N)的第一微球；所述第二捕获微球为偶联了抗原水泡性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的第二微球；所述第三捕获微球为偶联了抗原施马伦贝格病毒核蛋白(SBV-N)的第三微球；所述第四捕获微球为偶联了抗原蓝舌病病毒核蛋白(BTV-VP7)的第四微球。
所述液相蛋白芯片试剂盒，还包括PPRV-N抗原、VSV-N抗原、SBV-N抗原和BTV-VP7抗原，所述PPRV-N抗原、VSV-N抗原、SBV-N抗原和BTV-VP7抗原均由相关基因(GenBank：KX938427.1；AY383716.1；KC108886.1；JQ80437.1)经表达和纯化而得，并经间接ELISA方法和Western-blot方法验证其具有良好抗原性。
所述液相蛋白芯片试剂盒，还包括信号标记的检测抗体，所述信号标记的检测抗体为生物素(biotin)标记的驴抗羊二抗。
所述液相蛋白芯片试剂盒，还包括链亲和霉素-藻红素(SA-PE)，用于荧光分析。
所述液相蛋白芯片试剂盒，还包括试剂盒中的质控品和标准品，所述质控品包括针对PPRV抗原的羊多抗即阳性血清及其阴性血清、针对VSV抗原的羊多抗即阳性血清及其阴性血清、针对SBV抗原的羊多抗即阳性血清及其阴性血清和针对BTV抗原的羊多抗即阳性血清及其阴性血清；所谓标准品包括PPRV-N单抗、VSV-N单抗、SBV-N单抗和BTV-VP7单抗。
所述液相蛋白芯片试剂盒，制备步骤如下：
(1)取四种具有不同编码的、直径为6.5μm的荧光微球(第一微球、第二微球、第三微球和第四微球)各100μL，依次加入EDC和S-NHS以活化微球羧基，对微球表面的羧基进行活化以备偶联；
(2)将小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV-N)、水泡性口炎病毒核蛋白(VSV-N)、施马伦贝格病毒核蛋白(SBV-N)和蓝舌病病毒核蛋白(BTV-VP7)分别与步骤(1)中的活化微球偶联，制备相应四种捕获微球并用血球计数器分别计数；
(3)分别将PPRV、VSV、SBV、BTV四种抗体生物素化，再加入SA-PE读取荧光值以验证步骤(2)中蛋白的偶联效率。
(4)将步骤(2)中捕获微球加入实验板，在相应孔中分别加入样品和质控品，经充分孵育反应后，再加入biotin标记的二抗和SA-PE，读取荧光值分析结果；
所述液相蛋白芯片试剂盒，优化步骤如下：分别优化抗原、待检抗体、生物素化二抗和SA-PE的浓度，确定最佳反应条件；建立液相蛋白芯片检测方法。
本发明的第二方面是提供一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒的操作方法，包括以下步骤：
(1)取出一种或多种所述试剂盒中提供的捕获微球，混悬后加入50μL到96孔实验板中；优选的，每孔每种微球数量为5000个左右；
(2)在相应的孔中分别加入50μL按1：1000稀释的质控品和待测血清(每个样本至少做两个重复)，室温避光震摇30分钟；
优选的，根据不同待检样品可将血清做四倍倍比稀释，孵育可以静置，但震摇效果更好；
(3)洗涤离心后，加入50μL按1:100稀释的biotin标记的驴抗羊，室温避光震摇30分钟；
(4)洗涤离心后，加入50μL按1:500稀释的SA-PE储存液，室温避光孵育10分钟，不需震摇；
(5)离心弃上清，加入125μL储存缓冲液，重悬微球后读取MFI数值并分析数据。
本发明所提供的一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒，可同时检测小反刍兽疫、水泡性口炎、施马伦贝格病和蓝舌病这四种外来和新发动物疫病，具有平行检测高通量的特点，每次可完成近100份样本的约400个项目检测；用时时间短，1个多小时即可完成检测；样本用量少，只需0.1～1μL血清即可完成多项检测；该试剂盒具有良好的特异性和灵敏度；操作简单，无丰富专业知识的检测人员可使用。
附图说明
图1为本发明提供的液相蛋白芯片试剂盒联合检测PPRV抗体标准曲线；
图2为本发明提供的液相蛋白芯片联合检测VSV抗体标准曲线；
图3为本发明提供的液相蛋白芯片联合检测BTV抗体标准曲线；
图4为本发明提供的液相蛋白芯片联合检测SBV抗体标准曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一、一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒的制备
1、制备捕获微球
(1)微球活化
选取四种直径和材料相同但编码不同的羧基荧光磁性微球(商品信息分别为Bio-Plex：MC10035-01；MC10047-01；MC10055-01和MC10065-01，其中35，47，55和65代表磁珠编号)，作为本发明中所述的第一微球、第二微球、第三微球和第四微球。
取选中微球(约6.1×106个/mL)分别进行下述操作：漩涡混合30秒，超声波震荡30秒；取100μL微珠到反应管中，14000×g离心4分钟，小心移除上清液；加入100μL微珠清洗液，漩涡混合10秒，超声波震荡10秒，14000×g离心4分钟，小心移除上清液；加入80μL微珠活化缓冲液重悬微珠，漩涡混合30秒，超声波震荡30秒；准备EDC(50mg/mL)和S-NHS(50mg/mL)(注意：EDC必须确保新鲜，反复冻融不得超过5次，最好分装后一次性使用)；加入10μLEDC后迅速加入10μL S-NHS到微珠中，漩涡混合30秒；用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合20分钟；加150μL PBS，pH7.4，漩涡混合10秒，14000×g离心4分钟，小心移除上清液；加100μL PBS，pH 7.4重悬微珠，漩涡混合30秒，超声波震荡15秒。
(2)蛋白偶联
各取5-12μg的抗原小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV-N)、抗原水泡性口炎病毒核蛋白(VSV-N)、抗原施马伦贝格病毒核蛋白(SBV-N)和抗原蓝舌病病毒核蛋白(BTV-VP7)抗原蛋白，分别加到经过步骤(1)活化的四种不同的微球中，分别进行下述操作：用100μL PBS，pH7.4定溶到500μL；用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合2小时或者4℃过夜，14000×g离心4分钟，小心移除上清液；用500μL PBS，pH 7.4清洗偶联的微珠，14000×g离心4分钟，小心移除上清液，不要超声波清洗；用250μL封闭缓冲液重悬微珠，漩涡混合15秒，用铝箔盖住反应管，在室温中旋转混合30分钟，14000×g离心4分钟，小心移除上清液；用500μL储存缓冲液清洗微珠，16000×g离心6分钟，小心去除上清；加入150μL储存缓冲液保存微珠；可用血球计数器计算微珠的浓度，盖上铝箔，4℃保存偶联的微珠，可稳定保存1年。
2、偶联效率验证
验证方法是，先分别用生物素化的四种抗体然后用SA-PE(注意：所用的抗体种属必须一致)。具体步骤为：标记2个小离心管，其中1个用于阴性对照，偶联的微珠漩涡混合15秒，每管加入约5000个偶联的微珠；稀释生物素标记的抗体至20μg/mL，加50μL到测试管中，阴性对照管加50μL稀释缓冲液，14000g离心4分钟，移除上清；加入50的2μg/mL SA-PE，阴性对照管加50μl稀释缓冲液；盖上铝箔，室温孵育10分钟，不需旋转混合，14000×g离心4分钟，小心移除上清；用125μL的储存缓冲液重悬微珠，漩涡混合15秒，取125μL样品到平底96孔板中，检验微珠荧光值。阴性对照(背景)的荧光值不得超过100MFI；偶联微珠的荧光值超过2000MFI可认为偶联成功。
3、抗体生物素化
可使用生物素化试剂或生物素化试剂盒分别对四种单抗进行生物素化，按操作说明书进行即可，最后将生物素化的四种抗体分别透析过夜(PBS，PH 7.4)，目的是去除未结合的生物素，分装保存于-20℃备用。生物素化二抗可直接购买以备使用。
4、液相蛋白芯片检测方法的建立
包被抗原的微球用来捕获样品和质控品中的抗体，生物素化的二抗再与检测抗体结合，SA-PE与生物素结合，形成微球-抗原—待检抗体—生物素化二抗—链亲和霉素-藻红素的复合物，通过判断检测的荧光信号来判定样品。
5、液相蛋白芯片检测方法的优化
(1)偶联蛋白量的优化
分别用6μg、8μg、10μg、12μg和14μg的抗原进行优化试验条件，荧光信号随抗原量增加而不断增高，当抗原量大于10μg时，信号增强幅度降低，因此选择10μg的蛋白量用于偶联，即用适量PBS使偶联抗原的最终浓度为0.2mg/mL。
(2)生物素化二抗浓度的优化
分别用终浓度为0.2mg/mL、2mg/mL、20mg/mL和200mg/mL的biotin标记二抗进行优化试验条件，当抗体浓度达到20mg/mL时，MFI值有明显增高，因此选用最佳生物素化二抗浓度为20mg/mL。
6、标准曲线的建立
分别将偶联用标准抗原按10倍稀释(以PPRV为例，将标准抗原依次做10倍稀释后得到S10.22ng/mL～S622000ng/mL六个标准浓度)，各取50μL加入到已含有捕获磁珠的96孔板中，做3次重复，室温避光震摇30分钟；缓冲液洗涤3次，加入50μL生物素标记的二抗，室温避光震摇30分钟；缓冲液洗涤3次，加入50μL SA-PE工作液，室温避光孵育10分钟，不需震摇；离心弃上清，加入125μL储存缓冲液重悬；采用液相芯片系统检测荧光值并绘制标准曲线。如图1～4。
实施例2
利用实施例1的液相蛋白芯片试剂盒，对60份样本同时检测四种外来和新发动物疫病(样本来源：大连动物疫病预防控制中心20份、云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心15份、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心15份、中国检验检疫科学研究院10份)，包括以下步骤：
(1)取出所述试剂盒中提供的捕获微球，混悬后加入50μL到96孔实验板中；每孔每种微球数量为5000个左右；
(2)在相应的孔中分别加入50μL按1：1000稀释的质控品和60份待测血清(每个样本至少做两个重复)，室温避光震摇30分钟；
(3)洗涤离心后，加入50μL按1:100稀释的biotin标记的驴抗羊，室温避光震摇30分钟；
(4)洗涤离心后，加入50μL按1:500稀释的SA-PE储存液，室温避光孵育10分钟，不需震摇；
(5)离心弃上清，加入125μL储存缓冲液，重悬微球后读取MFI数值并分析数据。
检测结果如表1所示，标准曲线如图1～4所示。60份样品中分别检出阳性样品为2份BTV，4份PPRV，2份SBV及一份VSV，检测结果经ELISA与PCR方法验证一致，样品无明显交叉反应且变异系数均小于10％，证明该液相蛋白芯片试剂盒方法有效可行。
表1高通量液相芯片检测实例
本发明所提供的一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒，可同时检测小反刍兽疫、水泡性口炎、施马伦贝格病和蓝舌病这四种外来和新发动物疫病，具有平行检测高通量的特点，每次可完成近100份样本的约400个项目检测；用时时间短，1个多小时即可完成检测；样本用量少，只需0.1～1μL血清即可完成多项检测；该试剂盒具有良好的特异性和灵敏度；操作简单，无丰富专业知识的检测人员可使用。
根据上述说明书的具体阐述，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括四种具有不同编码的、直径为6.5μm的羧基活化的荧光磁性微球；且上述四种荧光磁性微球分别偶联了抗原小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV-N)、抗原水泡性口炎病毒核蛋白(VSV-N)、抗原施马伦贝格病毒核蛋白(SBV-N)和抗原蓝舌病病毒核蛋白(BTV-VP7)。
2.根据权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于和待检样品、质控品和阴性血清作用的生物素标记的驴抗羊二抗。
3.根据权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括链亲和霉素-藻红素。
4.根据权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品和标准品，所述质控品包括针对PPRV抗原的羊多抗及其阴性血清、针对VSV抗原的羊多抗及其阴性血清、针对SBV抗原的羊多抗及其阴性血清和针对BTV抗原的羊多抗及其阴性血清；所述标准品包括PPRV-N单抗、VSV-N单抗、SBV-N单抗和BTV-VP7单抗。
5.如权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)取四种具有不同编码的、直径为6.5μm的荧光微球各100μL，依次加入EDC和S-NHS对微球表面的羧基进行活化以备偶联；
(2)将小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV-N)、水泡性口炎病毒核蛋白(VSV-N)、施马伦贝格病毒核蛋白(SBV-N)和蓝舌病病毒核蛋白(BTV-VP7)分别与步骤(1)中的活化微球偶联，制备相应四种捕获微球并用血球计数器分别计数；
(3)验证步骤(2)中蛋白的偶联效率。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的蛋白的偶联效率验证方法为，分别将PPRV、VSV、SBV、BTV四种抗体生物素化，再加入SA-PE读取荧光值。
CN201711174357.1A 2017-11-22 2017-11-22 一种同时检测四种外来和新发动物疫病的液相蛋白芯片试剂盒及其制备方法 Pending CN107991494A (zh)

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