CN106591495A - 一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法 - Google Patents

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CN106591495A CN201710030383.0A CN201710030383A CN106591495A CN 106591495 A CN106591495 A CN 106591495A CN 201710030383 A CN201710030383 A CN 201710030383A CN 106591495 A CN106591495 A CN 106591495A
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陈枝楠
谢晋雄
张婷
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Abstract

本发明提供了一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法，包括设计ND病毒、H9、H5 AIV用探针Probe、上下游引物P1、P2以及探针反向互补序列(RC‑Probe)，并将所述探针与荧光编码微球偶联；提取样品RNA用RT‑PCR方法扩增；将与病毒探针偶联的荧光编码微球，与RT‑PCR产物进行杂交，通过比较待测样品的荧光强度中位值与空白对照荧光强度中位值，确定待测样品中是否感染计新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和/或H5亚型禽流感病毒。本发明的方法灵敏度高，多毒株PLex快速高通量检测方法检测H5基因的检测灵敏度为10‑5，相当于3000ELD50；所建方法快速，禽流感分型检测可在5h内完成；所建方法特异性强，通过两个引物和一个探针来确保各个毒株的特异性，各个毒株之间交叉反应性低，该方法与其他病原体之间也无非特异性反应。

Description

一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法。
背景技术
新城疫(ND)、禽流感(AI)是家禽的两大重要病毒性传染病，严重影响养禽业的健康发展。新城疫(newcastle disease,ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。新城疫病毒为副黏病毒科副黏病毒属(Avulavirus)的禽副黏病毒I型(APMV一1)。病毒存在于病禽的所有组织器官、体液、分泌物和排泄中，以脑、脾、肺含毒量最高，以骨髓含毒时间最长。在低温条件下抵抗力强，在4℃可存活1～2年，一20℃时能存活10年以上；真空冻干病毒在30℃可保存30天，15℃可保存230天；不同毒株对热的稳定性有较大的差异。禽流感是危害家禽生产最重要的传染病之一，H5等亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)致病力强、传播迅速，可造成家禽大规模死亡；其感染人类甚至造成死亡已引起世界各国的高度重视。低致病性禽流感病毒(LPAIV)也会因降低家禽生产力而给养禽业带来重大损失。由于禽流感亚型众多临诊表现及病理变化多样，易与其它疾病混淆，且不同亚型禽流感的危害也不同，
禽流感和新城疫作为我国规定的一类动物传染病和OIE(国际动物卫生组织)规定的A类传染病，新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒为我国养禽业常见多发病毒亚型，如何预防治疗新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒三种毒株引起的禽流感和新城疫疾病、以及检验检疫上述三种毒株的感染的成为我国养禽业重要课题。但由于检测成本高、周期长，对所述三种毒株的检测成为制约我国养禽业的技术瓶颈。特别是，建立能够特异性强、灵敏度和准确度高的同时诊断新城疫和禽流感的方法，成为迫在眉睫的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法，包括以下步骤：
1)设计新城疫病毒(ND病毒)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)与H5亚型禽流感病毒(H5 AIV)的检测用探针Probe、上下游引物P1、P2以及探针反向互补序列(RC-Probe)，并将所述探针与荧光编码微球偶联；
2)提取待测样品中的新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的RNA，使用RT-PCR方法扩增；
3)将步骤1)获得的所述与病毒探针偶联的荧光编码微球，与步骤2)的所述RT-PCR产物进行杂交，通过比较待测样品的荧光强度中位值与空白对照荧光强度中位值，确定待测样品中是否感染计新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和/或H5亚型禽流感病毒。
优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，所述步骤1)的新城疫病毒的检测用探针为根据新城疫病毒外壳蛋白基因设计的寡核苷酸、所述H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的检测用探针为根据H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的HA基因设计的寡核苷酸。更优选地，所述探针5’端的C6标记氨基所述探针的所有下游引物5’端标记生物素，所述探针的反向互补序列5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。
更优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，所述探针为干粉状；更优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，所述探针为液体；最优选地，所述探针的溶液为无tris或无叠氮钠或无其他含有氨基成份。
最优选地，探针及反向互补序列、引物的序列如下：AIV H5(HA基因)：195bp(1526—1720)，TM＝69℃:
P1(SEQ ID NO1)：5’-GGAACG TATGACTACCCGCAGT-3’，
P2(SEQ ID NO2)：5’-TCTGCATTGTAACGACCCATTG-3’，
Probe(SEQ ID NO3)：5’-TGGCG AGTTCCCTAGCACTGGCA-3’，
RC-Probe(SEQ ID NO4)：5’-TG CCAGTGCTAGGGA ACTCGCCA-3’。
AIV H9(HA基因)：201bp(1437-1637)，TM＝69℃，
P1(SEQ ID NO5)：5’-AGTGGAAGA TGGG AAAGG ATGTT-3’，
P2(SEQ ID NO6)：5’-AGAGAT GAGGCGACAG TCGAA-3’，
Probe(SEQ ID NO 7)：5’-TGCAT GGAGACAAT TCGGAACGG G-3’，
RC-Probe(SEQ ID NO 8)：5’-CCCGTTCCGAATTGTCTCCATGC A-3’。
ND(NP基因)：201bp(198-398)，TM＝68℃，
P1(SEQ ID NO 9)：5’-CCTCGTC TCAGACAGGGTC AA-3’，
P2(SEQ ID NO 10)：5’-CGGCACCTATAAAGCG TT TTTG-3’，
Probe(SEQ ID NO 11)：5’-TCCTC TTGGCGATTCC ATCC GC-3’，
RC-Probe(SEQ ID NO 12)：5’-GCGGAT GGA ATCGCCAAGAAGA-3’。
所有下游引物P2 5’端标记生物素，探针Probe 5’ C6标记氨基，探针反向互补序列RC-Probe 5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。
优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，所述步骤2)RT-PCR方法中反应体系为：RT-PCR缓冲液10μL、dNTP(每种10mM)2μL、、RNase抑制剂(40U/μL)0.25μL、DNA聚合酶2μL、病毒RNA各2μL，引物1(2μM～8μM)0.75μL、引物2(2μM～8μM)0.75μL、加入无RNA酶超纯水至50μL；其中所述病毒RNA为提取的所述样品新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的RNA。
优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，所述步骤3)中所述与病毒探针偶联的荧光编码微球为按照Luminex推荐的荧光编码微球顺序，荧光编码微球之间荧光信号误读率最低的8个荧光编码微球。
更优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，所述步骤3)中所述与病毒探针偶联的荧光编码微球为与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒探针偶联效率最高的三种荧光编码微球；更优选地，所述步骤3)中与病毒探针偶联的荧光编码微球为，将所述三种与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒探针偶联效率最高的荧光编码微球混合稀释后，获得的荧光编码微球混合液；其中所述荧光编码微球混合液的荧光编码微球含量为200个荧光编码微球/种/μL。
更优选地，在本发明的液相芯片高通量检测方法中，在所述步骤3)中的检测方法为：
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒的任意一种RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测单毒株RT-PCR产物的单毒株PLex检测体系；
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒的任意两种病毒的RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测双毒株RT-PCR产物的双毒株PLex检测体系；
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒的RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测三毒株RT-PCR产物的三毒株PLex检测体系。
由上述技术方案以及后续实施例所证明的，本发明将RT-PCR检测方法与LiquiChip检测方法结合，建立了H5 AIV、H9 AIV和NDV三毒株PLex快速高通量检测方法，本发明的方法至少有以下优点：
1、所建方法灵敏度高，多毒株PLex快速高通量检测方法检测H5基因的检测灵敏度为10-5，相当于3000ELD50；所建方法快速，禽流感分型检测可在5h内完成。
2、所建方法特异性强，通过两个引物和一个探针来确保各个毒株的特异性，各个毒株之间交叉反应性低，该方法与其他病原体之间也无非特异性反应。
3、搭建了H5 AIV、H9 AIV和NDV三个毒株全新快速高通量检测平台，为其他同类病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中所示的单亚型RT-PCR检测结果；
图2为本发明的一个实施例中所示的三种病毒RT-PCR检测结果。
具体实施方式
在本发明的实施例中详述了一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法，包括以下步骤：
1)设计新城疫病毒(ND病毒)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)与H5亚型禽流感病毒(H5 AIV)的检测用探针Probe、上下游引物P1、P2以及反向互补序列(RC-Probe)，并将所述探针与荧光编码微球偶联；
2)提取待测样品中的新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的RNA，使用RT-PCR方法扩增；
3)将步骤1)获得的所述与病毒探针偶联的荧光编码微球，与步骤2)的所述RT-PCR产物进行杂交，通过比较待测样品的荧光强度中位值与空白对照荧光强度中位值，确定待测样品中是否感染计新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和/或H5亚型禽流感病毒。
在本发明的另一个实施例中，所述步骤1)的新城疫病毒的检测用探针为根据新城疫病毒外壳蛋白基因设计的寡核苷酸、所述H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的检测用探针为根据H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的HA基因设计的寡核苷酸。
根据本发明的方法，可以根据不同地区不同宿主携带的新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒为目标，选取H5、H9亚型流感的HA基因以及新城疫的NP基因中保守寡核酸序列设计相应探针及引物。
在本发明的一个实施例中，选取以亚洲地区为主、不同宿主但以禽类尤其是鸡鹅为主的H5、H9亚型流感的HA基因以及新城疫的NP基因几百条进行序列在线排列分析。然后，可以使用如用DNA Star(V.5.06)中的Seqman和Megalign再次进行序列排序分析。找出基因中最保守的23-24个寡核苷酸作为液相芯片检测探针，在探针的5’端标记-NH2。分别在探针的上下游设计特异性的扩增引物。
在本发明的另一个实施例中，所述探针5’端的C6标记氨基所述探针的所有下游引物5’端标记生物素，所述探针的反向互补序列5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。
在本发明的另一个实施例中，所述探针为干粉状；在本发明的再一个实施例中，所述探针为液体；在本发明的又一个实施例中，所述探针的溶液为无tris或无叠氮钠或无其他含有氨基成份。
在本发明的另一个实施例中，选取的寡核苷酸以及设计的寡核苷酸的探针及反向互补序列、引物的序列如下：
AIV H5(HA基因)寡核苷酸：195bp(1526—1720)，TM＝69℃，探针及反向互补序列、引物的序列为：P1：5’-GGAACG TATGACTACCCGCAGT-3’，P2：5’-TCTGCAT TGTAACGACCCATTG-3’，Pro be：5’-TGGCG AGTTCCCTAGCACTGGCA-3’，RC-Probe：5’-TG CCAGTGCTAGGGAACTCGCCA-3’。
AIV H9(HA基因)寡核苷酸：201bp(1437-1637)，TM＝69℃，探针及反向互补序列、引物的序列为：P1：5’-AGTGGAAGA TGGG AAAGG ATGTT-3’，P2：5’-AGAGAT GAGGCGACAGTCGAA-3’，Probe：5’-TGCAT GGAGACAAT TCGGAACGG G-3’，RC-Probe：5’-CCCGTTCCGAATTGTCTCCATGC A-3’。
ND(NP基因)寡核苷酸：201bp(198-398)，TM＝68℃，探针及反向互补序列、引物的序列为为P1：5’-CCTCGTC TCAGACAGGGTC AA-3’，P2：5’-CGGCACCTATAAAGCG TT TTTG-3’，Probe：5’-TCCTC TTGGCGATTCC ATCC GC-3’，RC-Probe：5’-GCGGAT GGA ATCGCCAAGAAGA-3’。
其中，所有下游引物P2 5’端标记生物素，探针Probe 5’C6标记氨基，探针反向互补序列RC-Probe 5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。
在本发明的另一个实施例中，所述步骤2)RT-PCR方法中反应体系为：RT-PCR缓冲液10μL、dNTP(每种10mM)2μL、、RNase抑制剂(40U/μL)0.25μL、DNA聚合酶2μL、病毒RNA各2μL，引物1(2μM～8μM)0.75μL、引物2(2μM～8μM)0.75μL加入无RNA酶超纯水至50μL；其中所述病毒RNA为提取的所述样品新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的RNA。
在本发明的另一个实施例中，所述步骤3)中所述与病毒探针偶联的荧光编码微球为按照Luminex推荐的荧光编码微球顺序，荧光编码微球之间荧光信号误读率最低的8个荧光编码微球。
在本发明的另一个实施例中，所述步骤3)中所述与病毒探针偶联的荧光编码微球为与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒探针偶联效率最高的三种荧光编码微球；更优选地，所述步骤3)中与病毒探针偶联的荧光编码微球为，将所述三种与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒探针偶联效率最高的荧光编码微球混合稀释后，获得的荧光编码微球混合液；其中所述荧光编码微球混合液的荧光编码微球含量为200个荧光编码微球/种/μL。
在本发明的另一个实施例中，在所述步骤3)中的检测方法为：
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒的任意一种RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测单毒株RT-PCR产物的单毒株PLex检测体系；
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒的任意两种病毒的RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测双毒株RT-PCR产物的双毒株PLex检测体系；
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒的RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测三毒株RT-PCR产物的三毒株PLex检测体系。
本发明实施例中所涉及仪器为小型全自动核酸抽提工作站(BioRobotEZ1Workstation)购自Qiagen公司、高速台式冷冻离心机(Allegra 64R centrifuge)购自Beckman公司、梯度核酸扩增仪(PTC-200)购自DNA Engine公司、梯度核酸扩增仪(T-Gradient 796)购自Biometra公司、液相芯片检测工作站(Liquichip 200)购自Qiagen公司、凝胶成像分析仪(GAS7001X)购自UVItech公司；其他未特别说明的仪器设备均为现有技术中常用仪器或设备。
本发明实施例中所涉及试剂为TaKaRa One Step RNA PCR Kit、TaKaRa DNAFragment purification kit(2.0)购自TaKaRa公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit、QiagenOneStep RT-PCR Kit、EZ1 Virus mini Kit2.0、Liquichip calibration bead mix、Liquichip control bead Kit购自Qiagen公司；EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodimide hydrochloride)购自Pierce公司；Streptavidin R-PhycoerythrinLumi Grade购自Roche Applied Science公司；0.5M MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid hydrate)Solution、Water for molecular biology购自Fluka公司；Tween 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)、SDS(Sodium lauryl sulfate),10％solution、Sarkosyl(N-Lauroylsarcosine sodium salt)、TE(Tris-EDTA)Buffer,pH8.0,100×、5M TMAC(Tetramethylammonium chloride solution)、1M Tris-HCL,pH 8.0、SodiumChloride、Triton X-100购自Sigma公司；0.5M EDTA,pH 8.0购自Invitrogen公司；Liquichip carboxy bead购自Luminex公司。
在本发明实施例中病毒4株新城疫病毒、4株H9亚型禽流感病毒和3株H5亚型禽流感灭活病毒毒株均购自哈尔滨兽医研究所。
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1设计探针并将所述探针与荧光编码微球进行偶联
1、探针及引物的设计
选取以亚洲地区为主、不同宿主但以禽类尤其是鸡鹅为主的H5、H9亚型流感的HA基因以及新城疫的NP基因几百条进行序列在线排列分析。用DNA Star(V.5.06)中的Seqman和Megalign再次进行序列排序分析。找出基因中最保守的23-24个寡核苷酸作为液相芯片检测探针，在探针的5’端标记-NH2。分别在探针的上下游设计特异性的扩增引物。探针及反向互补序列、引物的序列如下：
AIV H5(HA基因)：195bp(1526—1720)，TM＝69℃，P1：5’-GGAACGTATGACTACCCGCAGT-3’，P2：5’-TCTGCAT TGTAACGACCCATTG-3’，Probe：5’-TGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCA-3’，RC-Probe：5’-TGCCAGTGCTAGGGA ACTCGCCA-3’。
AIV H9(HA基因)：201bp(1437-1637)，TM＝69℃，P1：5’-AGTGGAAGATGGG AAAGGATGTT-3’，P2：5’-AGAGAT GAGGCGACAG TCGAA-3’，Probe：5’-TGCAT GGAGACAAT TCGGAACGGG-3’，RC-Probe：5’-CCCGTTCCGAATTGTCTCCATGC A-3’。
ND(NP基因)：201bp(198-398)，TM＝68℃，P1：5’-CCTCGTCTCAGACAGGGTCAA-3’，P2：5’-CGGCACCTATAAAGCGTTTTTG-3’，Probe：5’-TCCTC TTGGCGATTCC ATCC GC-3’，RC-Probe：5’-GCGGATGGAATCGCCAAGAAGA-3’。
所有下游引物P2 5’端标记生物素，探针Probe 5’C6标记氨基，探针反向互补序列RC-Probe 5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。引物按各自摩尔数计算，用水溶解成200μM贮存母液备用。
2、特异性寡核苷酸探针与荧光编码微球的偶联
按照Luminex公司推荐的荧光编码微球(Liquichip carboxy bead)顺序，选择了荧光编码微球之间荧光信号误读率最低的8个荧光编码微球，分别与H5亚型、H9亚型AIV的HA基因和NDV的NP基因的特异性寡核苷酸探针按照表1之间的一一对应关系进行偶联。偶联后检测偶联的效率，看探针是否有效地偶联到微球上，分别去偶联各自特征的微球与标记了生物素的探针的反向互补序列进行杂交反应，看能否检测到信号，以确定偶联是否有效。荧光编码微球与探针的偶联参照Luminex推荐操作步骤进行。
表1禽流感和新城疫分型探针与不同荧光编码微球对应表
根据Luminex公司推荐的判定标准，当每种荧光编码微球个数不少于20个且背景空白荧光强度不高于500，表明实验成立，进行结果判定。
将各个毒株的探针与相应荧光编码的荧光编码微球偶联，偶联后检测偶联的效率，结果见表2。各个偶联后荧光编码微球的MFI都在5000以上，表明特异性寡核苷酸探针与荧光编码微球偶联成功。
表2微球偶联直接GMPLex检测MFI值
编码微球 33 34 35 36
探针 AIVH5 AIVH5 AIVH5 AIVH9
MFI+ 13220 13238 16835 14946
MFI对照 145 297 231 256
编码微球 38 42 43 44
探针 AIVH9 AIVH9 NDV NDV
MFI+ 12456 8966 12219 12602
MFI对照 39 40 60 111
实施例2制备RT-PCR产物
2.1单种病毒RT-PCR产物的制备
将新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒抗原等各毒株采用小型全自动核酸抽提工作站EZ1(简称EZ1)抽提病毒RNA。
按照Qiagen OneStep RT-PCR Kit Handbook推荐的方法建立50μL单亚型流感基因检测方法RT-PCR，同时以SPF鸡胚尿囊液抽提的总RNA为阴性对照。单亚型RT-PCR检测方法的反应体系如下(50μL)：
无RNA酶水(RNase-free water)32.3μL，5×Qiagen one step RT-PCR缓冲液10μL，dNTP混合物(每种10mM)2μL，，Rnase抑制剂(40U/μL)0.25μL，Qiagn one step RT-PCR酶混合物(HotStarTaq DNA聚合酶)2μL，病毒模板(病毒RNA)2μL，引物1(2μM～8μM)0.75μL、引物2(2μM～8μM)0.75μL。
加完RT-PCR反应各成分后，瞬时离心混匀，然后进行RT-PCR反应。反应程序：50℃逆转录35min；95℃逆转录酶的灭活及热启动15min；94℃变性30s，52℃褪火1min30s，72℃延伸1min，15个循环；72℃后延伸10min。反应结束后，取10μL RT-PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测。
按上述方法各个毒株抽提病毒核酸后进行单亚型RT-PCR扩增产物检测，取10μL于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测，。各个亚型的扩增图见图1，其中Mark为Mark DL 2000,1、2泳道为H5亚型AIV，3泳道为H9亚型AIV，4泳道为NDV。说明上述方法均能特异性地扩增出所需要的目的条带，与理论结果相符。
2.2制备三种病毒RT-PCR产物
将新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒各个亚型的所有引物混合，用上述EZ1抽提方法抽提各个毒株RNA，参照表单种病毒RT-PCR反应体系，适当调整水量，建立50μL多种病毒RT-PCR检测方法。
分别取三个毒株核酸各2μL作为模板，加入RT-PCR反应体系中，反应总体积为50μL，建立禽流感H5、H9、NDV三个毒株RT-PCR检测方法，按2.1所提供的条件进行PCR反应。反应结束后，取10μL RT-PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测。
各个亚型的扩增图见图2，其中Mark为Mark DL2000,1、2、3、4泳道分别为H5亚型AIV；5、6泳道为H9亚型AIV；7、8泳道为NDV。结果说明按照上述方法能够特异性地扩增出与理论相符的目的条带。
实施例3单毒株GM液相芯片检测方法
为了验证各个亚型探针偶联的荧光编码微球与相应单亚型RT-PCR产物之间能否正确杂交，取新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒单个毒株的RT-PCR扩增产物，按照Luminex推荐的液相芯片操作步骤，将新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒基因探针偶联的相应荧光编码微球只与相应病毒基因的RT-PCR产物对应进行杂交，建立75μL单亚型液相芯片(PLex)检测体系，以单亚型基因偶联探针的荧光编码微球分别检测相应单亚型RT-PCR产物。
即各个毒株的探针与相应荧光编码的荧光编码微球偶联后，分别只与各病毒株相应的RT-PCR反应扩增产物直接杂交后，进行单亚型PLex检测。各个参与计数的荧光编码微球均≥20个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信；各个荧光编码微球的空白对照MFI均<500，表明结果有效，试验可以进行结果判定；RT-PCR反应扩增产物的MFI明显大于阴性和空白对照的值。探针与相应的RT-PCR扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值都大于10，表明均为阳性。各个单毒株GMPLex检测的MFI值R结果见表3。
表3单毒株GMPLex检测MFI值
编码微球 33 34 35 36
探针 AIVH5 AIVH5 AIVH5 AIVH9
MFIB 297 130 339 336
MFIS 3861 3865 4275 4273
结果 + + + +
编码微球 38 42 43 44
探针 AIVH9 AIVH9 NDV NDV
MFIB 126 105 239 221
MFIS 4244 3064 4437 4398
结果 + + + +
实施例4多毒株液相芯片(PLex)检测方法
1、多毒株液相芯片(PLex)检测单毒株
取上述三种编码偶联较好的荧光编码微球(分别是偶联H5、H9AIV HA基因探针和NDV NP基因探针，分别是33、38、和44号微球，即33-H5、38-H9、44-ND微球)重悬液充分混合，制备多毒株PLex检测混合探针，与各个RT-PCR反应扩增产物杂交。仪器设置每次同时检测3个编码的荧光编码微球，进行多毒株PLex检测。
液相芯片定性比值结果(Luminex qualitative ratio result,LQRR)等于样品的校正后的荧光强度中位值(Median florescence intensity,MFI)与空白对照MFI的平均值(MFIB)的比值，即LQRR＝MFIS/mMFIB。如果LQRR≥3，判定为阳性样本；如果2≤LQRR≥3，则判定为可疑；如果LQRR<2，则判定为阴性。
将单毒株RT-PCR扩增产物纯化后，直接与偶联探针的混合微球进行杂交，每个样品三个重复，结果各个参与计数的荧光编码微球均≥20个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信；各个荧光编码微球的空白对照MFI均<300，表明结果有效，试验可以进行判定；RT-PCR反应扩增产物的MFI值都在3700以上。混合探针与各个毒株的RT-PCR与扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值均大于25，明显表明均为阳性，且非特异性反应很小几乎没有什么交叉反应。各个多毒株GMPLex检测单毒株的MFI值结果见表4。
表4多毒株GMPLex检测单毒株的MFI值
样品/荧光值MFI 33-H5 38-H9 44-ND
5-1 4175 129 141
5-2 3765 99 139
5-3 3961 141 121
9-1 130 3842 165
9-2 114 3775 212
9-3 66 3788 157
ND-1 220 43 4214
ND-2 49 62 4077
ND-3 156 78 3874
2、双毒株PLex检测结果
将两个毒株RT-PCR扩增产物纯化后，直接与混合液中荧光编码微球上的探针进行杂交，结果各个参与计数的荧光编码微球均≥20个，用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信；各个荧光编码微球的空白对照MFI同3.3.2.1，均<50，背景信噪值很低，表明结果有效，试验可以进行判定；RT-PCR反应扩增产物的MFI均大于500。混合探针与各个毒株的RT-PCR与扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值均大于25，明显表明均为阳性，且非特异性反应很小各个多毒株PLex检测两两混合的双毒株的MFI值结果见表5。
表5各个两两混合双毒株PLex检测MFI值
样品/荧光值MFI 33-H5 38-H9 44-ND
H5、H9-1 1108 926 41
H5、H9-2 1086 857 19
H5、H9-3 1020 1025 31
H9、ND-1 13 1042 1214
H9、ND-2 11 977 1073
H9、ND-3 26 1020 1040
H5、ND-1 520 23 865
H5、ND-2 633 22 912
H5、ND-3 656 18 1157
3、三毒株PLex检测结果
将三个毒株GM RT-PCR扩增产物直接与混合探针进行杂交，结果各个参与计数的荧光编码微球均≥20个，所产生的MFI值可信；各个荧光编码微球的空白对照MFI同3.3.2.1，均<100，表明各个荧光编码微球的背景信噪值很低，试验可以进行判定；RT-PCR反应扩增产物的MFI均大于496。混合探针与三个毒株的RT-PCR与扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值明显大于30，表明均为阳性，同时空白对照背景值很低，阳性对照LQRR值也不高但明显高于阳性样品，背景值也很低。多毒株PLex检测三个毒株的MFI值见表6。
表6三毒株GMPLex检测MFI值
样品/荧光值MFI 33-H5 38-H9 44-ND
1 496 626 664
2 542 757 620
3 675 725 780
4 662 542 714
5 630 677 673
6 688 720 640
空白对照 12 13 9
阳性对照 2577 3421 3931
实施例5 PLex快速高通量检测方法灵敏性试验结果
1多毒株PLex快速高通量检测方法检测单毒株的灵敏性试验结果
将H5亚型禽流感灭活病毒抽提病毒RNA 10倍梯度稀释后，进行H5 HA基因RT-PCR扩增、纯化，混合三种探针后进行多毒株PLex快速高通量检测。结果表明：多毒株PLex快速高通量检测方法检测H5基因的检测灵敏度为10-5，LQRR值约为2.19，通过计算相当于250EID50；检测结果见表7。
表7 PLex检测单亚型和单毒株灵敏度比较
3.4.2多毒株PLex检测方法同时检测三毒株灵敏度结果
按照所建立的三毒株PLex快速高通量检测方法对各个梯度进行灵敏性检测。结果表明三毒株PLex快速高通量分型检测方法同时检测新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒抗原三株毒株灵敏度分别为10-4、10-5和10-5，三毒株PLex快速高通量检测方法的灵敏度与只检测一个毒株的灵敏度约低一个数量级或相当。
实施例6 PLex快速高通量检测方法特异性试验
1单毒株检测方法特异性试验
1.1单毒株RT-PCR检测方法特异性试验
分别取新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒抗原等单个毒株核酸作为模板，按照H5HA基因、H9HA基因和NDV基因的单毒株RT-PCR扩增，分别检测所建方法的特异性，各个单毒株PLex检测的MFI值结果见3.3.2.1：探针与相应的RT-PCR扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值都大于10，表明均为阳性，而空白对照的值都很低，低于400，说明建立的单毒株PLex检测方法特异性很好，方法成立。
1.2多毒株PLex快速高通量检测方法特异性试验
为了验证各个毒株探针与其他毒株RT-PCR阳性扩增产物之间的交叉反应率，将3种编码的荧光编码微球混合液与3个不同毒株的RT-PCR阳性产物按照2.3.2.2杂交步骤进行杂交，检测所建方法的特异性。各个多毒株PLex检测单毒株的MFI值结果见表4和表5。混合探针与各个毒株的RT-PCR与扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交，LQRR值均大于25，明显表明均为阳性，且非特异性反应很小几乎没有什么交叉反应。
1.3小样本三毒株PLex快速高通量检测方法比对试验结果
利用本研究建立的H5 AIV、H9 AIV和NDV三毒株PLex快速高通量检测方法，检测100份待检样品。检测结果与实时荧光RT-PCR方法检测结果一致(表8)，部分样品分别是感染两种或三种病毒。
表8 PLex快速高通量分型检测方法与病毒分离鉴定的对比试验
*代表样品中混合感染其它病毒疾病，**表示多重感染样品的总共数
1.4多毒株型PLex快速高通量检测方法检测其他禽类病原体样品特异性试验
利用本研究建立的检测方法，检测IBV,ILTV,IBDV,MDV等感染家禽的病毒以及禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌等多种感染家禽的细菌进行检测，检测结果显示与其他禽类病原体之间无交叉反应，所建立的方法特异性强。
由以上实施例可知，笔者的研究显示，生物素标记引物的质量是影响试验是否成立的关键因素之一，低质量的标记将导致检测信噪比的降低，从而降低检测的灵敏度。；探针最好是干粉状，如果为液体，则探针溶液中必须无tris或无叠氮钠或无其他含有氨基成份的缓冲液进行稀释；但从经验来看，在50μL MES偶联体系中，EDC的终浓度越高，偶联效果越好；荧光编码微球的加入量并非越多越好，过多反面影响与探针的偶联效率，导致杂交信号MFI过低。
PCR扩增产物与荧光编码微球偶联的探针杂交结果受各种因素影响变化较大，影响因素包括探针的长度、扩增片段的大小、序列和二级结构，PCR扩增片段的产量和真正用于杂交的数量。一般而言，杂交温度低于探针与片段之间的Tm值5℃～10℃时，既可以保持杂交的特异性，又具备良好的敏感性。如果PCR片段与探针杂交后省略洗涤步骤，较短的PCR片段杂交效果会更好。多数杂交可在30min内完成。
本发明所建立的三毒株PLex快速高通量检测方法中，不交叉性显得尤其重要，既要求被检各毒株之间无相互交叉现象，这样才不至于将这几种疾病误诊或混淆，又要求与其他的病原体没有交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市检验检疫科学研究院
<120> 一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法
<130> 阿斯达
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaacgtatg actacccgca gt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctgcattgt aacgacccat tg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggcgagttc cctagcactg gca 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgccagtgct agggaactcg cca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agtggaagat gggaaaggat gtt 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agagatgagg cgacagtcga a 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgcatggaga caattcggaa cggg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cccgttccga attgtctcca tgca 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cctcgtctca gacagggtca a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cggcacctat aaagcgtttt tg 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcctcttggc gattccatcc gc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcggatggaa tcgccaagaa ga 22

Claims (10)

1.一种禽流感新城疫核酸液相芯片高通量检测方法，包括以下步骤：
1)设计新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的检测用探针、反向互补序列、引物的序列，并将所述探针与荧光编码微球偶联；
2)提取待测样品中的新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的RNA，使用RT-PCR方法扩增；
3)将步骤1)获得的所述与探针偶联的荧光编码微球，与步骤2)的病毒RT-PCR产物进行杂交，通过比较待测样品的荧光强度中位值与空白对照荧光强度中位值，确定待测样品中是否感染鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和/或H5亚型禽流感病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的新城疫病毒的检测用探针为根据新城疫病毒外壳蛋白基因设计的寡核苷酸、所述H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的检测用探针为根据H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的HA基因设计的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述探针5’端的C6标记氨基所述探针的所有下游引物5’端标记生物素，所述探针的反向互补序列5’端标记生物素，全部进行HPLC纯化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针为干粉状；或者所述探针为液体，其中，所述探针溶液中无tris或无叠氮钠或无其他含有氨基成份。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述H5亚型禽流感病毒的检测用探针为：5’-TGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCA-3’、反向互补序列为5’-TG CCAGTGCTAGGGA ACTCGCCA-3’、上游引物的序列为5’-GGAACGTATGACTACCCGCAGT-3’、下游引物的序列为5’-TCTGCATTGTAACGACCCATTG-3’；
所述H9亚型禽流感病毒的检测用探针为5’-TGCAT GGAGACAAT TCGGAACGG G-3’、反向互补序列为5’-CCCGTTCCGAATTGTCTCCATGCA-3’、上游引物的序列为5’-AGTGGAAGA TGGGAAAGG ATGTT-3’、下游引物的序列为5’-AGAGAT GAGGCGACAG TCGAA-3’，探针：5’-TGCATGGAGACAAT TCGGAACGG G-3’，反向互补探针(RC-Probe)：5’-CCCGTTCCGAATTGTCTCCATGC A-3’；
新城疫病毒的检测用探针为5’-TCCTC TTGGCGATTCC ATCC GC-3’、反向互补序列为5’-GCGGAT GGA ATCGCCAAGAAGA-3’、上游引物的序列为：5’-CCTCGTCTCAGACAGGGTCAA-3’、下游引物的序列为5’-CGGCACCTATAAAGCG TT TTTG-3’。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)RT-PCR方法中反应体系为：RT-PCR缓冲液10μL、dNTP(每种10mM)2μL、RNase抑制剂(40U/μL)0.25μL、DNA聚合酶2μL、病毒RNA各2μL，引物1(2μM～8μM)0.75μL、引物2(2μM～8μM)0.75μL加入无RNA酶超纯水至50μL；其中所述病毒RNA为提取的所述样品新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒的RNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中所述与病毒探针偶联的荧光编码微球为按照Luminex推荐的荧光编码微球顺序，荧光编码微球之间荧光信号误读率最低的8个荧光编码微球。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中所述与病毒探针偶联的荧光编码微球为与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒探针偶联效率最高的三种荧光编码微球。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中与病毒探针偶联的荧光编码微球为，将所述三种与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒探针偶联效率最高的荧光编码微球混合稀释后，获得的荧光编码微球混合液；其中所述荧光编码微球混合液的荧光编码微球含量为200个荧光编码微球/种/μL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中的检测方法为：
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒的任意一种RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测单毒株RT-PCR产物的单毒株PLex检测体系；
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或H5亚型禽流感病毒的任意两种病毒的RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测双毒株RT-PCR产物的双毒株PLex检测体系；
将所述荧光编码微球混合液，并与新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒的RT-PCR扩增产物杂交，建立75μL偶联探针的荧光编码微球混合液以检测三毒株RT-PCR产物的三毒株PLex检测体系。
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