KR101798587B1 - 심장사상충 감염 진단 키트 및 방법 - Google Patents

심장사상충 감염 진단 키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심장사상충(Dirofilaria immitis) 감염 진단용 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 심장사상충의 미토콘드리아 COI 유전자를 표적으로 하는 프라이머쌍과 프로브를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

심장사상충 감염 진단 키트 및 방법{A kit and method for detecting heartworms}
본 발명은 심장사상충 감염 진단 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 심장사상충 특이적 프라이머쌍을 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 감염 진단방법, 또한 심장사상충 특이적 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 감염 진단방법에 관한 것이다.
심장사상충(Dirofilaria immitis)은 선형의 사상충(Filarial nematodes)의 일종으로 심폐의 사상충증(Cardiopulmonary dirofilariasis)의 원인이 된다. 심장사상충의 주요한 매개체는 모기이다. 심장사상충의 감염은 열대지방, 아열대지방 그리고 일부 온대지방에서 이루어지며 지구온난화로 인해 그 발생빈도와 발생지역이 늘어나고 있는 추세이다. 모기가 최종 숙주인 개(Canine), 고양이(Feline) 또는 사람(Human) 등을 물 때에 심장사상충의 감염이 이루어지는데, 18-34 ℃의 온도 조건에서 심장사상충이 유충(larvae) 단계로 성숙하게 되고 심장사상충의 유충은 모기의 머리에 머물다가 최종 숙주로 이동하게 되는 것이다. 최종 숙주로 이동한 심장사상충의 유충은 숙주의 혈액 내에 머물다가 6-8개월의 성숙 단계를 거쳐 성체(adult)로 발달하면서 최종 숙주의 심장으로 이동하게 된다. 심장으로 이동한 심장사상충 성체는 심폐의 사상충증을 유발하게 되며, 사상충증이 심화되면 결국 숙주는 죽음에 이르게 된다. 참고로, 사람의 체내에서는 심장사상충의 유충이 성충으로 발달하지 못하는 것으로 알려져 있다. 현재 널리 이용되고 있는 심장사상충 감염 진단 방법으로는 현미경(microscope)을 이용하는 형태학적인 방법과 심장사상충의 항원(antigen)을 검출하는 방법이 있다. 형태학적인 방법은 혈액 내에서 심장사상충을 선별하고 현미경을 이용하여 형태학적으로 비슷한 다른 종들과 구별해내야 하기 때문에 전문적인 지식이 요구되며, 항원 검출 방법의 경우는 심장사상충 암컷 성체(female adult)의 생식선에서 분비되는 항원을 검출 하는 것이기 때문에 감염이 된 이후 최소 6개월 내지 8개월이 지나야 감염 여부를 알 수 있다. 또한 항원 검출 방법의 경우 감염된 심장사상충의 수가 적거나 수컷만 감염된 경우에는 위음성(false-negative)의 결과를 낼 수 있다. 이러한 검출의 한계점을 극복하기 위해서 분자 진단(molecular detection)의 개발이 이루어져야 한다. 관련 선행기술로는 대한민국공개특허공보 제2009-0057514호의 월바키아 표면단백질 항원을 이용한 심장사상충 감염의 조기진단 방법이 개시되어 있으나, 상기 방법은 심장사상충에 기생하는 미생물인 윌바키아의 표면단백질 항원을 검출하는 방식으로, 심장사상충 게놈 유전자를 검출하는 분자진단 기술인 본 기술과는 검출 대상, 원리 및 방법 면에서 상이한 기술이다.
그러나, 상기 특허문헌을 포함한 선행기술의 심장사상충 감염 진단 방법은 감염 초기 진단이 어렵고 위음성(false negative)의 결과를 나타낼 수 있는 등의 단점들이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 심장사상충의 분자진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 소단위체 I(COI) 유전자 내에서 선택되는 13 내지 30 nt로 올리고뉴클레오티드로 구성되는 포워드 프라이머 및 상기 핵산서열의 상보서열 내에서 선택되는 13 내지 30 nt의 올리고뉴크레오티드로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 소단위체 I(COI) 유전자 내에서 선택되는 13 내지 30 nt로 올리고뉴클레오티드로 구성되는 포워드 프라이머, 상기 핵산서열의 상보서열 내에서 선택되는 13 내지 30 nt의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로 증폭되는 핵산분자의 핵산서열 또는 그에 상보적인 핵산서열 내에서 선택되는 15 내지 45 nt의 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 비인간 피검대상 동물로부터 혈액 시료를 채취하는 시료 채취단계; 상기 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 DNA 추출단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 제1항의 심장사상충 감염 진단용 키트를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 1차 PCR 단계; 및 상기 PCR 반응물을 확인하는 검출단계를 포함한 심장사상충 감염 진단방법이 제공된다.
아울러 본 발명의 일 관점에 따르면 상기 심장사상충 감염 진단용 키트로 증폭된 심장사상충 특이적 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급된 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 기술 개발 단계에서 심장사상충 COI 유전자 및 심장사상충과 형태학적으로 유사한 6종의 선형 사상충 COI 유전자의 BLAST 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)에서 심장사상충 감염 진단용 프라이머 세트의 검출 한계(Detection Limit)를 보여주는 사진이다.
[부호설명]
Lane 1: 플라스미드 DNA 카피수 5 x 106
Lane 2: 플라스미드 DNA 카피수 5 x 105
Lane 3: 플라스미드 DNA 카피수 5 x 104
Lane 4: 플라스미드 DNA 카피수 5 x 103
Lane 5: 플라스미드 DNA 카피수 5 x 102
Lane 6: 플라스미드 DNA 카피수 50
Lane 7: 플라스미드 DNA 카피수 0
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 개의 혈액으로부터 추출한 게노믹 DNA를 주형으로 한 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 사진이다.
[부호 설명]
Lane 1 내지 3: 심장사상충 유전자 검출 프라이머 및 개 유전자 검출 프라이머 세트를 동시에 반응시킨 결과(프라이머 농도 비율 비교)
Lane 1: 심장사상충 프라이머 500 nM, 개 프라이머 500 nM(1:1)
Lane 2: 심장사상충 프라이머 500 nM, 개 프라이머 250 nM(2:1)
Lane 3: 심장사상충 프라이머 500 nM, 개 프라이머 125 nM(4:1)
Lane 4 내지 6: 심장사상충 유전자 검출 프라이머 또는 개 유전자 검출 프라이머 세트를 단독으로 반응시킨 결과
Lane 4: 심장사상충 유전자 검출 프라이머 세트, 500 nM
Lane 5: 개 유전자 검출 프라이머 세트, 500 nM
Lane 6: Lane 4와 5의 PCR product 혼합물(mixture)
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 SyBR Green 실시간 중합효소연쇄반응(SyBR Green real-time PCR)에서 합성 단계 이후의 녹는 온도 곡선(melting curve)이다. 상기 녹는 온도 곡선은 심장사상충 감염 진단용 프라이머 세트의 특이도를 보여주는 것으로, 도 4A는 플라스미드 DNA를 주형으로 한 반응에서의 녹는 온도 곡선이며, 도 4B는 게노믹 DNA를 주형으로 한 반응에서의 녹는 온도 곡선이고, 도 4C는 상기 도4A의 플라스미드 DNA의 녹는 온도 곡선 및 상기 도4B의 게노믹 DNA의 녹는 온도 곡선을 합친 그래프(merging graph)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응(TaqMan real-time PCR)의 증폭 곡선(amplification plot)(A), 및 상기 반응에서 각각의 농도에서의 Ct값을 이용하여 선형 회귀 분석한 결과 생성된 표준 곡선(Standard curve)이다(B). 상기 도 5A의 증폭 곡선에는 농도별로 희석된 플라스미드 DNA 및 검출 한계(Detection limit)의 증폭 곡선을 포함한다. 상기 증폭 곡선 및 표준 곡선 모두 단일반응 및 동시반응의 그래프를 합친 그래프(merging graph)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭 곡선으로, 심장사상충 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 및 개 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하는 양성대조군, 개 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 만을 주형으로 하는 음성대조군, 검출한계 카피수(25 카피)의 심장사상충 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 및 개 유전자를 포함하는 검출한계, 심장사상충 감염 개 및 비감염 개의 혈액으로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하는 증폭 곡선이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "심장사상충(heartworm)"은 선충류인 Dirofilaria immitis가 모기를 매개체로 하여 자충의 형태로 전파되어 병인이 되는 기생충을 의미한다. 또 다른 의미로는 상기 자충이 최종적으로 개의 우심실과 폐동맥 내에 주로 기생하며 호흡기계와 기타 다른 여러 장기에 장애를 가져오는 질환이다. 상기 심장사상충은 한국과 일본을 비롯한 아시아, 아프리카, 중아아메리카 및 미국 동해안지역을 포함한 열대 또는 아열대지역의 개에게서 많이 볼 수 있다. 또한 상기 심장사상충은 사람을 비롯한 많은 포유동물에게 감염을 일으키지만 주로 개와 고양이 그리고 개과의 야생동물에 감염된다. 농림부 산하 수의과학연구소의 최근 보고에 따르면 국내의 개 전체 중 약 10%~20%가 이미 심장사상충에 감염되어 있다고 한다. 상기 심장사상충은 여름철 모기가 전염시키는 무서운 질병으로 하루 중에 해진 후부터 새벽까지 모기가 활동하는 시간이 위험하며, 여름철에는 반드시 예방을 해서 건강한 애견 생활을 보장해주어야 한다. 상기 개의 내부 기생충증인 심장사상충은 심장, 폐, 혈관 내에 주로 서식하는 국수처럼 가늘며 흰색을 띄는 기생충으로 심장 안에 짧게는 15 cm에서 길게는 30 cm까지(성충 수컷：12 cm 정도, 성충 암컷：25~30 cm 정도임)의 길이를 가진 수십에서 수백 마리의 성충이 꽉 들어차 있어 심장과 폐의 기능을 못하도록 하는 기생충이다. 더욱 무서운 것은 마이크로 필라리아(Micro filaria：Larvae)라는 사상충의 자충들(심장사상충의 유충으로 길고 가느다란 꼬리를 가지고 있으며 길이는 307~322 mm 정도임)이 수없이 생산되기 때문에 이들이 모세혈관 등에 들어가서 막아버리면 간, 신장 등의 혈관이 많은 기관들의 이상에 의해 2차적으로 부작용이 더욱 심해질 수 있어 치료하기 곤란한 상태가 된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "형광체(fluorophore)"는 특정 파장의 빛을 흡수하여 다른 파장의 빛을 방출하는 형광화합물을 의미한다. 형광체는 통상적으로 병합된 방향족 또는 몇개의 파이(π) 결합을 갖는 평면상 또는 환상의 분자를 포함한다. 대표적인 형광체로는 플루오레세인(fluorescein), 그의 아민 반응성 이소티오시아네이트 유도체인 FITC(fluorescein isothiocyanate), 카르복시플루오레세인(FAM), TETTM, Cy3, Cy5, Cy5.5, TAMRA, HEX, Rhodamine GreenTM-X, Rhodamine RedTM-X, TYETM, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 750, ATTOTM 488, ATTOTM 532, ATTOTM 565, ATTOTM Rho101, ATTOTM 590, ATTOTM 633, ATTOTM 647N, Texas Red®-X, Lightcycler® 640, 5'-IRDye® 700, 5'-IRDye® 800, 5'-IRDye® 800CW, WellRed D4, WellRed D3, WellRed D2, Oregon Green®6-FAM, JOE, MAX, ROX, 또는 Yakima Yellow®일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "소광체(quencher)"는 형광체의 여기상태에 작용하여 여기에너지를 제거하고 발광을 저해하는 분자를 의미한다. 소광체에는 대표적으로 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 존재하는데, FAM, TET, JOE, HEX, Oregon Green®에 의한 형광을 소거할 수 있는 BHQ1, TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5 및 Cy5.5에 의한 형광을 소거할 수 있는 BHQ2, Cy5 및 Cy5.5에 의한 형광을 소광할 수 있는 BHQ3 등이 포함된다. 아울러, BHQ 외에도 ATTO 소광체(ATTO 540Q, ATTO 580Q 및 ATTO 612Q), DDQ-I, Dabcyl, Eclipse, Iowa Black FQ, QSY-7, QSY-9, QSY-35, DDQ-II, BBQ-650, Iowa Blck RQ, Iowa Black FQ, TAMRA-3'(carboxytetramethylrhodamine) 및 QSY-21 등이 포함된다. 소광체에 의한 소광현상은 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 분석의 기반이 되며, TaqMan 프로브에 의한 실시간 PCR 반응 및 각종 분자간 상호작용 여부의 확인을 위한 분석에 매우 유용하게 사용되고 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 소단위체 I(COI) 유전자 내에서 선택되는 13 내지 30 nt로 올리고뉴클레오티드로 구성되는 포워드 프라이머 및 상기 핵산서열의 상보서열 내에서 선택되는 13 내지 30 nt의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 키트가 제공된다.
상기 심장사상충 감염 진단용 키트에 있어서, 상기 포워드 프라이머는 서열번호 7의 1 내지 60번째, 67 내지 115번째, 131 내지 154번째, 165 내지 257번째, 274 내지 325번째, 342 내지 415번째, 437 내지 465번째, 476 내지 509번째, 516 내지 563번째, 574 내지 605번째 핵산서열로부터 선택될 수 있고, 상기 리버스 프라이머는 서열번호 7의 67 내지 115번째, 131 내지 154번째, 165 내지 257번째, 274 내지 325번째, 342 내지 415번째, 437 내지 465번째, 476 내지 509번째, 516 내지 563번째, 574 내지 605번째, 617 내지 650번째 핵산서열과 상응되는 상보서열로부터 선택될 수 있다.
아울러, 상기 심장사상충 감염 진단용 키트는 상기 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로 증폭되는 핵산분자의 핵산서열 또는 그에 상보적인 핵산서열 내에서 선택되는 15 내지 45 nt의 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 심장사상충 검출용 프로브는 서열번호 7의 1 내지 60번째, 67 내지 115번째, 131 내지 154번째, 165 내지 257번째, 274 내지 325번째, 342 내지 415번째, 437 내지 465번째, 476 내지 509번째, 516 내지 563번째, 574 내지 605번째, 또는 617 내지 650번째 핵산서열 또는 그에 상응하는 상보서열 내에서 선택될 수 있다.
본 발명의 좀 더 바람직한 실시태양에서, 상기 포워드 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 상기 리버스 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 심장사상충 검출용 프로브는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 것일 수 있다.
아울러, 상기 심장사상충 감염 진단용 키트는 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍을 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우 실시간 PCR을 위하여 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 소단위체 I(COI) 유전자 내에서 선택되는 13 내지 30 nt로 올리고뉴클레오티드로 구성되는 포워드 프라이머, 상기 핵산서열의 상보서열 내에서 선택되는 13 내지 30 nt의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로 증폭되는 핵산분자의 핵산서열 또는 그에 상보적인 핵산서열 내에서 선택되는 15 내지 45 nt의 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트가 제공된다.
상기 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트에 있어서, 상기 포워드 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 리버스 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이며, 상기 심장사상충 검출용 프로브는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 것일 수 있다.
아울러, 상기 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트는 서열번호 4 및 서열번호 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 비인간 피검대상 동물로부터 혈액 시료를 채취하는 시료 채취단계; 상기 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 DNA 추출단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 제1항의 심장사상충 감염 진단용 키트를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 1차 PCR 단계; 및 상기 PCR 반응물을 확인하는 검출단계를 포함한 심장사상충 감염 진단방법이 제공된다.
상기 진단방법에 있어서, 상기 PCR 반응은 상기 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로 증폭되는 핵산분자의 핵산서열 또는 그에 상보적인 핵산서열 내에서 선택되는 15 내지 45 nt의 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브가 추가로 이용되는 실시간 PCR 반응일 수 있다.
상기 진단방법에 있어서, 상기 포워드 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 리버스 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이며, 상기 심장사상충 검출용 프로브는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 것일 수 있다.
상기 진단방법은 상기 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 프라이머쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 2차 PCR 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 진단방법에 있어서, 상기 1차 PCR 단계 및 상기 2차 PCR 단계는 별도의 튜브에서 독립되어 수행되거나 하나의 튜브에서 다중반응(duplex reaction)으로 수행될 수 있다.
상기 진단방법에 있어서, 상기 2차 PCR 단계는 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 추가로 이용하는 실시간 PCR 반응에 의해 수행될 수 있다.
상기 진단방법은 상기 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 프라이머쌍 및 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성된 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하는 1차 실시간 PCR 단계; 및 상기 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하는 2차 실시간 PCR 단계를 포함할 수 있다.
상기 진단방법에 있어서, 상기 1차 실시간 PCR 단계 및 2차 실시간 PCR 단계는 독립적으로 수행되거나 하나의 튜브에서 다중반응으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면 상기 심장사상충 감염 진단키트로 증폭된 심장사상충 특이적 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명자들은 심장사상충 감염을 조기에 정확하게 검출할 수 있는 심장사상충 감염 진단키트를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 심장사상충의 미토콘드리아 유전자 중 사이토크롬 산화효소 소단위체 I(cytochrome oxidase subunit I, COI)의 핵산서열이 다른 감염성 선충의 핵산서열과 상동성이 낮은 부분이 존재하여 이러한 부분을 선택하여 프라이머쌍과 프로브를 고안할 경우, 심장사상충 감염만을 특이적으로 검출할 수 있을 것으로 판단하였다. 이에 본 발명자들은 심장사상충 및 다른 감염성 선충의 COI 유전자에 대한 상동성 분석을 통해 상기 상동성이 낮은 부분으로 서열번호 7의 핵산서열을 기준으로 1 내지 60번째, 67 내지 115번째, 131 내지 154번째, 165 내지 257번째, 274 내지 325번째, 342 내지 415번째, 437 내지 465번째, 476 내지 509번째, 516 내지 563번째, 574 내지 605번째, 또는 617 내지 650번째 핵산서열을 선정하였고, 그 중 38 내지 57번째 핵산서열을 포워드 프라이머로, 167 내지 187번째 핵산서열에 상응하는 상보서열을 리버스 프라이머로 그리고 74 내지 114번째 핵산서열을 프로브로 정하여 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, PCR 반응 및 실시간 PCR 반응을 수행한 결과, 심장사상충의 감염 여부를 매우 높은 감도와 정확도로 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
1. BLAST를 실시하여 선형 사상충 7종의 특정 유전자 염기서열 연관성 분석
본 발명자들은 심장사상충(Dirofilaria immitis)을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하기 위하여 심장사상충과 유사한 형태 및 유전 정보를 갖고 있는 선형 사상충(Filarial Nematodes)들의 유전 정보를 BLAST(Basic Local Alignment Tool) 알고리즘과 Genbank database를 이용하여 분석하였다.
상기 비교 대상이 된 유전정보로는 COI(Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자를 사용하였는데, 상기 COI 유전자는 미토콘드리아 DNA(MtDNA)의 일종이다.
본 발명자들은 심장사상충의 COI 유전자를 비교대상으로 하여 심장사상충 외 6종의 선형 사상충의 COI 유전자를 BLAST하였고, 그 결과 COI 유전자 상에서 85-90%의 상동성이 있음을 확인하였다. 이 중 일부 염기서열은 7종에서 모두 일치하였고, 또 다른 일부 염기서열은 유사한 염기서열을 보였으며, 일부에서는 전혀 다른 염기서열을 보였다(표 1 및 도 1 참조). 이러한 COI 유전자 염기서열 중에서 심장사상충 특이 염기서열을 선별하여 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 감염 진단용 프라이머쌍 및 상기 프라이머쌍으로 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 중간 부분으로부터 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드인 심장사상충 검출용 프로브를 디자인하였다.
아울러, 표준유전자(Internal standard gene)로 개의 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 선택하여 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 유전자 검출용 프라이머쌍 및 상기 프라이머쌍으로 증폭되는 폴리뉴클레오티드의 중간 부분으로부터 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드인 유전자 검출용 프로브를 디자인하였다(표 2). 상기 디자인된 프라이머 및 프로브의 서열은 또 다시 BLAST를 통해 그 특이도를 검증하였다.
선형 사상충 7종의 Cytochrome C oxidase I(COI) gene 염기서열 분석
GenBank 등록번호 기생충 종명 BLAST 분석결과
EU159111.1 Dirofilaria immitis Query
AB973225.1 Dirofilaria repens 90%
AJ544874.1 Setaria tundra 89%
EF174428.1 Staris digitate 88%
AJ271610.1 Brugia malayi 85%
AJ271612.1 Wuchereria bancrofti 86%
AM749284.1 Onchocerca volvulus 89%
심장사상충 감염 진단 프라이머 세트
명칭 핵산서열 서열번호
심장사상충 COI 특이적 포워드 프라이머 ATT GGG TGC CCC TGA AAT GG 1
심장사상충 COI 특이적 리버스 프라이머 CCC TCT ACA CTC AAA GGA GGA 2
심장사상충 COI 특이적 프로브 TGC TTT ATC TTT TTG GAT TAC TTT TGT TGC GTT GTT GAT GG 3
개 GAPDH 특이적 포워드 프라이머 CAT GTT TGT GAT GGG CGT GAA 4
개 GAPDH 특이적 리버스 프라이머 GAT GAC TTT GGC TAG AGG AGC 5
개 GAPDH 특이적 프로브 CAG CAA TGC CTC CTG CAC CAC CAA C 6
2. 프라이머 및 프로브 제작과 검증
본 발명자들은 상기 표 2에 기재된 프라이머 및 프로브를 모두 IDT(Integrated DNA Technologies, 미국)를 통해 제작하였다. 상기 심장사상충 유전자 검출용 프로브의 5'-말단 및 3'-말단에 각각 형광체인 6-카르복시플루오레세인(6-FAM: 여기파장 494 nm, 방출파장 521 nm) 염료 및 소광체인 ZENTM-Iowa Black® FQ quencher(Integrated DNA technologies, USA)가 연결되도록 제작하였다. 한편, 개의 유전자 검출용 프로브의 경우, 5'-말단 및 3'-말단에 각각 형광체인 헥사클로로플루오레세엔(HEX: 여기파장 538 nm, 방출파장 555 nm) 염료 및 소광체로 ZENTM-Iowa Black® FQ quencher를 연결하였다. 상기 프로브는 TaqMan 실시간 정량 중합효소연쇄반응을 위한 것으로, 프로브를 이용함으로써 특정 유전자에 대한 특이도를 높이고 보다 신속하고 정확한 실시간 정량이 가능하게 된다. 서울대학교 수의과대학을 통해 수득된 개의 혈액을 이용하여 상기에서 제조된 프라이머를 검증하였다. 개의 혈액으로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 상기에서 제조된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 중합효소 연쇄반응의 결과물(PCR product)의 염기서열을 시퀀싱(sequencing)을 통해 분석하였다. 시퀀싱 결과 심장사상충 유전자 검출용 프라이머 세트 및 개 유전자 검출용 프라이머 세트 모두 정확하게 타겟(target) 유전자에 결합하여 작용한다는 것을 확인하였다.
3. 플라스미드 DNA 제작 및 검증
본 발명자들은 상기 시퀀싱으로 그 염기서열이 검증된 중합효소연쇄반응의 결과물을 이용하여 감염 진단을 위한 양성대조군 및 표준 물질로서 심장사상충 COI 또는 개 GAPDH 의 특정 염기서열을 각각 포함하는 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 제작하였다. 구체적으로 심장사상충에 감염된 개의 혈액으로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 표 2의 심장사상충 COI 유전자 검출용 프라이머 세트 또는 개 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트를 이용하여 수행된 중합효소 연쇄반응의 결과물을 각각 정제한 후, T-벡터(pLUG-Prime® TA-cloningvector, 인트론바이오텍, 한국)에 삽입하여 플라스미드 DNA를 제작하였고, 제작된 플라스미드 DNA의 염기서열을 시퀀싱을 통해 검증하였다. 상기 시퀀싱 결과 플라스미드 DNA에 삽입된 DNA가 심장사상충의 COI 유전자의 특정 염기서열과 각각 100% 일치한다는 것을 확인하였다. 상기 플라스미드 DNA 및 각각의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 다시 한 번 플라스미드 DNA를 검증하였다. 상기 제작된 플라스미드 DNA는 이후 진행된 모든 실험의 양성 대조군(Positive Control) 및 표준물질(Standard)로 사용되었으며, 그 카피수(copy number)는 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
Figure 112016037512920-pat00001
X: DNA의 양(단위: ng)
N: DNA의 길이(단위: bp)
6.0221 x 1023: 아보가드로 수
660g/mole: 이중가닥 DNA 1 bp의 평균 질량
4. 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 심장사상충 감염 여부 진단
본 발명자들은 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 진단에는 DNA 또는 RNA 등을 주형으로 이용할 수 있으며, 상기 증폭 방식은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR) 또는 또 다른 방식의 PCR 형태일 수 있다. 또 다른 측정 방식으로는 노던 블라팅, DNA 칩 등이 포함될 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 개의 혈액으로부터 게노믹 DNA 추출
본 발명자들은 EDTA 튜브에 수집한 개의 혈액으로부터 게노믹 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 상기 게노믹 DNA는 alphaPrepTM Genomic DNA minikit(알파젠, 한국)를 이용하여 추출하였고, 상기 kit가 제공하는 절차에 따라, 200 ㎕(마이크로 리터)의 혈액을 스핀 컬럼(spin culumn) 방식을 이용하여 100 ㎕의 용출 용매(elution buffer)를 이용하여 추출하였다. 상기 게노믹 DNA 추출 후 UV/VIS 분광광도계(NanoDrop, Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였고, 260 nm에서의 흡광도와 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 게놈 DNA의 순도를 확인하였다. 상기 흡광도 비율은 1.8에서 2.0 사이로 측정되었다.
실시예 2: 심장사상충 검출용 프라이머 세트의 진단 한계 확인
본 발명자들은 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 검출용 프라이머쌍의 검출 한계(Limit of Detection)를 측정하기 위해 상기 발명 단계에서 제작한 심장사상충 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 40초씩 35사이클, 72℃에서 7분을 반응시켰다.
상기 중합효소연쇄반응에 이용한 프라이머의 농도는 각각 500 nM이며, 5 x 106부터 50 카피수(copy number)까지 10분의 1씩 단계별로 희석한 플라스미드 DNA를 주형으로 하였고, 중합효소 등 연쇄반응에 필요한 시약들을 포함하는 PCR master mix는 알파젠(한국)의 제품을 이용하였다. 중합효소연쇄반응의 결과물은 2% 아가로즈 젤 및 0.5X TBE 버퍼를 이용하여 전기영동을 수행한 후 자외선 조명기(UV illuminator)를 이용하여 증폭 결과를 관찰하였다. 그 결과 본 발명에서 디자인되고 제작된 심장사상충 검출용 프라이머 세트의 진단 한계가 50 카피로 그 민감도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 3: 심장사상충 유전자 검출용 프라이머 세트를 이용한 심장사상충 감염 진단
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 추출된 게놈 DNA 50 ng을 주형으로 하여 본 발명의 실시예 2에서도 중합효소연쇄반응과 동일한 조건으로 반응을 실시하였다. 상기 반응의 결과 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 검출용 프라이머쌍(500 nM)은 150 bp의 산물(PCR product)을 산출하였고, 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍은 106 bp의 산물을 산출하였다(도 3, Lane 4 내지 6).
아울러 본 발명자들은 심장사상충 유전자 및 개 유전자를 하나의 샘플로부터 동시에 검출하기 위해 프라이머의 농도를 조절(도 3, Lane 1 내지 3)한 결과 심장사상충의 COI 유전자 검출용 프라이머 세트 500 nM과 개의 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트 250 nM(2:1의 비율)로 반응하였을 때 두 가지 종류의 유전자 증폭 결과물을 비슷한 밴드 강도로 얻을 수 있었다(도 3, Lane 2).
실시예 4: 심장사상충 유전자 검출용 프라이머 세트의 검출 특이도
본 발명자들은 심장사상충 유전자 검출용 프라이머 세트의 검출 특이도(Specificity)를 확인하기 위하여 SyBR Green을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응 및 녹는 온도(Melting temperature) 측정을 실시하였다.
상기 SyBR Green을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응은 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분씩 40싸이클을 반응시켰고, CT(한계치의 싸이클; Cycle of Threshold)값은 자동으로 설정하였다. 각 싸이클마다 어닐링 단계(annealing step: 상기 증폭에서는 60℃인 시점)에서 데이터를 실시간으로 수집하였다. 증폭 이후의 녹는 온도 측정 단계는 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 간 반응시킨 후 60℃부터 95℃까지 0.3℃ 간격으로 증가시켜 상기 증폭 결과물의 녹는 온도 특이점(specific melting temperature of the amplification product)을 측정하였다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응에 이용한 프라이머의 농도는 각각 500 nM이며, 양성 대조군인 심장사상충 COI 유전자 함유 플라스미드 DNA 주형의 경우 5 x 108부터 50 카피(copies)까지 10분의 1씩 단계별로 희석하여 반응을 수행 하였고(도 4A), 심장사상충에 감염된 개의 게놈 DNA 주형의 경우 50 ng 부터 0.2 ng까지 2분의 1씩 단계별로 희석하여 반응을 수행하였다(도 4B). 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 AB(Applied Biosystems, 미국)의 SyBR Green master mix를 이용하였고, 모든 실시간 증폭 반응, 데이터 수집 및 분석은 AB(Applied Biosystems, 미국)의 StepOnePlusTM 장비 및 StepOne Software v2.3 프로그램을 이용하였다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응 결과 단계별로 희석한 심장사상충 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 및 심장사상충에 감염된 개의 게놈 DNA에서 모두 76.74℃에서 단 하나의 특이 녹는 온도 정점(one specific melting temperature peak)을 나타내었다(도 4A 및 4B). 도 4A 및 4B의 녹는 곡선(melting curve)을 합친 그래프(merging graph)인 도 4C를 통해 각각의 녹는 곡선의 경향 및 녹는 온도 정점이 일치함을 확인하였다.
상기 결과는 심장사상충 유전자 검출용 프라이머 세트의 심장사상충 유전자에 대한 특이도(Specificity)를 보여주는 것으로, 상기 프라이머 세트가 숙주인 개의 유전자, 다른 유사한 유전자를 갖고 있는 기생충 또는 어떠한 다른 종류의 유전자에 반응하지 않고 심장사상충 유전자에만 반응하여 심장사상충 유전자를 특이적으로 증폭시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 심장사상충 검출용 프라이머와 프로브 세트의 진단 한계
본 발명자들은 상기 실시예 2내지 4에서 검출 민감도 및 검출특이도가 검증된 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 심장사상충 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍 외에 상기 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성된 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 추가로 이용하여, TaqMan 실시간 정량 중합효소연쇄반응(TaqMan real-time quentificatioin PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 50℃에서 2분 반응시킨 후(incubation), 95℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분씩 40사이클을 반응시켰다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응에 이용한 심장사상충 유전자 검출용 프라이머쌍 및 프로브의 농도는 각각 500 nM 및 250 nM, 개 GAPDH 유전자 검출용 프라이머쌍 및 프로브의 농도는 각각 50 nM 및 250 nM이며, 심장사상충 유전자 검출용 프라이머쌍과 프로브 세트 및 개 GAPDH 유전자 검출용 프라이머쌍과 프로브 세트를 각각(단일반응, Simplex reaction) 또는 동시에 반응(동시반응, Duplex reaction)시켰다. 단일반응의 주형은 심장사상충 COI 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA로써, 5 x 108부터 50 카피(copies)까지 10분의 1씩 단계별로 희석하였고, 25 카피의 플라스미드 또한 반응시켰다. 동시반응은 상기 카피수별 심장사상충 플라스미드 DNA와 함께 5 x 106카피의 개 GAPDH 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 함께 주형으로 하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 AB(Applied Biosystems, 미국)의 TaqMan PCR master mix를 이용하였고, 모든 실시간 증폭 반응, 데이터 수집 및 분석은 AB(Applied Biosystems, 미국)의 StepOnePlusTM 장비 및 StepOne Software v2.3 프로그램을 이용하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응 결과 심장사상충 감염 진단용 프라이머쌍과 프로브 세트의 검출 한계는 25 카피로 그 민감도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5A). 아울러, 상기 단일반응 및 동시반응에 있어서 심장사상충 COI 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA, 5 x 108부터 50 카피까지의 Ct 값들을 이용하여 선형 회귀분석을 수행한 결과 단일반응 추세선(trend line)의 결정계수(coefficient of determination, R-square)는 0.9993이고 동시반응 추세선의 결정계수는 0.9992로 두 반응 모두 그 직선성이 매우 높게 나왔고, 상기 단일반응과 동시반응의 추세선의 기울기(slop value)가 각각 -3.645 및 -3.6008로 매우 유사한 수치를 나타내어, 심장사상충 및 개 유전자를 동시에 검출하는 동시반응의 PCR 효율이 심장사상충 유전자만을 검출하는 단일반응의 PCR 효율에 뒤지지 않음을 확인하였다(도 5B).
실시예 6: 심장사상충 검출용 프라이머와 프로브 세트를 이용한 심장사상충 감염 진단
본 발명자들은 상기 일실시예 1에서 추출된 게놈 DNA 50 ng을 주형으로 하여 실시예 5의 TaqMan 실시간 정량 중합효소연쇄반응과 동일한 조건으로 반응을 실시하였다. 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 양성대조군은 심장사상충 유전자 플라스미드 DNA 및 개 GAPDH 유전자 플라스미드 DNA를 각각 5 x 106 카피씩 주형으로 사용하였고, 음성대조군은 5 x 106 카피의 개 GAPDH 플라스미드 DNA 만을 주형으로 하였다. 검출한계는 25 카피의 심장사상충 유전자 플라스미드 DNA 및 5 x 106 카피의 개 GAPDH 유전자 플라스미드 DNA를 주형으로 하였다. 감염 샘플 및 비감염 샘플은 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 각각 감염된 개와 감염되지 않은 개의 혈액으로부터 추출한 50 ng의 게놈 DNA를 주형으로 하였다.
그 결과, 상기 TaqMan 실시간 중합효소연쇄반응 결과 양성대조군의 Ct값은 14, 검출한계점(25 카피)의 Ct값은 34, 심장사상충 감염 샘플들의 Ct값은 24 내지 26사이로 나타났다(도 6). 상기 심장사상충 감염 샘플을 이용한 감염진단은 상기 일실시예 5의 반응과 동시에 이루어진 것으로, 상기 심장사상충 감염 샘플들의 Ct값은 상기 일실시예 5에서 선형 회귀분석에 의해 생성된 표준 곡선(standard curve)의 Ct값을 기준으로 그 카피수를 계산해볼 수 있다. 상기 심장사상충 감염 샘플들의 Ct값은 24 내지 26사이로 심장사상충 COI 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA, 5 x 103 카피수의 Ct 값의 범위에 있으므로, 심장사상충 감염 샘플의 심장사상충 유전자 카피수는 대략 5 x 103 카피수이다.
이에, 상기 본 발명은 심장사상충 감염 여부를 감염 초기 단계부터 심장사상충 유전자 특이적으로 신속하고 정밀하게 진단할 수 있다.
상기 결과들은 심장사상충 감염 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명의 일 실시예를 통해 분자진단 키트 도출을 위한 연구에 매우 유용할 것으로 생각된다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Eulji University Industry Academy Cooperation Foundation <120> A kit and method for detecting heartworms <130> PD16-5359 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for heartworm COI gene <400> 1 attgggtgcc cctgaaatgg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for heartworm COI gene <400> 2 ccctctacac tcaaaggagg a 21 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for heartworm COI gene <400> 3 tgctttatct ttttggatta cttttgttgc gttgttgatg g 41 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for canine GAPDH gene <400> 4 catgtttgtg atgggcgtga a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for canine GAPDH gene <400> 5 gatgactttg gctagaggag c 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for canine GAPDH gene <400> 6 cagcaatgcc tcctgcacca ccaac 25 <210> 7 <211> 689 <212> DNA <213> Dirofilaria immitis <400> 7 tgattggtgg ttttggtaat tggatgttgc ctttgatatt gggtgcccct gaaatggctt 60 ttcctcgtgt taatgcttta tctttttgga ttacttttgt tgcgttgttg atggtttatc 120 aatctttttt tattgggggg ggtcctggga gtagttgaac tttttatcct cctttgagtg 180 tagagggtca gcctgagtta tctttggata gaatgatttt aggtcttcat actgttggta 240 ttggttcttt attaggtgct attaatttta tggttactgt tcagaatata cgttctactg 300 ctgtaacttt agatcagatt agtatgtttg tttgaacttc ttatttaact tcttttttat 360 tggtattgtc agtgcctgtt ttggctggtt ctttattatt tttgttgttg gatcgtaatt 420 ttaatacttc tttttatgat gctaataagg ggggtaatcc tttattgtat cagcatttgt 480 tttggttttt tggacatcct gaggtttatg ttattatttt accggtgttt gggattgtta 540 gtgaatgtgt tttatttttg actgataagg atcgtttgtt tggccagact agtatgactt 600 ttgcttctat ttggattgct gtattgggga cttctgtttg gggtcatcat atgtatacag 660 ctggtttgga tattgatact cgtacttat 689

Claims (21)

  1. 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머, 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 증폭용 검출용 프라이머쌍을 추가로 포함하는, 심장사상충 감염 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 추가로 포함하는 심장사상충 감염 진단용 키트.
  10. 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머, 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 포함하는 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    서열번호 4 및 서열번호 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 추가로 포함하는, 심장사상충 감염 진단용 실시간 PCR 반응 키트.
  13. 비인간 피검대상 동물로부터 혈액 시료를 채취하는 시료 채취단계;
    상기 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 DNA 추출단계;
    상기 게놈 DNA를 주형으로 제1항의 심장사상충 감염 진단용 키트를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 1차 PCR 단계; 및
    상기 PCR 반응물을 확인하는 검출단계를 포함한 심장사상충 감염 진단방법.
  14. 제13항에 있어서,
    서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브가 추가로 이용되는 실시간 PCR 반응인, 진단방법.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서,
    상기 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 2차 PCR 단계를 추가로 포함하는, 진단방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 1차 PCR 단계 및 상기 2차 PCR 단계는 별도의 튜브에서 독립되어 수행되거나 하나의 튜브에서 다중반응(duplex reaction)으로 수행되는, 진단방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 2차 PCR 단계는 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 추가로 이용하는 실시간 PCR 반응에 의해 수행되는, 진단방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 프라이머쌍 및 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성된 올리고뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 심장사상충 검출용 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하는 1차 실시간 PCR 단계; 및
    상기 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 4 및 5로 각각 기재되는 핵산서열로 구성되는 개 유전자 검출용 프라이머쌍 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 형광체 및 소광체가 연결된 개 유전자 검출용 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하는 2차 실시간 PCR 단계를 포함하는, 진단방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 1차 실시간 PCR 단계 및 2차 실시간 PCR 단계는 독립적으로 수행되거나 하나의 튜브에서 다중반응으로 수행되는, 진단방법.
  21. 삭제
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