CN102031312A - 一种检测人畜共患病病毒的基因芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人畜共患病病毒的基因芯片及其应用。本发明提供的基因芯片包括病毒检测探针,其特征在于:所述病毒检测探针由以下的探针组成:核苷酸序列分别是表2中序列1-150的病毒检测探针和核苷酸序列分别是序列1-150的反向互补序列的病毒检测探针。本发明的基因芯片与病毒的核酸进行杂交的最佳杂交条件为:采用0.25g/100ml NaBH4溶液封闭芯片,芯片在51℃,2h,在含50%(体积百分比)甲酰胺杂交液中杂交。在上述条件下,本发明的芯片具有较好的敏感性及检测特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种检测人畜共患病病毒的基因芯片及其应用。
背景技术
人兽共患病是指脊椎动物与人类之间自然传播的疾病和感染疾病。现在已知的200多种动物传染病中,至少有170多种属于人兽共患病。而病毒引起的人兽共患病也在逐年增加,如禽流感、口蹄疫、非典型性肺炎、狂犬病及多种虫媒病毒病,以及新出现的尼帕脑炎、猴痘、西尼罗河热、拉沙热、埃博拉出血热、马尔堡出血热等,这些病毒类人兽共患病疫情传播迅速、死亡率高。早期、快速进行重要人兽共患病病毒高通量筛查与鉴定,可显著提高我国应对该类传染病的能力。基因芯片技术可以在一张芯片上集中成千上万种探针信息,因此可一次对大量靶标进行平行检测,为未知病毒的检测与鉴定提供了新的技术手段。目前,基因芯片检测技术按探针不同分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片,相比之下,寡核苷酸芯片探针的制备更容易、检测敏感度更高,而且更容易控制相同的点样浓度及较一致的杂交条件,不要求像cDNA那样变性,也消除了能降低杂交效率的复性问题,在检测重复性上也优于cDNA芯片(Yauk CL,Berndt ML,Williams A,et al.Comprehensivecomparison of six microarray technologies[J].Nucleic Acids Res,2004,32(15):e124;Shippy R,Sendera TJ,Lockner R,et al.Performance evaluation of commercial short-oligonucleotidemicroarrays and the impact of noise in making cross-platform correlations[J].BMC Genomics,2004,5(1):61)。
自1995年基因芯片技术问世以来(Schena M,Shalon D,Davis RW,et al.Quantitativemonitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science 1995,270(5235):467-470),20多年间,基因芯片技术发展迅速,已应用于生物医学的多个领域中。在病毒类病原体的检测方面,国外进行了大规模病原体筛查及鉴定和呼吸道病毒的高通量检测等研究(Wang D,Coscoy L,Zylberberg M,et al.Microarray-based detection andgenotyping of viral pathogens[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24):15687-15692;Quan PL,Palaciosv G,Jabado OJ.Detection of respiratory viruses and subtype identification ofinfluenza A viruses by GreeneChipResp oligonucleotide microarray[J].J Clin Microbiol,2007,45(8):2359-2364)。基因芯片技术在病原体检测方面虽然已取得了很大的进展,但主要问题依然体现在精确性、敏感性、重复性以及特异性上(Draghici S,Khatri P,Eklund AC et al.Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurements[J].Trends Genet,2006,22(2):101-109)。
杂交动力学是影响芯片敏感性、特异性的重要因素。杂交动力学体现在靶分子的质量、杂交和杂交后处理的时间、杂交温度和杂交溶液方面。探针与靶核酸正确杂交与不正确杂交在杂交动力学上完全不同。与探针错配的核酸分子绑定不紧密,分离也较快。杂交温度越高,靶核酸分子与探针更容易分离,因此芯片特异性会增高,而敏感性会降低,但杂交温度过高正确的杂交也会分离。比较低的杂交温度,如低于42℃,样品会不可逆的绑定在芯片上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人畜共患病病毒的基因芯片,该芯片具有较好的敏感性和检测特异性。
本发明提供的基因芯片包括病毒检测探针,其特征在于:所述病毒检测探针由以下的探针组成:核苷酸序列分别是表2中序列1-150的150个病毒检测探针和核苷酸序列分别是序列1-150的反向互补序列的150个病毒检测探针。
所述基因芯片上还固定有1条核苷酸序列如表2中序列151所示的阳性对照探针。
上述基因芯片由以下探针组成:核苷酸序列分别是表2中序列1-150的150个病毒检测探针、核苷酸序列分别是序列1-150的反向互补序列的150个病毒检测探针和1条核苷酸序列如表2中序列151所示的阳性对照探针。
本发明的另一目的在于提供上述的基因芯片与待测生物样品的核酸进行杂交的方法。
本发明提供的上述的基因芯片与待测生物样品的核酸进行杂交的方法,包括以下步骤:将待测生物样品的核酸进行PCR扩增得到的扩增产物与上述的基因芯片杂交,杂交条件是:杂交液中的去离子甲酰胺浓度为25-60%(是体积百分比),杂交的温度是42-61℃,杂交的时间0.5-6小时。
上述杂交条件是如下1)或2)或3)或4):
1)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为40-60%(体积百分比),所述杂交的温度为51-61℃,所述杂交的时间为1-4小时;
2)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为40-50%(体积百分比),所述杂交的温度为51-54℃,所述杂交的时间为1-2小时;
3)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为50-60%(体积百分比),所述杂交的温度为58-61℃,所述杂交的时间为2-4小时;
4)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为50%(体积百分比),所述杂交的温度为51℃,所述杂交的时间为2小时。
上述基因芯片在杂交前用浓度为0.25%(质量与总体积之比,0.25g NaBH4/100ml)的NaBH4进行封闭。任一上述的待测生物样品是基孔肯亚病毒、日本乙脑病毒、狂犬病毒或辛德毕斯病毒的核酸的扩增产物。该扩增产物是PCR扩增产物。
实验证明:芯片杂交前用0.25%NaBH4进行封闭,最优杂交条件为杂交液中甲酰胺含量50%(体积百分比),杂交温度51℃,杂交时间为2h。此时芯片具有较好的敏感性及检测特异性。本实验从杂交温度,时间,杂交液中甲酰胺浓度方面探索对芯片杂交结果的影响,得出了更适合于本检测芯片技术平台的杂交动力学结果。
附图说明
图1为锚定随机引物方法扩增日本脑炎病毒电泳图,M:核酸分子量标准DLmarker2000;1:日本脑炎病毒扩增结果。
图2为点样模式图。
图3为芯片封闭前的杂交结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图4为芯片封闭前的杂交结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图5为0.5h杂交时间的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图6为1h杂交时间的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图7为2h杂交时间的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图8为4h杂交时间的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图9为6h杂交时间的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图10为不同杂交时间的检测结果的分析比较图,A:不同杂交时间的信号强度;B:不同杂交时间的信号数量。
图11为48℃杂交温度下的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图12为51℃杂交温度下的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图13为54℃杂交温度下的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图14为58℃杂交温度下的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图15为61℃杂交温度下的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图16为不同杂交温度检测结果的分析比较图,A:不同杂交时间的信号强度;B:不同杂交时间的信号数量,A的纵坐标是Cy5荧光信号强度;B图的纵坐标是阳性信号点数。
图17为杂交液中25%甲酰胺浓度的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图18为杂交液中33%甲酰胺浓度的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图19为杂交液中40%甲酰胺浓度的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图20为杂交液中50%甲酰胺浓度的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图21为杂交液中60%甲酰胺浓度的检测结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图。
图22不同杂交液成分检测结果的分析比较图A:不同杂交时间的信号强度;B:不同杂交时间的信号数量,A的纵坐标是Cy5荧光信号强度;B图的纵坐标是阳性信号点数。
图23辛德比斯病毒杂交分析结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图、C:杂交分析结果。
图24为狂犬病毒杂交分析结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图、C:杂交分析结果。
图25为日本脑炎病毒杂交分析结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图、C:杂交分析结果。
图26为基孔肯亚病毒杂交分析结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图、C:杂交分析结果。
图27为日本脑炎病毒的模拟临床标本杂交分析结果,A:芯片扫描图、B:结果分析图、C:杂交分析结果。
图23-27中的C图是用Treeview软件对各自的B图中的数据进行分析得到的。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中,如无特殊说明,均为常规方法。
本发明所用试剂及仪器如下:
AMV反转录酶和Taq酶购自日本TaKaRa公司。引物和探针由上海生工生物公司合成。荧光素Cy3及Cy5购自美国Amersham Pharmacia公司。氨基丙烯-dUTP(Aminoallyl-dUTP,aa-dUTP)购自美国Sigma公司。RNA提取试剂盒,DNA纯化试剂盒,REPLI-g试剂盒均购自德国QIAGEN公司。醛基化玻片CSS-100Si lylated购自美国CEL Associates公司。Scanarray Gx Plus扫描仪及Spotarray 24生物芯片点样仪均购自美国PerkinElmer公司。
本发明中的杂交结果用ScanArray Gx Plus扫描仪进行扫描,用GenePix Pro 5.0软件进行分析。在所有的检测中,病毒感染的细胞上清用Cyanine 5(Cy5)荧光染料标记,而未感染病毒的细胞上清阴性对照用Cyanine 3(Cy3)荧光染料标记,取病毒荧光信号绝对值大于1000和与细胞荧光信号强度比值在2.5以上的点为阳性信号,用Treeview软件对分析数据作图。
实施例1.基因芯片检测人兽共患病病毒的杂交条件优化
一、基因芯片的制备
1、寡核苷酸探针的设计及结果
1)寡核苷酸探针的设计
25种人兽共患病病毒见表1。其中Ebola、Marburg病毒探针的设计是通过下载Genbank上登录的相关病毒基因组序列,利用BLAST比较获得同一种病毒不同分离株的共有保守序列,按探针Tm值为73℃±5℃、单碱基重复数不能超过8个碱基和潜在发夹结构所在的序列长度不得大于9个碱基的原则用Array Designer 4.0软件设计探针,探针长度为56mer。
表1中的其它病毒的探针参考(Wang D,Coscoy L,Zylberberg M,et al.Microarray-baseddetection and genotyping of viral pathogens[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24):15687-15692)和(Chou CC,Lee TT,Chen CH,et al.Design of microarray probes for virusidentification and detection of emerging viruses at the genus level[J].BMC Bioinformatics,2006,7:232)所设计的探针序列,根据Tm值及探针特异性,修改为56mer的种特异性探针。在寡核苷酸探针的设计上,探针越长,芯片的敏感性越好,但特异性会降低。本发明采用56mer的探针,即保证探针有足够的长度能保证芯片的敏感性,另一方面也避免了因探针长度过长导致特异性显著下降的问题,较好的平衡了芯片的敏感性与特异性。
为了保证检测探针的特异性,在应用标准探针设计软件进行探针设计之后,首先应用生物信息学手段和其它物种的基因组进行同源性比对筛查,然后再经过实验验证,从理论及实验上降低了探针的GC含量、二级结构和探针点的空间结构对特异性的影响。本发明将获取的探针用生物信息学方法验证,剔除特异性差的探针,保证每条寡核苷酸探针与其它病毒基因组的同源性小于50%。
表1芯片检测的病毒种类
单个病毒1型、2型、3型、4型都属于单个病毒,为单个病毒的4个基因型。汉坦病毒(lee型)、汉坦病毒(Puumala型)、汉坦病毒(汉城型)、汉坦病毒(汉滩型)都属于汉坦病毒,为汉坦病毒的不同基因型。H5N1亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,为流感病毒A型的一个亚型。
2)寡核苷酸探针的设计结果
共设计150条如序列1-序列150所示的病毒oligo探针及与该150条互补的序列探针,1条如序列151所示的杂交系统阳性对照探针P。所有探针长度均为56mer,Tm值为73℃±5℃。其中Ebola、Marburg病毒各2条探针,禽流感病毒(HSN1)6条探针,汉坦病毒(HV-LEE、HV-PU、HV-SE和HV-HA)共10条探针,其它每种病毒设计各5条探针。每条oligo探针经过blast比对,与其它病毒基因组的同源性小于50%。具体设计如表2所示:
表2探针序列表
2、人兽共患病病毒基因芯片的制备
寡核苷酸探针纯化干燥后用3X标准柠檬酸盐溶液(standard saline citrate,SSC)溶解,使其终浓度为40umol/L。探针浓度是影响芯片敏感性的一个主要因素,在试验中发现,当探针浓度小于20umol/L时,芯片的敏感性会显著降低。然后用Spotarray 24芯片点样仪进行点样,使用醛基化处理的玻片(CSS-100Silylated),在基因芯片的点样制备中,背景荧光很大程度上取决于点样参数、玻片表面化学性质、点样缓冲液成分及后处理程序。本发明采用美国CEL Associates公司标准化生产的同一批次醛基化基片,消除了基片存在的批间差异,也保证了探针能有效地结合到基片上。每条探针重复点样3次,所有探针点制成2X4的矩阵,每种病毒的不同探针分散点样在8个矩阵中,这样得到点样后的芯片,点样示意图如图2所示,图2中上方从左至右依次为区域1、区域2、区域2和区域4;图2中下方从左至右依次为区域5、区域6、区域7和区域8。具体的点样如表3-表10所示,表中的P为阳性对照、N为阴性对照3×SSC溶液、E为空点(empty、未点任何样品)、数字表示序列表中相对应的序列、R数字表示序列表中该数字对应的序列的反向互补序列。如:41表示序列表中序列41;R41表示序列表中序列41的反向互补序列。
表3.区域1的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | 41 | 41 | 41 |
56 | 56 | 56 | 71 | 71 | 71 | 81 | 81 | 81 | 91 | 91 | 91 |
106 | 106 | 106 | 116 | 116 | 116 | 131 | 131 | 131 | 141 | 141 | 141 |
6 | 6 | 6 | 16 | 16 | 16 | 31 | 31 | 31 | 42 | 42 | 42 |
57 | 57 | 57 | 72 | 72 | 72 | 82 | 82 | 82 | 96 | 96 | 96 |
107 | 107 | 107 | 117 | 117 | 117 | 132 | 132 | 132 | 142 | 142 | 142 |
7 | 7 | 7 | 17 | 17 | 17 | 32 | 32 | 32 | 43 | 43 | 43 |
58 | 58 | 58 | 73 | 73 | 73 | 83 | 83 | 83 | 97 | 97 | 97 |
108 | 108 | 108 | 121 | 121 | 121 | 133 | 133 | 133 | 146 | 146 | 146 |
8 | 8 | 8 | 21 | 21 | 21 | 33 | 33 | 33 | 47 | 47 | 47 |
61 | 61 | 61 | E | E | E | N | N | N | P | P | P |
表4.区域2的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | 44 | 44 | 44 |
59 | 59 | 59 | 74 | 74 | 74 | 84 | 84 | 84 | 92 | 92 | 92 |
109 | 109 | 109 | 118 | 118 | 118 | 134 | 134 | 134 | 143 | 143 | 143 |
9 | 9 | 9 | 18 | 18 | 18 | 34 | 34 | 34 | 44 | 44 | 44 |
60 | 60 | 60 | 75 | 75 | 75 | 85 | 85 | 85 | 98 | 98 | 98 |
110 | 110 | 110 | 119 | 119 | 119 | 135 | 135 | 135 | 144 | 144 | 144 |
10 | 10 | 10 | 19 | 19 | 19 | 35 | 35 | 35 | 45 | 45 | 45 |
R56 | R56 | R56 | R71 | R71 | R71 | R81 | R81 | R81 | 99 | 99 | 99 |
R108 | R108 | R108 | 122 | 122 | 122 | R131 | R131 | R131 | 147 | 147 | 147 |
R6 | R6 | R6 | 22 | 22 | 22 | R31 | R31 | R31 | 48 | 48 | 48 |
62 | 62 | 62 | E | E | E | N | N | N | P | P | P |
表5.区域3的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | 38 | 38 | 38 |
R50 | R50 | R50 | R64 | R64 | R64 | 77 | 77 | 77 | R87 | R87 | R87 |
101 | 101 | 101 | 115 | 115 | 115 | 127 | 127 | 127 | 138 | 138 | 138 |
1 | 1 | 1 | 15 | 15 | 15 | R24 | R24 | R24 | 39 | 39 | 39 |
52 | 52 | 52 | 66 | 66 | 66 | 78 | 78 | 78 | R88 | R88 | R88 |
102 | 102 | 102 | R111 | R111 | R111 | 128 | 128 | 128 | 139 | 139 | 139 |
2 | 2 | 2 | R11 | R11 | R11 | 26 | 26 | 26 | 40 | 40 | 40 |
53 | 53 | 53 | 67 | 67 | 67 | 80 | 80 | 80 | 93 | 93 | 93 |
103 | 103 | 103 | R112 | R112 | R112 | R123 | R123 | R123 | R139 | R139 | R139 |
3 | 3 | 3 | R12 | R12 | R12 | 27 | 27 | 27 | R36 | R36 | R36 |
54 | 54 | 54 | E | E | E | N | N | N | P | P | P |
表6.区域4的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | R37 | R37 | R37 |
R51 | R51 | R51 | R65 | R65 | R65 | R76 | R76 | R76 | R89 | R89 | R89 |
104 | 104 | 104 | R113 | R113 | R113 | 129 | 129 | 129 | 140 | 140 | 140 |
4 | 4 | 4 | R13 | R13 | R13 | R25 | R25 | R25 | R38 | R38 | R38 |
R52 | R52 | R52 | 68 | 68 | 68 | R77 | R77 | R77 | R90 | R90 | R90 |
105 | 105 | 105 | R114 | R114 | R114 | 130 | 130 | 130 | R136 | R136 | R136 |
R1 | R1 | R1 | R14 | R14 | R14 | 28 | 28 | 28 | R39 | R39 | R39 |
R53 | R53 | R53 | 69 | 69 | 69 | R78 | R78 | R78 | 94 | 94 | 94 |
R101 | R101 | R101 | R115 | R115 | R115 | R124 | R124 | R124 | R137 | R137 | R137 |
5 | 5 | 5 | R15 | R15 | R15 | 29 | 29 | 29 | R40 | R40 | R40 |
55 | 55 | 55 | E | E | E | N | N | N | P | P | P |
表7.区域5的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | 148 | 148 | 148 |
R7 | R7 | R7 | 23 | 23 | 23 | R32 | R32 | R32 | 49 | 49 | 49 |
63 | 63 | 63 | R72 | R72 | R72 | 86 | 86 | 86 | 100 | 100 | 100 |
R106 | R106 | R106 | R121 | R121 | R121 | R132 | R132 | R132 | 149 | 149 | 149 |
11 | 11 | 11 | 24 | 24 | 24 | R33 | R33 | R33 | 50 | 50 | 50 |
64 | 64 | 64 | R73 | R73 | R73 | 87 | 87 | 87 | R96 | R96 | R96 |
111 | 111 | 111 | 123 | 123 | 123 | R133 | R133 | R133 | 150 | 150 | 150 |
12 | 12 | 12 | 25 | 25 | 25 | 36 | 36 | 38 | 51 | 51 | 51 |
65 | 65 | 65 | 76 | 76 | 76 | 88 | 88 | 88 | R97 | R97 | R97 |
112 | 112 | 112 | R126 | R126 | R126 | 136 | 136 | 136 | R146 | R146 | R146 |
E | E | E | N | N | N | N | N | N | P | P | P |
表8.区域6的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | R147 | R147 | R147 |
R8 | R8 | R8 | R21 | R21 | R21 | R34 | R34 | R34 | R47 | R47 | R47 |
R61 | R61 | R61 | R74 | R74 | R74 | 89 | 89 | 89 | R98 | R98 | R98 |
R107 | R107 | R107 | R122 | R122 | R122 | R134 | R134 | R134 | R148 | R148 | R148 |
13 | 13 | 13 | R22 | R22 | R22 | R35 | R35 | R35 | R48 | R48 | R48 |
R62 | R62 | R62 | R75 | R75 | R75 | 90 | 90 | 90 | R99 | R99 | R99 |
113 | 113 | 113 | 124 | 124 | 124 | R135 | R135 | R135 | R149 | R149 | R149 |
14 | 14 | 14 | R23 | R23 | R23 | 37 | 37 | 37 | R49 | R49 | R49 |
R63 | R63 | R63 | 79 | 79 | 79 | R86 | R86 | R86 | R100 | R100 | R100 |
114 | 114 | 114 | 126 | 126 | 126 | 137 | 137 | 137 | R150 | R150 | R150 |
E | E | E | N | N | N | N | N | N | P | P | P |
表9.区域7的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | R138 | R138 | R138 |
R2 | R2 | R2 | 20 | 20 | 20 | 30 | 30 | 30 | R41 | R41 | R41 |
R54 | R54 | R54 | 70 | 70 | 70 | R79 | R79 | R79 | 95 | 95 | 95 |
R102 | R102 | R102 | 120 | 120 | 120 | R125 | R125 | R125 | 145 | 145 | 145 |
R3 | R3 | R3 | R16 | R16 | R16 | R26 | R26 | R26 | R42 | R42 | R42 |
R57 | R57 | R57 | R69 | R69 | R69 | R82 | R82 | R82 | R91 | R91 | R91 |
R103 | R103 | R103 | R116 | R116 | R116 | R126 | R126 | R126 | R141 | R141 | R141 |
R9 | R9 | R9 | R17 | R17 | R17 | R27 | R27 | R27 | R43 | R43 | R43 |
R58 | R58 | R58 | R66 | R66 | R66 | R83 | R83 | R83 | R92 | R92 | R92 |
R109 | R109 | R109 | R117 | R117 | R117 | R128 | R128 | R128 | R142 | R142 | R142 |
E | E | E | N | N | N | N | N | N | P | P | P |
表10.区域8的点样
P | P | P | N | N | N | E | E | E | R140 | R140 | R140 |
R4 | R4 | R4 | R18 | R18 | R18 | R28 | R28 | R28 | R44 | R44 | R44 |
R55 | R55 | R55 | R67 | R67 | R67 | R80 | R80 | R80 | R93 | R93 | R93 |
R104 | R104 | R104 | R118 | R118 | R118 | R127 | R127 | R127 | R143 | R143 | R143 |
R5 | R5 | R5 | R19 | R19 | R19 | R29 | R29 | R29 | R45 | R45 | R45 |
R59 | R59 | R59 | R68 | R68 | R68 | R84 | R84 | R84 | R94 | R94 | R94 |
R105 | R105 | R105 | R119 | R119 | R119 | R129 | R129 | R129 | R144 | R144 | R144 |
R10 | R10 | R10 | R20 | R20 | R20 | R30 | R30 | R30 | R46 | R46 | R46 |
R60 | R60 | R60 | R70 | R70 | R70 | R85 | R85 | R85 | R95 | R95 | R95 |
R110 | R110 | R110 | R120 | R120 | R120 | R130 | R130 | R130 | R145 | R145 | R145 |
E | E | E | N | N | N | N | N | N | P | P | P |
二、待检测样品的制备
1、人兽共患病病毒核酸的提取
以JEV病毒(本实验室保存,杨银辉,朱晓光,张永国,康晓平等。利用基因芯片技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志,2007,30(12):1360-1363)作为待检测样品,从病毒感染的C6/36细胞(购自ATCC,保藏号是ATCC CRL 1660)培养上清中提取病毒核酸。其中培养条件是28℃,培养基是10%胎牛血清+DMEM培养基。病毒RNA用QIAGEN RNA提取试剂盒提取,操作步骤见说明书。
2、随机PCR扩增
病毒RNA用锚定随机引物进行反转录获得eDNA,反转录随机引物序列为5’-GTT TCCCAG TCA CGA TCN NNN NNN NN-3’,其中N=A或G或C或T。随机PCR扩增采用随机引物5’-GTT TCC CAG TCA CGA TC-3’,扩增条件为95℃变性5min;然后94℃30s,40℃30s,50℃30s,72℃60s循环;再72℃延伸7min,4℃保存。首先50ulPCR体系扩增40个循环,接着再扩增20循环并在扩增的过程中掺人aa-dUTP对PCR产物进行标记(Wang D,Coscoy L,Zylberberg M,et al.Microarray-based detection and genotyping of viralpathogens[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24):15687-15692)。
用锚定随机引物方法扩增JEV核酸的结果见图1。条带大小主要范围在250-1000bp,条带大小合适,可以与芯片直接杂交。
用下述的上下游引物扩增HCV病毒中的一段非编码区基因,并在扩增过程中掺入aa-dUTP以用于对PCR产物进行标记,扩出的基因作为阳性对照基因:
上游引物(HCVFP):5’-AGTGTCGTGCAGCCTCCAG-3’;
下游引物(HCVRP):5’-GCCTTTCGCGACCCAACACTACTC-3’。
3、荧光标记
aa-dUTP标记产物用DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化的病毒基因扩增产物和阳性对照基因混合,然后与Cy5荧光染料进行耦联,即在室温下避光反应1h,间隔15min振荡混匀1次,然后加入4.5μ1羟胺(4mol/L),避光反应15min。使反应体系中未与DNA结合的染料淬灭。
用Cy3标记未感染病毒的细胞基因组作为阴性对照。
三、杂交反应优化
为了选择适合不同探针的均一杂交条件,增强特异探针的敏感性、减少非特异杂交并降低信噪比,本实验从点样后封闭、杂交温度、杂交时间、杂交液中甲酰胺浓度几个方面对芯片杂交条件进行优化。
1、封闭效果实验
1)预杂交
将步骤一中得到的点制好的芯片过夜干燥,芯片杂交前置于37℃湿盒,然后用0.25g/100ml的NaBH4溶液封闭或不封闭。在正式杂交前先在预杂交液(5×SSC,0.1%SDS,0.1%BSA)中51℃预杂交1h。
2)杂交
在荧光染料标记好的样品核酸、阳性对照基因及阴性对照核酸加入杂交液(40%(体积百分比)去离子甲酰胺,5×SSC,0.1%SDS,0.5μg/μl鲑鱼精DNA),置PCR仪中95℃变性5min,然后置杂交盒中42℃下杂交2h。
3)洗涤
杂交后的芯片分别于洗液I(2×SSC,0.1%SDS)、洗液II(0.2×SSC,0.1%SDS)、洗液III(0.2×SSC)中各洗涤5min,最后在95%乙醇中浸提10s,800rpm离心甩干,进行杂交结果的扫描及分析,Cy3荧光染料用532nm波长扫描,Cy5荧光染料用635nm波长扫描(Wang D,Coscoy L,Zylberberg M,et al.Microarray-based detection and genotyping of viralpathogens[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24):15687-15692)。
结果处理分析:
判断标准:特异信号均值与非特异信号均值比值最大,特异信号点数≥28(共30)且非特异信号点数≤30,此条件下为最优条件。
不同杂交条件下的扫描及分析结果如图所示:从图3A与图4A的对比中可以看出,芯片点样后用0.25g/100ml的NaBH4溶液进行封闭,杂交点比较均匀,较好维持了样点的形状,使其减少了样点出现拖尾或“慧星尾”现象的机率,而未封闭的样点则有拖尾或“慧星尾”现象,显著降低信噪比,减少非特异杂交。图3B中显示,特异信号点数为21,非特异信号点数为29;图4B中,特异信号点数为30,非特异信号点数为17。说明采用0.25g/100ml NaBH4溶液进行封闭显著提高了芯片检测效果。
2、杂交时间优化
在步骤1的基础上进一步进行杂交时间的优化。步骤2中采用0.25g/100ml的NaBH4溶液进行封闭,杂交时间分别为0.5h、1h、2h、4h、6h,其余步骤与步骤1相同。
在0.5h、1h、2h、4h、6h杂交后的芯片扫面结果如图5至图9所示,将图5-图9中的特异信号强度、非特异信号强度、特异信号点数、非特异信号点数统计后,分析比较如图10所示,杂交时间2h,非特异信号点数最少,特异性信号强度仍保持30000以上,结果最为理想,因此杂交时间2h为最合适的杂交时间。
3、杂交温度的优化
在步骤1和2的基础上进一步进行杂交温度的优化。步骤3中杂交时间为2h,杂交温度分别为42℃、48℃、51℃、54℃、58℃、61℃,其余步骤与步骤2相同。
检测结果如图7以及图11-图15所示,将这些图中的特异信号强度、非特异信号强度、特异信号点数、非特异信号点数统计后,分析比较结果如图16所示,在42℃条件下,检测的JEV探针信号强度高,但非特异性信号值也出现得多且很强(如DEN等),杂交结果不够特异,不理想。随着温度的升高,特异信号强度逐渐减弱,而数量基本维持不变,但非特异的信号强度有较大幅度减弱,出现的非特异杂交信号的数量也减少。在51℃条件下,特异性信号强度仍保持在10000以上,而非特异的信号强度降至5000以下,且非特异的信号数量≤20。当温度超过54℃,特异信号强度过低,也不利于结果判断。由此可见,杂交温度设为51℃,可取得更为特异的杂交效果。
4、杂交液中甲酰胺浓度优化
在步骤1、2和3的基础上进一步对杂交液中甲酰胺浓度进行优化,步骤4中杂交温度是51℃,杂交液中甲酰胺浓度分别为25%、33%、40%、50%和60%(体积百分比),其余步骤与步骤3相同。
杂交液中对杂交效果能产生重要影响的主要是甲酰胺的浓度,所以本发明采用不同甲酰胺浓度的杂交液进行杂交检测,以比较杂交效果。
检测结果如图17-图21所示,将这些图中的特异信号强度、非特异信号强度、特异信号点数、非特异信号点数统计后,分析结果如图22所示,随着甲酰胺浓度的增高,非特异的信号数量和强度逐渐减少,检测的特异性逐渐增强;浓度达到50%,特异性信号强度保持在40000以上,而非特异的信号强度和数量与60%甲酰胺浓度相当,已达到很低的水平;浓度达到60%,特异性的信号强度也有大幅降低,影响结果判断,所以50%的甲酰胺浓度是最合适的杂交浓度。
杂交动力学的最优条件是:芯片点样后用0.25g/100ml的NaBH4溶液进行封闭芯片在51℃,2h,在含50%(体积百分比)甲酰胺杂交液中杂交。
此芯片为检测用基因芯片,要保证敏感性、特异性。首先用比较宽松的杂交条件,在保证能出杂交信号的前提下、优化条件,增加特异性。接着在有一定特异性及敏感性的基础上使检测时间不要太多,最后,再对敏感性及特异性优化,使其平衡,满足检测要求,用此方法节省开支,实用性强。
实施例2.基因芯片在上述最优条件下检测细胞培养的病毒以及检测模拟临床标本
一、基因芯片检测细胞培养的病毒
用基因芯片分别检测细胞(培养用的细胞和培养方法与实施例1的步骤二相同)培养的CHIK(施华芳,张海林,自登云,李兆祥等,云南首次从患者体内分离到基孔肯亚病毒,中国人兽共患病杂志,1990年第一期)、JEV(本实验室保存,杨银辉,朱晓光,张永国,康晓平等。利用基因芯片技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志,2007,30(12):1360-1363)、SIN(熊鸿燕,刘育京等,短波紫外线与交联淀粉碘对血浆中辛德比斯病毒灭活的研究,中国消毒学杂志,1998年第四期)和RV(本实验室保存,刘忠钰,袁慧君,朱武洋;,姜涛,陈水平,等;狂犬病毒载体的构建与鉴定,中国人兽共患病学报2008年11期2008,24(11)。首先分别提取各病毒核酸RNA,用反转录随机引物5’-GTT TCC CAG TCA CGA TCN NNN NNN NN-3’,其中N是A、T、C或G,进行反转录获得cDNA,然后用引物5’-GTT TCC CAG TCA CGA TC-3’扩增CHIK、JEV、SIN、RV的核酸,然后与实施例1步骤二得到的阳性对照基因混合,用荧光素染料对扩出的基因进行标记,并与芯片在最优条件下杂交,验证基因芯片的检测特异性。
SIN病毒杂交分析结果如图23(A:芯片扫描图、B:结果分析图、C:杂交分析结果,C图是用Treeview软件对B图的数据进行分析得到的)所示,探针具有很强的特异信号,非特异杂交较少,说明得到了正确的杂交结果。
RV病毒杂交分析结果如图24所示,探针具有很强的特异信号,非特异杂交较少,说明得到了正确的杂交结果;JEV病毒杂交分析结果如图25所示,探针具有很强的特异信号,非特异杂交较少,说明得到了正确的杂交结果;CHIK病毒杂交分析结果如图26所示,探针具有很强的特异信号,非特异杂交较少,说明得到了正确的杂交结果。
二、基因芯片检测检测模拟临床标本
C6/36细胞培养的JEV 200ul与BALB/c小鼠肺组织混合后,制备成模拟临床标本,然后加入300ul生理盐水研磨,然后将混合物4000rpm离心5分钟,取上清液提取病毒RNA,用实施例2步骤一的方法扩增JEV的核酸,然后用荧光素染料进行标记,并与芯片在最优杂交条件下杂交,验证基因芯片的检测特异性。
杂交结果如图27所示,特异信号强,非特异杂交较少,由分析结果可以判定为JEV。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>一种检测人畜共患病病毒的基因芯片及其应用
<130>CGGNARL92564
<160>2
<210>1
<211>56
<212>DNA
<213>1
<400>1
caccatcgcc cataaagttg agttcaaacc tgtaggaaga gagaagtacc gccatc 56
<210>2
<211>56
<212>DNA
<213>2
<400>2
tacgcgacca ggatcaacta agtattgtac tgaataacat ctatcaaggt tctacc 56
Claims (8)
1.一种基因芯片,包括病毒检测探针,其特征在于:所述病毒检测探针由以下的探针组成:
核苷酸序列分别是表2中序列1-150的150个病毒检测探针和核苷酸序列分别是序列1-150的反向互补序列的150个病毒检测探针。
2.根据权利要求1所述的基因芯片,其特征在于:所述基因芯片上还固定有1条核苷酸序列如表2中序列151所示的阳性对照探针。
3.根据权利要求1或2所述的基因芯片,其特征在于:所述基因芯片由以下探针组成:核苷酸序列分别是表2中序列1-150的150个病毒检测探针、核苷酸序列分别是序列1-150的反向互补序列的150个病毒检测探针和1条核苷酸序列如表2中序列151所示的阳性对照探针。
4.权利要求1至3中任一所述的基因芯片与待测生物样品进行杂交的方法,包括以下步骤:
将待测生物样品与权利要求1-3任一所述的基因芯片杂交,杂交条件是:杂交液中的去离子甲酰胺浓度为25-60%(体积百分比),杂交的温度是42-61℃,杂交的时间0.5-6小时。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述杂交条件是如下1)或2)或3)或4):
1)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为40-60%(体积百分比),所述杂交的温度为51-61℃,所述杂交的时间为1-4小时;
2)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为40-50%(体积百分比),所述杂交的温度为51-54℃,所述杂交的时间为1-2小时;
3)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为50-60%(体积百分比),所述杂交的温度为58-61℃,所述杂交的时间为2-4小时;
4)杂交液中的去离子甲酰胺浓度为50%(体积百分比),所述杂交的温度为51℃,所述杂交的时间为2小时。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述基因芯片在杂交前用浓度为0.25g/100ml的NaBH4进行封闭。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法,其特征在于:所述待测生物样品是基孔肯亚病毒、日本乙脑病毒、狂犬病毒或辛德毕斯病毒的核酸的扩增产物。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述扩增产物是PCR扩增产物。
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