CN102634610A

CN102634610A - 麻疹病毒和风疹病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

Info

Publication number: CN102634610A
Application number: CN2012101370609A
Authority: CN
Inventors: 文锋
Original assignee: ZHENJIANG HECHUANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZHENJIANG HECHUANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-05-07
Also published as: CN102634610B

Abstract

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。该试剂盒能够灵敏地检测并鉴别样品中存在的麻疹病毒和风疹病毒核酸，其检测下限均为20拷贝每反应体系，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

Description

麻疹病毒和风疹病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。

技术背景

麻疹是由麻疹病毒引起的全身发疹性急性呼吸道传染病，传染性强，易引起暴发流行，是危害儿童生命健康及其严重的传染病之一。在疫苗可预防的疾病中，麻疹仍然是死亡例数最多的病种。WHO已将麻疹列为无脊灰地区下一个消除的疾病，WHO西太平洋地区所有成员国承诺2012年消除麻疹，我国卫生部组织制定了《2006-2012年全国消除麻疹行动计划》。近年来随着计划免疫工作的开展，在麻疹减毒活疫苗普遍应用后，不但存在症状典型的麻疹，还存在症状不典型的病人，后者需根据实验室检测做出诊断。风疹是由风疹病毒引起的急性呼吸道传染病，可引起风疹和先天性风疹综合症(CRS)。风疹是干扰麻疹诊断的重要因素。有数据显示，在麻疹阴性标本中风疹所占的比例超过了40％。

麻疹、风疹一年四季均可发生，但以冬末春初为多。自20世纪60年代麻疹疫苗及后来风疹疫苗使用以来，麻疹、风疹的流行规律发生了很大的变化，发病年龄后移，症状轻微或不典型，易与其它发热出疹性疾病混淆，因此实验室诊断成为科学鉴别麻疹、风疹的重要手段。

麻疹、风疹都有很强的传染性，为了有效的保护患者和易感人群。应做到早发现、早隔离、早诊断、早治疗。这使麻疹与风疹的检测方法显得尤为重要。由于传统的麻疹和风疹检测方法如血清抗体ELISA法和细胞培养法，用于快速诊断低滴度病毒携带者存在一些缺陷。ELISA法检测敏感度低，假阴性高，细胞培养费时费力，不利于快速检测，并且涉及活病毒的培养，对于操作人员来说具备一定的危险性。近年来针对病毒核酸序列的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。另外，我们针对病毒特异的靶序列设计Taqman探针，用于检测病毒时很大程度上保证了结果的特异性。

发明内容

为了更加准确地检测样品麻疹病毒和风疹病毒核酸存在，本发明提供一种特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为：

P1：5`-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3`，

P2：5`-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3`，

P3：5`-CGCCGCACGGACAACT-3`，

P4：5`-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3`。

引物的序列可分别向5`和3`端方向延伸5个核苷酸。

P1和P2为针对麻疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P3和P4为针对风疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。

本发明的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为：

Probe1：5`-X₁-GGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-Y₁-3`，

Probe2：5`-X₂-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC-Y₂-3`。

X₁和X₂为荧光报告基团，Y₁和Y₂为荧光淬灭基团。Probe1为针对麻疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对风疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶和逆转录酶M-MLV，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。

本发明的一优选实施方案为：序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Eclipse。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的包含上述两对特异性引物和两条特异性探针，属于实时荧光双重PCR检测，可在同一个反应体系中对麻疹病毒和风疹病毒核酸进行检测和鉴别。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的PCR反应循环参数为42℃，10min；95℃，10sec；进入循环阶段：95℃变性5s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。

本发明的另一优选实施方案，试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmo l/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8μl、样品DNA 2μl，加灭菌水至终体系20μl。

本发明提供的试剂盒对麻疹病毒核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系；对风疹病毒核酸的检测下限均为20个拷贝每反应体系。

本发明分别根据麻疹病毒或风疹病毒基因组保守区分别设计特异性引物和探针，提供的试剂盒可以检出麻疹病毒或风疹病毒的核酸，但不能检出非麻疹病毒或风疹病毒病原体的核酸，说明试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的试剂盒3小时内即可完成检测，双重检测可节省50％的检测费用，可为麻疹病毒或风疹病毒的疾病监测和临床诊断提供实验依据。

附图说明

图1为双重实时荧光PCR检测麻疹病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的4条曲线分别为麻疹病毒体外转录RNA梯度稀释(10⁴-10¹)后扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。

图2为双重实时荧光PCR检测风疹病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的4条曲线分别为风疹病毒体外转录RNA梯度稀释(10⁴-10¹)后扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。

图3为实时荧光双重PCR检测体系对麻疹病毒和风疹病毒核酸检测特异性扩增曲线图。麻疹病毒和风疹病毒均出现S型扩增曲线，而其他病原微生物质控毒株均未出现S型扩增曲线。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。

1、引物和TaqMan探针的设计与合成

利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的所有的麻疹病毒和风疹病毒基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列，并针对这两个检测靶序列设计和合成多套引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中麻疹病毒的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团，风疹病毒的检测探针5’端标记Hex荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团。

2、检测菌种的准备

本实施例中所使用的麻疹病毒、风疹病毒以及其他阴性对照质控毒株 (鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒)均由朝阳医院检验科惠赠。。

3、菌株DNA的抽提

选用Qiagen公司QIAamp Viral RNA Mini Kit(货号：52906)提取病毒RNA。具体步骤试剂盒参考操作说明书。

4、引物和探针的筛选

采用设计的多套引物和探针分别检测提取的麻疹病毒、风疹病毒和阴性对照质控毒株的核酸，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。(见序列表，麻疹病毒正向引物p1、反向引物p2和探针prob1；风疹病毒正向引物p 3、反向引物p4和探针probe2)

5、标准品的构建与制备

分别利用p1、p2和p 3、p4引物，RT-PCR扩增麻疹病毒与风疹病毒特异性基因片段，回收PCR产物，并克隆至含有T7启动子序列的质粒(如pGEM-Teasy vector)，使用大连宝生物公司的RNA Polymerase，合成RNA，加入无RNA酶的胰DNA酶I以终止体外转录反应，通过用酚：氯仿抽提纯化RNA。利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处的吸光率，然后计算RNA浓度与纯度，然后10倍梯度稀释至10个拷贝每微升。

6、反应条件优化

对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、Takara逆转录酶和DNA聚合酶混合物0.8μl、模板2ul，加灭菌水至终体系20μl。

根据扩增片段长、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定的循环参数为：逆转录42℃，10min；95℃，10sec；进入循环阶段：95℃变性5s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。每个循环在退火及延伸阶段采集荧光信号。

在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。

7、检测限的评价

取体外转录RNA标准品，进行10倍梯度稀释，每个反应体系加入2X10⁴至2X10¹拷贝的模板，评价了双重实时荧光PCR检测体系的检测敏感性。本发明提供的试剂盒对麻疹病毒核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系；对风疹病毒核酸的检测下限均为20个拷贝每反应体系。

8、检测特异性的评价

以上述2中的菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对麻疹病毒和风疹病毒核酸进行检测时均可见明确的扩增曲线，对上述7种其他咽部常见病原微生物检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他毒株之间不存在交叉反应。

尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测麻疹病毒和风疹病毒的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。

Claims

1.一种用于特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒核酸的引物组合，这套序列组合特征在于包括下列引物：

P1：5`-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3`，

P2：5`-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3`，

P3：5`-CGCCGCACGGACAACT-3`，

P4：5`-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3`。

2.一种用于特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒核酸的引物和寡核苷酸探针组合，其中引物为权利要求1所述的引物，寡核苷酸探针为：

Probe1：5`-X₁-GGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-Y₁-3`，

Probe2：5`-X₂-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC-Y₂-3`。

X₁和X₂为荧光报告基团，Y₁和Y₂为荧光淬灭基团。

3.如权利要求2所述，这套序列组合特征还在于，其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Eclipse。

4.如权利要求2所述，这套序列组合特征还在于，可用于双重实时荧光聚合酶链反应检测，即一个反应体系可同时检测和鉴别麻疹病毒和风疹病毒核酸。

5.一种用于特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒核酸的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其特征在于PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：

P1：5`-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3`，

P2：5`-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3`，

P3：5`-CGCCGCACGGACAACT-3`，

P4：5`-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3`。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：

Probe1：5`-X₁-GGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-Y₁-3`，

Probe2：5`-X₂-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC-Y₂-3`。

X₁和X₂为荧光报告基团，Y₁和Y₂为荧光淬灭基团。

7.如权利要求5所述的的试剂盒，其特征还在于PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针：其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Eclipse。

8.如权利要求5所述的的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8μl、样品DNA 2μl，加灭菌水至终体系20μl。

9.如权利要求5所述的的试剂盒，其特征还在于PCR反应循环参数为：

逆转录42℃，10min；95℃，10sec；进入循环阶段：95℃变性5s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。