CN103175816A - 一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法。它包括如下步骤：（1）在F₀F₁-ATP合酶的ε亚基上依次连接生物素化的ε亚基多克隆抗体、链亲和素和生物素化的2-十二烷基环丁酮多克隆抗体，得到分子马达生物传感器；（2）用溶剂提取未经辐照的含脂食品得到溶剂提取液a；将其与分子马达生物传感器在启动缓冲液存在的条件下进行反应；向反应体系中加入PBS缓冲液终止反应；然后将所述反应体系的反应液与荧光素/荧光素酶溶液混匀，用超微弱发光仪进行检测，得到未经辐照的含脂食品的荧光强度；（3）用溶剂萃取待鉴定的含脂食品得到溶剂提取液b，将溶剂提取液b进行步骤（2）同样的操作，得到待鉴定含脂食品的荧光强度，即实现对含脂食品的鉴定。本发明提供的鉴定辐照含脂食品的方法可将检测时间缩短至10分钟左右，且2-DCB检测灵敏度能达到10^-4μg/mL，满足现有的辐照含脂食品检测范围。

Description

一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法。

背景技术

辐照技术已经广泛应用于提高食品卫生安全、延长货架期。自1990年辐照食品商业化以来，辐照食品产业已发展成为重要的国际贸易（Stewart,E.M.In FoodIrradiation Principals and Applications.Molins,R.A.,Ed.,New York:Wiley Interscience,2001:347-386）。为了落实辐照食品标签法规，提高消费者的信心，需要一种可靠、快速的辐照食品检测方法。

2-烷基环丁酮（2-ACBs）是含脂食品的特异性辐解产物，可作为标志物检测含脂辐照食品（Obana H,FurutaM,Tanaka Y.Evaluation of2-dodecylcyclobutanone as anirradiation dose indicator in fresh irradiated ground beef.J Agric Food Chem.,2005,53(17):6603-6608；Obana H,Furuta M,Tanaka Y.Detection of irradiated meat,fish andtheir products by measuring2-alkylcyclobutanones levels after frozen storage.J Food HygSoci Japan,2007,48(6):203-206）。2-十二烷基环丁酮（2-DCB）由食品中的棕榈酸和棕榈酸甘油酯辐解产生，是2-ACBs中的一种。由于在大部分食品中，棕榈酸是含量较高的饱和脂肪酸，并且其烃基链较短且饱和，相对其它2-ACBs较为稳定。因此选用2-DCB作为检测含脂辐照食品的标志性化合物具有实用性。

目前2-DCB的检测方法主要为气相色谱-质谱（GC-MS）联用法（EuropeanCommittee for Standardization(2003)Foodstuffs-Detection of Irradiated Food ContainingFat-Gas Chromatographic/Mass Spectrometric Analysis of2-AlkylcyclobutanonesEN1785:2003;European Committee for Standardization:Brussels），该方法对样品的提取和纯化时间长，需要大量有机溶剂并且GC/MS设备昂贵。因此迫切需要开发一种快速、简便、不需贵重仪器的含脂辐照食品检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法，以克服现有方法提取和纯化时间长、需要大量有机溶剂并且仪器昂贵等缺点。

本发明所提供的一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法，包括如下步骤：

（1）在F₀F₁-ATP合酶的ε亚基上依次连接生物素化的ε亚基多克隆抗体、链亲和素和生物素化的2-十二烷基环丁酮多克隆抗体，得到分子马达生物传感器；

（2）用溶剂萃取未经辐照的含脂食品得到溶剂提取液，记为溶剂提取液a；将所述溶剂提取液a与所述分子马达生物传感器在启动缓冲液存在的条件下进行反应；向所述反应体系中加入PBS缓冲液终止反应；然后将所述反应体系的反应液与荧光素/荧光素酶溶液混匀，用超微弱发光仪进行检测，至少检测3次，得到所述未经辐照的含脂食品的荧光强度；

（3）用所述溶剂萃取待鉴定的含脂食品得到溶剂提取液，记为溶剂提取液b；所述溶剂提取液b与所述分子马达生物传感器在所述启动缓冲液存在的条件下进行反应；向所述反应体系中加入所述PBS缓冲液终止反应；然后将所述反应体系的反应液与所述荧光素/荧光素酶溶液混匀，用超微弱发光仪进行检测，至少检测3次，得到所述待鉴定的含脂食品的荧光强度；

如果待鉴定的含脂食品的荧光强度与所述未经辐照的含脂食品的荧光强度在0.05水平上存在显著差异，则所述待鉴定的含脂食品候选为经过辐照的含脂食品。

上述的方法中，步骤（1）中，连接所述生物素化的ε亚基多克隆抗体、所述链亲和素和所述生物素化的2-十二烷基环丁酮多克隆抗体的步骤均可在所述PBS缓冲液中进行。

上述的方法中，所述PBS缓冲液的组成如下：0.2g KH₂PO₄、3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl、8g NaCl、1000mL双蒸水；

所述PBS缓冲液的pH为7.4。

上述的方法中，所述溶剂可为乙腈，常温下2-DCB在乙腈中的溶解度大于5mg/L，远大于食品中可能存在的2-DCB含量。

上述的方法中，所述方法还包括对所述溶剂提取液a和所述溶剂提取液b用硅胶固相萃取小柱（1g，6mL）进行净化的步骤。

上述的方法中，所述启动缓冲液的组成如下：20mM Tricine–NaOH、2mM MgCl₂、2mM Na₂HPO₄和0.5mM二磷酸腺苷（ADP）；

所述启动缓冲液的pH值为8.0。

上述的方法中，步骤（2）中，所述溶剂提取液a、所述分子马达生物传感器、所述PBS缓冲液、所述荧光素/荧光素酶溶液混合物的体积比可为1：1：45：3。

上述的方法中，步骤（3）中，所述溶剂提取液b、所述分子马达生物传感器、所述PBS缓冲液和所述荧光素/荧光素酶溶液混合物的体积可为1：1：45：3。

上述的方法中，所述含脂食品具体可为牛肉。

本发明提供的鉴定辐照含脂食品的方法可将检测时间缩短至10分钟左右，且2-DCB检测灵敏度能达到10^-4μg/mL，满足现有的辐照含脂食品检测范围。

附图说明

图1为0.5mg/L2-DCB标准样品（a），未辐照样品（b），辐照样品（c，0.5kGy），辐照样品（d，5kGy）和加标样品（e，0.5mg/kg牛肉）的选择离子m/z=98、12色谱图。

图2为本发明构建的分子马达生物传感器的模式图，图中a、b、c、α、β、δ、γ和ε均为ATP合成酶亚基，1表示ε亚基多克隆抗体，2表示链亲和素，3表示生物素，4表示2-DCB多克隆抗体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的仪器和主要试剂：

RE-2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；

硅胶固相萃取小柱（1g，6mL，Varian Inc.公司）；

RT-A3型食品绞肉机（北京瑞天盛达电器有限公司）；

重铬酸银（Ag₂Cr₂O₇）剂量计；

Mettler AE240型电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；

超微弱发光仪（Centro XS3LB960，德国）；

荧光光度计（芬兰Thermolabsystems公司）；

新鲜冷却牛腩肉（含脂30%）（北京美廉美超市）；

乙腈、正己烷、乙醚，分析纯无水硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；

色谱纯正己烷，2-DCB（美国sigma公司）；

链亲和素、生物素，ADP、牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司）；

2-氧-环丁烷十一烷酸（圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司）；

荧光素/荧光素酶（FF2021，美国Promega公司）；

FITC购自Molecular Probes(Eugene,Oregon,USA）；

PBS缓冲液的配制方法为：0.2g KH₂PO₄、3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl和8gNaCl溶于1000mL ddH₂O，调pH为7.4。

ε亚基的表达与纯化：

带有His-tag的ε亚基的基因亚克隆到pET22b中转入E.coli BL21中。菌种在LB培养基中生长到对数生长期（OD₆₀₀值在0.6～0.8之间）时，1mM IPTG加入到细胞中继续培养6h（20°C）。将上述扩培的菌种在Hitachi-CR7.日立离心机中4°C、4000r/min离心30min取沉淀，溶于溶解缓冲液（50mM tris-HCl，5mM MgCl₂,20mM NaCl，1mMEDTA，0.5mM DTT)中，在Hitachi-CR22G(Rotor:R20A2)离心机中4°C、8000r/min离心20min取下层。得菌体17.02g，于-20°C冰箱中保存。

用咪唑液（50mM Tris-HCl,5mM MgCl₂,300mM NaCl）60ml(已加入蛋白酶抑制剂0.1mol/L PMSF稀释1000倍且30min加一次和0.1mol/Lβ-巯基乙醇稀释1000倍用)将上述冷冻后细菌溶解，倒入小烧杯中在超声细胞破碎仪中进行细胞破碎（超声5s，停8s，共超声10min，320W）。

4°C、15000G离心30min后取上清做蛋白洗脱。Ni-NTA亲和柱柱前处理：30%乙醇洗—超滤水洗—100mM EDTA洗—超滤水洗—100mM NiSO₄洗—超滤水洗—咪唑液（50mM tris-HCl,5mM MgCl₂,300mM NaCl）（平衡柱子）—加入上清液—20mM咪唑液（50mM tris-HCl,5mM MgCl₂,300mM NaCl，20mM咪唑）（洗脱杂蛋白）—250mM咪唑液（50mM tris-HCl,5mM MgCl₂,300mM NaCl，250mM咪唑）（洗脱目的蛋白）。目的蛋白用sartorius超滤管纯化并用SDS-PAGE方法测定。

ε亚基的去内毒素：

使用上海GENMED蛋白样品液相法去内毒素试剂盒对ε亚基去内毒素，具体操作步骤如下：

（1）从-70℃冰箱里取出蛋白样品，置于冰槽里融化；

（2）移取1毫升蛋白样品到1.5毫升离心管；

（3）加入100微升GENMED去毒液（Reagent A）（注意：使用前，充分混匀GENMED去毒液（Reagent A））；

（4）涡旋震荡15秒；

（5）在4℃条件下，置于平式摇荡仪上孵育30分钟，速度为50rpm；

（6）放进37℃恒温水槽孵育10分钟，期间涡旋震荡2次

（7）放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM）；

（8）小心移取上层液相（留下150至200微升）到新的1.5毫升离心管；

（9）保存在-70℃冰箱里备用或即刻进行后续实验；

ε亚基的定量：

定量方法可用Bradford法。操作步骤如下：

（1）先稀释BSA，称取0.1g BSA粉末，溶解至10ml水中，此时浓度为10mg/ml,将其稀释5倍至2mg/ml；

（2）用PBS连续倍比稀释成1mg/ml、500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml和31.25ug/ml；

（3）取出做ELISA试验用的酶标板条，每孔中加入180ul考马斯亮蓝溶液，将上述稀释好的不同浓度的BSA标准液分别取20ul加入到考马斯亮蓝溶液中，另外取待测蛋白样品20ul加入到180ul考马斯亮蓝溶液,每个浓度各做两个复孔，用排枪上下吹打充分混匀；

（4）室温反应5min后，放入到酶标仪中读数OD₅₉₅。根据读数绘制标准浓度曲线，计算出待测样品浓度。

ε亚基多克隆抗体的制备：

以纯化的ε亚基作为免疫抗原，免疫2kg兔子2只。按免疫剂量（按每只兔子0.5mg抗原）定量取出，加入等体积的弗氏（不）完全佐剂，用注射器来回抽吸，制成油包水（W/O）型的乳化液，背部、颈部皮下多点注射。制定的免疫程序如下：首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，0.5ml/只，腿部肌肉注射；两周后第2次免疫，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原。间隔10天，进行第三次免疫。自第三次免疫10天后耳静脉采血分离血清，用间接ELISA法检测血清抗体效价。

2-氧-环丁烷十一烷酸-BSA偶联物的制备：

（1）将EDC平衡到室温；

（2）2mg冻干的BSA加入到200μl结合缓冲液中；

（3）2mg半抗原加入到500μl结合缓冲液中，然后将其加入到200μl的蛋白液中；

（4）10mg EDC溶解在1ml超纯水中，然后迅速加入100μl到上步得到的溶液中；

（5）室温反应2h；

（6）用PBS缓冲液透析；

2-DCB多克隆抗体的制备：

以纯化的2-氧-环丁烷十一烷酸-BSA偶联物作为免疫抗原，免疫2kg兔子2只。按免疫剂量（按每只兔子0.5mg抗原）定量取出，加入等体积的弗氏（不）完全佐剂，用注射器来回抽吸，制成油包水（W/O）型的乳化液，背部、颈部皮下多点注射。制定的免疫程序如下：首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，0.5ml/只，腿部肌肉注射；两周后第2次免疫，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原。间隔10天，进行第三次免疫。自第三次免疫10天后耳静脉采血分离血清，用间接ELISA法检测血清抗体效价。

生物素化的ε亚基抗体和2-DCB多克隆抗体的制备：

将2μl N-Biotin(10mM)分别加到500μlε亚基多克隆抗体(20μM)和2-DCB多克隆抗体(20μM)中，室温孵育1h，多余的生物素通过PBS透析除去。

实施例1、提取溶剂的选择

现已报道的样品的前处理方法多采用传统的索氏抽提法。以正己烷为提取剂提取含脂辐照食品中的脂肪，并用自制的弗罗里硅土柱净化后进行GC-MS分析测定，该方法提取和纯化时间长并且需要消耗大量有机溶剂；采用超临界流体萃取（SFE）的方法提取2-ACBs快速、方便，提取时间为30到60min，但是SFE装备昂贵，使用不够广泛；加速提取法（ASE）法使用加速溶剂萃取仪，用乙酸乙酯作为提取剂于高温高压下萃取脂肪，萃取液加入乙腈置于-20℃下过滤除脂，然后用1g的硅胶柱净化，用GC-MS分析2-ACBs含量，分析5个样品和一个空白样品需7-8小时，并且有较高的回收率（70-105%），可以检测辐照剂量为0.7-7kGy的牛肉、猪肉、鸡肉中的2-DCB、2-TCB，但是此方法仍需脱脂操作，并且加速溶剂萃取仪价格昂贵，大多数实验室不具备。

（1）提取溶剂的选择

由于乙腈不能溶解脂肪，用乙腈提取2-DCB，提取出的脂肪含量低，可以增大上样量，提取物不用脱脂即可以用1g的硅胶柱纯化，缩短了前处理时间，降低了检测限，而且由于正己烷的极性参数为0.01，乙腈的极性参数为5.8，它们不可互溶，所以乙腈提取物蒸干后用正己烷溶解时可除去部分极性较强的杂质。结果表明乙腈提取，经硅胶固相萃取小柱净化后进行GC-MS分析，杂质干扰小，可以得到较好的分离效果（图1）。

（2）2-DCB的提取与净化

5g牛肉糜与7g无水硫酸钠混合均匀后加入150ml乙腈，搅拌器搅拌2min。用4号滤纸过滤后转移至500ml的圆底烧瓶中。提取重复二次，将提取液旋转蒸干，用正己烷清洗并收集，定容至50ml，取10ml氮吹浓缩至1ml用于净化。

硅胶固相萃取小柱先用10ml5%（体积分数）乙醚/正己烷淋洗，然后用10ml正己烷淋洗活化。1ml浓缩提取液用于上样，先用10mL正己烷淋洗并丢弃，然后用2%(体积分数)乙醚/正己烷淋洗并收集，将洗提液浓缩至1ml，1μl用于GC-MS分析。

（3）GC-MS条件

GC-MS为岛津GCMS-QP2010PLUS气质联用仪，Rtx-5MS毛细管柱（30.0m*0.25μm*0.25mm）；载气He，1.0ml·min^-1；不分流；柱前恒压35kPa；进样量1μl；进样口温度250℃，起始柱温55℃，保持1min，以10℃/min至180℃，再以5℃/min至250℃，保持2min。质谱条件：选择离子检测（SIM）选择的质量碎片m/z：98，112，m/z：98用于定量。

（4）线性范围和检测限

采用外标法，用正己烷准确配制浓度梯度为：0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.0mg/L的2-DCB标准溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线，结果表明2-DCB在0.01-1.0mg/L浓度范围内线性关系良好。回归方程为：Y=263175.6X-2513.994，相关系数R2＝0.9995，相对标准偏差（RSD）为11.2%。通过向空白样品中添加2-DCB来考察方法的检出限，选择信噪比（S/N）≥3时为检出限，S/N≥10时为定量限。本方法的最低检出限为0.004mg/kg，定量限为0.01mg/kg。

（5）回收率实验

通过在空白牛肉中添加2-DCB确定此方法的回收率，添加量分别为0.01mg/kg牛肉和0.5mg/kg牛肉，计算得到平均回收率分别为88.7%和90.4%。

由上述实验可知，用乙腈进行提取，操作简单快速，所以乙腈直接萃取法提取2-DCB非常优越。

实施例2、构建分子马达生物传感器

将15μL光合载色体（chromatophores，其上有F₀F₁-ATP合酶）（50mg/mL）与8μL（0.5mg/ml）生物素化的ε亚基多克隆抗体混合后，用PBS缓冲液稀释至1mL，然后于37°C温育60min，多余的ε亚基多克隆抗体4°C下40000转离心20min除去；沉淀用500μL PBS缓冲液复溶，然后加入7.5μL（0.1mg/mL）的链亲和素，并用PBS缓冲液稀释至1mL，于37°C温育10分钟，多余的链亲和素于4°C下40000转离心20min除去；沉淀用500μL PBS缓冲液复溶，然后加入28μl（0.036mg/ml）的生物素化的2-DCB多克隆抗体，并用PBS缓冲液稀释至1mL，于37°C下温育10min，多余的2-DCB多克隆抗体于4°C下40000转离心20min除去；然后将沉淀用500μL PBS缓冲液复溶，即得到构建好的分子马达生物传感器。

本实施例构建的分子马达生物传感器的模式图如图2所示。

实施例3、用分子马达生物传感器检测2-DCB标品

检测步骤如下：

A、取1.5ml EP管，加入2-DCB标品溶液10μl，浓度依次为0、10^-4μg/ml、10^-3μg/ml、10^-2μg/ml、10^-1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和10μg/ml，取构建好的分子马达生物传感器10μl加入上述各EP管。

B、另取1个EP管加入10μL10%甲醇/PBS缓冲液（体积分数），再加入10μl分子马达生物传感器作为本底对照，漩涡振荡器振荡使反应体系混匀。

C、再向EP管中分别加入30μl启动buffer（20mM Tricine–NaOH pH8.0，2mMMgCl₂，2mM Na₂HPO₄，0.5mM ADP，现用现配），振荡使反应体系混匀。

D、将上述反应体系放入37°C恒温摇床中温育10min。

E、将EP管从摇床中取出，分别加入450μL PBS缓冲液，振荡使体系混匀。

F、取一块干净的96孔板，将管中的最终反应物加入其中，每孔加样50μL，均设5个平行，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的摩尔比为1：1的荧光素/荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀。

G、将96孔板用超微弱发光仪检测，处理数据，对各组数据取平均值，然后按照下式计算各样品的相对荧光强度，

样品的相对荧光强度=（样品的荧光强度－本底的荧光强度）/本底的荧光强度。

表1分子马达生物传感器检测2-DCB标品的结果

由表1中的数据可知，构建的分子马达生物传感器对10^-4μg/mL的2-DCB仍可检出，而0.5kGy辐照的含脂食品的2-DCB含量大都在10^-2μg/ml水平，所以本发明提供的方法检测限已经满足现有的辐照含脂食品检测范围。

实施例4、用分子马达生物传感器鉴定辐照牛肉

A、取1.5ml EP管，加入10μl待测辐照样品的提取纯化液，取构建好的分子马达生物传感器10μl加入上述各EP管。

B、另取1个EP管加入10μL10%甲醇/PBS缓冲液（体积分数），再加入10μl分子马达生物传感器作为本底对照，漩涡振荡器振荡使反应体系混匀。

C、另取1个EP管加入10μL空白样品的提取纯化液10μl，再加入10μl分子马达生物传感器作为空白对照，漩涡振荡器振荡使反应体系混匀。

D、再向EP管中分别加入30μl启动buffer（20mM Tricine–NaOH pH8.0，2mMMgCl₂，2mM Na₂HPO₄，0.5mM ADP，现用现配），振荡使反应体系混匀。

E、将上述反应体系放入37°C恒温摇床中温育10min。

F、将EP管从摇床中取出，分别加入450μL PBS缓冲液，振荡使体系混匀。

G、取一块干净的96孔板，将管中的最终反应物加入其中，每孔加样50μL，均设5个平行，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的摩尔比为1：1的荧光素/荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀。

G、将96孔板用超微弱发光仪检测，处理数据，对各组数据取平均值，然后按照下式计算各样品的相对荧光强度，

样品的相对荧光强度=（样品的荧光强度－本底的荧光强度）/本底的荧光强度。

表2分子马达生物传感器检测辐照牛肉中2-DCB的结果

由表2中的数据可知，本发明提供的方法可检出0.5kGy辐照的牛肉。

Claims (9)

1.一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法，包括如下步骤：

（1）在F₀F₁-ATP合酶的ε亚基上依次连接生物素化的ε亚基多克隆抗体、链亲和素和生物素化的2-十二烷基环丁酮多克隆抗体，得到分子马达生物传感器；

（2）用溶剂萃取未经辐照的含脂食品得到溶剂提取液，记为溶剂提取液a；将所述溶剂提取液a与所述分子马达生物传感器在启动缓冲液存在的条件下进行反应；向所述反应体系中加入PBS缓冲液终止反应；然后将所述反应体系的反应液与荧光素/荧光素酶溶液混匀，用超微弱发光仪进行检测，至少检测3次，得到所述未经辐照的含脂食品的荧光强度；

（3）用所述溶剂萃取待鉴定的含脂食品得到溶剂提取液，记为溶剂提取液b；所述溶剂提取液b与所述分子马达生物传感器在所述启动缓冲液存在的条件下进行反应；向所述反应体系中加入所述PBS缓冲液终止反应；然后将所述反应体系的反应液与所述荧光素/荧光素酶溶液混匀，用超微弱发光仪进行检测，至少检测3次，得到所述待鉴定的含脂食品的荧光强度；

如果待鉴定的含脂食品的荧光强度与所述未经辐照的含脂食品的荧光强度在0.05水平上存在显著差异，则所述待鉴定的含脂食品候选为经过辐照的含脂食品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，连接所述生物素化的ε亚基多克隆抗体、所述链亲和素和所述生物素化的2-十二烷基环丁酮多克隆抗体的步骤在所述PBS缓冲液中进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的组成如下：0.2g KH₂PO₄、3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl、8g NaCl和1000mL双蒸水；

所述PBS缓冲液的pH为7.4。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述溶剂为乙腈。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对所述溶剂提取液a和所述溶剂提取液b用硅胶固相萃取小柱进行净化的步骤。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述启动缓冲液的组成如下：20mM Tricine–NaOH、2mM MgCl₂、2mM Na₂HPO₄和0.5mM二磷酸腺苷；

所述启动缓冲液的pH值为8.0。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述溶剂提取液a、所述分子马达生物传感器、所述PBS缓冲液和所述荧光素/荧光素酶溶液混合物的体积比为1：1：45：3。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述溶剂提取液b、所述分子马达生物传感器、所述PBS缓冲液和所述荧光素-荧光素酶溶液混合物的体积比为1：1：45：3。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述含脂食品为牛肉。

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