CN101735986A - 分泌抗猪戊型肝炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分泌抗猪戊型肝炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。其中，所述杂交瘤细胞株的微生物保藏号是CGMCC.2696。经生物学特性鉴定，由该杂交瘤细胞株所分泌的针对IV型猪戊型肝炎病毒ORF2-M1蛋白的单克隆抗体，具有效价高、特异性好的特点，采用间接免疫荧光法将其作为诊断猪戊型肝炎病毒病原的试剂，检测结果具有很高的特异性和敏感性，可作为IV型猪戊型肝炎病毒的诊断试剂。

Description

分泌抗猪戊型肝炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，尤其涉及能稳定分泌抗猪戊型肝炎病毒ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及由该细胞株所分泌的抗猪戊型肝炎病毒重组ORF2-M1蛋白单克隆抗体，本发明还涉及该单克隆抗体在诊断、预防或治疗猪戊型肝炎病毒中的应用，属于猪戊型病毒领域。

背景技术

猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是一种无包膜的正义链RNA病毒，直径27-32nm，表面粗糙，呈不规则球型。HEV基因组全长大约为7.5kb，具有3个互相重叠的开放阅读框即ORF1、ORF2、和ORF3。ORF2起于第5107位核苷酸，延伸1980bp，终止于Poly(A)上游63个核苷酸，长约2kb，编码病毒衣壳蛋白，为主要的结构基因编码区。该病毒主要经粪.口途径传播，常引起HE爆发或散发。HE广泛流行于亚、非及美洲的一些国家，呈全球性分布，主要侵害青壮年，其中孕妇死亡率高达20％(Emerson S U，Nguyen H，Graff J，et al.In vitro replication ofhepatitis E virus(HEV)genomes and of an HEV replicon expressing green fluorescentprotein[J].Virol，2006，78：4838-4846.)。我国是HE流行的主要地区之一，HE发病率约占临床散发型肝炎的15％-20％。1997年，Meng等发现猪群中存在着与美国人戊型肝炎基因组高度相似的病毒(Emerson S U，Nguyen H，Graff J，et al.In vitroreplication of hepatitis E virus(HEV)genomes and of an HEV replicon expressing greenfluorescent protein[J].Virol，2006，78：4838-4846.)，从此对猪戊型肝炎病毒人畜共患的研究在许多国家开展起来(Erker J C.A hepatitis E virus variant from the UnitedStates：molecμlar characterization and transmission in cynomolgus macaques[J].GenVirol，2004，80：681-690；Gonzalea J M，Penzes Z，Almazan F，et al.Stabilzation offull-length infectious cDNA clone of transmisible gastroenteritis coronavims byinsertion of a Intron[J].Virol，2004，76：4655-4661；Guobin T，Suhua Z，Yanbing L，et al.Protective efficacy in chickens，geese and ducks of an H5N1 inactivated vaccinedeveloped by reverse genetics[J].Virology，2005，341：1532-1562)。最近国际上从猪、羊以及鼠等动物体内检测到抗HEV抗体，在部分地区动物中抗体阳性率较高。关于我国猪戊型肝炎流行情况的报道已经有许多(Guobin T，Suhua Z，Yanbing L，et al.Protective efficacy in chickens，geese and ducks of an H5N1 inactivated vaccinedeveloped by reverse genetics[J].Virology，2005，341：1532-1562)。由于缺乏有效的病毒体外长期培养系统，阻碍了戊型肝炎病毒(HEV)疫苗的研制和诊断试剂的开发。用基因工程手段表达HEV主要结构蛋白已成为研究的热点。

本发明人利用北京万泰生物公司戊型肝炎夹心ELISA诊断试剂盒，对全国22个省市地区进行的血清学流行病学研究，证明几乎所有被检地区都存在猪戊型肝炎病毒感染，而且戊肝感染率呈上升趋势，控制该病刻不容缓(王佑春，张华远，李河民，等.戊型肝炎病毒VI型全基因序列的分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(2)：210-213.)。控制戊肝发生和蔓延的关键之一是要做到快速而准确的诊断。目前，在戊肝诊断方面，主要应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、以及RT-PCR等诊断技术(孟继鸿，戴星，窦晓光，等.不同基因型戊型肝炎病毒重组蛋白的抗原性分析[J].东南大学学报(医学版)，2002，21(1)：31-35.)，其中许多诊断技术都需要戊肝抗体作为试验材料。单克隆抗体由于具有特异性强、均质性高等特点，将其作为诊断试剂可以显著提高戊肝病毒检测的特异性和敏感性，因此在戊肝防制中具有重要的应用价值。以单克隆抗体(McAb)作为诊断试剂建立的快速诊断方法，易于标准化判定。是今后疾病诊断发展的主要方向。

HEV是一种无包膜单股正链RNA病毒，由于其成熟的细胞培养模型至今尚未建立，因而目前多采用基因工程表达的重组蛋白或合成肽作为HEV特异性抗体检测的包被抗原以及作为免疫原制备McAbs和免疫血清。Mast等通过对不同HEV抗体检测方法的比较，发现以HEV ORF2编码蛋白作为已知抗原来检测未知抗体有较好的敏感性。另外许多研究证实ORF2编码的衣壳蛋白上抗原表位数量多，结构复杂，其富含疏水区的C端2/3部分存在多个免疫优势B细胞表位，包括能诱导中和抗体的抗原结合位点(Pastey MK，Samal SK.Analysis of the bovinerespiratorysyncytial virus fusion protein(F)using monoclonal antibodies[J].VeterinaryMicrobiology，2005，58：175～185.)。近年来单克隆抗体在研究蛋白结构及其功能方面，以及抗原表位的分析和精确定位方面都起到了促进作用。国内外既往的研究表明(Pastey MK，Samal SK.Analysis of the bovine respiratorysyncytial virus fusionprotein(F)using monoclonal antibodies[J].Veterinary Microbiology，2005，58：175～185.)，利用原核系统表达的HEV ORF2224-660位氨基酸重组蛋白免疫动物能够刺激机体产生特异性抗体，此类抗体不仅有效的抵抗同型HEV病毒株的攻击，而且还具有保护机体免受不同亚型HEV攻击的能力。

免疫荧光技术因其直观性强和操作简便成为实验室常用的快速检测手段(Pastey MK，Samal SK.Analysis of the bovine respiratorysyncytial virus fusionprotein(F)using monoclonal antibodies[J].Veterinary Microbiology，2005，58：175～185.)，间接免疫荧光法更扩大了抗体的应用范围，通过荧光素标记二抗的结合，将信号进行放大，在一定程度上提高了检测的灵敏度，但随之带来的高背景也增加了检测的非特异性。因此如何降低间接免疫荧光检测的非特异性，提高其检测的准确性在实践上具有重要意义。

目前对HEV检测所用的抗体制剂多为全病毒制备的抗血清，在抗血清的制备过程中，因抗原的纯度，不同的免疫批次以及免疫动物的个体差异均会影响免疫血清的质量和检测的稳定性(Purdy MA，Causfland Kin，Krawczynsk K，et al.Preliminaryevidence that a trpE-HEV fusion protein protects cynomolgus macaques againstchallenge with wild-type hepatitis E virus(HEV)[J].Med Viml，1993，41：90-94.)。

发明内容

本发明目的之一是提供二株各自均能稳定分泌抗HEV ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明目的之二是获得由上述杂交瘤细胞株所分泌的抗HEV ORF2-M1重组蛋白的单克隆抗体。

本发明目的之三是将上述抗HEV ORF2-M1重组蛋白的单克隆抗体用于诊断、预防或治疗猪戊型肝炎病毒。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株能稳定分泌抗HEV ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(其代号为BC4)，其微生物保藏号是：CGMCC.2696；分类命名是：单克隆抗体细胞株；保藏时间是：2008年10月10日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

本发明还获得了另外一株能稳定分泌抗HEV ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(其代号为2A10)。

本发明利用纯化的猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2-M1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术，获得了二株稳定分泌抗HEV ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其代号分别为BC4和2A10。经ELISA测定，2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1.60×10³和1∶0.80×10³，接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×10⁶和1∶1.28×10⁶。2株单抗均能特异性识别重组ORF2-M1蛋白，但它们识别ORF2-M1蛋白的不同表位。应用抗猪戊型肝炎病毒ORF2-M1蛋白单克隆抗体和猪戊型肝炎病毒多克隆抗血清对感染猪戊型肝炎病毒的A549细胞培养物进行了间接免疫荧光检测病原的比较研究。结果表明，采用本发明抗HEV ORF2-M1蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光法对猪戊型肝炎病毒病原检测具有很高的特异性。

本发明利用已建立的抗HEV ORF2-M1蛋白McAb与全病毒抗血清分别对感染和未感染HEV的细胞培养物进行间接试验的比较研究结果表明，McAb鉴定的HEV感染细胞培养物间接免疫荧光染色结果特异性强，排除了高背景的非特异荧光影响，对结果的判定更为准确。利用本发明抗HEV ORF2-M1蛋白McAb建立的间接免疫荧光检测方法为HEV感染的病原提供了重要的快速检测手段。

本发明获得的针对IV型HEV ORF2-M1蛋白的单克隆抗体，经生物学特性鉴定，具有效价高、特异性好的特点，可作为IV型HEV诊断试剂，并为建立IV型HEV的抗原捕获方法提供有力的技术支持，可预期在我国IV型HEV的防制中发挥重要的作用。

附图说明

图1抗HEV ORF2蛋白McAb杂交瘤上清液对感染HEVA549细胞系进行间接免疫荧光染色结果。

图2抗HEV ORF2蛋白McAb杂交瘤上清液对未感染HEV A549细胞系进行间接免疫荧光染色结果。

图3抗HEV全病毒制备的抗血清对感染HEVA549细胞进行间接免疫荧光染色结果。

图4抗HEV全病毒制备的抗血清对未感染HEVA549细胞进行间接免疫荧光染色结果。

图5SP2/0细胞染色体计数结果。

图6BC4细胞染色体计数结果。

图72A10细胞染色体计数结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1主要试剂

HAT、HT选择培养基、HRP-羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品；PEG(MW，3350)为Solarbio公司产品；国产优级胎牛血清购自天津颧洋生物工程公司；所用其他化学试剂均为分析纯。羊抗鼠IgG荧光抗体，购自北京中山生物技术有限公司，用前以0.01％伊文思蓝0.01mol/l pH 7.2PBS液稀释成所需要的浓度。

1.1.2细胞、实验动物、毒株与血清

人肺癌细胞(A549)购自北京协和医院、SP2/0骨髓瘤细胞为本发明人实验室冻存。雌性BALB/c小鼠和昆明白鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。感染swDQ株HEV猪的胆汁来源于黑龙江省某猪场。HEV阳性猪血清由本发明人实验室保存。

1.2实验方法

1.2.1间接ELISA检测方法的建立

采用方阵滴定法确定间接ELISA所用包被抗原和抗体的最适工作浓度。将纯化的ORF2-M1抗原、BALB/c小鼠阳性血清和阴性血清均作倍比稀释，同时设立SP2/O细胞培养上清及空白对照，选择以阳性血清孔的OD_492nm值接近1.0，P/N＞2.1时的抗原、血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度。

1.2.2单克隆抗(McAb)和多克隆抗血清对接种病毒的细胞培养物进行间接免疫荧光检测病原的比较研究

取生长良好的A549细胞，倒去培养液，用无血清的M199和MH的混合培养液洗两次，按1/100体积的培养液加入感染swDQ株HEV猪的胆汁，37℃吸附1h后，加无血清M199和MH的混合培养液培养，培养72h后，收获细胞培养物作为下次吸附细胞的病毒培养物，培养盲传4代，待细胞出现病变后，收获细胞培养物进行免疫荧光检测。

取接种病毒和未接种病毒的细胞培养物，倒去培养上清液，刮取培养物单层，涂于玻片上，自然干燥后，用预冷的丙酮液固定40min，挥干后，用0.01mol/L pH7.2PBS液洗涤3次，每次3min，自然干燥后，分别滴加抗HEV ORF2-M1蛋白McAb杂交瘤上清液和工作浓度为1∶500的抗病毒多克隆抗血清，37℃湿盒作用30min后，用0.01mol/L pH 7.2PBS液冲洗后，在装有0.01mol/L pH 7.2PBS液的3个缸内依次浸泡，每个缸浸泡5min，期间不时震荡几次。玻片从玻缸取出后，用滤纸吸干，滴加工作浓度为1∶1000荧光素标记的羊抗鼠IgG后，将玻片放入湿盒，37℃作用30min后取出，用相同方法洗涤3次，挥干后，滴加磷酸甘油封片，镜检观测。

1.2.3小鼠免疫及检测

用电洗脱方法纯化ORF2-M1蛋白加等体积完全弗氏佐剂，充分混匀后经背皮下和后腿肌肉注射6周龄Balb/c小鼠，100μg每只；两周后进行第2次免疫，方法与首免相同；间隔2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。3周后采取尾静脉和腹腔注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射半量抗原，3d-4d后采血用间接ELISA测定血清效价，效价达到1∶10⁴以上即可取脾进行细胞融合(Gonzalea J M，Penzes Z，Almazan F，et al.Stabilzation of frll-length infectiouscDNA clone of transmisible gastroenteritis coronavims by insertion of a Intron[J].Virol，2004，76：4655-4661；Guobin T，Suhua Z，Yanbing L，et al.Protective efficacy in chickens，geese and ducks of an H5N1 inactivated vaccine developed by reverse genetics[J].Virology，2005，341：1532-1562)。

1.2.4细胞融合

按照常规方法进行(Huang F F，Pierson F W，Toth T E，et al.Construction andcharacterization of infectious cDNA clones of a chicken strain of hepatitis E virus(HEV)，avian HEV[J].Journal of General Virology，2005，86：2585-2593.)。

1.2.5单克隆抗体腹水的制备

按照常规方法进行(Tong Y P，Bi S L，Lu J，et al.Antigencity identification ofrecombinant hepatitis E virus ORF2 protein expressed in Pichia pastoris[J].ChineseJournal of Experimental and Clinical Virology，2003，17(3)：258～261.)。

1.2.6杂交瘤细胞染色体检查

按照常规方法进行(吕琦，张爱玲，王泽华，等.抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备和鉴定[J].云南大学学报：自然科学版，2006，28(1)：88-92.)，计算出平均染色体数目。

1.2.7单克隆抗体饱和值的测定

将2株单克隆抗体从1∶1000开始做倍比稀释，加入包被有最适浓度抗原的96孔酶标板，同时设阳性、阴性血清对照，以单抗OD_490nm值明显降低的临界点为单抗饱和浓度值。

1.2.8单克隆抗体抗原识别位点的分析

采用测相加指数法，以最适浓度抗原包被酶标板，洗涤后分别加入饱和浓度的单抗，每株16孔，37℃孵育1h，洗涤后每株取其中8孔分别加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，洗涤后显色，测定OD值。然后在剩余的8孔中分别加入另一株单抗，37℃孵育1h，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，洗涤后显色，分别测定OD_490nm值。按公式AI＝(A1.2-A1)/A2×100％计算2株单克隆抗体叠加后的AI值，其中A1.2表示2株单抗叠加后的OD_490nm值；A1表示第1株单抗的OD_490nm值；A2表示第2株单抗的OD_490nm值。当两两抗体叠加的AI值大于10％时，表明这2种抗体所识别的抗原位点不同，当两两抗体叠加的AI值小于或等于10％时，表明这2种抗体所识别的抗原位点相近或相同(刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用[M].合肥：安徽科技出版社，2005.)。

2实验结果

2.1杂交瘤细胞株的建立

用所免疫的ORF2-M1重组蛋白包被酶标反应板，pet-32a包被酶标反应板作为对照。采用间接ELISA法检测，OPD底物显色，测定A吸光度值，P/N≥2.1者为ELISA阳性。杂交瘤筛选时，凡ORF2-M1阳性，同时pet-32a阴性者，为McAb阳性孔。阳性孔用有限稀释法亚克隆2-3次，至100％培养孔阳性，即建立分泌McAb的杂交瘤细胞株。采用制备腹水和培养瓶直立培养法大量制备McAbs。获得2株阳性杂交瘤细胞，分别命名为BC4和2A10。

2.2杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定

将杂交瘤细胞培养上清和腹水分别进行系列稀释，然后用间接ELISA法测定OD_490nm值同时设立阳性、阴性血清对照。P/N比值大于2.1时McAbs的最大稀释度即为其效价。经间接ELISA测定，获得2株阳性杂交瘤细胞，其培养上清及腹水效价(见表1)。

表1  杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价

2.3腹水单杭饱和值测定

将杂交瘤细胞腹水分别进行系列稀释，然后用间接ELISA法测OD_490nm值，以OD_490nm值明显降低的前一个稀释度作为单抗饱和浓度值。经间接ELISA测定，2株阳性杂交瘤细胞腹水抗体的饱和度均为1∶10⁶。

2.4单杭特异性鉴定

2.4.1ELISA检测两株单抗与HEV的反应性

分别用纯化的原核表达的ORF2-M1蛋白，ORF2其它部分片段的蛋白PproDQ1，AG02为抗原，进行间接ELISA实验。结果表明，2株单抗只与原核表达的ORF2-M1蛋白发生反应。结果见表2。

表2  间接ELISA检测2株单抗与ORF2-M1蛋白和PproDQ1蛋白，AG02蛋白反应性

2.5间接免疫荧光试验结果

应用抗HEV ORF2-M1蛋白的McAb对接种HEV的细胞培养物和未接种病毒的对照细胞培养物所进行的间接免疫荧光试验表明，接种HEV的细胞培养物多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光(见图1)；未接种病毒的细胞培养物，被伊文思蓝染成红色，未见有黄绿色荧光染色的细胞存在(见图2)。利用HEV全病毒制备的抗血清对接种病毒和未接种病毒的细胞培养物进行间接免疫荧光试验表明，接种病毒的细胞培养物染色后，荧光强度高，呈现亮绿色(见图3)，但对照未接种HEV的细胞培养物进行染色结果观察亦具有一定的非特异性荧光反应(见图4)。比较McAb和多克隆全病毒抗血清对HEV细胞培养物间接免疫荧光染色的结果表明，利用抗HEV ORF2-M1蛋白McAb对病原的检测与多克隆抗血清比较，虽然荧光反应强度低，但非特异性大大减小。

2.6杂交瘤细胞株的染色体分析

对所获得的2株杂交瘤细胞株进行染色体分析，结果如图2，图3，图4显示，SP2/0细胞的平均染色体数为47-52个，而杂交瘤细胞的平均染色体数是85-95个，正常小鼠的体细胞染色体数是40个。由此可见，杂交瘤细胞是骨髓瘤细胞和小鼠正常体细胞的杂合体。

2.6单克隆抗体抗原识别位点分析

经相加ELISA测定，BC4和2A10两株单克隆抗体两两叠加后的AI值为35.6％，说明它们分别识别不同的抗原表位。

Claims (8)

1.一株能分泌抗猪戊型肝炎病毒ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：其微生物保藏号是：CGMCC.2696。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株所分泌的抗猪戊型肝炎病毒ORF2-M1重组蛋白的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测猪戊型肝炎病毒试剂中的用途。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防或治疗猪戊型肝炎药物中的用途。

5.一株能分泌抗猪戊型肝炎病毒ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其代号为2A10。

6.由权利要求5所述杂交瘤细胞株所分泌的抗猪戊型肝炎病毒ORF2-M1重组蛋白的单克隆抗体。

7.权利要求6所述的单克隆抗体在制备诊断或检测猪戊型肝炎病毒试剂中的用途。

8.权利要求6所述的单克隆抗体在制备预防或治疗猪戊型肝炎药物中的用途。

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