CN111893211A - 一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒。特别是涉及基于重组酶和聚合酶的恒温链置换聚合扩增技术，结合荧光基团标记的特异性性探针，实现对靶基因特异性的检测；同时以人类基因GAPDH设计引物探针作为检测内标，可有效监控样品和扩增反应的有效性。发明包括引物探针特异性序列设计组合、检测反应液A、检测反应液B、阴性质控品、阳性质控品，应用本发明引物探针序列组以及试剂盒可在15分钟内鉴别检测核酸样品中是否存在新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒三种病原体的一种或多种核酸。可应用于临床疑似新型冠状病毒感染者的快速筛查检测、疾病预防控制系统的疫情监测，以及机场、车站、海关等区域疑似人员的快速筛查等多个领域。

Description

一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试 剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒（2019-nCoV）属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或者椭圆形，常为多态性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。严重危害人民群众的健康、生活，给我国医疗健康、经济带来极大损失。
一般针对病毒感染，常见检测方法有基因检测、免疫检测、分离培养、基因组测序等技术手段和方法。新型冠状病毒为新突发病原体，目前国家卫健委推荐的主要诊断手段和方法为常规实时荧光RT-PCR方法和全基因组测序法。已经有公司开发出IgM和IgG免疫学检测方法和试剂。病毒培养均有准确、可靠性高的特点，但对于实验室、人员操作的要求高，但对感染早期样本，培养法阳性率低。基因组测序费用高，检测周期1周，对于低载量样本容易出现假阴性结果。
基于重组酶和聚合酶的恒温链置换聚合扩增技术（Thermostatic Chainreplacement polymerization amplification，TCRPA）是一种将聚合酶链式反应的高效扩增特点与基于单链重组酶的恒温扩增相结合的先进技术，而普通实时荧光PCR扩增反应获得检测结果需要60-100min。若将实时荧光TCRPA技术应用于快速检测，将在短时间内判断是否有感染新型冠状病毒，从而便于疫情防控单位、临床单位及时采取必要的防控和治疗措施，对于防止交叉感染和提高诊疗效率、出入境检验检疫、疫病监测防控等都意义重大。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，包括特异性引物和探针组合物、检测反应液A、检测反应液B、阴性质控品和阳性质控品；
所述特异性引物和探针组合物由人类基因GAPDH特异性正反向引物、目标病原特异性正反向引物和不同荧光标记的特异性探针组成；
所述目标病原特异性正反向引物包括新型冠状病毒特异性正反向引物、甲型流感病毒特异性正反向引物和乙型流感病毒特异性正反向引物；
所述特异性探针包括GAPDH特异性探针、新型冠状病毒特异性探针、甲型流感病毒特异性探针和乙型流感病毒特异性探针；
所述人类基因GAPDH特异性正反向引物的序列分别为5’- GAGTGCTACATGGTGAGCCCCAAAGCTGGTG-3’和5’-GTGATGGGATTTCCATTGATGACAAGCTTCC-3’， 所述GAPDH特异性探针的序列为5’- CACGTATTCCCCCAGGTTTACATGTTCCAA(Cy5 dT) (THF) (BHQ1 dT)GATTCCACCCATGG-3’；
所述新型冠状病毒特异性正反向引物的序列分别为5’- AGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCG -3’和5’- AGTACTAGTGCCTGTGCCGCACGGTGTAAG -3’，相对应的所述新型冠状病毒特异性探针序列为5’- GAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAA (FAMdT)CG(THF)TA(BHQ1dT)TAAACGGGTTTG-3’，所述新型冠状病毒特异性探针含有荧光发生基团6-FAM和荧光淬灭基团BHQ1，进而可特异性地检测新型冠状病毒；
甲型流感病毒特异性正反向引物的序列分别为5’- TTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCC -3’和5’- GTCCATGTTGTTTGGGTCYCCATTCCCATT- 3’，相对应的所
述甲型流感病毒特异性探针序列为5’- CCAGTGAGCGAGGACTGCAG CGTAGACGC (HEX dT)(THF) (BHQ1 dT) GTCCAAAATGCCCTT -3’，所述甲型流感病毒特异性探针两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，进而可特异性地检测甲型流感病毒；
所述乙型流感病毒特异性正反向引物的序列为5’- AACTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGAC-3’和5’- GTCTCCCTCTTCTGGTGATAATCGGTGCTC -3’，相对应的所述乙型流感病毒特异性探针序列为5’- CAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAG(Texas Red dT) (THF) (BHQ1dT) TATCCCAATTTGGTC -3’，所述乙型流感病毒特异性探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，进而可特异性地检测乙型流感病毒。
优选地，所述新型冠状病毒特异性探针序列、甲型流感病毒特异性探针序列和乙型流感病毒特异性探针序列的3’端分别修饰C3-Spacer。
优选地，所述新型冠状病毒特异性探针、甲型流感病毒特异性探针和乙型流感病毒特异性探针的序列上分别设计修饰碱基的dT-荧光基团和dT-淬灭剂基团，所述所述新型冠状病毒特异性探针、甲型流感病毒特异性探针和乙型流感病毒特异性探针的序列上分别设计四氢呋喃残基标记。
优选地，所述四氢呋喃残基位于dT-荧光基团修饰的碱基和dT-淬灭剂基团修饰的碱基之间。
优选地，所述dT-荧光基团标记采用FAM、VIC、TAMRA、NED、JOE、HEX、YakimaYellow、Texas Red、Cy5、Cy3中任一种荧光基团标记；所述dT-淬灭剂基团可采用BHQ1、BHQ2、Eclipse中任一种荧光淬灭基团标记。
优选地，所述特异性引物和探针组合物中特异性正反引物浓度为6-25μmol/L，所述探针浓度为2~10μmol/L。
优选地，所述检测反应液A由逆转录酶、重组酶、SSB、聚合酶、dNTPs组成，其每份反应中重组酶的用量为1~5U，最佳用量2U；逆转录酶用量为2~4U，最佳用量3U；SSB单链结合蛋白用量为0.1~0.5ng,最佳用量为0.3ng；聚合酶用量为1~5U，最佳用量为3U；dNTPs为0.25~0.45mmol， 最佳用量为0.3mmol。
优选地，所述检测反应液B由Tris-HAc、Mg（Ac）2组成，其在于Tris-HAc缓冲液的pH值为7.8~8.8，最佳为8.2；Tris-HAc浓度为20~100mmol/L，最佳浓度为50 mmol/L； Mg(Ac)2浓度为2~8mmol/L，最佳浓度为3.0mmol/L。
优选地，用于具有温控功能的实时荧光PCR仪时，鉴别检测条件为：阶段1：40℃ 1分钟，阶段2：40℃ 20秒，40个循环，收集荧光。
优选地，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为含有新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒三个靶基因扩增区域基因片段连接后而构建的人工构建假病毒。
本发明利用本发明所述的引物探针序列，或基于以上序列所组合的试剂盒可以快速准确地鉴别出样本中是否存在2019-nCoV、甲型流感病毒以及乙型流感病毒核酸。
在对GENBANK上已知上述三种病毒核酸序列进行比对的基础上，分别寻找各病原体核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物以及探针。这些引物探针可在含有聚合酶，逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白（SSB）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）的酶组合以及含有Mg2+等成份的TCRPA缓冲液中，通过具有荧光读取模块的温控仪实现对特异性靶基因检测的目的；同时以人类基因GAPDH设计引物探针作为检测内标，可有效监控样品和扩增反应的有效性。
本发明的有益效果，或与现有技术相比优点为：①一份样本可鉴别三种病原体的感染情况，检测过程只需15min，而普通多重实时荧光PCR需要60~120min；②分别针对三种病毒核酸特异性序列设计专用引物、探针序列组合，保证检测的特异性和准确性。根据实施例的记载，对于新型冠状病毒（2019-nCoV）的检测灵敏度为100copies/mL.对甲型流感病毒的检测灵敏度达到100copies/mL,对乙型流感病毒检测灵敏度为100copies/mL，比荧光定量R-PCR方法高5-10倍，且与呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、腺病毒、副流感病毒无交叉反应，表现出良好的特异性；③新型冠状病毒感染患者与流感病毒感染患者具有临床症状相似的特点，不容易鉴别诊断，本发明将三种病原体可一次性鉴别完成，对于鉴别诊断具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例的仪器最佳实验条件的设置界面示意图。
图2是本发明实施例的新型冠状病毒(2019-nCoV)检测引物探针组及试剂盒阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线图。
图3是本发明实施例的新型冠状病毒(2019-nCoV)检测引物探针组及试剂盒检测阳性样品核酸的扩增曲线图。
图4是本发明实施例的甲型流感病毒检测引物探针组及试剂盒阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线图。
图5是本发明实施例的甲型流感病毒检测引物探针组及试剂盒检测阳性样品核酸的扩增曲线图。
图6是本发明实施例的乙型流感病毒检测引物探针组及试剂盒阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线图。
图7是本发明实施例的乙型流感病毒检测引物探针组及试剂盒检测阳性样品核酸的扩增曲线图。
图8是本发明实施例的新型冠状病毒(2019-nCoV)/流感病毒(IV)检测引物探针组及试剂盒阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线图。
图9-图11是本发明实施例的新型冠状病毒(2019-nCoV)/流感病毒(IV)检测引物探针组及试剂盒检测阳性样品核酸的扩增曲线图。
图12是本发明实施例的新型冠状病毒(2019-nCoV)/乙型流感病毒（IVB）检测引物探针组及试剂盒阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线图。
图13是本发明实施例的新型冠状病毒(2019-nCoV)/甲型流感病毒（IVA）检测引物探针组及试剂盒阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线图。
图14是本发明实施例的乙型流感病毒（IVB）样品Texas Red通道有扩增信号曲线图。
图15是本发明实施例的特异性引物探针Mix检测试剂对呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒、腺病毒无非特异性扩增曲线图。
图16是本发明实施例的临床样品检测内标IC通道有扩增信号曲线图。
图17是本发明实施例的新型冠状病毒（2019-nCoV）检测灵敏度扩增曲线图。
图18是本发明实施例的甲型流感病毒（IVA）检测灵敏度扩增曲线图。
图19是本发明实施例的乙型流感病毒（IVB）检测灵敏度扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1一种新型冠状病毒（2019-nCoV）快速鉴别检测引物探针组及试剂盒应用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针Mix（20μl/管）1管、检测反应液A（60μl/管）1管，检测反应液B（320μl/管），阳性质控品（20μl/管）1管，阴性质控品（20μl/管）1管。
2、标本类型：临床采集的深部咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清、血浆。
3、核酸提取
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
4、实时荧光TCRPA检测
每管完整的检测体系应包括1µl引物探针Mix（其中包括nCoV-2019特异性引物探针组、人类基因GAPDH引物探针组作为内标IC）、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B、 5µl质控品待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
4.1 试剂准备：每管扩增管中加入1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B，也可以根据检测所需总反应数N（包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品），计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
4.2 加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入设备的反应槽中。
4.3 上机扩增检测：（ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V1.4）
打开软件主界面，点击New Experiment开始新实验设置，设置Experiment Name，在Setup主窗口下“Experiment properties”界面下，选择仪器运行模块为“7500 FAST（96Wells）”，实验类型为“Quantitation-Standard Curve”，试剂类型选择“TaqManReagents”，仪器运行速度类型选择“FAST”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets andSamples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher分别为：2019-nCoV、FAM、None；IC、Cy5、None。阳性质控品位置设置为“P”（Positive）阴性质控品孔位设置为“N”（Negative）、待测标本加样孔位为“U”（Unknow）。继续在“Run Method”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:40℃ 1min；“Cycling Stage”:40℃ 20sec(采集荧光)；Number of Cycles为40（见附图1）。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
4.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Analysis主界面窗口下打开“AmplificationCurve”子界面下查看阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线情况（附图2），若符合质控要求，则继续在“Amplification Plot”子界面查看各个样本孔的2019-nCoV通道以及IC通道的扩增情况，并进行结果判读（附图3）。
实施例2 一种甲型流感病毒（IVA）核酸快速鉴别检测引物探针组及试剂盒应用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针Mix（20μl/管）1管、检测反应液A（60μl/管）1管，检测反应液B（320μl/管），阳性质控品（20μl/管）1管，阴性质控品（20μl/管）1管。
2、标本类型：临床采集的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液。
3、核酸提取
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到 RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
4、实时荧光TCRPA检测
每管完整的检测体系应包括1µl引物探针Mix（包括IVA特异性引物探针组、人类基因GAPDH引物探针组作为内标IC）、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B、 5µl质控品待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
4.1 试剂准备：每管扩增管中加入1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B，也可以根据检测所需总反应数N（包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品），计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
4.2 加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入设备的反应槽中。
4.3 上机扩增检测：（ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V1.4）
打开软件主界面，点击New Experiment开始新实验设置，设置Experiment Name，在Setup主窗口下“Experiment properties”界面下，选择仪器运行模块为“7500 FAST（96Wells）”，实验类型为“Quantitation-Standard Curve”，试剂类型选择“TaqManReagents”，仪器运行速度类型选择“FAST”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets andSamples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher分别为：IVA、HEX、None；IC、Cy5、None。阳性质控品位置设置为“P”（Positive）阴性质控品孔位设置为“N”（Negative）、待测标本加样孔位为“U”（Unknow）。继续在“Run Method”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:40℃ 1min；“Cycling Stage”:40℃ 20sec(采集荧光)；Number of Cycles为40（见附图1）。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
4.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Analysis主界面窗口下打开“AmplificationCurve”子界面下查看阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线情况（附图4），若符合质控要求，则继续在“Amplification Plot”子界面查看各样本孔相应通道扩增情况，并进行结果判读（附图5）。
实施例3 一种乙型流感病毒（IVB）核酸快速鉴别检测引物探针组及试剂盒应用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针Mix（20μl/管）1管、检测反应液A（60μl/管）1管，检测反应液B（320μl/管），阳性质控品（20μl/管）1管，阴性质控品（20μl/管）1管。
2、标本类型：临床采集的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液。
3、核酸提取
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到20~30μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
4、实时荧光TCRPA检测
每管完整的检测体系应包括1µl引物探针Mix（其中包括IVB特异性引物探针组，人类基因GAPDH引物探针组作为内标IC）、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B、 5µl质控品待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
4.1 试剂准备：每管扩增管中加入1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B，也可以根据检测所需总反应数N（包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品），计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
4.2 加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入设备的反应槽中。
4.3 上机扩增检测：（ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V1.4）
打开软件主界面，点击New Experiment开始新实验设置，设置Experiment Name，在Setup主窗口下“Experiment properties”界面下，选择仪器运行模块为“7500 FAST（96Wells）”，实验类型为“Quantitation-Standard Curve”，试剂类型选择“TaqManReagents”，仪器运行速度类型选择“FAST”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets andSamples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher分别为：IVB、Texas Red、None；IC、Cy5、None。阳性质控品位置设置为“P”（Positive）阴性质控品孔位设置为“N”（Negative）、待测标本加样孔位为“U”（Unknow）。继续在“Run Method”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:40℃ 1min；“Cycling Stage”:40℃ 20sec(采集荧光)；Number of Cycles为40（见附图1）。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
4.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Analysis主界面窗口下打开“AmplificationCurve”子界面下查看阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线情况（附图6），若符合质控要求，则继续在“Amplification Plot”子界面查看各样本孔相应各通道扩增情况，并进行结果判读（附图7）。
实施例4 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）/流感病毒（IV）核酸快速鉴别检测引物探针组及试剂盒应用
制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针Mix（20μl/管）1管、检测反应液A（60μl/管）1管，检测反应液B（320μl/管），阳性质控品（20μl/管）1管，阴性质控品（20μl/管）1管。
以上组分中的引物探针Mix包括2019-nCoV引物探针组、IVA引物探针组、IVB引物探针组、人类基因GAPDH引物探针组。
3、标本类型：临床采集的深部咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清、血浆。
4、核酸提取
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到20~30μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
5、实时荧光TCRPA检测
每管完整的检测体系应包括1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B、 5µl质控品待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
5.1 试剂准备：每管扩增管中加入1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B，也可以根据检测所需总反应数N（包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品），计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
5.2 加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入设备的反应槽中。
5.3 上机扩增检测：（ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V1.4）
打开软件主界面，点击New Experiment开始新实验设置，设置Experiment Name，在Setup主窗口下“Experiment properties”界面下，选择仪器运行模块为“7500 FAST（96Wells）”，实验类型为“Quantitation-Standard Curve”，试剂类型选择“TaqManReagents”，仪器运行速度类型选择“FAST”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets andSamples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher分别为：2019-nCoV、FAM、None；IVA、HEX、None；IVB、Texas Red、None；IC、Cy5、None。阳性质控品位置设置为“P”（Positive）阴性质控品孔位设置为“N”（Negative）、待测标本加样孔位为“U”（Unknow）。继续在“Run Method”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:40℃1min；“Cycling Stage”:40℃ 20sec(采集荧光)；Number of Cycles为40（见附图1）。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
5.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Analysis主界面窗口下打开“AmplificationCurve”子界面下查看阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线情况（附图8），若符合质控要求，则继续在“Amplification Plot”子界面查看各样本孔相应通道扩增情况，并进行结果判读（附图9-11）。
实施例6 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）/乙型流感病毒（IVB）核酸快速鉴别检测引物探针组及试剂盒应用
制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针Mix（20μl/管）1管、检测反应液A（60μl/管）1管，检测反应液B（320μl/管），阳性质控品（20μl/管）1管，阴性质控品（20μl/管）1管。
以上组分中的引物探针Mix包括2019-nCoV引物探针组、IVB引物探针组、人类基因GAPDH引物探针组。
3、标本类型：临床采集的深部咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清、血浆。
4、核酸提取
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到20~30μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
5、实时荧光TCRPA检测
每管完整的检测体系应包括1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B、 5µl质控品待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
5.1 试剂准备：每管扩增管中加入1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B，也可以根据检测所需总反应数N（包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品），计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
5.2 加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入设备的反应槽中。
5.3 上机扩增检测：（ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V1.4）
打开软件主界面，点击New Experiment开始新实验设置，设置Experiment Name，在Setup主窗口下“Experiment properties”界面下，选择仪器运行模块为“7500 FAST（96Wells）”，实验类型为“Quantitation-Standard Curve”，试剂类型选择“TaqManReagents”，仪器运行速度类型选择“FAST”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets andSamples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher分别为：2019-nCoV、FAM、None；IVB、Texas Red、None； IC、Cy5、None。阳性质控品位置设置为“P”（Positive）阴性质控品孔位设置为“N”（Negative）、待测标本加样孔位为“U”（Unknow）。继续在“Run Method”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:40℃ 1min；“Cycling Stage”:40℃ 20sec(采集荧光)；Number of Cycles为40（见附图1）。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
5.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Analysis主界面窗口下打开“AmplificationCurve”子界面下查看阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线情况（附图12），若符合质控要求，则继续在“Amplification Plot”子界面查看各样本孔相应各个通道扩增情况，并进行结果判读。
实施例6 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）/甲型流感病毒（IVA）核酸快速鉴别检测引物探针组及试剂盒应用
制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针Mix（20μl/管）1管、检测反应液A（60μl/管）1管，检测反应液B（320μl/管），阳性质控品（20μl/管）1管，阴性质控品（20μl/管）1管。
以上组分中的引物探针Mix包括2019-nCoV引物探针组、IVA引物探针组、人类基因GAPDH引物探针组。
3、标本类型：临床采集的深部咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清、血浆。
4、核酸提取
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到20~30μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
5、实时荧光TCRPA检测
每管完整的检测体系应包括1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B、 5µl质控品待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
5.1 试剂准备：每管扩增管中加入1µl引物探针Mix、3µl检测反应液A、16µl检测反应液B，也可以根据检测所需总反应数N（包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品），计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
5.2 加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入设备的反应槽中。
5.3 上机扩增检测：（ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V1.4）
打开软件主界面，点击New Experiment开始新实验设置，设置Experiment Name，在Setup主窗口下“Experiment properties”界面下，选择仪器运行模块为“7500 FAST（96Wells）”，实验类型为“Quantitation-Standard Curve”，试剂类型选择“TaqManReagents”，仪器运行速度类型选择“FAST”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets andSamples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher分别为：2019-nCoV、FAM、None；IVA、HEX、None； IC、Cy5、None。阳性质控品位置设置为“P”（Positive）阴性质控品孔位设置为“N”（Negative）、待测标本加样孔位为“U”（Unknow）。继续在“RunMethod”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:40℃ 1min；“CyclingStage”:40℃ 20sec(采集荧光)；Number of Cycles为40（见附图1）。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
5.4 结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Analysis主界面窗口下打开“AmplificationCurve”子界面下查看阴性质控品、阳性质控品的扩增曲线情况（附图13），若符合质控要求，则继续在“Amplification Plot”子界面查看各样本孔相应各通道扩增情况，并进行结果判读。
实施例7 应用新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别检测试剂盒检测临床样品
采用新型冠状病毒（2019-nCoV）人工构建假病毒颗粒、以及新型冠状病毒（2019-nCoV）人工构建假病毒颗粒与健康个体鼻咽拭子制备的模拟样品，甲型流感病毒（IVA）感染者咽拭子1份、乙型流感病毒（IVB）感染者咽拭子1份、呼吸道合胞病毒（RSV）感染者咽拭子2份、腺病毒（ADV）感染者咽拭子2份、副流感病毒感染者咽拭子1份、偏肺病毒(HMPV)感染者咽拭子1例，以上样品均来自临床确诊患者。对所有样本进行核酸提取，上机扩增检测及结果分析步骤参照实施例4进行，同时进行质控品的检测。
检测结果：阴性质控品无扩增曲线，阳性质控品三个检测通道均为扩增曲线（附图8）；质控品符合质控要求，因此待检标本的检测结果是有效确的。
由待检标本的检测结果可知试剂盒检测新型冠状病毒（2019-nCoV）假病毒颗粒以及模拟样本FAM通道有扩增信号；IVA样品HEX通道有扩增信号；IVB样品Texas Red通道有扩增信号（附图14）。同时特异性引物探针Mix检测试剂对呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒、腺病毒无非特异性扩增（附图15）；所有临床样品检测内标IC通道有扩增信号（附图16）。
实施例8 应用新型冠状病毒（2019-nCoV）及流感病毒核酸引物探针组以及鉴别检测试剂对检测样本RNA的灵敏度测试，采用新型冠状病毒（2019-nCoV）人工构建假病毒颗粒，并提取RNA，以Qubit 荧光计（Invitrogen）定量浓度为3.2×106copies/mL, 以DEPC水稀释至1.0×106copies/mL后，10倍比稀释至1.0×100copies/mL。
另外，取甲型流感病毒、乙型流感病毒灭活培养物，提取RNA后同样以Qubit 荧光计（Invitrogen）定量RNA浓度，分别为7.5×106copies/mL, 4.8×106copies/mL,分别稀释至1.0×106copies/mL后，10倍倍比稀释至1.0×100copies/mL,作为甲型流感病毒、乙型流感病毒RNA检测灵敏度检测参考样品。
以上三种RNA样品制备的灵敏度检测参考样品，均包括以下浓度的RNA溶液，1.0×106copies/mL，1.0×105copies/mL，1.0×104copies/mL，1.0×103copies/mL，1.0×102copies/mL，1.0×101copies/mL，1.0×100copies/mL共计7个浓度。
以本发明所设计的新型冠状病毒（2019-nCoV）及流感病毒核酸引物探针组分别对以上样品进行检测，每个样品做一次重复。
结果显示，使用本发明引物探针组以及试剂，新型冠状病毒（2019-nCoV）检测试剂对1.0×102copies/mL浓度可100%检出，检测灵敏度为100copies/mL（附图17）。甲型流感病毒（IVA）和乙型流感病毒（IVB）的检测灵敏度也均可达到100copies/mL（附图18、附图19）。
本次试验中模拟样品和临床样本的检测结果与国家食品药品监督管理局批准的应急商品化试剂盒（常规实时荧光PCR方法）检测结果完全一致，说明利用本发明的引物探针组和试剂盒鉴别以上病毒感染是可行的，且检测时间仅需要15min，操作简便，检测结果立等可取。一次可鉴别新型冠状病毒（2019-nCoV）、甲型流感病毒（IVA）、乙型流感病毒（IVB）三种病原体，对疑似病例的快速鉴别检测，现场初筛检测、疫情防控具有重大意义。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
<110> 广东药科大学
<120>一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1 .0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 1
AGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCG 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 2
AGTACTAGTGCCTGTGCCGCACGGTGTAAG 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的探针。
<400> 3
GAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAA FAMdT CG THF TA BHQ1dT TAAA CGGGTTTG 30
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 4
TTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCC 49
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 5
GTCCATGTTGTTTGGGTCYCCATTCCCATT 30
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的探针。
<400> 6
CCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGC FAM dT THF BHQ1 dT GTCCAA AATGCCCTT 34
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 7
AACTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGAC 47
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 8
GTCTCCCTCTTCTGGTGATAATCGGTGCTC 31
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的探针。
<400> 9
CAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAG FAM dT THF BHQ1 dT TATCCC AATTTGGTC 30
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 10
GAGTGCTACATGGTGAGCCCCAAAGCTGGTG 48
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的引物。
<400> 11
GTGATGGGATTTCCATTGATGACAAGCTTCC 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 根据特定核苷酸序列设计，以用作恒温链置换聚合扩增方法及试剂盒的探针。
<400> 12
CACGTATTCCCCCAGGTTTACATGTTCCAA Cy5 dT THF BHQ1 dT GATTCC ACCCATGG 31

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：包括特异性引物探针组合物、检测反应液A、检测反应液B、阴性质控品和阳性质控品；
所述特异性引物探针组合物由人类基因GAPDH特异性正反向引物、目标病原特异性正反向引物和不同荧光标记的特异性探针组成；
所述目标病原特异性正反向引物包括新型冠状病毒特异性正反向引物、甲型流感病毒特异性正反向引物和乙型流感病毒特异性正反向引物；
所述特异性探针包括GAPDH特异性探针、新型冠状病毒特异性探针、甲型流感病毒特异性探针和乙型流感病毒特异性探针；
所述人类基因GAPDH特异性正反向引物的序列分别为5’- GAGTGCTACATGGTGAGCCCCAAAGCTGGTG-3’和5’-GTGATGGGATTTCCATTGATGACAAGCTTCC-3’， 所述GAPDH特异性探针的序列为5’- CACGTATTCCCCCAGGTTTACATGTTCCAA(Cy5 dT) (THF) (BHQ1 dT)GATTCCACCCATGG-3’；
所述新型冠状病毒特异性正反向引物的序列分别为5’- AGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCG -3’和5’- AGTACTAGTGCCTGTGCCGCACGGTGTAAG -3’，相对应的所述新型冠状病毒特异性探针序列为5’- GAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAA (FAM dT)CG(THF) TA(BHQ1 dT)TAAACGGGTTTG-3’，所述新型冠状病毒特异性探针含有荧光发生基团6-FAM和荧光淬灭基团BHQ1，进而可特异性地检测新型冠状病毒；
甲型流感病毒特异性正反向引物的序列分别为5’- TTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCC -3’和5’- GTCCATGTTGTTTGGGTCYCCATTCCCATT- 3’ ，相对应的所述
甲型流感病毒特异性探针序列为5’- CCAGTGAGCGAGGACTGCAGCG TAGACGC (HEX dT)(THF) (BHQ1 dT) GTCCAAAATGCCCTT -3’，所述甲型流感病毒特异性探针两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，进而可特异性地检测甲型流感病毒；
所述乙型流感病毒特异性正反向引物的序列为5’- AACTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGAC-3’和5’- GTCTCCCTCTTCTGGTGATAATCGGTGCTC -3’，相对应的所述乙型流感病毒特异性探针序列为5’- CAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAG(Texas Red dT) (THF)(BHQ1 dT) TATCCCAATTTGGTC -3’，所述乙型流感病毒特异性探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1，进而可特异性地检测乙型流感病毒。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述新型冠状病毒特异性探针序列、甲型流感病毒特异性探针序列和乙型流感病毒特异性探针序列的3’端分别修饰C3-Spacer。
3.如权利要求1或2所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述新型冠状病毒特异性探针、甲型流感病毒特异性探针和乙型流感病毒特异性探针的序列上分别设计修饰碱基的dT-荧光基团和dT-淬灭剂基团，所述新型冠状病毒特异性探针、甲型流感病毒特异性探针和乙型流感病毒特异性探针的序列上分别设计四氢呋喃残基标记。
4.如权利要求3所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述四氢呋喃残基位于dT-荧光基团修饰的碱基和dT-淬灭剂基团修饰的碱基之间。
5.如权利要求3所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所用dT-荧光基团标记采用FAM、VIC、TAMRA、NED、JOE、HEX、Yakima Yellow、Texas Red、Cy5、Cy3中任一种荧光基团标记；dT-淬灭剂基团可采用BHQ1、BHQ2、Eclipse中任一种荧光淬灭基团标记。
6.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述特异性引物和探针组合物中特异性正反引物浓度为6-25μmol/L，所述探针浓度为2~10μmol/L。
7.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述检测反应液A由逆转录酶、重组酶、SSB、聚合酶、dNTPs组成，其每份反应中重组酶的用量为1~5U，最佳用量2U；逆转录酶用量为2~4U，最佳用量3U；SSB单链结合蛋白用量为0.1~0.5ng,最佳用量为0.3ng；聚合酶用量为1~5U，最佳用量为3U；dNTPs为0.25~0.45mmol，最佳用量为0.3mmol。
8.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述检测反应液B由Tris-HAc、Mg（Ac）2组成，其在于Tris-HAc缓冲液的pH值为7.8~8.8，最佳为8.2；Tris-HAc浓度为20~100mmol/L，最佳浓度为50 mmol/L； Mg(Ac)2浓度为2~8mmol/L，最佳浓度为3.0mmol/L。
9.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：用于具有温控功能的实时荧光PCR仪时，鉴别检测条件为：阶段1：40℃ 1分钟， 阶段240℃ 20秒，40个循环，此阶段进行荧光收集。
10.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒及流感病毒核酸快速鉴别引物探针组和试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为含有新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒三个靶基因扩增区域基因片段连接后而构建的人工构建假病毒。
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