RU2703405C1 - Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных - Google Patents

Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных Download PDF

Info

Publication number
RU2703405C1
RU2703405C1 RU2018134628A RU2018134628A RU2703405C1 RU 2703405 C1 RU2703405 C1 RU 2703405C1 RU 2018134628 A RU2018134628 A RU 2018134628A RU 2018134628 A RU2018134628 A RU 2018134628A RU 2703405 C1 RU2703405 C1 RU 2703405C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
genome
bordetella bronchiseptica
signal
positive
Prior art date
Application number
RU2018134628A
Other languages
English (en)
Inventor
Василий Александрович Баннов
Олег Юрьевич Черных
Денис Владиславович Малышев
Александра Андреевна Котельникова
Ирина Михайловна Донник
Александр Анатолиевич Лысенко
Александр Иванович Клименко
Роман Анатольевич Кривонос
Анатолий Александрович Стекольников
Владимир Николаевич Шевкопляс
Андрей Георгиевич Кощаев
Аркадий Васильевич Иванов
Альбина Геннадиевна Исаева
Латиф Асланбиевич Хахов
Любовь Анатольевна Дайбова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Priority to RU2018134628A priority Critical patent/RU2703405C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2703405C1 publication Critical patent/RU2703405C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выявления ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica у сельскохозяйственных животных, включающий выделение ДНК из биологического материала сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома Bordetella bronchiseptica олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов, согласно изобретению проводят флуоресцентную детекцию, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica, а по каналу FAM/Green сигнал внутреннего контроля, интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Bordetella bronchiseptica и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1. Изобретение позволяет достоверно диагностировать ДНК возбудителя Bordetella bronchiseptica. 2 ил., 4 табл.

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных.
В настоящее время бордетеллез является широко распространенным заболеванием животных во многих странах мира. Bordetella bronchiseptica является возбудителем хронических и, довольно часто, асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахеобронхита) животных. Возбудитель поражает животных всех возрастных групп, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. Тяжесть заболевания связана с присутствием у В. bronchiseptica факторов патогенности: адгезинов (филаментозного гемагглюти-нина, пертактина и фимбрий) и токсинов (дермонекротического, аденилатцик-лазы-гемолизина и липополисахарида). Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства).. Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, содержащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продуктивности животных, обусловливают необходимость выявления В. bronchiseptica и проведение противоэпидемических мероприятий.
Известен способ ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции (Bordetella pertussis), предусматривающий взятие клинического материала из ротоглотки больного, выделение ДНК, проведение электрофореза, до выделения ДНК проводится пробоподготовка клинического материала, при которой тампоны с клиническим материалом суспендируют в физиологическом растворе на микроцентрифуге-вортексе в течение 5 минут для удаления тампонов, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 3 минут, удаляют супернантант и ресуспендируют осадок, выделяют ДНК с помощью коммерческого набора, проводят изотермальную амплификацию с использованием смеси №1, состоящей из 10х реакционного ПЦР-Bst буфера, 2 mМ смеси нуклеотидов (dNTP s), 25 mM MgCl 2, раствора Betaine и трех пар праймеров и смеси №2, содержащей рабочее разведение Bst полимеразы, при 65°С в течение 60 минут и 80°С в течение 2 минут; после электрофореза в 2% агарозном геле при 160 V в течение 1 часа продукты амплификации подвергают дифференциации путем сравнения электрофоретической подвижности полученных фрагментов ДНК с подвижностью контрольного образца ДНК штамма В. pertussis и при наличии специфического светящегося профиля, аналогичного контрольному образцу ДНК штамма В. pertussis, диагностируют заболевание коклюшем (Патент РФ №2542396, 2014 г.).
Также известен способ выявления инфекций в клинических образцах методом мультиплексной ПНР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2506317, C12Q 1/68, 2014 г.), включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных особей сорбционным методом, постановку одноэтапной с добавлением внутреннего положительного контроля мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома олиго-нуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold).
Наиболее близким является способ молекулярно-генетической идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции (Мастиленко А. В, Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук «Разработка идентификации bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов»,Саратов - 2011, http://rykovodstvo.ru/exspl/58953/index.html?page=3), включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома Bordetella bronchiseptica олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов
Однако в известном способе последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза.
Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома возбудителя ДНК Bordetella bronchiseptica инфекции у сельскохозяйственных животных.
Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК Bordetella bronchiseptica.
Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica у сельскохозяйственных животных, включающем выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома Bordetella bronchiseptica олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов согласно изобретению проводят флуоресцентную детекцию, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica, а по каналу FAM/Green сигнал внутреннего контроля, интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контроль-ного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Bordetella bronchiseptica и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
BBrFl GAAACCCAGGCCGCAAATTC - прямой праймер
BBrR1 CCCAGGCGCTCGAACAATA - обратный праймер
BBRP1 [R6G]TAT AGC CGC CGC AAA CCAC[BHQ1] - зонд
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р FAM ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд.
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК Bordetella bronchiseptica инфекции животных проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома Bordetella bronchiseptica олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПНР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики Bordetella bronchiseptica инфекции у животных, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 Канал HEX - для тестирования наличия ДНК Bordetella bronchiseptica.
Способ выявления генома возбудителя Bordetella bronchiseptica инфекции у сельскохозяйственных животных осуществляется следующим образом
Предварительно выделяют ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica из биологического материала, взятый от инфицированных животных по выбору: ротоглоточные мазки, трансназальные или бронхоальвеолярные смывы, фрагменты легких, бронхов, трахеииз сорбционным методом. Затем проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с добавлением внутреннего положительного контроля, в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и проводят 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Bordetella bronchiseptica и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклео-тидными последовательностями:
Figure 00000001
Далее накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX)/Yellow для специфического сигнала; FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.
Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.
Праймеры, специфичные для Bordetella bronchiseptica были отобраны на основе митохондриальной последовательности ДНК генома Bordetella bronchiseptica (Bordetella bronchiseptica strain D755 chromosome, complete genome, CP020651.1, участок между 4945015 и 4945092). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Bio-systems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран оли-гонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд BBrPl (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров BBrFl и BBrRl). Зонд был помечен красителем HEX. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР.
Пример конкретного осуществления способа выявления генома возбудителя Bordetella bronchiseptica инфекции у с.-х животных. Для исследования используют от инфицированных животных В. bronchiseptica (далее В. Bronchiseptica по выбору следующий материал:
ротоглоточные мазки
Figure 00000002
трансназальные или бронхоальвеолярные смывы
Figure 00000002
фрагменты легких, бронхов, трахеи
Figure 00000002
клеточные культуры.
Затем проводят подготовку проб. Мазки и смывы исследуют без предварительной подготовки. Культуры в жидких средах исследуют без предварительной подготовки, бактериальные колонии, ресуспендируют в 0,5 мл физиологического раствора.
Исследуемые пробы фрагментов легких, бронхов и трахеи (небольшие кусочки до 1 г весом) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков или автоматических гомогенизаторов. Затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600-1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.
Далее осуществляют анализ, состоящий из трех этапов:
Figure 00000003
экстракция нуклеиновых кислот (НК);
Figure 00000003
проведение реакции ПНР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
Figure 00000003
учет результатов анализа.
Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое-количество одноразовых пробирок объемом - 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) В. Bronchiseptica в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов.
Для проведения анализа используют набор, который состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПНР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах:
1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы);
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Состав наборов приведены в Таблицах 1 и 2.
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-БОРДЕТЕЛЛЕЗ-ФАКТОР» для выявления ДНК вируса (Bordetella bronchiseptica) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПНР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-156-51062356-2018 http://www.vetfaktor.ru/.
Figure 00000004
Figure 00000005
Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначают как ВК-).
Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.
Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С. Подготавливают образцы к проведению ПНР следующим образом Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы -10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют используя ПКО В. Bronchiseptica, ВКО В. Bronchiseptica и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с кон-центрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомби-нантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК В. bronchiseptica и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
5 мкл ПЦР смесь В. bronchiseptica
10 мкл смеси ПЦР БУФЕР В. Bronchiseptica
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл
ДНК соответствующей пробы;
в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО В. Bronchiseptica.
Проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.
Для проведения амплификации был использован прибор «Rotor-Gene Q»
Figure 00000006
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки ампли-фикатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя.
Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фигура 1). В четырех пробах, включая клинический образец к88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке - отрицательный образец - (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фигура 2).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4, фиг. 1, 2)
Figure 00000007
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору. Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Образец считается положительным (ДНК возбудителя (Bordetella bronchiseptica) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 32 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 32), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПНР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.
В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 32 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.
Образец считается отрицательным (ДНК возбудителя (Bordetella bronchiseptica) отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct по каналу FAM/Green и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, фиг. 1, 2).
Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого технического решения с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при выявлении генома возбудителя генома возбудителя Bordetella bronchiseptica на 3,7-4,3% выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.

Claims (7)

  1. Способ выявления ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica у сельскохозяйственных животных, включающий выделение ДНК из биологического материала животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома Bordetella bronchiseptica олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение специфического сигнала и сигнала контроля по каналам соответствующих красителей и интерпретацию результатов, отличающийся тем, что проводят флуоресцентную детекцию, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК генома возбудителя Bordetella bronchiseptica, а по каналу FAM/Green сигнал внутреннего контроля, интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Bordetella bronchiseptica и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
  2. BBrF1 GAAACCCAGGCCGCAAATTC - прямой праймер;
  3. BBrR1 CCCAGGCGCTCGAACAATA - обратный праймер;
  4. BBRP1 [R6G]TATAGCCGCCGCAAACCAC[BHQ1] - зонд;
  5. T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер;
  6. T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер;
  7. Т4Р FAMACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд.
RU2018134628A 2018-10-01 2018-10-01 Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных RU2703405C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018134628A RU2703405C1 (ru) 2018-10-01 2018-10-01 Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018134628A RU2703405C1 (ru) 2018-10-01 2018-10-01 Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2703405C1 true RU2703405C1 (ru) 2019-10-16

Family

ID=68280321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018134628A RU2703405C1 (ru) 2018-10-01 2018-10-01 Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2703405C1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542396C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ и набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542396C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ и набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
МАСТИЛЕНКО А.В. Разработка идентификации Bordetella Bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов, авто, Саратов, 2011. *
МАСТИЛЕНКО А.В. Разработка идентификации Bordetella Bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов, автореферат, Саратов, 2011. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2680094C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных
Léon et al. Identification of pathogenic Leptospira strains in tissues of a premature foal by use of polymerase chain reaction analysis
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN113930547B (zh) 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法
CN110878381A (zh) 一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组合物、试剂盒及方法
CN107460255A (zh) 一种检测猪丁型冠状病毒的rt‑lamp引物组、试剂盒及应用
CN111020042B (zh) 检测a族链球菌的组合物及方法
KR20190037027A (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법
RU2703405C1 (ru) Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных
RU2700477C1 (ru) Тест-система для обнаружения генома возбудителя ДНК Bordetella bronchiseptica инфекции у сельскохозяйственных животных
CN111778343A (zh) 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用
RU2700449C1 (ru) Способ выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота
CN113584221A (zh) 一种快速专一检测甲型流感病毒的试剂盒及其使用方法
RU2700254C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота
RU2700245C1 (ru) Способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV)
CN112063734A (zh) 一种采用实时荧光定量pcr技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法
CN113549709A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
RU2728660C1 (ru) Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
RU2703400C1 (ru) Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных
RU2814556C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2700450C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV)
RU2814548C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2700255C1 (ru) Тест-система для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных
RU2719719C1 (ru) Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2700456C1 (ru) Способ выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20201002