CN112501356A

CN112501356A - 一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组、试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN112501356A
Application number: CN202011484153.XA
Authority: CN
Inventors: 王贵升; 张鹤晓; 苏莹; 兰邹然; 李玉杰; 马慧玲; 杨鹏
Original assignee: BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD; SHANDONG PROVINCE CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD; SHANDONG PROVINCE CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: NL2030146A; CN112501356B; NL2030146B1

Abstract

本发明具体涉及一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组、试剂盒及其检测方法，属于动物检疫技术领域。本发明选择水貂冠状病毒N基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行水貂冠状病毒引物和探针设计；选择新冠病毒N基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上，进行新冠病毒引物和探针设计选择。本发明设计合成的探针引物，具有快速、灵敏、特异性强、稳定性好，且不易污染。

Description

一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组、试剂盒及其检测方法，属于动物检疫技术领域。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

水貂冠状病毒病又称水貂冠状病毒性肠炎，是由水貂冠状病毒引起的危害水貂养殖业的一种病毒性传染病，主要症状是腹泻。该病是除水貂细小病毒性肠炎外导致水貂腹泻的又一重要病毒性传染病，最早发现于北美，又叫水貂流行性卡他性胃肠炎或Utah州肠炎，上世纪八十年代，我国从北美引种时将该病带进了国内。该病死亡率虽然较低，但发病率可达90%，造成水貂营养不良，毛皮质量降低。

新型冠状病毒（COVID-19）是2019年年末出现的一种感染人的传染病，该病波及范围之广，防控难度之大是罕见的。早在疫情爆发之初，科学家就发现水貂容易感染新冠病毒。4月份，荷兰以及欧洲其他国家陆续报告养殖场水貂集中感染新冠病毒的事件，到8月份，美国的两家农场也发现水貂感染新冠病毒疫情。早在2020年5月，荷兰就报告了疑似水貂新冠病毒感染人的病例，到9月份，新冠病毒可在人类与水貂间相互跳跃感染被证实，2020年11月，丹麦发现了多例通过接触水貂而感染的人类病例，新冠病毒由水貂跳跃到人类造成感染得到进一步确认，而且所感染的病毒是在水貂体内发生变异的新的毒株。

新型冠状病毒在人与水貂之间的相互传播不仅给人类防控带来困难，而且对水貂养殖业造成巨大损失，丹麦于2020年11月4日甚至想扑杀国内所有1700万只水貂。新冠病毒主要引起人的呼吸道传染病，部分出现肠炎症状，从感染新冠病毒的部分人群的肠道也能检测到新冠病毒。水貂感染新冠病毒后一般没有症状，是无症状感染者，但是可以将病毒传播给其他水貂，并且也能将病毒传染给人。有研究表明，新冠病毒在水貂体内发生变异导致感染能力增强。

及时发现水貂新冠病毒感染对于减少新冠病毒的散播，降低水貂感染几率，进而减少由水貂传播到人的事件具有十分重要意义，新冠病毒引起的症状与水貂冠状病毒引起的症状部分相似，甚至可能出现交叉感染的情况，因此，建立快速、敏感、特异的同时检测这两种病毒的检测方法是非常必要的。人的新冠病毒检测方法虽已大规模应用，但是同时检测新冠病毒和水貂冠状病毒的鉴别检测方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是建立一种能够同时对水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组。

本发明还提供了一种含有上述探针引物组的试剂盒及利用该试剂盒的检测方法，为快速鉴别水貂冠状病毒与新型冠状病毒提供一种简便方法。本发明的试剂盒具有特异性强、敏感性高等优点。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组，所述探针引物序列为：

新型冠状病毒上游引物 HF如SEQ ID NO.1所示: AGCGCTTCAGCGTTCTTC

新型冠状病毒下游引物 HR如SEQ ID NO.2所示: CACCTGTGTAGGTCAACCAC

新型冠状病毒探针 HP如SEQ ID NO.3所示: 5’FAM-CGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCG-BHQ1 3’

水貂冠状病毒上游引物 MF如SEQ ID NO.4所示:GGCTAAGTCTAGTGAAAGACCTG

水貂冠状病毒下游引物 MR如SEQ ID NO.5所示:CCTTCACTAATTCTGCATCACC

水貂冠状病毒探针 MP如SEQ ID NO.6所示:5’HEX-AAGCACTCATGGAAGAAAACGCCT-BHQ1 3’。

本发明还提供了一种含有上述探针引物组的试剂盒，还包括以下成分：荧光RT-PCR反应液、酶混合物、阳性对照、阴性对照中的一种或多种。

进一步的，所述荧光RT-PCR反应液由1体积浓度为10μmol/L水貂冠状病毒上游引物、1体积浓度为10μmol/L的水貂冠状病毒下游引物、0.3体积浓度为10μmol/L的水貂冠状病毒探针、1.5体积浓度为10μmol/L的新冠病毒上游引物、1.5体积浓度为10μmol/L的新冠病毒下游引物、0.5体积浓度为10μmol/L的新冠病毒探针、5体积5xRT、2体积浓度为25mmol/L的MgCl₂、2体积浓度为2.5mmol/L的dNTP和5.2体积焦碳酸二乙酯处理水组成。

进一步的，所述酶混合物由200 U/μL的M-MLV反转录酶、5 U/μL的Taq DNA 聚合酶、40 U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。

进一步的，所述阴性对照为高压灭菌过的焦碳酸二乙酯处理水；所述阳性对照为体外转录的水貂冠状病毒和新型冠状病毒N基因RNA片段。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：

（1）在0.2 mL反应管中加入荧光RT-PCR反应液20 μL和酶混合物1 μL，再加入待测样品核酸5.0 μL，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，500g离心10s，放入荧光PCR检测仪内进行荧光RT-PCR反应；

（2）结果读取：对于多通道PCR仪，利用FAM（465-510）通道和HEX（VIC）（533-580）读取结果；对于ABI仪器，选择FAM和HEX通道，无荧光淬灭基团读取结果。

进一步的，所述荧光定量PCR反应的具体参数为：第一阶段预变性，42℃/15 min；第二阶段92℃/3分钟；第三阶段92℃/15 sec，53℃/10 sec ，60℃/35 sec，共40个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。

本发明所使用的阴性对照：焦碳酸二乙酯处理水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水, 得 Millipore-Q纯化水；然后向 Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12h，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟。阳性对照的制备：以常规方法克隆水貂冠状病毒和新型冠状病毒N基因，构建重组质粒，对质粒中的N基因进行序列测定，测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，以经纯化的酶切DNA片段为模板进行体外转录，将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后，即得到体外转录RNA，即阳性对照。

本发明提供一种能够同时对水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组。本发明选择水貂冠状病毒N基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行水貂冠状病毒引物和探针设计；选择新冠病毒N基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上，进行新冠病毒引物和探针设计选择。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。水貂冠状病毒探针序列的5’端标记报告荧光基团HEX（5-hexachloro-荧光素），3’端标记淬灭基团BHQ1；新冠病毒探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。

本发明进行PCR反应后进行结果的读取：

阴性：双检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无水貂冠状病毒和新冠病毒；双阳性：双检测通道Ct值均≤32.0，且均出现典型的扩增曲线，表明样品中有水貂冠状病毒和新冠病毒；单阳性：如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤32.0，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在新型冠状病毒。如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤32.0，而FAM检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在水貂冠状病毒。

本发明提供的检测方法，阴性对照用两个检测通道读取数据时，应均无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照用两个检测通道读取数据时，应分别出现相应的特征性扩增曲线，且Ct值均应≤30；如阴性或阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。任一通道Ct值＞32.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验；复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。

本发明通过实验证明，本发明提供的检测试剂盒及检测方法，可以一步法确认待检样品中是否存在水貂冠状病毒和新型冠状病毒。

本发明选择水貂冠状病毒的N基因和新型冠状病毒N基因作为靶序列，分别设计引物和探针建立并优化了一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒，取得了优异的技术效果：

1）快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果，且较单重荧光RT-PCR检测方法省时，具有快速、一步即可鉴别的优势。

2）灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示，试剂盒的灵敏度可达10拷贝/反应。

3）特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于普通RT-PCR方法；与其他冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、犬冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、人的其他冠状病毒等，均无交叉反应，表明特异性良好。

4）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝数的cRNA进行重复性试验，变异系数小于5%。

5）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

附图说明

图1为本发明实施例中设计的引物探针序列比对情况；

图2为本发明实施例中（水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒）灵敏度试验结果图；

图3为本发明实施例中（水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒）特异性试验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试剂盒验证方法：（1）用DEPC处理水对水貂冠状病毒和新型冠状病毒阳性质控品（拷贝数为10⁵copies/反应）提取核酸后作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为灵敏度质控样品。按照6-7中方法对水貂冠状病毒、新型冠状病毒灵敏度质控样品（拷贝数依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/反应）进行检测，验证本试剂盒的灵敏度应达到10¹copies/反应。（2）检测猪传染性胃肠炎病毒核酸、猪流行性腹泻病毒核酸、猪δ冠状病毒核酸、犬冠状病毒核酸、鸡传染性支气管炎病毒核酸、人的其他冠状病毒核酸，验证本试剂盒的特异性，应无阳性交叉反应。

实施例1 引物、探针的设计

实施实例1

1.引物、探针设计

1.1引物、探针设计原则

为确保引物、探针的保守性和特异性，选取水貂冠状病毒和新型冠状病毒N基因编码区特定序列作为靶区域，秉着引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右的原则进行特异性引物、探针设计。

本领域大多数的引物设计都是软件直接合成，选取最优引物序列，本申请实施例中涉及到的引物序列是在软件设计的基础上人工设计的结果；实施例中涉及到的引物探针序列可以保证不漏检，可以覆盖GeneBank中所登录的全部序列，并且可以同时对水貂冠状病毒与新型冠状病毒进行快速鉴别检测，这一点是现有技术中引物探针序列所不能达到的。

1.2引物、探针设计

从NCBI上下载6条水貂冠状病毒N基因编码区特定序列，27条新型冠状病毒N基因编码区特定序列，利用Prime 5.0引物设计软件分别进行引物探针设计，在进行初步的筛选后，进行人工设计，在多重序列比对的基础上，设计特异性引物探针，用于引物探针设计的部分水貂新冠病毒参比毒株及用于引物探针设计的部分新型冠状病毒参比毒株，具体如表1及表2所示。

表1 用于引物探针设计的部分水貂新冠病毒参比毒株

表2 用于引物探针设计的部分新型冠状病毒参比毒株

1.3引物探针设计特色

引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。用于筛选比较的其他引物、探针的名称、序列来源见表3，比对结果如图1。

表3 用于筛选比较的引物、探针的名称及序列

在原有33条序列的基础上从GeneBank重新下载了一些序列，将设计的引物探针序列与之比对，发现经人工设计的探针引物组可以在同时检测水貂冠状病毒和新型冠状病毒的基础上未发现漏检情况，而仅靠软件设计的探针引物组无法达到理想的效果，故最终确定引物探针的核苷酸序列如下：

新型冠状病毒上游引物 HF: AGCGCTTCAGCGTTCTTC

新型冠状病毒下游引物 HR: CACCTGTGTAGGTCAACCAC

新型冠状病毒探针 HP: 5’FAM- CGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCG-BHQ1 3’。

水貂冠状病毒上游引物 MF:GGCTAAGTCTAGTGAAAGACCTG

水貂冠状病毒下游引物 MR:CCTTCACTAATTCTGCATCACC

水貂冠状病毒探针 MP:5’HEX-AAGCACTCATGGAAGAAAACGCCT-BHQ1 3’

实施例2 水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒荧光RT-PCR反应体系的建立

在多重序列比对的基础上，设计能同时快速鉴别检测水貂冠状病毒与新型冠状病毒的探针引物组，初步建立荧光RT-PCR检测方法，并应用Taguchi方法进行优化，找出引物、探针、Mg²⁺浓度的最佳范围，根据最佳范围进行相应的调整，最终获得引物、探针、Mg²⁺的具体浓度，从而确定该检测方法的最适条件：反应体系共25 μL，包括荧光RT-PCR反应液、酶混合物、模板三部分。其中，一个检测的反应液由2 μL的dNTP Mixture（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶脱氧核苷酸混合物）（2.5mmol/L）、1 μL的引物MF（10 μmol/L）、1 μL的引物MR（10 μmol/L）、0.3 μL的探针MP（10 μmol/L）、1.5 μL的引物HF（10 μmol/L）、1.5 μL的引物HR（10 μmol/L）、0.5 μL的探针HP（10 μmol/L）、5 μL的5×RT-PCR缓冲液、2 μL的MgCl₂（25mmol/L）及5.2 μL的焦碳酸二乙酯处理水组成；一个检测的酶混合物由0.5 μLM-MLV反转录酶（200 U/μL）、0.25 μLTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）、0.25μLRNA酶抑制剂（40 U/μL）组成；最终确定该检测方法的扩增条件是第一阶段预变性，42℃/15 min；第二阶段92℃/3分钟；第三阶段92℃/15 sec，53℃/10 sec ，60℃/35 sec，共40个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。

荧光RT-PCR反应完成后，若双检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无水貂冠状病毒和新型冠状病毒；若双检测通道Ct值均≤32.0，且均出现典型的扩增曲线，表明样品中有水貂冠状病毒和新型冠状病毒；如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤32.0，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在新型冠状病毒。如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤32.0，而FAM检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在水貂冠状病毒。

实施例3 水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒的组装

试剂盒组成清单如表4所示。

表4 试剂盒组成清单

实施例4 水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒的敏感性试验

用DEPC处理水对水貂冠状病毒和新型冠状病毒阳性质控品（拷贝数为10⁵copies/反应）提取核酸后作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为灵敏度质控样品。进检测和判定1:10、1:100、1:1000稀释质控品的检测结果均为阳性，1:10000为阳性，1:100000为阴性，表明试剂盒的检测极限可以达到1:10000，即10¹copies/反应，见图2。

实施实例5 水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测试剂盒的特异性试验

检测猪传染性胃肠炎病毒核酸、猪流行性腹泻病毒核酸、猪δ冠状病毒核酸、犬冠状病毒核酸、鸡传染性支气管炎病毒核酸、人的其他冠状病毒核酸，验证本试剂盒的特异性，均无阳性交叉反应，见图3。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>山东省动物疫病预防与控制中心

<120> 一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组、试剂盒及其检测方法<160>6

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

AGCGCTTCAG CGTTCTTC 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

CACCTGTGTA GGTCAACCAC 20

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

CGCATTGGCA TGGAAGTCAC ACCTTCG 27

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

GGCTAAGTCT AGTGAAAGAC CTG 23

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>5

CCTTCACTAA TTCTGCATCA CC 22

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>6

AAGCACTCAT GGAAGAAAAC GCCT 24

Claims

1.一种水貂冠状病毒与新型冠状病毒快速鉴别检测的探针引物组，其特征在于，所述探针引物序列为：

新型冠状病毒上游引物 HF如SEQ ID NO.1所示；

新型冠状病毒下游引物 HR如SEQ ID NO.2所示；

新型冠状病毒探针 HP如SEQ ID NO.3所示；

水貂冠状病毒上游引物 MF如SEQ ID NO.4所示；

水貂冠状病毒下游引物 MR如SEQ ID NO.5所示；

水貂冠状病毒探针 MP如SEQ ID NO.6所示。

2.一种含有如权利要求1所述的探针引物组的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分：荧光RT-PCR反应液、酶混合物、阳性对照、阴性对照中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光RT-PCR反应液由1体积浓度为10μmol/L水貂冠状病毒上游引物、1体积浓度为10μmol/L的水貂冠状病毒下游引物、0.3体积浓度为10μmol/L的水貂冠状病毒探针、1.5体积浓度为10μmol/L的新冠病毒上游引物、1.5体积浓度为10μmol/L的新冠病毒下游引物、0.5体积浓度为10μmol/L的新冠病毒探针、5体积5xRT、2体积浓度为25mmol/L的MgCl₂、2体积浓度为2.5mmol/L的dNTP和5.2体积焦碳酸二乙酯处理水组成。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物由200 U/μL的M-MLV反转录酶、5 U/μL的Taq DNA 聚合酶、40 U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。

5.根据权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为高压灭菌过的焦碳酸二乙酯处理水；所述阳性对照为体外转录的水貂冠状病毒和新型冠状病毒N基因RNA片段。

6.一种利用权利要求2-5任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的具体参数为：第一阶段预变性，42℃/15 min；第二阶段92℃/3分钟；第三阶段92℃/15 sec，53℃/10 sec，60℃/35 sec，共40个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。