CN108060264A - 小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光rt-pcr快速检测方法 - Google Patents

小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光rt-pcr快速检测方法 Download PDF

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赵福振
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Abstract

本发明提供了一种小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT‑PCR快速检测方法，包括小反刍兽疫病毒引物对和探针，蓝舌病病毒引物对和探针，其中两组探针的5’端和3’端分别用不同的荧光报告基团及配套的荧光淬灭基团标记。该快速检测方法能够对单个样本一次性检测两种病毒，具有敏感、高效的优点，临床应用价值优异。

Description

小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基于病毒核酸序列的基因检测试剂盒，及其检测方法。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起小反刍兽的急性接触性传染病，以发热，口腔、舌黏膜糜烂，流泪，流鼻液，腹泻和肺炎为特征；蓝舌病(Bluetongue，BT)是由蓝舌病病毒(BTV)引起反刍动物的非接触性传染病，以高热，口腔、鼻腔和胃肠道黏膜水肿，溃疡性炎症变化为特征。小反刍兽疫病毒(PPRV)主要感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚、努比亚野山羊、长角羚及其它小反刍兽。骆驼、猪和牛也可感染，但通常无临床症状。蓝舌病病毒(BTV)对绵羊、山羊和牛易感，一般情况下，绵羊感染后的临床症状明显，山羊和牛呈隐性感染。小反刍兽疫和蓝舌病(以下简称“两病”)在我国均列为一类动物疫病，在我国周边国家及国内多个省份都有发生，特别是羊的小反刍兽疫近年疫情形势严峻。羊在感染“两病”后的临床症状不易鉴别，且近年发现“两病”常有双重混合感染的情形存在，在国外被称为小反刍兽的跨界疾病。但是现行缺乏快速检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的方法，给后续开展的防控、检疫工作带来很大的困难。
对“两病”的诊断，一般是采用Elisa抗体筛查、单重RT-PCR或普通RT-PCR检测的方式。由于动物交易活跃，动物免疫背景不清，导致Elisa抗体筛查结果并不准确；单重RT-PCR费时费力，无法满足高通量检测的需求；而普通PCR的检测敏感性较差。
发明内容
本发明旨在提供一种利用双重荧光RT-PCR快速同时鉴别小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法，包括RT-PCR反应液、酶混合液、小反刍兽疫病毒/蓝舌病病毒双重反应液和去RNA酶水。其中小反刍兽疫病毒/蓝舌病病毒双重反应液包括：(1)一对小反刍兽疫病毒引物和一条小反刍兽疫病毒探针组成；(2)一对蓝舌病病毒引物和一条蓝舌病病毒探针组成。
具体引物和探针如表1所示。
表1双重荧光RT-PCR引物和探针
进一步，小反刍兽疫病毒探针用ROX荧光报告基团和BHQ2荧光淬灭基团标记，蓝舌病病毒探针用FAM荧光报告基团和BHQ1荧光淬灭基团标记。
进一步，所述RT-PCR的扩增程序为：42℃15min；95℃3min；95℃15s，55℃45s，共40个循环。
本发明提供的小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法，对单个样本一次性检测两种病毒，具有敏感、高效的优点，临床应用价值优异。
附图说明
图1是小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法特异性检测曲线图；
图2是小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法灵敏度检测曲线图；
图3是小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法样品检测曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立
分别以PPRV和BTV的合成Template DNA(模板DNA)为模板，以表2中的反应体系、表3中的反应条件进行RT-PCR扩增。
表2 PPRV-BTV双重荧光RT-PCR反应体系
表3 PPRV-BTV双重荧光RT-PCR反应条件
实施例2特异性试验
分别采用PPRV疫苗株、BTV病毒株，以及与PPRV同为副黏病毒科的鸡新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株、犬瘟热病毒(CDV)疫苗株，与BTV同为呼肠孤病毒科的禽呼肠孤病毒(ARV)疫苗株、猪轮状病毒(PRV)疫苗株作为检测对象，验证特异性。分别提取各待检病毒株的RNA作为反应模板，在实施例1的反应体系和条件下，进行荧光RT-PCR扩增。得到如图1所示的荧光RT-PCR扩增曲线，除PPRV、BTV病毒具有荧光信号增长外，其余检测目标均未收集到荧光信号。由于NDV、CDV与PPRV，ARV、PRV与BTV分别为同一病毒科，有较为相近的分子进化关系，试验结果可以证实所述小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法具有检测特异性。
实施例3灵敏度试验
阳性对照质粒(合成Template DNA)在紫外分光光度计上测定OD260数值，换算成质量浓度，再根据分子量大小和阿佛加德罗常数换算成摩尔浓度，即拷贝数。将质粒原液10倍梯度稀释成以下浓度：109、108、107、106、105、104、103、102、101和100，最小浓度为理论上100拷贝/μL。在实时荧光PCR仪上检到的最小拷贝数即是该体系的检测灵敏度。
阳性标准品按照100～109拷贝/μL梯度浓度为模板，荧光RT-PCR扩增结果见图2，其中109、108、107、106、105、104、103、102、101浓度的模板均有比较好的扩增效果，100检测结果阴性。因此，本研究中建立的方法检测灵敏度为101拷贝/μL。
实施例4临床样本的检测
从珠海市两家活羊屠宰车间采集屠宰后的羊的淋巴结样本200份。先采用实施例1的检测方法进行检测得到如图3所示的检测曲线图。其中3份样本收集到了荧光信号，疑似PPRV阳性，而蓝舌病病毒并未检测到。对荧光RT-PCR检测结果阳性的样本，采用巢式RT-PCR的方法进行扩增，回收扩增产物，结果其中2份疑似PPRV阳性样本成功得到扩增，回收巢式RT-PCR的第二轮PCR产物，为保证测序结果的准确性，采用双向测序。测序结果通过BLAST序列比对，其序列与2013-2014年间我国各省流行的毒株相似性为100％，与Nigeria-75/1毒株(疫苗毒株)的相似性为96％。另一个未能成功测序的阳性样本可能为样品本身病毒含量太低，病毒RNA未能成功抽提。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttcaatatg ttgttagcct ccat 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtatccggtg ccgtaacag 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacaagtctg gatccttctg gcca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttaaaaagt gtcgctgcca 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctctcctgat tatgtttcat tttttc 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctatccgggc tgatccaaag gttcga 26

Claims (2)

1.一种小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法，其特征在于，包括如SEQ ID№1～3所示的小反刍兽疫病毒引物对和探针，如SEQ ID№4～6所示的蓝舌病病毒引物对和探针，两组探针的5’端和3’端分别用不同的荧光报告基团及配套的荧光淬灭基团标记。
2.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光
RT-PCR快速检测方法，其特征在于，所述RT-PCR的扩增程序为：42℃15min；95℃3min；95℃15s，55℃45s，共40个循环。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634610A (zh) * 2012-05-07 2012-08-15 镇江和创生物科技有限公司 麻疹病毒和风疹病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒
CN104450966A (zh) * 2014-12-09 2015-03-25 艾军 一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重pcr试剂盒
CN105331742A (zh) * 2015-11-19 2016-02-17 西北农林科技大学 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634610A (zh) * 2012-05-07 2012-08-15 镇江和创生物科技有限公司 麻疹病毒和风疹病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒
CN104450966A (zh) * 2014-12-09 2015-03-25 艾军 一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重pcr试剂盒
CN105331742A (zh) * 2015-11-19 2016-02-17 西北农林科技大学 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. VENKATESANA等: "TaqMan based real-time duplex PCR for simultaneous detection andquantitation of capripox and orf virus genomes in clinical samples", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
中国医学创新杂志社: "《实用临床诊疗 检验学》", 31 October 2013 *
侯月娥等: "猪PRRSV和PCV2双重TaqMan荧光定量PCR", 《中国预防兽医学报》 *
宋爽等: "小反刍兽疫、蓝舌病、羊痘一步法多重PCR检测方法的建立", 《黑龙江畜牧兽医》 *
武昱孜等: "猪肺炎支原体和猪鼻支原体双定量PCR检测方法的建立重荧光", 《畜牧兽医学报》 *
王建华等: "尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立", 《动物医学进展》 *
秦敏等: "蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎多重PCR检测方法的建立", 《动物医学进展》 *

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