CN1705755A - 用于检测鸟类组织样品中病毒的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测鸟类组织样品中的病毒方法，其中测试来自羽毛的遗传物质中是否存在来自病毒的遗传物质。

Description

用于检测鸟类组织样品中病毒的测定方法

本发明涉及测定方法，具体而言涉及检测鸟类组织样品中病毒，特别是马立克氏病病毒(MDV)存在的测定方法。

发明背景

马立克氏病病毒(MDV)是一种疱疹病毒，导致鸡的淋巴组织增生性疾病。即使在引入预防MDV的疫苗后，感染仍然导致养鸡业相当大的损失。MDV分为三种血清型，所有三种血清型均产生潜伏性感染。血清型1包括致癌病毒，血清型2包括非-致癌病毒，血清型3包括火鸡疱疹病毒(HVT)(Bulow et al(1976)Zentralblatt fur Veterinarmedizin，23B，391-402)。

传统的马立克氏病诊断是以临床体征和病理改变为基础的。然而，期望监测MDV的流行最好有更特异的方法。Haider等人描述了用琼脂凝胶沉淀试验检测羽毛毛囊上皮细胞中的病毒抗原(1970)Poultry Science，49，1654-1657。不同的血清型可通过琼脂凝胶沉淀试验区分开来(Lee等人(1983)Journal ofImmunology，130，1003-1006)，但检测的敏感性不如酶联免疫吸附测定(ELISA)和DNA杂交(Davidson et al(1986)于：Current research on Marek′sdisease.Proceedings of the 5^th International Symposium on Marek′s Disease(pp.311-316).Tallahassee：Rose Printing Company，Inc.)。

优选的用于病毒分离的样品为暗黄层细胞(buffy-coat cell)，其可与易感染的原代细胞培养物共培养。随后可使用免疫荧光测定(Kitamoto et al(1979).Biken Journal，4，137-142)或ELISA(Cheng et al(1984)Avian Diseases，4，900-911)鉴定MDV血清型。做为选择，血清型也可通过限制性内切酶分析(Ross et al(1983).Journal of General Virology，64，2785-2790)或聚合酶链反应(PCR)(Wang et al(1993)Molecular and Cellular Probes，7，127-131)进行鉴定。原位杂交现已用于检测感染组织中的MDV基因组(Endoh et al(1996)Journal of Veterinary Medical Science，58，969-976；Ross et al(1997)Journal of General Virology，78，2191-2198)，但该方法对常规诊断而言过于繁琐。(Davidson et al(1995)Avian Pathology，24，69-94；和Davidson et al(1996)于：Current research on Marek′s disease.Proceedings of the 5^th InternationalSymposium on Marek′s Disease(pp.311-316).Tallahassee：Rose PrintingCompany，Inc.)，MDV血清型1-特异的PCR技术在大部分有赘生疾病的商品鸡和火鸡群的全血和肿瘤组织样品中的应用。Wang等人(1993)Molecular andCellular Probes，7，127-131；Young，P.& Gravel，J.(1996)于Current researchon Marek’s disease.Proceedings of the 5^th International Symposium on Marek′sDisease(pp.308-310)，Tallahassee：Rose Printing Company，Inc.；和Silva，R.F.& Witter R.L.(1996)于Current research on Marek′s disease.Proceedings of the 5^thInternational Symposium on Marek′s Disease(pp.302-307)。Tallahassee：RosePrinting Company，Inc.，MDV血清型1-特异的PCR方案在试验性地接种了JM/102菌株鸡的多种组织中的应用。

Handberg et al描述了使用血清型1和血清型3特异的PCR检测鸡中的MDV(2001)Avian Pathology 30：243-249。组织样品取自血液(血沉棕黄层细胞)、脾脏、肝脏、皮肤、羽毛尖端和卵巢。

发明概述

本发明提供另一种方法，用于检测鸟类组织样品中的病毒，特别是MDV。

本发明的第一方面提供检测鸟类组织样品中的病毒的方法，包括：从鸟类组织样品中提取遗传物质；测定提取的遗传物质以检测任何来自病毒的遗传物质；特征在于鸟类组织样品来自腋窝区的一根或多根羽毛。

通过使用羽毛样品，检测可在活体动物上进行。羽毛的采样简单、快速，并且在野外条件下很实用。可将羽毛样品置于适当的容器中，根据需要可立刻检测或储存用于将来检测。相反地，从血液采样需要非常小心，以防止形成血凝块，包括在冷却受控的条件下运输血液。血液凝固导致阴性试验结果。内脏器官样品例如脾脏和肿瘤样品，必须在湿冰上运输，在野外条件下无法进行。

与从鸟类的不同部位取得组织样品的已知方法相比，本发明通过选择腋窝区羽毛从中获得组织样品，具有显著的优势。

意外地，我们发现在腋窝区羽毛中病毒的检出水平高于其它区的羽毛，因此，当在其它组织样品包括其它区的羽毛中不能检出时，根据本发明可在腋窝区检测出病毒。因此，通过检测腋窝区羽毛组织样品中疫苗菌株的存在，本发明方法特别适用于检测鸟群中MDV疫苗免疫的有效程度。

就″鸟类″而言，我们包括任何一种鸟类，但优选商品化生产的鸟类，特别是家禽例如鸡、火鸡、鸭，等。

就″腋窝区羽毛″而言，我们包括的意思为，在附随的羽毛图(图1)中位于鸟类的标记为″腋下″区域的羽毛。优选地，选择的腋窝区羽毛为″幼羽″，即生长中的未成熟羽毛。术语″幼羽″对于技术人员来说是熟悉的。例如：van TyneJ& Berger AJ(1959)Fundamentals of Ornithology，John Wiley，New York参见″新的生长中的羽毛，还未完全长出″。Lucas AM & Stettenheim PR(1972)AvianAnatomy，Integument Part 1，US Government Printing Office，Washington，pp199-200，注释″新羽毛形成时紧紧地卷曲于鞘内。当它出现在皮肤上时，为长圆锥形，具有钝的顶端和稍微湿的表面。任何一代处于这一阶段的羽毛，通常被称为幼羽″。(也可参见图1(a)，取自Lucas & Stettenheim(1972))。

优选地，腋窝区羽毛采自最好小于1月龄的小鸡。

在优选的实施方案中，在免疫后13天或之前，优选在免疫后8-12天期间，更优选在免疫后9-11天期间，即免疫后的第9、10或11天，取小鸡样品实施本方法。

优选地，本方法提供有关样品中的病毒，特别是MDV数量的定量信息。

优选地，本方法为MDV血清型1特异的，更优选本方法是MDV-1 RispensCVI 988菌株特异的。后者菌株为Fort Dodge，IA，USA生产的商品化疫苗，可从美国典型培养物保藏所(ATCC)，Mannassas，VA，美国获得。

有利地，本方法涉及使用PCR反应。优选地，在进行该PCR反应之前，用试剂处理用于检测的提取的遗传物质，以消除任何可能存在于羽毛中的组织因子的抑制作用。这种抑制作用似乎与黑色素有关，因而从来自棕色鸟类的羽毛采样时可能成为一个特定的问题。优选地，该试剂选自牛血清白蛋白、猪科(猪)的白蛋白和绵羊科(绵羊)的白蛋白中的一个或多个。

本领域技术人员将会意识到：可用于检测本发明方法中使用的病毒遗传物质，特别是MDV的遗传物质的许多种检测方法，例如上述Handberg et al(2001)的方法。

用于检测MDV-1菌株CVI 988的特别优选的方法如下：

(i)提供核酸聚合酶的正反向引物，该引物选自位于MDV 132bp核酸重复序列两侧的核苷酸序列；

(ii)在引物之间扩增核酸序列；

(iii)检测扩增的核酸序列中132bp重复序列的数目；

(iv)将132bp重复序列数与病毒核酸的鉴定联系起来，从而鉴定组织样品中MDV的类型，多拷贝的132bp重复序列指示MDV-1菌株CVI 988。

根据本发明用于检测MDV的优选的定量方法包括：

(a)提供能与MDV-特异的目标核苷酸序列特异性结合的多聚核苷酸序列；(b)将提取的遗传物质与探针接触，使探针与MDV目标核苷酸特异性结合；(c)确定探针是否与MDV目标多聚核苷酸结合；

(d)以目标核苷酸的存在指示样品中MDV的存在为基础，确定样品是否含有MDV。

步骤(d)优选提供样品中病毒数的定量测定。

有利地，确定探针是否与目标多聚核苷酸结合的步骤包括扩增目标多聚核苷酸的区域，该区域包含探针结合部位。

优选地，探针具有5′AGA CCC TGA TGA TCC GCA TTG CGA CT 3′序列(SEQ ID No.1)。

优选地，扩增由下列引物启动：

正向引物(GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA-SEQ ID No.2)，其位于GA菌株Meq基因序列的1341-1361位的NT核苷酸处。

菌株GA(Georgia)是来自乔治亚的来自卵巢肿瘤的1964分离菌。参考：C.S.Eidson & S.C.Schmittle(1968)。Studies on acute Marek′s disease.I.Characteristics of isolate GA in chickens.Avian Diseases 12；467-476。

反向引物(GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA-SEQ ID No.3)位于1413-1393位的NT核苷酸处。

探针最好用荧光进行标记，确定探针是否与目标多核苷酸结合的步骤包括测定探针的荧光发射。

通过直接与一短的寡聚探针两端结合使两种荧光染料在物理上接近(5′报道分子荧光染料，通常为6-FAM，3′淬灭剂荧光染料，通常为TAMRA)。高能量的荧光基团(FAM)在488纳米激发，而预期的荧光发射在520纳米处，俘获能量转移到低能量的荧光基团(TAMRA)，并且在580纳米处发射(发生荧光共振能量传递，FRET)。联合使用荧光素/罗丹明报告分子/淬灭剂，可有效地产生FRET，即使该基团被25-30个DNA碱基分开。在TaqMan^TM测定过程中，在Taq DNA聚合酶的5′-核酸酶作用下，两个荧光基团在物理上彼此分开，在488纳米激发后导致在520纳米可见的FAM发射。

双-标记探针通常具有5′-报告分子染料，例如FAM、TET、HEX、JOE或VIC，和3′-淬灭剂基团，例如TAMRA或Dabcyl(通用的淬灭剂)。

适当的荧光标记在技术人员的普通常识内。以下试剂从Sigma-Aldrich(英国)获得：

HEX代表六氯荧光素；TET代表四氯荧光素；Joe为6-羧基4′，5′-二氯2′，7′-二甲氧基荧光素；ROX为5-羧基-荧光染料；dabcyl为4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)安息香酸。

所有这些结构及更详细的资料可从分子探针网站www.probes.com获得。VIC染料从Applied Biosystems获得。

6-FAM＝6-羧基荧光素；(一种亚磷酰胺)；黄-绿色染料；最大吸收＝494纳米，最大发射＝525nm

HEX＝一种亚磷酰胺；粉红色染料；最大吸收＝535，最大发射＝556

TET＝一种亚磷酰胺；橙色染料；最大吸收＝521，最大发射＝536

VIC＝最大吸收538，最大发射＝554

JOE＝最大吸收＝521，最大发射＝547

TAMRA＝6-羧基四甲基罗丹明；最大吸收＝555，最大发射＝580

Dabcyl＝最大吸收＝453，没有最大发射(通用的淬灭剂)

根据上文所述，显然本发明方法的一个重要方面是，使用的鸟类组织样品，比过去用于检测病毒，特别是MDV感染所使用的鸟类组织样品，更为方便和有效。

因此，本发明另一方面涉及鸟类组织样品的供应。

本发明的第二个方面提供从腋窝区一根或多根羽毛中分离的组织样品。

就″分离″而言，我们包括的意思为，将组织样品从相当数量的材料中分离出来，通常是本质上与之相关的材料。例如，组织样品可保存于容器中，或通过多种分离、提取和/或纯化方法从最初的腋窝区羽毛中获得。

优选地，分离的组织样品由近端部分组成(非-具倒刺毛(non-barbed)部分，其与皮肤相连并且含髓-见附图)。因此优选将腋窝区羽毛近端部分与羽毛远端部分(具倒刺毛的)分开。这可通过简单地用剪刀剪下羽毛的近端部分，弃去远端部分而轻易地实现。

本发明的第三方面提供含遗传物质的、来自鸟类组织样品的提取物，其中提取物取自本发明第二方面描述涉及的组织样品。

应当了解，根据本发明的第二和第三方面，可实地收集和/或制备样品，或运送至分开的场所例如实验室，用于制备和检测。因此，根据本发明的第二和/或第三方面，本发明另方面涉及以适于运输至分开场所的方式保存的样品。

羽毛可以被完整地保存(例如在20毫升无菌通用塑料试管中)，或将制备DNA需要的近端部分剪下后保存(例如保存在1ml带折帽或螺丝帽的微量离心管中)。做为选择，羽毛也可保存于热-封口或扎紧的塑料袋中。

对于短期保存(例如1周)，羽毛可保存于4℃，但要长期保存，应将其冻存于-20℃。

DNA应保存于-20℃，在带螺丝帽或扣帽的0.5ml或1.5ml微量离心管内，在Tris-EDTA缓冲液中，或者，如果DNA用于Taqman分析，则保存于水中，因为EDTA会抑制Taqman反应。

有利地，以可懂格式(Intelligible format)提供本方法的结果。优选地，将结果记录或保存于信息载体上。不过，提供结果的步骤也可采取口头交流结果方式。就″信息载体″而言，我们包括保存信息的任何方式，例如纸、电脑软盘；基于因特网的信息传输系统，例如电子邮件或因特网页，或电子文件等。当然，″可懂格式″还可包含可用近似密钥破解的加密信息。

现参考下列附图对具体体现本发明某些方面的实施例进行描述，其中：

图1(a)显示在第1个4代期间皮肤上羽毛的发育。圆圈指示还在生长的羽毛；圆点指示完全长成的羽毛。

图1(b)为鸡羽毛生长模式的示意图，显示其腋窝区。

腋窝区位于小鸡的下侧，在每一边从颈下部向上腹部伸展，在翅膀下面沿着胸骨。图1取自书“Bird Structure：An approach through evolution developmentand function in the fowl”。D.A.Ede，出版者：Hutchinson Educational，1964。该羽毛生长模式在所有鸟类中是相同的。

图2(a)-2(d)为腋窝区羽毛的照片，以及显示个体羽毛保留部分的特写，该部分提供根据本发明的组织样品。图2(a)和2(b)阐明腋窝区羽毛。图2(c)和2(d)阐明羽毛用作分析的部分。

图3：显示用Taqman方法，以Meq引物(78bp产物)检测的血清型CVI988疫苗的剂量反应。CVI988疫苗从细菌的人工染色体(BAC)载体获得。

进行本试验以检验/优化Meq Taqman引物/探针组合的使用。用BAC10DNA作为目标DNA，因为已知其含有病毒基因组的多个拷贝。

使用Taqman分析检测来自克隆于细菌人工染色体(BAC10)的Rispens病毒基因组DNA中的Meq基因。DNA经10倍稀释使用。在实时PCR的每个循环中，均释放出报告荧光染料FAM并可发出荧光。因此，荧光强度随着每一循环而增加。Ct值(荧光超过固定阈值时的循环)是目标序列起始拷贝数的测量尺度。Ct值越低，目标序列的起始拷贝数越高。Ct值为40，表明目标序列不存在，或存在的目标序列的数量不能检出。该图显示DNA制剂经1∶10-1∶10000稀释给出的Meq PCR产物的可检出数量。Ct值随DNA稀释度的增加而线性增加。

图4：CVI 988疫苗在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)和细菌人工染色体(BAC)中的剂量反应。以采自Rispens-MDV感染细胞的DNA进行本实验，以检测/优化Meq Taqman引物/探针组合的使用。使用Taqman分析检测来自BAC10 DNA和来自Rispens MDV-感染的鸡胚纤维母细胞(CEF)DNA中的Meq基因。DNA经10倍稀释使用。本图显示对于BAC10 DNA和Rispens-感染的CEF DNA，Ct值均随DNA稀释度的增加而线性增加。

图5：CVI 988疫苗在鸡脾脏和CEF中的剂量反应。以采自Rispens-MDV感染鸡的组织样品中的DNA进行本实验，以检测/优化Meq Taqman引物/探针组合的使用。使用Taqman分析检测接种Rispens小鸡(11dpi)和龄期-匹配的未接种小鸡脾脏DNA的Meq基因。用Rispens-感染的CEF细胞DNA作为阳性对照。将1mg/ml的DNA原液稀释10倍后使用，每个反应使用1μl。尽管未接种的脾脏DNA的Ct值低于40，但显然它们不随DNA浓度的增加而增加。然而，当DNA不经稀释或以1∶10稀释使用时，在接种脾脏DNA中的Meq检测值明显升至基线以上。我们从而建立了采自接种小鸡组织样品DNA的Taqman分析，每个反应我们从1mg/ml的DNA原液中取出1μl使用(即1ug)。

图6：小鸡羽毛中CVI988疫苗的复制时间进程表明感染15-20天后复制达到峰值。

进行本实验以通过Taqman分析来追踪在接种的小鸡腋窝区羽毛中的Rispens MDV-感染的时间进程。使用Taqman分析检测接种0(未接种)、10、15、20、28dpi后，从小鸡羽毛尖端制备的DNA中的Meq基因。5只小鸡一组，在每个时间点采样(4只小鸡在0dpi)。取1μg DNA用于Taqman分析。绘出每组的Ct平均值。Ct值在0-15dpi时减少，在20-28dpi时又增加，在感染15-20dpi时显示最大值。

图7：

进行本实验以通过132bp重复序列PCR来追踪接种小鸡的腋窝区羽毛的Rispens MDV-感染时程。

在接种0(未接种)、10、15、20、28dpi后，从Rispens-接种小鸡的羽毛尖端制备DNA。5只小鸡一组，在每个时间点采样(4只小鸡在0dpi)。取1μg DNA用于PCR(每个反应包括10μg牛血清白蛋白)，将样品在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳。

(M)＝λ分子大小标记物，(-)＝水(阴性对照)，(+)＝Rispens BAC10 DNA(阳性对照)。感染后天数指示于凝胶下方。

(a)为了确认每一DNA样品的PCR-数量和质量，进行PCR以检测存在于所有鸡细胞中的内原性反转录病毒序列。可在所有的羽毛样品中检测到360bp的内原性反转录病毒产物，确认了每一样品中的PCR质量。

(b)进行132bp重复序列PCR。标记(+)的泳道显示由Rispens BAC10得到的132bp重复序列的梯状PCR产物-可清楚地辨别出6个拷贝。阴性对照显示没有PCR产物，4只未接种小鸡中的3只也是如此。第4只未接种小鸡显示出模糊的产物带，相当于3个重复序列拷贝，表明这只小鸡因为与接种小鸡放在同一个房间而有接触感染。在11、15、20和28dpi，所有接种小鸡均为132bp重复序列阳性。代表一定重复序列拷贝数的PCR产物在多数情况下占主导地位，这种占主导地位的产物所代表的拷贝数在样品之间变化。这表明具有一套重复序列数目的接种病毒的亚克隆，开始在不同小鸡中占主导地位。

图8：显示使用Rispens BAC10 DNA的Meq基因反应的标准曲线图

图9：显示在接种疫苗后的(A)8，(B)13，(C)19和(D)26天，小鸡个体的各种羽毛区中的Rispens病毒载量的比较。

图10：显示通过实时PCR测定多种羽毛区的Rispens病毒载量对Meq基因作图，(A)对数坐标，(B)线性坐标。4只接种小鸡的平均值(+SEM)。

实施例1：MDV-1的定量PCR测定

Taqman^TM定量PCR是一种用于通过测定达到荧光阈值(由Ct值通过数学方法确定)所需要的PCR循环数而定量PCR目标序列起始数目的已确立的技术。样品中目标序列的拷贝数越高，达到Ct阈值需要的PCR循环数就越少。

Taqman引物和探针根据MDV菌株GA的Meq基因序列进行设计(见后)。该序列发表于：Jones D，Lee L，Liu JL，Kung HJ，Tillotson JK。马立克氏病病毒编码类似于高度表达于淋巴母细胞瘤中的fos/jun致癌基因的碱性亮氨酸拉链基因(Marek disease virus encodes a basic-leucine zipper gene resembling the fos/junoncogenes that is highly expressed in lymphoblastoid tumors.)Proc Natl Acad Sci USA.1992 May 1；89(9)：4042-6.序列登记号为：M89471(SEQ ID No.9)使用Applied Biosystems的“引物快递”(′Primer Express′)软件，从Meq序列中选择最佳的引物/探针序列。

用于本分析的特异性引物在MDV血清型1病毒的Meq基因中扩增出73bp的序列。该区域为疫苗菌株和野生分离菌所共有的区域。

实验描述了使用CVI88疫苗作为血清型1马立克氏病病毒的例子，这些结果可应用于所有血清型1马立克氏病病毒，因为该引物所针对的序列区在MDV血清型1病毒中是保守的。

羽毛尖端样品的Taqman^TM Meq基因的PCR分析方案

1.需要的材料：

试剂：

·TNE缓冲液(保存于室温)含Tris(10mM)、NaCl(150mM)、EDTA(1mM)，用HCl调节pH至pH7.5。

·十二烷基硫酸钠(SDS)10％溶液(保存于室温)

·蛋白酶K(冻干粉末，Sigma & num目录号P-6556；在水中配制成20mg/ml的原液，保存于-20℃)

·酚pH7.9，从Sigma获得(目录号P-4557)保存于4℃)

·氯仿(保存于-20℃)

·3M乙酸钠pH5.2(保存于室温)

·过滤后的无水乙醇(保存于室温)

·过滤后的70％冷乙醇(保存于4℃)

·PCR规格水

·过滤后的含有800pg/ml牛血清白蛋白(BSA)的PCR规格水

·冰

·Taqman^TM PCR核心试剂-Taqman缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq聚合酶、尿嘧啶N-糖基化酶(Perkin Elmer Biosystems)

Meq正向引物5′GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA 3′(SEQ ID No.2)(MWG Biotech)

Meq反向引物5′GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA 3′(SEQ ID No.3)(MWG Biotech)

Meq探针5′FAM AGA CCC TGA TGA TCC GCA TTG CGA CT 3′(SEQID No.1)TAMRA

(Sigma-Genosys Ltd)

(FAM和TAMRA为荧光标签)

6-FAM＝6-羧基荧光素；(一种亚磷酰胺)；黄-绿色染料；最大吸光度＝494nm，最大发射量＝525nm

TAMRA＝6-羧基四甲基荧光染料；最大吸光度＝555，最大发射＝580

5′FAM-3′TAMRA标记的探针从Sigma-Genosys公司获得。(LondonRoad，Pampisford，Cambridgeshire，CB2 4EF，UK.Tel.01223 839200)

5′VIC-3′TAMRA标记的探针从Applied Biosystems公司获得(KelvinClose，Birchwood Science Park North，Warrington，Cheshire，WA3 7PB)

其它的供应商为：

Integrated DNA Technologies(IDT)1710 Commercial Park，Coralville，IA，52241，USA

Oswel Research Products Ltd.：Lab5005，Medical and Biological SciencesBuilding，University of Southampton，Boldrewood，Bassett Crescent East，Southampton，S016 7PX，Tel：02380 592984

仪器

*无菌的20毫升塑料通用试管

*洁净的剪刀和钳子

*调至50℃的恒温水浴箱

*台式离心机

*1.5毫升带折帽的Eppendorf试管(高压消毒的)

*1.5毫升带螺丝帽的Eppendorf试管(高压消毒的)

*0.5毫升带折帽的Eppendorf试管(高压消毒的)

*真空/冻干机(非必须的)

*分光光度计

*PCR专用盒、吸管和高压消毒的吸头

*速热96-孔PCR平板和盖子(Perkin Elmer/Applied Biosystems)

*ABI Prism 7700序列测定仪(Perkin Elmer/Applied Biosystems)

2.采集羽毛：

·从每只鸡的臂羽区(参见附图)采摘8-10根“幼羽”(短的，带有许多浆状物的新生羽毛)。

·将羽毛置于“通用”的塑料试管中运送回实验室。

3.从羽毛尖端制备DNA：

·剪下并保留羽毛的近端1厘米(即非-具倒刺毛羽毛的部分，附着于皮肤上，含浆状物-见照片)。弃去羽毛远端的具倒刺毛部分。

·对于每只小鸡，将8-10根保留的羽毛端置于1.5毫升带折帽的Eppendorf试管中。

·加入500μl蛋白酶K样品缓冲液(含0.5％SDS的TNE缓冲液)，含100ug蛋白酶K(临用前加入蛋白酶K)。

·在50℃恒温水浴箱中孵育1.5-2小时。

·离心试管(6000rpm，10min)，以“沉淀”羽毛尖端和碎片。

·转移上清液至一新的带折帽的试管中(如果羽毛来自于棕色鸟类，则由于存在黑色素，上清液将是棕色的)。

·再向上清液中加入等体积(500μl)的酚。

·涡旋

·以13000rpm离心，2min。

·将上层相(水相)转至新的带折帽的试管中。

·再向上清液中加入等体积(500μl)的酚。

·涡旋

·以13000rpm离心，2min。

·将上层相(水相)转至新的带折帽的试管中。

·加入等体积(500ul)的冷氯仿。

·涡旋。

·以13000rpm离心，2min。

·将上层相转移至1.5毫升的带螺丝帽的试管中。

·加入1毫升过滤的100％乙醇。

·加入50μl的3M乙酸钠。

·反转试管轻轻混合，在室温下放置20分钟(当沉淀时DNA变成可看见的)。

·13000rpm离心2分钟，以沉淀DNA(如果使用白色小鸡，则沉淀将是白色的；如果使用棕色小鸡，则沉淀为棕色)。

·弃去上清液。

·用500μl的70％冷乙醇漂洗沉淀两次，使乙醇轻轻沿试管壁流下，然后倾出(小心不要触动DNA沉淀)。

·用Parafilm盖住试管顶部开口，用针头在Parafilm上刺出若干个小孔。

·将试管置于真空干燥器中约5分钟，干燥沉淀(做为选择也可以晾干)。

用50μl PCR规格水重悬沉淀，轻轻涡旋。

使用分光光度计测定DNA制剂的浓度。

用水调整浓度至1mg/ml。

保存于-20℃。

4.TaqMan ^TM 的定量PCR测定(Perlcin Elmer Biosystems)

在PCR专用盒中设立反应，使用高压消毒的PCR专用吸管和吸头

在冰上处理

制备含有下列试剂的用于适当数目样品的主混合物——每个样品设立双份平行反应-(各反应给定的体积)：

组分	每25μl反应的体积	终浓度
			Taqman缓冲液	2.5μl
MgCl2(5mM)	5.0μl	1.0mM
			dATP(10mM)	0.5μl	0.2mM
dCTP(10mM)	0.5μl	0.2mM
			dGTP(10mM)	0.5μl	0.2mM
dUTP(10mM)	0.5μl	0.2mM
			含800μg/ml BSA的水	11.6μl	～10μg BSA/每反应
Meq探针(10μM)	0.5μl	0.2μM
			Meq正向引物(10μM)	1.0μl	0.4μM
Meq反向引物(10μM)	1.0μl	0.4μM
			Taq金牌DNA聚合酶(5U/μl)	0.13μl	26U/ml
尿嘧啶N-糖基化酶(1U/μl)	0.25μl	10U/ml

·涡旋以确保完全混合

·将速热PCR平板放入冰上的平板盒内，向所用各孔内加入24ul主混合物

·将1μl高压消毒水加入无模板-对照(NTC)孔，并在打开任何DNA样品之前盖好这些孔

·将1μl阳性对照DNA(＝1μl的1mg/ml制剂)，例如来自Rispens感染CEF的DNA，加入适当的孔内并盖好这些孔

·将1μg样品DNA(＝1μl的1mg/ml制剂)加入适当的孔内并盖好

·在离心机中短暂脉冲振荡平板

·将平板放入ABI Prism 7700序列测定仪(Applied Biosystems)中，设定计算机读取FAM荧光(Meq探针)，运行样品

·热循环参数

50℃   2min

95℃   10min

94℃   15sec)×40

60℃   1min)

·使用微软电子表格系统分析数据-对于每一样品将有一个Ct值(第一次检测到荧光产物超过基线水平的PCR循环数)计算各DNA样品重复试验的平均Ct值。

上述实验结果如图6所示中。

注释

正向引物(GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA-SEQ ID No.2)位于Meq基因序列GA链的1341-1361位核苷酸处。反向引物(GCA TAG ACG ATGTGC TGC TGASEQ ID No.3)位于1413-1393位核苷酸处。将探针设计成能特异性地在Meq目标序列的两条引物之间退火(参见图8)。

在PCR期间，该荧光探针结合在两个引物之间，在每一延伸循环期间，Taq聚合酶的5核酸酶活性切开探针，释放出报告荧光染料FAM，FAM随即发出荧光。

因此，荧光强度随着每一循环而增加。Ct值(荧光超过固定阈值时的循环)是目标序列起始拷贝数的测量尺度。起始拷贝数越高，Ct值越低。

在PCR期间使用牛血清白蛋白：

羽毛组织(特别是来自棕色鸡的组织)含有黑色素，已经证明其抑制PCR。在反应中使用牛血清白蛋白可消除这些黑色素诱导的抑制。在棕色鸡中进行了试验。按照Giambernardi等人的方法加入牛血清白蛋白(1998)Biotechniques 25：564-6。

实施例2：用于特异性地检测MDV-1(CV1 988疫苗)菌株的方法

本发明的该实施例涉及使用132碱基对(bp)重复序列聚合酶链反应(PCR)试验的特别修正形式，来检测小鸡羽毛中CVI988马立克氏病疫苗的存在。

该132碱基对的重复基因序列位于马立克氏病病毒(血清型1)基因组的重复长(IR1)片段的内部。Tulman等人描述了MDV 1的全部基因组序列(Sept2000)J Virol.Vol.74 No.17，p7980-7988，并保存入GenBank登记号AF243438中。血清型1马立克氏病的CV1 988分离菌(疫苗菌株)具有多拷贝的重复片段，尽管野生菌株仅有单个拷贝(Silva et al(1992)Avian Dis 36：521-528；和Becker et al(1993)Virus Genes 7：277-287)。测量拷贝数为区别疫苗菌株和野生菌株提供了可能性(Becker et al(1992)J Virol Methods 40：307-322和kopacek et al(1993)Acta Virol 37：191-195)。

根据附图采集羽毛样品，使用腋窝区羽毛的基部顶端。PCR分析(见下文)表明在动物接种疫苗后11-28天期间有多个拷贝的132bp片段。疫苗接种在鸟类1日龄时进行。

本试验的容许变化是使用任何龄期的鸟类中的羽毛作为新鲜样品，或保存用于日后试验测定CV1 988疫苗的存在。

在羽毛尖端样品上的132bp重复序列PCR的方案

1.需要的材料：

试剂：

·TNE缓冲液(保存于室温)含Tris(10mM)、NaCl(150mM)、EDTA(1mM)，用HCl调节pH至pH7.5。

·十二烷基硫酸钠(SDS)10％溶液(保存于室温下)

·蛋白酶K(冻干粉末，Sigma & num目录号P-6556；在水中配制成20mg/ml的原液，保存于-20℃)

·酚pH7.9，从Sigma获得(目录号P-4557)(保存于4℃)

·氯仿(保存于-20℃)

·3M乙酸钠pH5.2(保存于室温)

·过滤后的无水乙醇(保存于室温)

·过滤后的70％冷乙醇(保存于4℃)

·PCR规格水

·过滤后的含有800pg/ml牛血清白蛋白(BSA)的PCR规格水

·Taq金牌DNA聚合酶(5U/μl)，Taq缓冲液，MgCl2(25mM)来自Bio/Gene公司，kimbolton，Cambridgeshire，英国

·dATP、dTTP、dCTP、dGTP(100mM贮存物)从Promega(美国)获得；我们制备了含全部4种的混合物，每种浓度10mM，保存于-20℃

·DNA分子大小标记

·琼脂糖和TBE缓冲液

·引物序列：

MD-132 FOR；5′TACTTCCTATATAGATTGAGACGT-3′(SEQ ID No.4)

MD-132 REV：5′GAGATCCTCGTAAGGTGTAATATA-3′(SEQ ID No.5)

仪器

*无菌的20毫升塑料通用试管

*洁净的剪刀和钳子

*调至50℃的恒温水浴箱

*台式离心机

*1.5毫升带折帽的Eppendorf试管(高压消毒的)

*1.5毫升带螺丝帽的Eppendorf试管(高压消毒的)

*0.5毫升带折帽的Eppendorf试管(高压消毒的)

*真空/冻干机(非必须的)

*分光光度计

*PCR专用盒、吸管和高压消毒的吸头

*热循环仪

*琼脂糖凝胶装置

2.采集羽毛：

·从每只鸡的臂羽区(参见附图)采摘8-10根“幼羽”(短的，带有许多浆状物的新生羽毛)。

·将羽毛置于“通用”的塑料试管中，运送回实验室。

3.从羽毛顶端制备DNA：

·剪下并保留近端1厘米的羽毛(即非-具倒刺毛羽毛，附于皮肤上，含浆状物-见照片)。弃去羽毛远端的具倒刺毛部分。

·对于每只小鸡，将8-10根保留的羽毛端置于1.5毫升带折帽的Eppendorf试管中。

·加入500μl蛋白酶K样品缓冲液(含0.5％SDS的TNE缓冲液)，含100gag蛋白酶K(临用前加入蛋白酶K)。

·在50℃恒温水浴箱中孵育1.5-2小时。

·离心试管(6000rpm，10min)，以“沉淀”羽毛端和碎片。

·转移上清液至一新的带折帽的试管中(如果羽毛来自于棕色鸟类，则由于存在黑色素，上清液将是棕色的)。

·向上清液中加入等体积(500μl)的酚。

·涡旋

·以13000rpm离心，2min。

·将上层相(水相)转至新的带折帽的试管中。

·再向上清液中加入等体积(500μl)的酚。

·涡旋

·以13000rpm离心，2min。

·将上层相(水相)转至新的带折帽的试管中。

·加入等体积(500ul)的冷氯仿。

·涡旋。

·以13000rpm离心，2min。

·将上层相转移至1.5毫升的带螺丝帽的试管中。

·加入1毫升过滤的100％乙醇。

·加入50μl的3M乙酸钠。

·反转试管轻轻混合，在室温下放置20分钟(DNA沉淀后能够看见)。

·13000rpm离心2分钟，以沉淀DNA(如果使用白色小鸡，则沉淀将是白色的；如果使用棕色小鸡，则沉淀为棕色)。

·弃去上清液。

·用500μl的70％冷乙醇漂洗沉淀两次，使乙醇轻轻沿试管壁流下，然后倾出(小心不要触动DNA沉淀)。

·用Parafilm盖住试管的顶部开口，用针头在Parafilm上刺出若干小孔。

·将试管置于真空干燥器中约5分钟，干燥沉淀(做为选择也可以晾干)。

·用50μl PCR规格水重悬沉淀，轻轻涡旋。

·使用分光光度计测定DNA制剂的浓度。

·用水调整浓度至1mg/ml。

·保存于-20℃。

4.132bp重复序列PCR：

·在0.5毫升Eppendorf管中，在PCR专用盒内于冰上设立反应，使用高压消毒的PCR专用吸管和吸头。

·制备用于适当数目样品的含下列试剂的“主混合物”——每个样品设立双份平行反应-(给出各反应的体积)：

组份	每20μl反应的体积	终浓度
			正向引物(10μM)	1.0μl	0.5μM
反向引物(10μM)	1.0μl	0.5μM
			10×Taq缓冲液	2.0μl
MgCl2(25mM)	1.6μl	2mM
			DNTP混合物(10mM)	0.5μl	0.25mM
Taq金牌DNA聚合酶	0.1μl	25U/ml
			含800μg/ml BSA的水	12.8μl	10μg BSA/反应

·涡旋以确保完全混合。

·分装1ul“主混合物”至高压消毒的0.5毫升带折帽的Eppendorf管中。

·加入1ul DNA(＝1ul 1mg/ml制剂，或更大的体积，如果DNA制剂浓度较低的话)。

·涡旋以确保完全混合。

·(我们的热循环仪具有加热的盖，因此不需要用矿物油覆盖反应物)。

·采用下面的循环参数在热循环仪上运行：

95℃ 2min 1个循环

95℃ 1min)

50℃ 30sec)×40个循环

72℃ 1min)

72℃ 10min 1个循环

·在琼脂糖凝胶上分析反应产物。

上述实验结果如图7所示。

注释

正向引物位于重复序列上游65bp处，反向引物位于重复序列下游105bp处。因此对于单个的重复序列，预期带的大小为302bp(即65+132+105)，对于双重复序列(302+132)为434bp，对于三重复序列(434+132)为566bp等。Rispens疫苗菌株产生许多串联的重复序列。

实施例3-使用PCR检测羽毛尖端DNA中Rispens病毒基因：来自不同羽毛区样品的比较。

方法

从Rispens-接种的小鸡中采集羽毛样品

经腹膜内途径，给两周龄的洛岛红小鸡注射1000pfu的Fort Dodge Rispens疫苗病毒。将龄期匹配的未接种小鸡放在分开的房间内。对所有小鸡两翅均做了绑扎，以便在整个实验期间鉴别小鸡个体。在疫苗接种后第8、13、19和26天，从5只接种小鸡(#921，#923，#924，#925)和1只未接种小鸡(#946)中采集样品。从颈、肩、脊柱、腋下和股骨区各拔下大约6根羽毛。其余5个羽毛区没有使用，要么因为羽毛数太少不容许在4个点采样，要么因为考虑到从活小鸡娇嫩的皮肤区域拔毛是不人道的。

从羽毛顶端制备DNA，进行实时PCR以检测病毒Meq基因，概括如下。

从羽毛尖端样品制备DNA

如上所述从羽毛尖端制备DNA。简言之，将羽毛尖端在含100μg蛋白酶K的TNE-SDS缓冲液中，于50℃孵育2小时。将上清液先用酚，然后用冷氯仿抽提。使用乙醇/乙酸钠沉淀DNA，将沉淀物真空干燥，然后重悬于水中至浓度为200μg/ml。

实时(TaqMan)PCR分析检测Meq基因

如上所述设立25μl双份平行反应，使用Taq金牌DNA聚合酶和引物，从200ng羽毛顶尖DNA中扩增病毒Meq基因和宿主卵清蛋白样基因(Ovo)(表1)。每一反应中含有浓度10μg的牛血清白蛋白。通过FAM荧光标记Meq探针和VIC-荧光标记Ovo探针追踪反应动力学(表1)。每一样品都设双份平行反应。热循环参数为：50℃1个循环(2min)，95℃1个循环(10min)，继之以94℃(15秒)和60℃(1min)的40个循环。在试验中除羽毛样品外，反应平板中还包括Rispens BAC10 DNA的10-倍稀释液(克隆入细菌人工染色体中的Rispens病毒基因)，其含有适当的Rispens基因拷贝数。

使用微软电子表格系统(Microsoft Excel)分析数据。对于每一反应各有一个Ct值(检出荧光产物第一次超过基线水平的PCR循环数)，并由此获得40-Ct值。Ct值为40表明无目标序列存在。以“40-Ct”表示该值使得更高的值等于更多的病毒基因拷贝数。

对于RispensBAC10样品，画出40-Ct值对病毒基因拷贝数的曲线(对数坐标)以生成标准曲线。确定图的线性部份的方程式。对于试验中的羽毛样品，根据Ovo的40-Ct值(存在于所有小鸡细胞中的″持家基因″)使40-Ct值″标准化″，以校正对于每一样品的DNA数量的微小差异。然后确定两份反应的标准化的40-Ct平均值，使用标准曲线换算成Rispens基因组拷贝数。

表1：用于传统和实时PCR的引物和探针

目标序列	引物名称	引物序列(5’-3’)	引物位置	扩增子的大小
					MDV-1 Meq基因(基于GA序列)	Meq正向	GGTCTGGTGGTITCCAGGTGA(SEQ ID No.2)	1341-1361	73bp
Meq反向	GCATAGACGATGTGCTGCTGA(SEQ ID No.3)	1413-1393
			Meq探针	AGACCCTGATGATCCGCATTGCGACT(5’FAM标记，3’TAMRA标记)(SEQ ID No.1)		1366-1391

卵运铁蛋白基因(Ovo)	Ovo正向	CACTGCCACTGGGCTCTGT(SEQ ID No.6)	4517-4535	62bp
					Ovo反向	GCAATGGCAATAAACCTCCAA(SEQ ID No.7)	4567-4587
	Ovo探针	AGTCTGGAGAAGTCTGTGCAGCCTCCA(5’VIC标记，3’TAMRA标记)(SEQ ID No.8)	4537-4564(44564)

结论

羽毛采样和DNA的制备

虽然最初计划从十个羽毛区中的每一个采样，但实际仅从颈、肩、脊柱、腋下和股骨区采集。其余5个羽毛区没有使用，要么因为羽毛数太少不容许在4个点采样，要么因为考虑到从活小鸡娇嫩的皮肤区域拔毛是不人道的。在疫苗接种后第8、13和19天从各区获得足够的幼羽。经26天后(当这些小鸡将近6周龄时)幼羽开始被坚硬的成熟羽毛所取代。从所有样品中获得足够的DNA，在从不同区域的相同数目的羽毛中获得的DNA数量之间没有显著性差异。为了使Meq和Ovo的Ct值落进实时PCR检测的线性范围内，发现需将DNAs稀释至浓度为200ng/μl，取1μg这种原液用于每一实时PCR反应。

为了能精确地比较不同时间点、不同羽毛区及不同小鸡中的病毒载量，进行实时定量PCR。

计算每一反应的40-Ct值。对于Rispens BAC10样品，绘制40-Ct值对病毒基因拷贝数的曲线(对数坐标)以生成标准曲线。精确检测的下限为50拷贝，因此对于40-Ct值为0的任何样品，每200ng羽毛顶端DNA中含有Rispens基因组的拷贝数低于50。

该图的线性部份的方程式为：y＝1.8102Ln(X)-6.796。对于试验中的各羽毛样品，使用该方程式，将标准化的40-Ct平均值转换成Rispens基因组拷贝数(见表2A、B、C和D；图9A、B、C和D)正如所料，在任何给定的时间点，小鸡个体之间存在相当大的变化。然而，在给定个体的5个不同羽毛区检测到的病毒水平相仿。在每只小鸡中，在试验的4个时间点，第13天病毒的载量最高，在第19和26天降低。

表2A：Rispens MDV拷贝数(8天)

接种后8天
						小鸡编号及羽毛区	Rispens MDV基因组拷贝数/200ng羽毛DNA
肩	脊柱	股骨	颈	腋下
					#921		673	537	2630	442	778
#923	1504	4890	5127	5921		6101
					#924		112910	61242	258345	31425	62444
#925	2603	1265	2010	1883		1583
					平均值		29422	16983	67028	9918	17726
SDev	55664	29567	127552	14524		29904
					SE平均值		27832	14784	63776	7262	14952

表2B：Rispens MDV拷贝数(13天)

接种后13天
						小鸡编号及羽毛区	Rispens MDV基因组拷贝数/200ng羽毛DNA
肩	脊柱	股骨	颈	腋下
					#921		2133045	2564484	2432204	1224616	2511886
#923	3814060	4374639	5998652	3561896		38349161
					#924		24768376	876646	4241591	24073508	24711780
#925	866276	4478465	1557400	1856729		485447
					平均值		7895439	3073559	3557462	7679187	16514568
SDev	11313237	1708035	1974326	10974035		18229569
					SE平均值		5656619	854018	987163	5487018	9114785

表2C：Rispens MDV拷贝数(19天)

接种后19天
						小鸡编号及羽毛区	Rispens MDV基因组拷贝数/200ng羽毛DNA
肩	脊柱	股骨	颈	腋下
					#921		353997	613762	1158777	736207	439542
#923	1040917	1427067	1061134	1029830		1335442
					#924		3108135	891103	256243	1584386	391420
#925	2958332	9800358	1469708	3373701		1705109
					平均值		1865345	3183073	986466	1681031	967878
SDev	1378768	4424421	517048	1181980		655758
					SE平均值		689384	2212211	258524	590990	327879

表2D：Rispens MDV拷贝数(26天)

接种后26天
						小鸡编号及羽毛区	Rispens MDV基因组拷贝数/200ng羽毛DNA
肩	脊柱	股骨	颈	腋下
					#921		295801	193642	167109	74645	95940
#923	921896	694141	541176	976157		569305
					#924		771643	615826	349598	343195	104585
#925	353768	926750	511690	251692		236766
					平均值		585775	607590	392393	411422	251649
SDev	308455	305928	172194	392646		221359
					SE平均值		154228	152964	86097	196323	110680

对于4只接种的小鸡，测定了每一时间点各羽毛区的平均基因组拷贝数(每200ng羽毛DNA)，并使用对数坐标(图5)或线性坐标(图10B)，绘出相对于疫苗接种后的时间的曲线图。在第8天，每200ng DNA中的平均拷贝数为10⁴-10⁵拷贝。在第13天，平均拷贝数为5×10⁶-5×10⁷；在第19天，为10⁶-10⁷；在第26天，为10⁵-10⁶。

对数坐标曲线图(图10A)表明在5个羽毛区中，病毒的复制动力学相似。然而，在线性坐标曲线图中，其差异加重(图10B)。该图显示，在第13天，4只小鸡的平均病毒载量，在腋窝区比其它4个区高出达4倍之多。在该时间点，在肩和颈部区域的病毒载量非常接近，并且高于骨和脊柱区域的病毒载量。这些羽毛区域之间的差异在第8、19或26天不明显。

对于未接种的对照小鸡(#946)大多数样品给出的40-Ct值为0，正如预期没有MDV DNA出现。然而，对于某些样品，其40-Ct值达到3(数据未显示)。这在实时PCR很常见，“阴性”样品给出的40-Ct值大于0，而认为小于4的值是“不可信的”。因此，虽然40-Ct值为3相当于200拷贝的Rispens基因组，但是该值仍比任何从接种的小鸡中获得样品的值低100倍，可认为是阴性的。如图5B所示，未接种小鸡的5个羽毛区的平均拷贝数没有超出基线。

实时PCR分析概述

·在疫苗接种后第8、13、19和26天，各羽毛区的病毒载量足以通过实时PCR检出。

·在疫苗接种后第13天，与疫苗接种后第8、19和26天相比，所有试验羽毛区的病毒载量均最高。

·在疫苗接种后第13天，腋窝区的病毒载量高于肩和颈部区(高2倍)或脊柱和股骨区(高4倍)。

序列表

<110>Wyeth

<120>分析方法

<130>AM101125

<140>GB 0223960.6

<141>2002-10-15

<160>9

<170>专利版本3.1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>DNA探针

<400>1

agaccctgat gatccgcatt gcgact                                         26

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>合成的DNA引物

<400>2

ggtctggtgg tttccaggtg a                                             21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>DNA探针

<400>3

gcatagacga tgtgctgctg a                                             21

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>DNA探针

<400>4

tacttcctat atagattgag acgt                                          24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>DNA探针

<400>5

gagatcctcg taaggtgtaa tata                                          24

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>DNA探针

<400>6

cactgccact gggctctgt                                                19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>DNA探针

<400>7

gcaatggcaa taaacctcca a                                             21

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>合成的DNA引物

<400>8

agtctggaga agtctgtgca gcctcca                                         27

<210>9

<211>2466

<212>DNA

<213>DNA

<400>9

gaattcggtg atataaagac gatagtcatg catgacgtgg ggggctggat cgactgatat     60

ctaatggttc gggagtgata cggagacggg gggggggggg aaatgatcga tttataccta    120

cctcttaaat aaactattgc tcctttataa aatgacaggt gaattgtgac cgttcgcgaa    180

cgtgtaattc ttcaatactt tcgggtctgt gggtgttgct tttttaatta ttattttggt    240

tcggggaggt tggtgctgga atgttaagaa taaattccgc acactgattc ctaggcaggc    300

gtctcttgca ggtgtatacc agggagaagg cgggcacggt acaggtgtaa agagatgtct    360

caggagccag agccgggcgc tatgccctac agtcccgctg acgatccgtc ccccctcgat    420

ctttctctcg ggtcgacttc gagacggaaa aaaaggaaaa gtcacgacat ccccaacagc    480

ccctccaaac accccttccc tgacggccta tctgaggagg agaaacagaa gctggaaagg    540

aggagaaaaa ggaatcgtga cgccgctcgg agaagacgca ggaagcagac ggactatgta    600

gacaaactcc atgaagcatg tgaagagctg cagagggcca atgaacacct acgtaaggaa    660

attcgagatc taaggactga gtgcacgtcc ctgcgtgtac agttggcttg tcatgagcca    720

gtttgcccta tggcggtacc cctaacggtg acccttggac tgcttaccac cccgcacgat     780

cccgttcctg aacctcccat ttgcactcct ccacctccct caccggatga acctaacgct     840

ccacattgct ccggttccca acctcctatc tgtacccccc ctcctcccga tacggaggaa     900

ctttgcgccc agctctgctc gaccccacca cctcccatct ctactcccca tattatctac     960

gctccggggc cttcccccct ccaacctcct atctgtaccc cccctcctcc cgatgcggag    1020

gagctttgcg cccagctctg ctcgacccca ccacctccca tctgtactcc ccattccctc    1080

ttctgccctc cccagcctcc atctccggag ggaatcttcc ctgcattgtg tcctgttacc    1140

gagccgtgta cccctccatc gccggggacg gtttacgctc agctttgtcc tgttggccag    1200

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gaattc                                                               2466

Claims (21)

1.一种检测鸟类组织样品中病毒的方法，包括：从鸟类组织样品中提取物遗传物质；测定提取的遗传物质以检测任何来自病毒的遗传物质；其特征在于鸟类组织样品来自腋窝区一根或多根羽毛的组织样品。

2.权利要求1所述的检测病毒的方法，其中该方法提供有关样品中病毒数量的定量信息。

3.权利要求1或2所述的检测病毒的方法，其中该方法是特异性地针对MDV的。

4.权利要求3所述方法，其中该方法是特异性地针对MDV血清型1的。

5.权利要求4所述的检测MDV的方法，其中该方法是特异性地针对MDV-1 Rispens菌株CVI 988的。

6.权利要求5所述的方法，其中该方法包括(i)提供核酸聚合酶的正向及反向引物，其中引物选自位于MDV 132bp核酸重复序列两侧的核苷酸序列；(ii)扩增引物间的核酸序列；(iii)检测扩增核酸序列中132bp重复序列的数目；(iv)将132bp重复序列数与病毒核酸的鉴定联系起来，从而鉴定组织样品中MDV的类型。

7.权利要求1-5中任意一项所述的方法，包括(a)提供能与病毒-特异性的目标核苷酸序列特异性地结合的多聚核苷酸序列；(b)将提取的遗传物质与探针反应，使探针与目标病毒的多聚核苷酸特异性地结合；(c)确定探针是否与目标病毒的多聚核苷酸结合；(d)以目标核苷酸的存在指示样品中病毒的存在为基础，确定样品是否含有病毒。

8.权利要求7所述的方法，其中确定探针是否与目标多聚核苷酸结合的步骤(c)包括多聚核苷酸目的区域的扩增，该区域包含探针的结合部位。

9.权利要求8所述的方法，其中扩增由下列引物启动：

正向引物(GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA)

反向引物(GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA)

10.权利要求9所述的方法，其中探针具有5′AGA CCC TGA TGATCC GCA TTG CGA CT 3′序列。

11.权利要求7-10中任意一项所述的方法，其中探针为荧光标记的，并且其中确定探针是否与目标多聚核苷酸结合的步骤包括测定该探针的荧光发射。

12.前述任意一项权利要求所述的检测病毒的方法，其中该方法涉及使用PCR反应。

13.权利要求12所述的方法，其中在进行所述的PCR反应之前，将用于检测的提取的遗传物质用试剂处理，以消除任何可能存在的羽毛的组织因子的抑制作用。

14.权利要求13所述的检测病毒的方法，其中所述的试剂选自牛血清白蛋白；猪科(猪)的白蛋白；和绵羊科(绵羊)的白蛋白中的一种或多种。

15.前面任意一项权利要求的方法，还包括以可懂格式提供该方法的结果的步骤。

16.权利要求15的方法，其中该方法的结果以记录或保存于信息载体上的方式提供。

17.从腋窝区的一根或多根羽毛中分离的鸟类组织样品。

18.权利要求17的分离的鸟类组织样品，其中腋窝区羽毛的近端部份与远端(具有倒刺毛的)部分分开。

19.一种含有遗传物质的提取物，来自权利要求17或18所述的分离的鸟类组织样品。

20.权利要求17、18或19的样品或提取物，其中所述的样品以适于运输至分开场所的方式保存。

21.权利要求20的样品，其中所述的样品或提取物包含在密封容器内。

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