CN113846184A

CN113846184A - 一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒

Info

Publication number: CN113846184A
Application number: CN202110770772.3A
Authority: CN
Inventors: 曹国君; 邢志芳; 关明; 钟贞强; 张卿芸; 朱旻; 陈瑜
Original assignee: North Campus Huashan Hospital Affiliated To Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2021-12-28

Abstract

本发明提供了一种快速检测SARS‑CoV‑2Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒。该引物组合物包括针对L452R的引物体系和针对T478K的引物体系；针对L452R的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6或序列为SEQID NO.8～SEQ ID NO.12的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；针对T478K的引物体系包括序列为SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.19或序列为SEQ ID NO.15、17、21‑23的引物或序列为SEQ ID NO.14‑17、23‑24的引物或序列为SEQ IDNO.15、17、23、25‑26的引物以及序列为SEQ ID NO.20的探针。本发明提供的引物组合物灵敏度高、特异性强，相应的试剂盒在使用过程中不受退火温度的限制，易于实现多靶标的同步检测，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30‑60min内即可准确检测出Delta变异株，便于及时的掌握病毒的变异状况，具有良好的应用前景。

Description

一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒是冠状病毒科、单股正链RNA病毒。与以往的病毒感染不同，新型冠状病毒感染初期在患者体内大量复制，但并不会引起宿主明显的炎症反应，因此患者根本无法意识到自己已被感染，然而此时的患者已经具有传染性，从而导致周围的人也被感染，造成疫情大规模肆虐。目前新型冠状病毒疫苗的广泛使用，对于疫情的成功防控发挥了重要的作用，然而目前的疫苗仍处于不断完善阶段，即使接种了疫苗也不能保证不会再被新型冠状病毒感染，而且针对新型冠状病毒的特效药缺乏。因此，对新型冠状病毒进行准确、快速的检测，及时切断传染源仍然是目前疫情防控的最主要手段之一。

新型冠状病毒是一种RNA病毒，极易发生变异，目前已被发现的变异有几千种之多。而刺突糖蛋白(S蛋白)是新型冠状病毒与宿主受体(ACE2)结合的关键蛋白，其变异对于病毒的传播速度和免疫逃逸有重要的影响，当前发生于 S蛋白的重要变异有N501Y、D614G、P681H、E484K、K417N和P681R等。目前新型冠状病毒的变异株主要分为三大类：关注的变异株(variant of concern, VOC)、感兴趣的变异株(variant of interest，VOI)或正调查的变异株(variant under investigation，VUI)、监控的变异株(variant undermonitoring，VUM)。据报道，新型冠状病毒的VOC变异株传播速度显著增快，例如英国Alpha变异株(B.1.1.7) 传染性增加56％，南非Beta变异株(B.1.351)传染性也显著增加，巴西Gamma 变异株传染性增加1.4-2.2倍，印度Delta变异株(B.1.617.2)传染性提高100％，秘鲁Lambda变异株(C.37)传染性和疫苗的抵抗力可能变强。其中目前传染速度最快的VOC是Delta变异株(B.1.617.2，印度变异株)，Delta变异株感染具有感染者病毒载量高、传播速度快(10天左右传播5代)、患者病情进展迅速、核酸转阴时间长等新特点，因此，准确的检测出新型冠状病毒并对其进行准确分型，及时了解新型冠状病毒的动态变化，对于新冠肺炎的诊断、疫情的防控和相关政策的制定具有重要意义。世界卫生组织专家称：Delta变异株目前波及全球 90多个国家，正成为全球主要流行的变异毒株，有可能引起新一波疫情大流行。

最新的研究表明新型冠状病毒Delta变异株中S蛋白L452R和T478K突变导致其传播速度显著增快，加大了疫情防控的难度，因此及时掌握该病毒的变异状况至关重重要，但目前针对Delta变异株的特征性新突变(L452R和T478K) 缺乏高效、简单、快速的检测手段和试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种快速检测SARS-CoV-2 Delta 变异株变异的引物组合物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物，包括针对L452R的引物体系和针对T478K的引物体系；

上述针对L452R的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6或序列为SEQID NO.8～SEQ ID NO.12的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；

上述针对T478K的引物体系包括序列为SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.19或序列为SEQ ID NO.15、17、21-23的引物或序列为SEQ ID NO.14-17、23-24的引物或序列为SEQ IDNO.15、17、23、25-26的引物以及序列为SEQ ID NO.20 的探针。

本发明的第二方面是提供一种包括上述引物组合物的快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异的试剂盒。

进一步地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、酶溶液、荧光染料和去离子水。

进一步地，上述荧光染料为SYBR Green。

进一步地，上述酶溶液的浓度为8U。

本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的方法，所采用的扩增体系的总体积为25μL，针对L452R或T478K变异，包括：2×反应缓冲液12.5μL，各个引物的体积均为0.5μL，PNA:0.5μL，酶溶液1μL，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL。

进一步地，在上述扩增体系中，引物F3和B3的终浓度均为0.2μmol/L；引物FIP和BIP的终浓度均为1.6μmol/L，引物LF、LB和PNA的终浓度均为0.8 μmol/L。

进一步地，上述方法所采用的LAMP反应程序为：58℃-68℃，70min；所采用的仪器为PCR仪。

进一步地，上述方法对结果的判读标准为：若CT值<50，即判断为阳性。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的引物组合物灵敏度高、特异性强，相应的试剂盒在使用过程中不受退火温度的限制，易于实现多靶标的同步检测，此外，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30-60min内即可准确检测出Delta变异株，便于及时的掌握病毒的变异状况，具有良好的应用前景。

附图说明

图1显示了本发明一实施例中验证针对变异L452R(图A)、T478K(图B) 的检测试剂盒的灵敏度；其中，图中的扩增曲线从右向左，对应的模拟样本浓度分别为：2×10²copies/ml，2×10³copies/ml，2×10⁴copies/ml，2×10⁵copies/ml， 2×10⁶copies/ml；

图2显示了本发明一实施例中验证针对变异L452R(图A)、T478K(图B) 的检测试剂盒的特异性。

具体实施方式

本发明提供了一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒，特使是针对Delta变异株的特征性新突变(L452R和T478K)设计了特异性LAMP引物，并采用PNA探针对扩增体系中的非特异性模板(野生型核酸) 进行封闭，以提高LAMP检测体系的特异性。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种针对SARS-CoV-2 Delta变异株的特征性新突变(L452R 和T478K)的LAMP引物组合物，主要包括针对L452R的引物体系和针对T478K 的引物体系。

其中，L452R对应的的野生型靶序列(共399bp)如下所示：

TAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAA TTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATT GCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTG GAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATA GATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGA AATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGT TACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCA ACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCT(SEQ ID NO.1)，突变类型为CTG>CGG。针对L452R变异的引物体系如下表1所示。

表1针对L452R变异的引物体系

T478K对应的的野生型靶序列(共401bp)如下所示：

TCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGAT GATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGG TTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAA CCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTT GTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTC CAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTT TTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTA ATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATG(SEQ ID NO.13)，突变类型为ACA>AAA。针对T478K变异的引物体系如下表2所示。

表2针对T478K变异的引物体系

实施例2

本实施例提供含有上述引物组合物的快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异(L452R和T478K)的试剂盒，其还包括：反应缓冲液、酶溶液、SYBR Green 荧光染料和去离子水。

此外，采用该试剂盒的SARS-CoV-2Delta变异株变异(L452R和T478K) 的方法包括如下：

步骤一，获取待测样本并提取基因组DNA；

步骤二，配制扩增体系，该扩增体系的总体积为25μL，针对每一种变异，包括：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，引物F3:0.5μL(终浓度0.2μmol/L)，引物 B3：0.5μL(终浓度0.2μmol/L)，引物FIP：0.5μL(终浓度1.6μmol/L)，引物 BIP：0.5μL(终浓度1.6μmol/L)，引物LF：0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，引物 LB：0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，PNA:0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，酶溶液1μL (8U)，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL,去离子水将终体积补足至25μL；

步骤三，设置LAMP反应程序为58℃-68℃,70min(每个循环1min，扩增 70个循环)；采用PCR仪进行扩增；

步骤四，扩增结束后，对结果进行判读：CT值<50(或50min内出扩增曲线)，即判断为阳性。

验证实施例

本实施例对实施例2提供的试剂盒(以表1和表2中的引物体系1为例)以及对应的方法进行灵敏度和特异性验证，具体的步骤和结果如下：

1.灵敏度：制作梯度浓度的模拟样本，具体浓度为2×10¹copies/ml， 2×10²copies/ml，2×10³copies/ml，2×10⁴copies/ml，2×10⁵copies/ml，2×10⁶copies/ml，采用上述试剂盒和方法进行检测；由图1可知，实验结果表明L452R和 T478KLAMP检测体系的灵敏度均可达2×10²copies/ml。

2.特异性：采用上述试剂盒和方法对临床常见的呼吸道病原甲型流感病毒 RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道合胞病毒RNA、肠道病毒RNA 和野生型新型冠状病毒模拟样本RNA进行扩增；由图2可知，仅阳性对照样本出现了扩增曲线，其他样本均为出现任何扩增，表明所建立的L452R和T478K LAMP检测体系具有良好的特异性。

综上所述，本发明提供的快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异(L452R 和T478K)的试剂盒和方法灵敏度高、特异性强，适合大规模推广。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属华山医院北院

<120> 一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 399

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat tcatttgtaa ttagaggtga 60

tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt gctgattata attataaatt 120

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tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag tctaatctca aaccttttga 240

gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca ccttgtaatg gtgttgaagg 300

ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa cccactaatg gtgttggtta 360

ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttct 399

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctgctttact aatgtctatg ca 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agatttcagt tgaaatatct ctctc 25

<210> 4

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agcctgtaaa atcatctggt aatttgtgat gaagtcagac aaatcg 46

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atcttgattc taaggttggt ggtaggtttg agattagact tcct 44

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aatctttcca gtttgccctg g 21

<210> 7

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ttaatggaca tatct 15

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctgcgttata gcttggaatt 20

<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ccattagtgg gttggaaac 19

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ggtttgagat tagacttcct aaacaatctt gattctaagg ttggtgg 47

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gtagcacacc ttgtaatggt 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tccagggcaa actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg 60

ctgcgttata gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta attataatta 120

cctgtataga ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga 180

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tttacaatca tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat acagagtagt 300

agtactttct tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac 360

taatttggtt aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat g 401

<210> 14

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<213> Artificial Sequence

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cttttgagag agatatttca actga 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cattgaagtt gaaattgaca cat 23

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<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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tgggttggaa accatatgat tgtaaatcta tcaggccggt agc 43

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<213> Artificial Sequence

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tgttggttac caaccataca gagtaagact ttttaggtcc acaaaca 47

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ccttcaacac cattacaagg ttt 23

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ccatcgtgtg gaaca 15

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aaatctatca ggccggtag 19

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tgggttggaa accatatgat tgtaacaaac cttgtaatgg tgttga 46

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tcttttgaac ttctacatgc accag 25

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accttcaaca ccattacaag gtg 23

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atctatcagg ccggtagc 18

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<213> Artificial Sequence

<400> 26

tgggttggaa accatatgat tgtaaacctt gtaatggtgt tgaagg 46

Claims

1.一种快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异的引物组合物，其特征在于，包括针对L452R的引物体系和针对T478K的引物体系；

所述针对L452R的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6或序列为SEQ IDNO.8～SEQ ID NO.12的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；

所述针对T478K的引物体系包括序列为SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.19或序列为SEQ IDNO.15、17、21-23的引物或序列为SEQ ID NO.14-17、23-24的引物或序列为SEQ ID NO.15、17、23、25-26的引物以及序列为SEQ ID NO.20的探针。

2.一种包括如权利要求1所述的引物组合物的快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液、酶溶液、荧光染料和去离子水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SYBR Green。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶溶液的浓度为8U。

6.一种采用如权利要求2-5任一项所述试剂盒的快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异的方法，其特征在于，所采用的扩增体系的总体积为25μL，针对L452R或T478K变异，包括：2×反应缓冲液12.5μL，各个引物的体积均为0.5μL，PNA 0.5μL，酶溶液1μL，荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述扩增体系中，引物F3和B3的终浓度均为0.2μmol/L；引物FIP和BIP的终浓度均为1.6μmol/L，引物LF、LB和PNA的终浓度均为0.8μmol/L。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所采用的LAMP反应程序为：58℃-68℃,70min；所采用的仪器为PCR仪。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对结果的判读标准为：若CT值<50，即判断为阳性。