CN107881221A - 基于Lectin基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：（1）基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，测序比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；（2）若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，测序比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株。本发明经序列比对及进化树结果表明，Lectin基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSU rRNA 序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具。
Description
技术领域
本发明属于寄生虫的种类鉴定技术领域，具体涉及一种基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法。
背景技术
隐孢子虫是一种重要的人兽共患性原虫，被认为是仅次于轮状病毒的第二大重要的腹泻病原体，其宿主范围广泛，可引起急慢性及肠胃炎性腹泻，严重程度与宿主自身的免疫状态有关。隐孢子虫也是因人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的艾滋病和器官移植的机会性病原体。该病已被确定为引起人类腹泻的6大病因之一，常通过水源或食源性污染造成暴发性流行，迄今为止仍无有效的治疗药物，对人类公共卫生造成很大威胁。目前隐孢子虫有效种已达31种，C. parvum、C. hominis在人隐孢子虫检测中较为常见，对这两个种以及与它们相近种的隐孢子虫种类的鉴定与分析应进行更深入的研究。目前常用的鉴定隐孢子虫的基因工具是SSU rRNA。该基因分类工具可以鉴别出多种隐孢子虫种类，且由于基因的多拷贝特性，以及存在半保守和高变区域，适合于设计属特异性引物。但SSU rRNA基因的不足之处在于不同拷贝间存在微小的序列差异，这有时会导致某一虫种或基因型RFLP分析结果不一致。因此，区别不同分离株不同拷贝序列内部差异是很有必要的。
目前隐孢子虫种类的确立主要基于以下几个方面：(1)卵囊的形态；(2) 虫体遗传特征；(3)自然或试验感染宿主的特异性；(4)符合国际动物命名法规(International CodeOf Zoological Nomenclature)。基因型的命名是指在发现有足够的的 SSU rRNA基因（Small subunit ribosome RNA）或者其他基因差异，以及需要通过系统发育分析排除这种差异是由于SSU rRNA基因拷贝之间的异质性或者内部基因变化导致的。
理想的分子诊断工具应可鉴定所有的种类或基因型，或者能够检测所有感染人的种类，但是目前只有少数方法可以做到这点，究其原因，在很大程度上因为在隐孢子虫种类和基因型水平上，只有少数基因位点可用。如功能基因小亚基核糖体rRNA(SSUrRNA)基因、卵囊壁蛋白(COWP)基因、70 kDa热休克蛋白(HSP70基因)、肌动蛋白(actin)基因等。在HSP70、COWP、 actin 基因中，隐孢子虫种类存在序列多样性，很难设计一个有效的属特异性的基因引物，这点限制了他们在隐孢子虫分子流行病学中的应用。基于SSU rRNA 基因的属特异性的PCR-RFLP技术用于鉴别隐孢子虫的种类和基因型， SSU rRNA基因的不足之处在于不同拷贝间存在微小的序列差异（隐孢子虫有5个拷贝的SSU rRNA基因），区别不同分离株不同拷贝序列内部差异是很有必要的。COWP 基因，为编码隐孢子虫卵囊壁蛋白的基因（wall protein），该基因具有广泛的多态性，可以鉴别部分虫种。HSPs, 热休克蛋白家族（heat shock proteins，Hsps）是一群进化上高度保守的管家基因家族，其功能主要做为分子伴侣辅助蛋白折叠和转运。该家族分子量大小不同，其中Hsp70基因在进化上高度保守且没有内含子，在隐孢子虫基因分型上应用较多。 Feng等建立了基于Hsp90 基因分型方法用于准确区分感染人的隐孢子虫种（Feng Y, Dearen T, Cama V, et a1. 90-kilodaltonheat shock protein, Hsp90, as a target for genotyping Cryptosporidium sppknown to infect humans[J]. Eukaryot Cell, 2009, 8(4): 478-482.）。Actin 基因，是编码肌动蛋白的基因。肌动蛋白是真核细胞中普遍存在的高度保守蛋白之一，由于其非编码序列差异较大，因此可以反映隐孢子虫的进化程度。Sulaiman等对C. parvum,等九种种隐孢子虫 及C. parvum内不同基因型虫株的 actin基因进行了扩增和比对分析，结果确证了隐孢子不同种类和微小隐孢子虫的不同基因型中间存在遗传学差异，系统进化树分析和之前报道的基于SSU rRNA、Hsp70基因、COWP基因获得的结果大体一致（Sulaiman IM, LalAA, Xiao L. Molecular phylogeny and evolutionary relationships ofCryptospordium parasites in the Actin locus[J]. J Parasitol, 2002, 88(2):388-394.）。基因型的命名规则通常反映隐孢子虫之间的差异，也趋于和生物学特性差异相关联。一些基因型显示与同类属基因序列存在大量的核苷酸差异，彼此间很相似的那些基因主要归因于寄生虫和宿主的共进化。
基因分型不能将人源隐孢子虫与人兽共患的隐孢子虫区分开来，因为这些分型工具分辨率较低，使其在流行病学调查中使用受限。相反，亚型分型工具 在对C. parvum 和C. hominis 的流行病学研究中得以发展。比如微卫星（microsatellites）和小卫星（minisatellites）工具和 60-kDa 糖蛋白基因(GP60)、及双链 (double-stranded，ds)RNA成分和rRNA内含子转录间隔区2（the internal transcribed spacer-2，ITS-2），这些靶基因较用于分型的位点有较高的进化率。微卫星或者小卫星，是DNA中由1-4个 bp的（微卫星）或者更多的（小卫星）重复序列串联组成。由于复制的错误，这些序列比核心区基因的进化率高，往往表现为微卫星或小卫星的串联重复数的变化，因此能够通过PCR产物分级或者用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因扫描技术区别不同亚型。gp60 靶点，和微卫星序列相似，是由系列编码丝氨酸的串联核酸序列TCA/TCG/TCT组成，主要用于C. parvum 和C.hominis分类的gp60基因除了三核甘酸串联重复，在非重复区也存在基因差异，根据这些差异和重复，将C.hominis 分为Ia, Ib, Id, Ie, 和 If等亚家族，把 C. parvum 分为IIa，IIc，IId，和IIe等亚家族。在每个亚型家族内，主要根据三联密码子的重复数区分不同亚型。gp60基因是最具多态型的基因，是隐孢子虫亚型鉴定中应用最广的靶点。而gp60是位于隐孢子虫入侵宿主阶段虫体表面顶端的具有中和抗体作用的主要蛋白，因此，它可能与在同一亚型家族中隐孢子虫的生物学特点和临床表现相关。必须注意的是多数的亚型分析工具都是建立在C. parvum或者 C. hominis的基因组序列基础上的，以至于这些工具只能扩增出与这两个种类相近的隐孢子虫如C. meleagridis，他们通常不能扩出遗传距离较远的在自然感染人的C. canis, C. felis, C. suis和C. muris等隐孢子虫。
现有的隐孢子虫类工具和体系，在某种程度上把现有的隐孢子虫分为31个种类和60多个基因型，某些亚型分类也用于流行病学和群体遗传研究，但对于和人隐孢子虫（C.hominis）SSUrRNA基因相似的兔隐孢子虫（C. cuniculus）、horse genotype、donkeygenotype、来自袋鼠的与C.hominis 完全相似的隐孢子虫，及其人和不同动物来源的C.parvum之间的区分依靠gp60基因做亚型分型工具仍难以区分动物来源和不同虫株间的差异。因此探索新的分型工具是当今隐孢子虫分子流行病学调查和溯源研究所需要的。从申请者目前扩增的Lectin基因序列进行在GenBank 搜索，仅发现4条相关序列，其中两个为C.parvumIowa和C.huminis全基因序列。搜索文献也未见该基因位点用于隐孢子虫的分子流行病学和遗传结构分析的报道。
凝集素是一类可以使细胞凝集或者糖复合物沉淀的非免疫来源的糖结合蛋白或者糖蛋白。凝集素大部分来于植物，但是动物、真菌、细菌和病毒也能合成。凝集素及其作用在某些寄生虫上已经得到分析和验证。原虫凝集素功能研究中，溶组织阿米巴凝集因子的功能已经比较清楚：凝集素基因编码凝集素活性的粘附因子，已证明此种粘附活性与溶组织阿米巴虫种毒力相关。溶组织阿米巴对宿主组织的侵袭力特异地表现为一种对靶标物的接触性杀伤功能。这种“触杀”机制，是一个包括对靶细胞和组织的粘附、杀伤、溶噬的连锁生理过程。滋养体表膜现有两种具植物凝血素（Lectin）活性的粘附因子（adhesin）能与靶细胞（宿主细胞）糖萼中的乙酰氨基葡萄糖（GLcNAc）和乙酰氨基乳糖胺（GalNAc）发生受体性结合，提供了对靶细胞进行攻击的前提。Bhat等在微小隐孢子虫和人隐孢予虫子孢子表面分离出一种Gal/GalNAc特异性凝集素-P30蛋白，其定位于子孢子和胞内阶段虫体的顶端表面介导虫体的黏附及侵入（Bhat N，Joe A，PereiraPerrin M，et a1．Cryptosporidiump30，aGalactose/
N-acetylgalactosamine-specific lectin，mediates infection in vitro[J]．JBiol Chem 2007，282：34877-34887）。现有的研究表明，糖结合蛋白或凝集素在原虫识别和粘附宿主细胞过程中起介导作用，这将有助于隐孢子虫的侵袭和致病。Stein等用透射电镜观察具有凝集素的C.parvum能粘附MDCK细胞和HCT-8细胞，同时卵囊对Gal/GalNAc结合凝集素有高反应，而卵囊中的Gal/GalNAc亦能帮助入侵宿主细胞（Stein B，Stover L，GillemA，et a1．The effect of lectins on Cryptosporidium parvum oocyst in vitroattachment to host cells[J]．J Parasitol JT 2006，92(1)：1-9）。Hashim等曾用Gal预处理隐孢子虫卵囊以观察其入侵阻断作用，发现Gal能阻断C.parvum对HCT-8和牛的原代培养小肠上皮细胞侵入（Hashim A，Mulcahy G，Bourke B，et a1．Interaction ofCryptosporidium hominis and Cryptosporidium parvum with primary human andbovine intestinal cells[J]．Infect Immun JT 2006，74(1)：99-107）。还有报道称C.parvum 是依靠粘液样糖蛋白（mucin-like glycoproteins）来粘附和入侵宿细胞的。
在人的凝集素基因的应用上，已经有报道在儿童过敏性紫斑、肺结核易感性等方面尝试应用。隐孢子虫的主要致病机理为虫体侵入宿主的上皮细胞并不断复制而破坏了长上皮细胞导致腹泻等一系列症状。对隐孢子虫的功能基因及其编码蛋白研究一直是人们试图找到该虫控制办法途径，其中该虫的黏蛋白样糖蛋白在试验条件下介导对宿主细胞的粘附和入侵。Edwinson等报道C. parvum 和 C. hominis的滋养体发育是经Gal-GalNAc以浓度依赖方式触发的（Edwinson A, Widmer G, McEvoy J. Glycoproteins and Gal-GalNAccause Cryptosporidium to switch from an invasive sporozoite to a replicativetrophozoite.Int J Parasitol. 2016, 46(1):67-74）。Varughese等试验发现用抑制剂处理SHP-2（Src homology-2 domain-containing phosphatase 2）和桩蛋白及SRc家族激酶，有效减少了C. parvum剂量效应的多重感染（Chen XM, LaRusso NF.Mechanisms ofattachment and internalization of Cryptosporidiumparvum to biliary andintestinal epithelial cells. Gastroenterology. 2000, 118(2):368-79）。研究揭示了SHP-2在C.parvum发病机理中的重要作用。Bhalchandra 等鉴定了一种C.parvum 新的含C型凝集素结构域(CTLD)的粘附素样糖蛋白Clec (CpClec)且在C. hominis 和 C. muris有直接同源物（在从人到病毒的多种生物中都有含CTLD的蛋白，它是结合蛋白配基，主要功能是附着/粘附和信号作用）（Bhalchandra S, Ludington J, Coppens I, et al.Identification and characterization of Cryptosporidium parvum Clec, a novelC-type lectindomain-containing mucin-like glycoprotein.Infect Immun. 2013, 81(9):3356-65）。这是从顶复门原虫首次报道含CTLD蛋白，CpClec定位在虫体尖端表面和子孢子及裂殖子的致密颗粒，CpClec在试验感染48小时后表达量最高，暗示其受发育调控。随着对C. parvum 黏蛋白样糖蛋白和包含C型凝集素结构域蛋白的认识，表明CpClec在隐孢子虫-宿主细胞间的相互作用中发挥重要作用。
以上研究表明，糖结合蛋白或凝集素在原虫识别和粘附宿主细胞过程中起介导作用，这将有助于隐孢子虫的侵袭和致病，其作用在某些寄生虫上已经得到了分析和验证。这也提示了对黏蛋白样糖蛋白的研究将成为隐孢子虫致病机理的新方向。对于隐孢子虫粘附素功能的研究已经受到广泛关注，而其在分子流行病学和遗传结构分析上，该基因位点的作用仍然没有被重视和挖掘。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足之处，提供一种基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，通过巢式PCR技术，对数种不同隐孢子虫阳性样品进行SSU rRNA及Lectin位点的扩增，并与其它已知的隐孢子虫相关序列比对，构建系统进化树。
本发明的目的是以下述方式实现的：
基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：
（1）基于SSU rRNA位点的扩增：基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；
基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：
外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；
R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；
内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；
R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4；
（2）基于凝集素基因Lectin位点的扩增：若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；
基于Lectin基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；
若两待测样品的Lectin基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种；若两待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；
基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：
外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；
R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；
内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；
R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8。
步骤（1）中的PCR反应条件：94℃，5min，1 个循环；94℃，45 s，55℃和55℃，45s，72℃，1min，35 个循环；72℃，10min，1 个循环。
步骤（2）中的PCR反应条件：94℃，3 min，1 个循环；94℃，30 s ，56℃和53℃，30s，72℃，1 min，40个循环；72℃，10 min，1 个循环。
步骤（1）和步骤（2）中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。
申请者从事隐孢子虫研究多年，对背景技术中的隐孢子虫基因分型和亚型分型工具的靶标的应用已经实践多次，对于各个基因标记的应用情况和得力程度非常了解。鉴于上述分型工具的局限性，本发明试图找到一个可以应用于区分不同来源的人兽共患种类隐孢子虫的靶标基因。对于目前申请者初步研究的结果来看，凝集素基因（Lectin）基因位点做靶标已经很好地区分了C.parvum、C.hominis及其在SSr RNA与C.hominis 极为相近的horse genotype和donkey genotype，结果见研究基础中图3（部分隐孢子虫基于Lectin 位点的进化关系）。因此，该基因位点极有可能成为人兽共患隐孢子虫的分类和遗传研究的有效得力的工具，因此有必要进行积极的探索和尝试。
隐孢子虫子孢子对宿主细胞的黏附和侵入是其致病的关键。尽管有数个研究表明隐孢子虫黏附素样蛋白的作用及其宿主细胞的相互作用，不同种类隐孢子虫凝集素基因及其编码蛋白在隐孢子虫侵袭中所起作用大小仍然不是非常清楚。本发明旨在研究不同种类隐孢子虫lectin基因序列差异，旨在为隐孢子虫分子流行病学调查、遗传结构分析和疫病暴发溯源提供新的分子工具。
相对于现有技术，本发明通过对隐孢子虫种分别进行SSU rRNA和Lectin位点的扩增，来探讨Lectin基因作为分型工具的可能性，旨在为隐孢子虫流行病学调查、遗传结构分析和疫病暴发溯源提供新的分子工具。本发明中，经序列比对及进化树结果表明，Lectin基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSU rRNA 序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具，是目前隐孢子虫分类工具的有益补充。
附图说明
图1是隐孢子虫部分虫种SSU rRNA基因的扩增，M： DNA标准DL2000；1是13-C.canis，2是14-C.canis，3是56-C.baileyi，4是355-C.andersoni，5是166-C.muris，6是167-C.muris，7是8-C.hominis，8是201-C.parvum，9是SCA667- C. cuniculus，10是268 -horse genotype- Donkey，11是89- C. hominis- Donkey，12是阳性对照，13是阴性对照。
图2是隐孢子虫部分虫种Lectin基因的扩增，M： DNA标准DL2000；1是13-C.canis，2是14-C.canis，3是56-C.baileyi，4是355-C.andersoni，5是166-C.muris，6是167-C.muris，7是8-C.hominis，8是201-C.parvum，9是SCA667- C. cuniculus，10是268 -horsegenotype- Donkey，11是89- C. hominis- Donkey，12是阳性对照，13是阴性对照。
图3是基于Lectin基因位点的隐孢子虫种系发育分析图。
图4是ClustalX的结果对照图。
具体实施方式
本发明中基于Lectin基因鉴定部分隐孢子虫的种类，所述的部分隐孢子虫是指C. parvum、C. hominis、C. cuniculus及其在SSU rRNA 处与人源C. hominis 极为相近的horse genotype、驴源C. hominis。
KOD-plus酶购自郑州科贸生物技术有限公司，由日本TOYOBO公司生产。
基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：
（1）基于SSU rRNA位点的扩增：基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；
基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：
外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；
R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；
内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；
R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4；
（2）基于凝集素基因Lectin位点的扩增：若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；
基于Lectin基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；
若两待测样品的Lectin基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种；若两待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；
基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：
外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；
R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；
内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；
R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8。
步骤（1）中的PCR反应条件：94℃，5min，1 个循环；94℃，45 s，55℃和55℃，45s，72℃，1min，35 个循环；72℃，10min，1 个循环。
步骤（2）中的PCR反应条件：94℃，3 min，1 个循环；94℃，30 s ，56℃和53℃，30s，72℃，1 min，40个循环；72℃，10 min，1 个循环。
步骤（1）和步骤（2）中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。
1. 隐孢子虫阳性样品的收集
隐孢子虫阳性样品共56份，包括52份实验室保存的在SSU rRNA位点进行过巢式PCR并鉴定为阳性的样品（16 份C. parvum、16 份人源C. hominis、5 份驴源C. Hominis、1 份驴源Horse genotype、4 份C. andersoni、3 个C. canis、3 个C. muris、2 个C. bailey 和2个C. ubiquitum），以及澳大利亚莫道克大学媒介与水传病原研究团队（Vector & Water-Borne Pathogen Research Group）保存的来源于袋鼠的4 份C. cuniculus，样品信息见表1。
2. 基于SSU rRNA位点的PCR的扩增
2.1 SSU rRNA位点的引物
SSU rRNA引物参考Xiao的方法在生工合成（Xiao L, Escalante L, Yang C, et al.Phylogenetic analysis of Cryptosporidium parasites based on the small-subunitrRNA gene locus[J]. Applied and environmental microbiology, 1999, 65(4):1578-1583）。
基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：
外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；
R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；
内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；
R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4。
2.2基于SSU rRNA位点的扩增
基于SSU rRNA基因对所有阳性样品进行巢式PCR的扩增，每次PCR扩增均设阳性对照样品和阴性对照样品。
PCR反应体系见表2，PCR反应条件：94℃，5min，1 个循环；94℃，45 s，55℃和55℃，45 s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，1个循环。
2.3 电泳
取5μl的第二套PCR产物加入2μl的DNA Green于琼脂糖凝胶电泳中扩增，电泳结束后在电泳凝胶成像系统仪中观察拍照，隐孢子虫部分虫种SSU 18s rRNA基因的扩增的凝胶成像图如图1所示。
2.4 测序
隐孢子虫阳性样品经SSU rRNA位点扩增后的第二套PCR产物，纯化后直接进行测序。每个样品均进行双向测序，测序委托北京诺赛基因有限公司完成，测序仪为ABI PRISMTM3730 XL DNA Analyzer（Applied Biosystems，USA）。
2.5 确认样品的种属
双向测序后的样品在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，应用ClustalX 1.83软件进行比对分析，对照比对结果和测序峰图，获得校准序列，如图4所示，确认待测样品所属的隐孢子虫种类，结果如表1所示。
3. 基于Lectin位点的PCR的扩增
3.1 Lectin位点的引物
Lectin的引物外引物F1、R1参照Zahedi A合成（Zahedi A, Monis P, Aucote S, etal. Zoonotic Cryptosporidium species in animals inhabiting Sydney watercatchments [J]. PloS one, 2016, 11(12): e0168169.），内引物用MacVector12.6软件设计，委托生物公司合成。
基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：
外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；
R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；
内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；
R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8。
3.2 基于凝集素基因Lectin位点的扩增
经SSU rRNA扩增后，对于属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis种属的待测样品基于Lectin基因再次进行巢式PCR扩增，每次PCR扩增均设阳性对照样品和阴性对照样品。
PCR反应体系见表2，PCR反应条件：94℃，3 min，1 个循环；94℃，30 s ，56℃和53℃，30 s，72℃，1 min，40个循环；72℃，10 min，1 个循环。
3.3电泳
取5μl的第二套PCR产物加入2μl的DNA Green于琼脂糖凝胶电泳中扩增，电泳结束后在电泳凝胶成像系统仪中观察拍照，隐孢子虫部分虫种Lectin基因的扩增的凝胶成像图如图2所示。
3.4 测序
隐孢子虫阳性样品经Lectin位点扩增后的第二套PCR产物，纯化后直接进行测序。每个样品均进行双向测序，测序委托北京诺赛基因有限公司完成，测序仪为ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer（Applied Biosystems，USA）。
3.5确认样品的种属
双向测序后的样品在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，应用ClustalX 1.83软件进行比对分析，对照比对结果和测序峰图，获得校准序列，如图4所示，确认待测样品所属的隐孢子虫种类，以及同种隐孢子虫的不同分离株。
3.6种系发育分析
种系发育进化树使用MEGA5软件建立，同时结合MegAlign建立的同源性结果进行序列的分析，种系发育分析图如图3所示，用于建立进化树的隐孢子虫种的Lectin位点的碱基序列如SEQ ID NO 9- SEQ ID NO 20，201-C.parvum-Cattle：SEQ ID NO 9，14793-C.parvum-Human：SEQ ID NO 10，KX375354.1 C parvum：SEQ ID NO 11，15281-C.Hominis-Human：SEQID NO 12，SCA782-C.hominis-Kangaroo：SEQ ID NO 13，KX375352.1 C.hominis：SEQ IDNO 14，SCA675-C.cuniculus-Rabbit：SEQ ID NO 15，KX375351.1 C.cuniculus：SEQ ID NO16，268-horse genotype-Donkey：SEQ ID NO 17，S13-C.hominis-Donkey：SEQ ID NO 18，106-C.hominis-Donkey：SEQ ID NO 19，89-C.hominis-Donkey：SEQ ID NO 20。
4. 结果
4.1 PCR对不同隐孢子虫种的扩增结果
经Lectin 基因引物共扩增了56份样品，其中42份隐孢子虫阳性样品在SSU rRNA基因位点和Lectin位点均已成功扩出，这些样品分属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、Horse genotype。而C. andersoni、C. canis、C. muris、C. bailey和C. ubiquitum，在SSUrRNA位点能够扩增目的序列，在Lectin位点却未能扩增出目的条带。在Lectin位点校准过的测序结果与GeneBank仅有的几条序列Blast结果相似。
由图1和图2可知，SSU rRNA位点可区分C.canis、C.baileyi、C.andersoni、C.muris、C.hominis、C.parvum、C. cuniculus、Horse genotype和驴源C. hominis，而Lectin位点不能区分C.canis、C.baileyi、C.andersoni和C.muris，只能区分C.hominis、C.parvum、C. cuniculus、Horse genotype和驴源C. hominis。
4.2序列比对与同源性分析
将42份Lectin基因扩增产物测序结果进行分析，同时与参考序列进行了比对，ClustulX比对结果显示：不同种类的隐孢子虫，重复序列碱基组成不同（数量不等的编码谷氨酰胺的CAA三联密码子），同种隐孢子虫不同分离株或不同来源的重复序列数目不同，其中，C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、驴源C. hominis和Horse genotype的连续的CAA个数见表3。此外，在6个C. parvum Lectin位点序列中发现样品431在56位点处碱基为T，而其它5个C. parvum的碱基为G，在302-307位点之间碱基缺失，其它5个C. parvum的碱基为ACTACC。可能是样品431与其它5个C. parvum的亚型不同，其具体结果有待进一步的验证。
由于比对序列较多，本发明选取9个隐孢子虫分离株的序列：C. parvum（201/15389）、C. hominis（15281/SCA782）、C. cuniculus（SCA675）、驴源C. hominis（89/106/S13-R）和Horse genotype（268-R）与参考序列KX375354.1 、KX375352.1及KX375351.1 进行同源性的分析。参考序列信息见表4。
同源性分析结果表明，在Lectin基因位点上C. parvum的这两个分离株，宿主来源不同，其中来源于牛的201号样品与KX375354.1同源性为97.1%，而来源于人的15389号样品与KX375354.1同源性为92.4%；C. hominis的两个分离株间宿主来源不同，同源性高达99.8%，但与KX375352.1的同源性是100%；C. cuniculus与KX375351.1的同源性为100%；3个驴源C. hominis间同源性在99.1%~99.7%之间，与KX375352.1的同源性为98.8%。遗传进化树及同源性结果表明，不同种类的隐孢子虫分布在不同的进化分支上，同种隐孢子虫也因虫株来源不同，显示遗传距离的远近，见图3。
括号中的样品与代表样品序列相同，处于同一分支上：
SCA782-C. hominis-Kangaroo（8, 23, 402, 14592, 15281, 15402, 14581, 15479,14671, 14638, 15410, 15429, SCA718，SCA631,SCA849）；
201-C. parvum-Cattle（207,224,239,339,123,BD,NX,15389,15289,431,14793,15324,15465, 15490, SCA642）；
SCA675-C. cuniculus-Rabbit（SCA678,SCA667,SCA663）；
S13-C. hominis-Donkey（89,58,59,106）。
4.3不同种类隐孢子虫凝集素Lectin基因的扩增
Lectin基因是编码隐孢子虫毒力因子的基因，其编码的蛋白质位于子孢子和裂殖子的顶端区域，可能与虫体的黏附、侵入及胞内的发展有关。研究表明，在很多寄生性的原虫中，凝集素Lectin或者与糖结合的蛋白质都能介导原生动物黏附宿主细胞、增强细胞的毒性及补体的抗药性，并能促进形成囊体或包囊壁，可能与隐孢子虫的致病性有关。本试验是在尝试使用Lectin基因位点作为分析工具时发现不同隐孢子虫种类在该位点的序列不同，尤其是不同种隐孢子虫有数量不等的CAA三联密码子重复序列，根据其他原虫相关研究，如溶组织阿米巴凝集素蛋白对阿米巴致病力的影响，推测该基因编码蛋白影响隐孢子虫的入侵、繁殖和致病力。在对Lectin位点进行引物的设计时，Lectin基因序列仅在C. parvum、C. hominis和C. cuniculus上有少量报道，而其他隐孢子虫Lectin基因存在与否及序列特性知之甚少，为此本实验选用全基因组序列中已上传的全基因测序完成的C. parvum和C. hominis的Lectin基因作为研究对象，设计隐孢子虫属特异性的巢式PCR引物，试图扩增出其他种的隐孢子虫Lectin基因序列。试验之初，曾对实验室保存的其他隐孢子虫如C. andersoni、C. baileyi、C. canis、C. ubiquitum、C. muris一并进行了扩增，但仅在C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype扩增出了目的基因。分析原因，可能是设计Lectin基因引物是基于C.parvum、C.hominis的基因序列设计的，所以只能扩增出这两个种或者与之相近的隐孢子虫种或基因型。NCBI上已公布的全基因组序列中，C.muris在Lectin位点上与C.parvum、C.hominis序列差别很大，这也是C.muris等在本次试验中无法扩增出目的条带，而C. parvum、C. hominis及其相近虫种可以顺利扩增的主要原因。
4.4在Lectin位点处对隐孢子虫相近种的扩增比SSU rRNA处有更好的区分度
挑选本实验中的11个样品（6个C. parvum、2个C. hominis和3个驴源C. hominis）分别进行SSU rRNA和Lectin的扩增，将第二套扩增产物送去测序，拼接序列后进行ClustalX比对。比对结果显示：在SSU rRNA位点处，仅能区分出不同的隐孢子虫种，而同种隐孢子虫不同分离株间的差别无法区分开来。而在Lectin位点处，能把C. parvum和C. hominis这两个隐孢子虫种及驴源C.hominis 很好地区分开来。同时，通过用Lectin位点扩增C. parvum，C. hominis，C. cuniculus，horse genotype，驴源、袋鼠源C. hominis 几种隐孢子虫/基因型时，发现在不同种类的隐孢子虫分离株中，其重复序列的碱基组成不同，同种隐孢子虫不同样品中重复序列的碱基数目不同。这也表明，Lectin 基因有望成为新的隐孢子虫标记基因，补充现有基因位点对隐孢子虫分型分类的不足。
目前，国内外将Lectin 基因位点用于隐孢子虫种类和基因型的鉴定，仅少量报道。本发明通过对不同隐孢子虫分离株在Lectin位点进行扩增，并将部分隐孢子虫种分别进行SSU rRNA和Lectin位点的扩增，以此来探讨Lectin基因作为分型工具的可能性，旨在为隐孢子虫流行病学调查、遗传结构分析和疫病暴发溯源提供新的分子工具。本发明中，经序列比对及进化树结果表明，Lectin基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSU rRNA 序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具，是目前隐孢子虫分类工具的有益补充。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法
<130> 1
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctagagct aatacatgcg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccatttcct tcgaaacagg a 21
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaagggttg tatttattag ataaag 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcataaggt gctgaaggag ta 22
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcaactaacg aaggagggga 20
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<400> 6
gtggtgtaga atcgtggcct 20
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<212> DNA
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<400> 7
cgtgcgaatg aagaaaga 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatcgtggcc taagagtg 18
<210> 9
<211> 393
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 9
tgttacaaaa cctattttct caaactattc ttcaattggg agaaattcag gagttgaaga 60
agtttattca agtaatgttt caaccatttc ctctaaagga gtagtattcc cgaataccac 120
aacttcctct gataatgatt tcactaagaa taaccctgct aacagttcta aacatacccc 180
cacctccacc actacaaata ctacaacaac cactacgaga acaacaacca ctaccacaac 240
cactaccact accactacca ctaccactac cactaccact accactacca ctaccactac 300
cactacaaca acaaccacaa caacagaaac gacaaccaca aagaaaagca ctacaacaac 360
taaaaacaca acaaccactc ttaggccacg att 393
<210> 10
<211> 565
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 10
tccaacatac cacctttgga tagaagctca tctggaagtt ttgagtctga tagtacagaa 60
tccgggcgtg cgaatgaaga gagaaacgat accctggagg agatgatcta caagcagagt 120
tctgactcta ttgaagatat attggttcct gttacaaaat ctattttctc agactattct 180
tcaattggga gaaattcagg agttgaagaa gtttattcaa gtaatgtttc aaccatttcc 240
tctaaaggag tagtattccc gaataccaca acttcctctg ataatgattt cactaagaat 300
aaccctgcta acagttctaa agataccccc acctccacca ctacaaatac tacaacaacc 360
actacgagaa caacaaccac aaccacaacc actaccacta ccactaccac taccactacc 420
actaccacta ccactaccac taccactaca acaacaacca cagcaacaga acgacaacca 480
caacagaaaa gcactacaac aactaaaaac acaacaacca ctcttaggcc acgattctac 540
accacagcaa cagaaacgac aacca 565
<210> 11
<211> 446
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 11
gaatccgggc gtgcgaatga agaaagaaac gataccctgg aggagatgat ctacaagcag 60
agttctgact ctattgaaga tatattggtt cctgttacaa aacctatttt ctcagactat 120
tcttcaattg ggagaaattc aggagttgaa gaagtttatt caagtaatgt ttcaaccatt 180
tcctctaaag gagtagtatt cccgaatacc acaacttcct ctgataatga tttcactaag 240
aataaccctg ctaacagttc taaacatacc tccacctcca ccactacaaa tactacaaca 300
accactacga gaacaaccac aaccacaacc acaaccacaa ccacaaccac aacaacaaca 360
accacaacaa cagaaacgac aaccacaaag aaaagcacta cagcaactaa aaacacaaca 420
accactctta ggccacgatt ctacac 446
<210> 12
<211> 458
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 12
tccaacatac catcctttgg ctagaagctc atcttgaagt tttgagtctg atagtacaga 60
atctgggcgt gtgaatgaag aaagaaacga taccctggag gaaatgatct acaagcagag 120
ttctgactct attgaagata tattggttcc tattacaaaa cctattttct cagactatgc 180
ttcaattggg agaaattcag gagttgaaga agtttattca agtaatgttt caaccatttc 240
ctctaaagga gtagtattcc cgaatactac agcttcctct gataatgctt tcactaagaa 300
taactctact aacagttcta aacatacctc cacctccacc actacaaata ctacaacaac 360
aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaaccacaa caaccacaac 420
aaccacaaca accacagcaa cagaaacgac aaccacaa 458
<210> 13
<211> 477
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 13
gagtctgata gtacagaatc tgggcgtgtg aatgaagaaa gaaacgatac cctggaggaa 60
atgatctaca agcagagttc tgactctatt gaagatatat tggttcctat tacaaaacct 120
attttctcag actatgcttc aattgggaga aattcaggag ttgaagaagt ttattcaagt 180
aatgtttcaa ccatttcctc taaaggagta gtattcccga atactacagc ttcctctgat 240
aatgctttca ctaagaataa ctctactaac agttctaaac atacctccac ctccaccact 300
acaaatacta caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca 360
accacaacaa ccacaacaac cacaacaacc acagcaacaa aaacgacaac cacaaagaaa 420
aacactacaa caactaaaan cacaacaacn actcttaggc cacgattcta caccaca 477
<210> 14
<211> 344
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 14
gaatctgggc gtgtgaatga agaaagaaac gataccctgg aggaaatgat ctacaagcag 60
agttctgact ctattgaaga tatattggtt cctattacaa aacctatttt ctcagactat 120
gcttcaattg ggagaaattc aggagttgaa gaagtttatt caagtaatgt ttcaaccatt 180
tcctctaaag gagtagtatt cccgaatact acagcttcct ctgataatgc tttcactaag 240
aataactcta ctaacagttc taaacatacc tccacctcca ccactacaaa tactacaaca 300
acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caac 344
<210> 15
<211> 452
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 15
gagtctgata gtacagaatc tgggcgtgcg aatgaagaaa gaaacgatac cctggaggaa 60
atgatctaca agcagagttc tgactctatt gaagatatat tggttcctat tacaaaacct 120
attttctcag actatgcttc aattgggaga aattcaggag ttgaagaagt ttattcaagt 180
aatgtttcaa ccatttcctc taaaggagta ttattcccga atactacagc ttcctctgat 240
aatgctttca ctaagaataa ctctactaac agttctaaac atacctccac ctccaccact 300
acaaatacta caacaaaaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca 360
acaacaacaa caacaacaac aaccacaaca accacagcaa caaaaacgac aaccacaaag 420
aaaaanacta caacaactaa aannacaaca ac 452
<210> 16
<211> 365
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 16
gaatctgggc gtgcgaatga agaaagaaac gataccctgg aggaaatgat ctacaagcag 60
agttctgact ctattgaaga tatattggtt cctattacaa aacctatttt ctcagactat 120
gcttcaattg ggagaaattc aggagttgaa gaagtttatt caagtaatgt ttcaaccatt 180
tcctctaaag gagtattatt cccgaatact acagcttcct ctgataatgc tttcactaag 240
aataactcta ctaacagttc taaacatacc tccacctcca ccactacaaa tactacaaca 300
aaaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca 360
acaac 365
<210> 17
<211> 399
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 17
tccaacatac catcctttgg atagaagctc atctggaagt tttgagtctg atggtacaga 60
atctgggcgt gcaaatgaag aaagaaacga taccctggag gagatgatct acaaacaggg 120
ttctgactct attgaagata tattggttcc tgttacaaaa cctattttct cagactattc 180
ttcaattggg agaaattcag gagttgaaga agtttattca agtaatgttt caaccatttc 240
ctctaaagga gtagtattcc cgaatatcac aacttcctct gataatgact tcactaagaa 300
taactctact aacagttcta aacatacctc caccactaca aatactacaa ccactacaag 360
aacgacaaca acaacaacaa caacaacaac cacaaccac 399
<210> 18
<211> 464
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 18
tccaacatac catcctttgg atagaagctc atctggaagt tttgagtctg atagtacaga 60
atctgggcgt gcgaatgaag aaagaaacga taccctggag gaaatgatct acaagcagag 120
ttctgactct attgaagata tattggttcc tattacaaaa cctattttct cagactatgc 180
ttcaattggg agaaattcag gagttgaaga agtttattca agtaatgttt caaccatttc 240
ctctaaagga gtagtattcc cgaatactac agcttcctct gataatgctt tcactaagaa 300
taactctact aacagttcta aacatacctc cacctccaca attacaaata ctacaacaac 360
aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaacc acaacaacca caacaaccac 420
aacaaccaca acaaccacag caacagaacg acaaccacaa caac 464
<210> 19
<211> 373
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 19
tggttcctat tacaaaacct attttctcag actatgcttc aattgggaga aattcaggag 60
ttgaagaagt ttattcaagt aatgtttcaa ccatttcctc taaaggagta gtattcccga 120
atactacagc ttcctctgat aatgctttca ctaagaataa ctctactaac agttctaaac 180
atacctccac ctccacaatt acaaatacta caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa 240
caacaacaac aacaaccaca acaaccacaa caaccacaac aaccacaaca accacagcaa 300
cagaaacgac aaccacaaag aaaaacacta caacaactaa aaacacaaca accactctta 360
ggccacgatt ata 373
<210> 20
<211> 458
<212> DNA
<213> 隐孢子虫种
<400> 20
tccaacatac catcctttgg atagaagctc atcttgaagt tttgagtctg atagtacaga 60
atctgggcgt gcgaatgaag aaagaaacga taccctggag gaaatgatct acaagcagag 120
ttctgactct attgaagata tattggttcc tattacaaaa cctattttct cagactatgc 180
ttcaattggg agaaattcag gagttgaaga agtttattca agtaatgttt caaccatttc 240
ctctaaagga gtagtattcc cgaatactac agcttcctct gataatgctt tcactaagaa 300
taactctact aacagttcta aacatacctc cacctccaca attacaaata ctacaacaac 360
aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaacc acaacaacca caacaaccac 420
aacaaccaca acaaccgcag caacagaaac gacaacca 458
Claims (4)
1.基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）基于SSU rRNA位点的扩增：基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；
基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：
外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；
R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；
内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；
R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4；
（2）基于凝集素基因Lectin位点的扩增：若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；
基于Lectin基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；
若两待测样品的Lectin基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种；若两待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；
基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：
外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；
R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；
内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；
R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8。
2.根据权利要求1所述的基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤（1）中的PCR反应条件：94℃，5min，1 个循环；94℃，45 s，55℃和55℃，45 s，72℃，1min，35 个循环；72℃，10min，1 个循环。
3.根据权利要求1所述的基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中的PCR反应条件：94℃，3 min，1 个循环；94℃，30 s ，56℃和53℃，30 s，72℃，1 min，40个循环；72℃，10 min，1 个循环。
4.根据权利要求1所述的基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。
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| CN101289689A (zh) * | 2007-09-27 | 2008-10-22 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 隐孢子虫快速检测试剂盒 |
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-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1814806A (zh) * | 2005-12-08 | 2006-08-09 | 华南农业大学 | 安氏隐孢子虫pcr检测试剂盒 |
| CN101289689A (zh) * | 2007-09-27 | 2008-10-22 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 隐孢子虫快速检测试剂盒 |
| CN103627797A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-03-12 | 深圳职业技术学院 | 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法 |
| CN107177692A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-09-19 | 华东理工大学 | 一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ALIREZA ZAHEDI等: "Zoonotic Cryptosporidium Species in Animals Inhabiting Sydney Water Catchments", 《PLOS ONE》 * |
| C.M. CAREY等: "Biology, persistence and detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis oocyst", 《WATER RESEARCH》 * |
| SEEMA BHALCHANDRA等: "Identification and Characterization of Cryptosporidium parvum Clec, a Novel C-Type Lectin Domain-Containing Mucin-Like Glycoprotein", 《INFECTION AND IMMUNITY》 * |
| 刘珍珍等: "基于凝集素基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定", 《中国人兽共患病学报》 * |
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