CN101993820A - 快速、灵敏和特异地检测痕量小RNAs的旋转式传感器的制造方法 - Google Patents

Abstract

发明为快速、灵敏和特异地检测痕量小RNAs的旋转式传感器的制造方法技术领域本发明属于生物传感器技术领域，更具体地涉及一种新型的旋转式传感器检测方法的建立和应用。该发明具有快速、简便和显著地提高检测细胞、组织、体液和血液中低丰度的小RNA的灵敏度和特异性的特点。摘要本发明提供了一种新型的旋转式小RNAs传感器的制造方法，用于筛选、检测和比较内源性小RNA(如shRNA、miRNA、piRNA、siRNA等)的表达，和改进已有的载色体纯化、制备和荧光标记，探针的设计以及传感器组装和相关芯片的制备技术。在该发明中，F_oF₁-ATPase同时兼有生物传感器和分子马达的双重作用。检测过程中，分子马达上高特异性的探针像螺旋桨一样旋转，这种分子马达的旋转可以引起离心力和周围液体的流动性的增加，从而缩短靶小RNAs接近探针的时间和增强非靶小RNA的离开。这样，该方法可快速、简便而高灵敏和高特异地检测到细胞、组织、体液和血液中低丰度表达的小RNA分子，可用于鉴定和比较细胞分化前后小RNA的变化，以及诊断和评价疾病的发生和发展。

Description

发明名称：快速、灵敏和特异地检测痕量小RNAs的旋转式传感器的制造方法 

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，更具体地涉及一种新型的旋转式传感器检测方法的建立和应用。该发明具有快速、简便和显著地提高检测细胞、组织、体液和血液中低丰度的小RNA的灵敏度和特异性的特点。 

背景技术

目前，生物样品快速检测技术的研究成为国际高科技十分重要领域之一。快速测定技术不但要求样品颗粒的尺度要足够小；而且测定要求快速、灵敏与方便。因此近来发展用分子组装的智能化传感器，即指分子识别、信号转换与测定技术组成为一体。 

生物传感器可分为静态式和动态式两类。微小粒子与生物分子联接、以固定材料为载体构建生物芯片(如酶，核酸，生物色素复合物)等的研究工作称为静态式；静态式生物传感器与动态式生物传感器，根本区别在于它信号测定的原理：静态式是有/无；因此一般实验过程：需要识别分子的结合(约1小时)；洗涤(0.5小时)；封闭(约1小时)；洗涤(0.5小时)；和二抗的结合与显色(约1小时)，繁琐操作过程与费时约4小时。而动态传感器将则将上述繁琐费时的过程简化成为，识别分子结合的一步过程，省去了其它操作步骤，并且它的信号是可以控制并放大，被称为“智能化传感器”。以ATP分子马达，旋转RNA马达以及鞭毛马达等为代表。它们与传统的静态式生物传感器有本质的区别；动态式传感器特别是旋转可控制的分子马达(F1)旋转技术作为生物传感器，是近年来F1-ATP分子马达深入研究基础上发展起来的，其技术相对成熟，该分子马达被Boyer(诺贝尔奖获得者)称为美丽的分子机器。目前正逐步被开发成实用型单分子传感器器件[1]。 

以日本Noji等科学家为代表，他们用高分子材料(PDMS)构筑成微室，将F1-ATP马达装入，外面用磁场技术控制ATP马达旋转；当ATP合成时，体系用荧光素酶发光法测定体系内的ATP浓度变化，从而推测其旋转速度。由于ATP马达旋转速度与其负载相关，因此ATP马达旋转技术作为生物传感器，不但能体现在单分子水平，而且具有信号放大的功能。可见旋转式技术作为生物传感器是国际上在传统的静态式生物传感器的基础上发展来的全新一代智能化生物传感器。该技术的研发是一个多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，进入门槛较高。国际上多数研究工作仍然停留在实验室水平，虽然有专利报导，但是未见到实际产品(采用分子马达原理的单分子探测器，专利号：WO2005080603，2005/09/01；Univ.ARIDNA(US))。进一步，美国对分子生物传感器的考虑，提出有15年的研究发展计划：网络式地毯智能化传感器，将目标用于未来(10-15年)太空探测，其核心的原理是分子马达的应用。 

本课题组创立的可控分子马达也是动态式生物传感器的一种，但与上述F1-ATP分子马达不完全相同。日本等科学家，将分子马达旋转的信号转化成ATP浓度变化并进行测定；我们则选择F1F0-ATP马达合成ATP过程中的质子转运速度的变化，除了使用F1-ATP马达之外，还增加了F0-ATP马达。利用生物分子F1与F0马达自身偶联的原理，把F1F0-ATP马达复合物作为单分子传感器。由于F0-ATP马达的质子转运与F1-ATP马达上的负载密切相关，用荧光pH探针作为其旋转的指示。因此，建立了将分子识别功能、信号变换方式和生物活性元件一体化的新方法[2]，与国际上比较，显得更为经济，实用与方便。分子马达传感器不仅在检测速度和灵敏度方面取得进一步的提高，并具有通量检测能力，可为同时检测多种病原提供了可能和方便。此外，该新技术具备前瞻性的技术响应：(1)进一步发展成远距离可遥控的生化传感器的能力；(2)具备对于“新型病毒”的快速应答初筛能力。因为识别分子的抗体不需要单克隆抗体，只要免疫的多抗血清(15天左右可得到需要的抗体)。在纸片法免疫 测定技术中，首先用一种单克隆抗体，固定在界面与待测的抗原相接合，然后必需用另一株单克隆抗体(不同识别结合位点，标记了色素分子)进一步与抗原相结合，一对单克隆抗体才能达到测定的目点，而免疫多抗血清不能达到此目的(因为单克隆抗体的制备一般要6个月左右的时间周期)。而本研究中，以血清快速制备的多抗技术就可以应用，因此具备快速应答的初筛能力。 

在另一方面，为了克服抗体制备在抗原的获取，靶点的鉴定，生产的周期等方面的限制，我们已开辟了核酸鉴定技术如检测特定的DNA/RNA序列和小RNA种类。现已发现小RNA分子具有细胞生理状态特异性，组织特异性，和发育阶段特异性。所以，它们将是新一代的诊断肿瘤，感染和其它疾病的标志物。这些小RNA可制成特异的诊断芯片，因此具备快速诊断的鉴定和评估能力。 

因此，本研究的学术思想与技术路线与研究方案，进一步与微流体芯片将样品进样，样品洗涤与测定技术为一体的化技术结合；同时，在测定装置的设计中将样品的通量测定；数据管理又建立了一体化的技术体系。 

鉴于上述三个一体化技术的融合，该测定装置设计没有机械扫描部件，速度快、稳定性好，易于进行小型化和微型化，而且成本较低、灵敏度和特异性高，有利于该技术在发展中国家的推广普及。 

该研究思想在国内外均未见报道，具有原创性。并且由于我们的技术方案设计得相当完整，不但具有实用化前景，而且可以结合我院的信息科技创新基地无线传感网与微系统技术的生物无线传感网奠定基础。本发明人中乐加昌已就其他的相关技术正在申请专利，题为“可调控分子马达微动力生物传感器”(申请号：200410098929.9)和“ATP马达旋转式生物传感器的单分子分析与分离新技术、新方法”(200710118060.3)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够通过综合使用小RNA的结构特点，旋转式F1F0-ATP传感器以及通过特定探针设计的液相小RNA芯片(图1)的高通量检测(图2)，鉴定细胞、组织、体液和血液中低丰度表达的小RNA分子，和快速、特异和高灵敏地比较细胞分化前后小RNA的变化，以及诊断和评价疾病的发生和发展。 

本发明的第一方面，提供了一种能高效结合成熟小RNA的新型探针，如图3所示。这种探针的特征为长度为40-70个碱基，其中能识别成熟小RNA的DNA探针长度为15-35个碱基，此外还连接着10-30个碱基的非义链DNA序列如CCGGCCTATTATGGCCGG，此序列能形成一种发卡结构(本发明不限于所举例中的序列，包括各种能形成发卡结构的序列)，在探针的另一端连有一段共同的核苷酸配基AGCCUGAGCAUCCCGGUUCC或AGCCGAUGUCAACGCACAUC，或生物素。在检测新的小RNA时，该探针设计与制备的新颖性在于选择了通过计算机设计获得的或已鉴定的潜在小RNA的功能链的反义RNA或DNA序列，该序列只能与成熟的小RNA片段杂交，形成互补的二聚体，而不能与小RNA的前体或更长的同源片段杂交形成互补的二聚体。这是因为较大的发夹环的阻抑作用和分子马达的离心力。所以这种分子探针可以提高探针与待检测样品中的互补小RNA的特异性结合，降低非特异性背景信号，提高检测的灵敏度，更适合于检测样本中的低丰度的成熟的小RNA(图2)。这样成功的去除小RNA前体的影响。 

本发明的第二方面在于改良了载色体纯化的方法。使载色体的大小更为均一，纯度更高，便于点制高通量的液态芯片，用于高通量地检测和分析小RNA的表达。另外，本发明所述的小RNA旋转式传感器还可用于制备包含其的各种液态芯片。 

本发明的第三方面在于采用无δ亚基的分子马达FI的α亚基或γ亚基作为 识别分子连接的靶位点，扩展了我们以前专利所涉及的范围，也可用于达到对多个靶分子和单一靶分子进行分析的目的。 

本发明的第四方面在于采用商业化的芯片点样仪如Nano-Plotter NP2.1，每一个分子马达连接上一种特异的探针，从而能稳定地生产出不同高低通量的分子马达芯片，更全面和更准确地检测样品中不同小RNA的表达谱，和更好地用于基础研究和疾病的诊断。 

本发明的第五方面在于提供了包含本发明所述的小RNA或其衍生物旋转式传感器的检测和诊断试剂盒。 

以下将通过实施例对本发明作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。 

图1.生物传感器设计模型。(1)α亚基抗体；(2)[biotin-AC5-sulfo-OSu]-streptavidin-[biotin-AC5-sulfo-OSu]小RNA探针体系；(3)小RNA探针；(4)功能性小RNA；(5)535nm QDs量子点；(6)chromatophore；(7)bacteriorhodopsins(BRs)；(8)lipidbiotin-streptavidin-[biotin-AC5-sulfo-OSu]-Polylysine连接体系；(9)玻璃面。 

图2.载色体微阵列芯片.它可用于单一功能的检测如小RNA靶分子的捕获和分析，也可用于多种功能的同时测定如在每一列的分子马达上连接上小RNA、DNA、 抗原和抗体的同时检测和分析。 

图3.新型小RNA检测探针的结构示意图。探针的黄色部分表示每一条RNA/DNA探针中与生物素连接的部分，红线部分表示每一条探针中的专一性核酸序列，黑色部分是每一条探针中相同的能形成发卡结构的核酸序列。该探针的3’端通过生物素等与分子马达上的α亚基或γ亚基相连。 

图4.光合细菌载色体的提取纯化。A，用传统的方法提取和纯化的载色体；B，用改良的方法提取和纯化的载色体。 

图5.DCCD对荧光强度的抑制作用。a，未用DCCD处理的样品；b，用DCCD处理过的样品。 

图6.确定光照时间。用560nm光源分别起始FoF₁-ATPase的旋转1hr(a)，30min(b)，15min(c)，0min(d)。 

图7.图(A)中曲线(a，b，c，d，e，f，g)分别表示了37℃条件下加入不同数量的负载对生物传感器荧光变化的影响。只加入miRNA探针(a)；分别加入10个细胞的总RNA(曲线b)；10²个细胞(曲线c)；10³个细胞(曲线d)；10⁴个细胞(曲线e)；10⁵个细胞(曲线f)和10⁶个细胞(曲线g)。图(B)从A图中的数值分析得到的荧光变化速率与miRNA分子量之间的关系。 

图8.动态杂交的方检测miRNA的方法可以用于特异性的检测人工合成的靶 miRNA。let-7a探针用于捕捉let-7家族成员。37℃下生物传感器分别只与let-7a探针杂交(a)，结合了let-7a探针的生物传感器捕捉let-7b(b)，let-7c(c)，let-7d(d)和let-7a(e) 

图9.动态杂交反应可以减少杂交时间。生物传感器只负载了miRNA探针(a)；在检测前分别将从MCF-7细胞中提取的miRNA在37℃下与生物传感器杂交1hr、6hr以及12hr(曲线b，c和e)；在从10⁶个细胞中提取的总RNA背景下将生物传感器与靶miRNA杂交(d)。曲线d显示的是一个实时监测的动态杂交结果。图10.在检测前，生物传感器与不同长度的ssDNA在退火温度下杂交形成dsDNA。曲线a，b，c，d，e和f分别为10bp，20bp，30bp，40bp，有一个非互补位点的40bp长的片段和有两个非互补位点的40bp长的片段。 

实施例1。分子马达传感器的制备、标记和组装 

光合细菌载色体的提取[2，3]：将培养的R.rubrum细胞(由张旭家博士提供)5g用50ml TSM buffer(50mM Tricine-NaOH，pH 8.0，0.25M蔗糖，4mM MgCl₂)悬浮。用超声的方法破碎细胞：大探头，25％强度，超5s，停5s，超声10-12min，从而可防止由于超声产生的过热反应导致的生物大分子的变性和失活。然后25,000g离心30min；将上清在FicollPM400(GE Healthcare，USA)中用145,000g再离心90min，可得到均一的沉淀带，即纯度较高的光合细菌载色体(chromatophores)(图4)。再将沉淀用1ml的TSM buffer悬浮，并加入等体积的甘油，在-20℃或者-80℃保存。 

载色体的LiCl处理：取新提取的载色体0.8ml(未加甘油)，加入0.12ml 64mM ATP(终浓度为8mM)，4℃轻轻搅拌1h，然后逐滴加入溶于TSM buffer的4M的LiCl，4℃剧烈搅拌30min，然后145,000g离心90min，然后再用TSM buffer洗两遍。保存方法同上。载色体(Chromatophores)的定量根据Clayton的方法[4]，用Bchl(bacteriochlorophyll)的量表示.具体方法如下：取490μl TSMbuffer加入到紫外杯中，调零(autozero和baseline)，加入10μl载色体，混匀以后，测300-900nm吸收谱。可以在880nm左右得到一个峰，读取峰值OD_880. 根据公式计算浓度：[Bchl]＝OD₈₈₀×50/140。重组参考文献[2，5]的方法，并修改如下，重组缓冲液组成为：50mM Tricine-NaOH，pH 8.0，4mM ATP，25mMMgCl₂，1mM DTT(二硫苏糖醇)，10％甘油；加入β亚基的量按如下比例：5μg去β载色体/50μgTF₁β，在37℃保温12h以后，100,000g离心40min，然后将沉淀再用50mM Tricine-NaOH，pH 8.0，10％甘油缓冲液，悬浮离心(100,000g，30min)洗3遍。 

F_oF₁-ATP酶水解活性的测定：按文献方法[6]。通过酶偶联法监测NADH在340nm处的吸光值的变化从而测定ATPase水解活力，温度37℃。在0.5ml反应体系(10mM KCl，50mM Tris-HCL，pH 8.0，5mM MgCl₂，1mM ATP，0.5mM PEP(购自Sigma公司)，0.2mM NADH)中加入2U PK(购自Sigma公司)，2U LDH(购自Sigma公司)，混匀以后，开始扫描曲线，待曲线走平以后(1min左右)，加入F₁-ATP酶(工程化F₁-ATPase(α，β和γ)由Montemagno教授惠赠)启动反应，在Shimadzu 2010分光光度计上测定D₃₄₀的变化。酶偶联法测定ATP水解活性的原理如图1。 

标记量子点(发射波长为535nm的量子点QDs由理化所邓正涛博士惠赠)于重组的载色体的外表面：重组的载色体30μl 0.05(μg/μl)，20000g，4℃离心20min以洗掉甘油。沉淀被重悬在含(50mM Tricine-NaOH，5mM MgCl₂，10mM KCl， pH 6.5)的溶液中与60μl CdTe QDs(1×10¹⁵/μl，溶于水中)在室温反应1小时。标记好的载色体在4℃，20000g离心20min洗掉游离的QDs，洗两遍。量子点标记的重组的载色体在使用前被溶解于含(1mM tricine-NaOH，pH 8.0)，2mM MgCl₂，2mM ADP，50mM KCl，5mM NaN₃)的溶液中。 

荧光检测方法：α亚基抗体或γ亚基抗体20μl与10μl(2μM)生物素(购自pharmacia/安码西亚公司)室温反应30分钟。然后加入5μl链霉抗生素(2μM)(购自pharmacia/安码西亚公司)室温反应30分钟。用Nano-PlotterNP 2.1将量子点标记的重组的载色体均匀的点加到各种基质上如载玻片、硝酸纤维素薄膜、或微孔板(购自MILLIPORE公司)上，形成不同大小的微阵列，室温放置一小时左右，直到基本干透(图2)。2μlα亚基抗体-生物素-链霉抗生素加入到铺好的量子点标记量子点标记的载色体上，室温反应1小时。TSMbuffer(50mM Tricine-NaOH，pH 8.0，0.25M蔗糖，4mM MgCl₂)洗涤3次，每次5分钟。100μl 10μM标记有生物素的探针(TSM buffer稀释)分别加入到各孔中。室温反应30分钟后，TSM buffer洗涤3次，每次5分钟。至此，检测小RNAs的生物传感器探针系统连接完成。光照前加入启动buffer(2mM NaN₃ and 2mMATP)，通过570nm的滤光器冰上光照1小时后，加入待检测的含目的小RNA的小RNAs样品液，在37℃启动旋转及相应的杂交反应，杂交的动态过程通过BPCL系统实时检测。荧光的激发波长是488nm，发射波长是535nm。实验结果有四组以上平行。 

生物传感器设计模型：我们利用无δ亚基F_oF₁-ATPase建立了完全旋转的生物传感器。载色体通过α亚基抗体-生物素-链霉抗生素连接体系固定在玻璃片上[7]。F_oF₁-ATPase的3个α亚基通过其抗体分别连接上生物素-链霉抗生素-生物素-小RNA探针检测系统。检测不同的成熟miRNA可以通过合成不同的连 接生物素的小RNA探针来实现，这也是该体系的优点之一。在冰上光照一小时可以使质子通过细菌视紫红质[bacteriorhodopsins(BRs)]从膜外泵到膜腔内，从而蓄积足够的质子梯度，这种梯度可以维持一小时以上而保证不启动[8，9]。当温度达到37℃，酶活性达到最高，质子从内腔泵出，从而推动酶旋转。标记在载色体外膜的pH敏感的碲化镉量子点(CdTe-QDs)可以感应质子浓度的变化，并通过荧光强度反应出来[10]。酶的转子和定子可以通过加入NaN₃和ATPMg²⁺进行重构；NaN₃和ATPMg²⁺不仅抑制了δ缺失的F_oF₁-ATPase的水解活性，还固定了γ亚基和α₃β₃之间的相对运动，从而形成了新的转子α₃β₃γεc_n和新的定子ab₂[7，11，12]。依据以上原理，靶miRNA结合到探针上增加了α亚基的负载，从而使旋转相对无负载体系减慢。它会导致质子泵出速度减慢，这种影响通过量子点荧光增加减慢表现出来。有趣的是，连接在α亚基上的探针体系可以像螺旋浆一样转动。利用这种旋转引起的液体流动性增加可以大幅地缩短靶miRNA和探针的结合时间。另一个可以缩短实验时间的步骤是，在转动的同时进行检测，既可以捕捉结合的动态过程，又可以简化实验步骤，我们的方法可在检测开始500秒内获得数据。 

实施例2。生物传感器可行性检测 

以前的研究表明，加入质子通道通透剂CCCP可以使膜内外通透，从而抑制无δ亚基F_oF₁-ATPase的旋转[11]。此外，F_o通道的抑制剂DCCD(购自Sigma公司)的作用是能够和F_o上c亚基的61位天冬氨酸的羧基共价结合，从而阻塞质子外流，导致荧光不再升高。实验中，20μM的DCCD在室温条件下孵育样品一小时，由于DCCD的抑制作用，温度提高到37℃后荧光不会升高(图5)。以上结果证明，荧光增加是质子从膜内向外泵出的结果，而并非假象。 

确定光照时间：检测前，miRNA检测体系经一个560nm的滤光片分别光照1hr(曲线a)，30min(曲线b)，15min(曲线c)，0min(曲线d)，如图6。光照启动了质子从载色体的外面向里面的质子转运，δ缺失的F_oF₁-ATPase转子被PMF驱动转动。光照缓冲液为包含2mM NaN₃和2mMATP的100μl甲酰胺杂交缓冲液。光照时间越长，膜上的bacteriorhodopsins(BRs)分子泵入膜腔的质子数就越多，产生的质子梯度差就越大。以前的研究表明，膜腔可以保持长时间质子不外泄。 

计算标记在载色体表面上CdTe量子点的数量：12.5μl细菌色素体(BChl)加入250μl缓冲液，BChl的浓度是0.1μg/μl。因此，12.5μl BChl含12.5μg载色体约1.4×10^-8mol.(BChl分子量为890g/mol). 

BChl分子数为：1.4×10^-8mol×6.02×10²³＝8.42×10¹⁵ 已知，6个光捕获系统I(LH1)包含600个BChl，10个光捕获系统II(LH2)包含400个BChl，一个载色体包含16个LH1和50个LH2[13，14]。因此，一个载色体包含3800个BChl。 

因此，总的载色体数量是：8.42×10¹⁵/3800＝2.4×10¹²

已知，CdTe量子点的浓度是1×10¹⁶粒/ml，因此，100μl CdTe量子点溶液的个数为1×10¹⁶.实验表明，60％的CdTe量子点被标记到载色体上，因此，标记到载色体上CdTe量子点的数量是：1×10¹⁵×60％＝6×10¹⁴

综上所述，载色体表面连接的CdTe量子点是：6×10¹⁴/2.4×10¹²＝250。 

实施例3.生物传感器的灵敏度 

以前的研究表明，mir-145在乳腺癌细胞中属于肿瘤抑制基因，因此会表达量相对正常细胞偏低[15]。因此，本实验选择了检测人类乳腺癌细胞MCF-7中 含量较低的mir-145进行研究。我们首选用Trizol(购自invitrogen公司)提取细胞总RNA，在这一复杂的环境中探测mir-145。图7中曲线(a，b，c，d，e，f，g)分别表示了37℃条件下加入不同数量的负载对生物传感器荧光变化的影响。其中曲线a代表对照样品探针系统连接完全，仅没有结合靶miRNA。实验表明，当加入10⁶以上细胞的总RNA后miR-145曲线斜率与加入10⁶个细胞总RNA的曲线斜率相同。通过以上结果，可以确定检测的饱和浓度，即所有结合位点被靶miR-145占满的细胞数。该饱和浓度可以通过增加铺板量来调节。已知饱和浓度后，以此浓度为最高限，间隔10倍稀释，通过探索检测的最低限。加入分别从10个细胞(曲线b)10²个细胞(曲线c)，10³个细胞(曲线d)，10⁴个细胞(曲线e)，10⁵个细胞(曲线f)和10⁶个细胞(曲线g)提取的总RNA后，前500秒的增长速率分别是554.08±9.95U/s，531.73±10.97U/s，517.06±4.19U/s，501.29±10.05U/s，487.66±6.95U/s，471.27±5.94U/s。实验结果表明，靶miRNA连接到探针的数量越多，总体的荧光强度增加速率就越慢。与未连接靶miRNA的对照(曲线a，563.94±9.68U/s)相比，10个细胞的靶miRNA作为负载产生的荧光强度(曲线b，531.73±7.97U/s)增加与之最接近。用旋转的生物传感器不仅能检测大量的靶miRNA(1.2×10^-12mol)，还可以检测到微量的样品(1.2×10^-18mol)，与同类方法相比具有检测范围宽的优势。此外，能检测到1.2×10^-18mol靶miRNAs，比现有的检测方法更加灵敏。 

检测量根据以下方法计算： 

我们实验室以前的研究表明，1μg BChl载色体包含3×10^-13mol载色体(浓度大约0.1μg/μl)。部分载色体是不含F_oF₁-ATP酶的空泡，所以，一个载色体对应0.79FOF₁-ATP酶[16]。每个样品稀释三倍后，加入5μl BChl载色体，即含 有4×10^-14mol载色体。由于一个F_oF₁-ATPase有三个亚基，所以，一个载色体对应三个miRNAs，当所有位点被占满需要1.2×10^-13mol靶miRNAs。实验表明，从10⁶个细胞中提取的mir-145可以使位点完全饱和。在以上载色体数量下，再提高细胞的数量荧光变化也不会进一步降低。确定了最高检测限后，我们通过十倍逐层稀释的方法探测检测的低限。结果表明，捕获10个细胞中提取的mir-145接近不连接mir-145的对照组，因此，从10个细胞中提取的miR-145数量是检测的低限，即1.2×10^-18mol(图7)。 

我们根据以上的计算结果得出了前500秒荧光变化值与miRNAs数量线性的定量曲线。 

实施例4.生物传感器的特异性 

let-7家族成员(let-7a，let-7b，let-7c，let-7d)间相差一到两个碱基(由上海吉玛公司合成)。我们根据的let-7a序列设计互补的检测探针，在旋转的状态下使之分别捕捉1pM let-7a，let-7b，let-7c，let-7d。我们化学合成了4条模板。 

如图8所示，let-7a探针系统结合let-7a时，荧光强度在500秒内的增长速率为471.36±10.17U/s(曲线e)。不加靶miRNA的对照组(曲线a，559.96±7.05U/s)与通过序列完全互补的方式连接的曲线e相比荧光强度增加速率更快。let-7a探针系统与let-7b，let-7c和let-7d相结合的荧光强度增加速率(553.14±10.07U/s，549.42±9.97U/s，552.99±8.94U/s)接近不加靶miRNA的对照组(曲线a)，而远快于与let-7a结合，见图8。以上结果表明，旋转的生物传感器可以分辨几个碱基的差异。我们初步推测其原因是，快速旋转的分子马达倾向于结合互补能力强的片断，有几个碱基未结合的片断可 能在旋转的过程中被甩掉。 

1.动态杂交与静态杂交的比较 

由于通常的杂交过程是静态的，因此，都需要过夜杂交。为了检测静态条件下不同杂交时间的杂交效率，我们分别将提取的miRNA在37℃下杂交1hr、6hr以及12hr(曲线b，c和e)。我们以前的实验表明，过夜杂交不会影响δ-free F_oF₁-ATP酶的活性。检测前光照，条件及检测方法参实验方法1.2.12。图9中曲线b、c及e的荧光强度在500秒内的增长速率为分别是555.57±8.15U/s，511.47±10.01U/s及469.87±10.58U/s。与未连接任何小RNA的对照组(曲线a，565.89±5.19U/s)相比，静态杂交1hr的样品在500秒内的荧光强度增长速率没有显著变化(曲线b，555.57±8.15U/s)。而静态杂交的杂交数量随着时间的延长而增加。我们的实验结果与已知的常规方法的结果一致。进行动态杂交的生物传感器(曲线d，469.87±8.01U/s)在前500秒内就可以和未加附载的对照区分开，并且比静态杂交6hr的样品的500秒内荧光强度增长速率(曲线c，511.47±10.01U/s)更加明显，但略高于静态杂交12hr的样品(曲线e，451.90±7.61U/s)，见图10。根据以上结果，我们推断动态杂交反应可以在很大程度上减少检测前后所用的时间。 

关于检测机理的初步探索 

我们设计合成了长度分别为10bp、20bp、30bp、40bp的末端标记生物素的oligoT及相应长度的oligoA。在适当的温度下使其退火形成双链后连接到α亚基抗体-生物素-链霉抗生素系统上。按1.2.12的方法进行检测。本实验与2.1的不同是杂交过程为静态，目的是探索不同的负载是否会改变荧光强度的增长速率。实验结果表明，曲线a、b、c、d荧光强度在500秒内的增长速率 (558.24±7.15U/s，500.52±8.37U/s，446.57±10.29U/s，429.43±11.19U/s)逐渐降低，这说明负载越大δ-free FOF₁-ATPas旋转体现出的总体荧光变化就越缓慢。该结果为探索动态结合实验机理提供了重要的参考。 

此外，我们还设计了长度为40bp的分别存在一个中间部位碱基不互补和两个对称的位置碱基不互补的两条oligoA与标记生物素的寡聚腺苷酸进行杂交形成双链后进行检测。序列如下： 

5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′ 

5′-AAAAAAAAAAAGCTGAAAAAAAAAAGCTGAAAAAAAAAAA-3′ 

该实验的目的是模拟细胞中存在的诸如let-7a家族这样一个或几个碱基不互补的情况。图10中曲线e和f荧光强度在500秒内的增长速率(443.25±9.96U/s，450.52±7.94U/s)和同等长度的曲线d(429.43±8.19U/s)相比可以看出有所提高，但二者之间没有明显的差别。我们推断，荧光强度变化提高的原理是，某些位置的不互补使得刚性比较强的双链中被加入了柔软的接点。刚性的双链对旋转产生的阻力大于相对柔软的某些位置不互补的双链。那么为什么本实验与图8相比改变几个碱基没有那么明显的差异呢？我们认为图8的实验还需要考虑动态结合这个重要的因素，可能在旋转过程中探针系统更加倾向于保留结合力较强的完全互补的靶分子。 

以上的实验仅仅是为探索旋转生物传感器的检测机理和检测中的特异性提供了实验证据。 

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Claims (13)

1.这种小RNAs旋转式传感器主要包括三种成份：小RNA探针，F_oF_l-ATP酶以及F_oF_l-ATP酶的支架结构-载色体。

2.根据权利要求1的小RNAs旋转式传感器，其中所述小RNA探针是一种检测内源性小RNA(＜40nt)的寡核苷酸探针，它由三部分组成：第一部分为与核算配基或生物素结合寡聚核苷酸，第二部分为能与成熟小RNA杂交的寡聚核苷酸，第三段由高CG含量组成的可形成发夹结构的寡聚链核苷酸。

3.如权利1和2所要求的，寡核苷酸探针的总长度在30-70碱基之间。

4.如权利1和2所要求的，寡核苷酸探针中能够与成熟小RNA形成互补结构的寡聚核苷酸的长度在15-40碱基之间，而高CG含量的非义链寡核苷酸的大小在10-30碱基之间。

5.如权利1和2所要求的，高CG含量的非义链寡核苷酸能够形成发卡结构。

6.如权利1和2所要求的，寡核苷酸探针中能够与成熟小RNA形成互补结构的寡聚核苷酸中的每一个核苷酸可以是自然无修饰的如DNA、RNA或DNA与RNA的杂合体，也可以是经不同化学方法修饰的，如肽核苷酸(PNA)、闭锁核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修饰的核苷酸或脱氧核苷酸。

7.根据权利要求1的小RNAs旋转式传感器，其中所述F_oF_l-ATP酶是一种利用生物分子F1与F0自身偶联的原理产生的由α、β、γ、δ和ε-亚基等组成的F_oF_l-ATPase分子马达传感器。

8.如权利1和7所要求的，其中将F_oF_l-ATP酶的α亚基、γ亚基或δ亚基与相应的探针复合物结合，并且进一步与样品中的靶分子结合来调控分子马达的旋转速度。

9.如权利8所述的α亚基、γ亚基或δ亚基与相应的探针复合物结合，是通过特异的核酸配基与探针分子结合或通过生物素-链酶抗生物素-生物素与探针分子结合。

10.如权利8所述，其中样品中的靶分子是DNA、miRNA、piRNA、siRNA或其它形式的RNA以及它们与蛋白/多肽的复合物。

11.根据权利要求1的小RNAs旋转式传感器，其中所述F_oF_l-ATP酶的支架结构-载色体是一种直径大约100nm的双层磷脂酶体，内含一个F_oF_l-ATP酶，6-11个光能转换复合物。

12.根据权利要求1和11的小RNAs旋转式传感器，它可以单一或阵列的形式组成各种类型的检测和分析芯片。

13.如权利1到10任一项所述的小RNA探针的用途，是利用具有细胞生理状态特异性、组织特异性和发育阶段特异性的一切形式的靶DNA、RNA和它们的蛋白或多肽复合物等作为标志物，进行疾病等的检测和诊断。

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