CN102337353A

CN102337353A - 用于h5亚型禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、检测方法及应用

Info

Publication number: CN102337353A
Application number: CN201110255246XA
Authority: CN
Inventors: 包红梅; 王秀荣; 陈化兰
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明公开了一组用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用，所述的引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别如SEQ ID No.1、2所示，内引物对序列分别如SEQ IDNo.3、4所示，环引物对序列分别如SEQ ID No.5、6所示。本发明的引物组可用于制备H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括：Reaction Mix；Enzyme Mix；Distilled Water；荧光检测试剂以及本发明的引物组。本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为H5亚型禽流感的防控预警机制提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。

Description

用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及禽流感病毒的检测方法，尤其涉及基于RT-LAMP设计的检测H5亚型禽流感病毒的引物组，及其检测方法和应用，属于禽流感病毒的检测领域。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA，是正粘病毒科流感病毒属成员，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的囊膜糖蛋白-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为16个HA亚型和9个NA亚型。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza，HPAI)可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。在1959-1998年的40年间，世界范围内一共报道了17次高致病性禽流感(HPAI)。近年在全球时见报导的主要是H5N1和H7N1两个亚型，其中倍受关注的是H5N1。近几年来发生的高致病力禽流感疫情是由H5亚型AIV引起的有：1983～1984年美国发生H5N2亚型引起的禽流感流行，病死率近90％，死亡和扑杀家禽1700万只；1997年香港发生H5N1亚型禽流感流行，宰杀了家禽150万只。2003～2004年东南亚的H5N1亚型禽流感暴发，韩国、日本、台湾、越南、泰国等10多个国家和地区，我国内地广西、湖北、安徽等多个省市的某些乡镇发生H5N1亚型引发的禽流感疫情，病死与宰杀的家禽已逾5000万只。尤其是1997年以来已有人类感染禽流感并致死的报道，最近，世界卫生组织最近再次确认全球已确诊153例人感染禽流感83人死亡，造成世界对H5N1的一片恐慌。因此，为了对疫情快速采取应对措施，对疑似病例做出快速有效的诊断有重要意义。目前对AIV进行快速检测的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、Real-time RT-PCR、NASBA(Nucleic acidsequence-based amplification)和Microarray等。

快速诊断和及时监测是禽流感防控的首要步骤和重要一环。目前，有关禽流感的检测方法较多，经典的流感病毒病原学诊断方法中病毒分离及其生物学特性的研究是最为可行和最能说明问题的，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，需要较长的时间(几天到一周)，不能够满足急性烈性传染病紧急疫情防制工作的需要，同时由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳动物的潜在危险，病毒的操作需要在生物安全三级实验室进行，一般检疫部门不具备这种试验条件。快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已经在禽流感病毒检测中发挥着重要作用(Shan，2003；Collins，2002；Wang，2005；Spackman，2003；Poddar，2002)。但都需要复杂的检测仪器(如PCR仪，荧光定量PCR仪等)，在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增(Loop-mediated IsothermalAmplification Method，LAMP)技术是一种新的体外扩增特异性DNA片段的分子生物学方法(Notomi，2000)。该方法不需要额外的反转录步骤，只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的核酸，不需要通过核酸电泳的方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果(如果加入荧光染料后会更易观察)。LAMP所具有的简单、快速、高效、实用的特点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法已经成功地应用于H5和H9亚型AIV的检测。建立一种能够灵敏、特异的H5亚型AI V的RT-LAMP检测方法的前提是需要针对H5HA基因保守区设计得到特异性引物。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够灵敏、特异的检测H5亚型禽流感病毒RT-LAMP的引物组；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

本发明还提供一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于：使用所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。

优选的，所述的扩增反应是将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62.5℃反应1h，80℃作用10min结束反应。

本发明的所述的RT-LAMP引物组可用于制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂。

本发明还涉及一种用于H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于还包括荧光检测试剂及以上所述的引物组；

Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water均可按照常规现有方法制备；在本发明的一具体实施例中所述的Reaction Mix、Enzyme Mix来自RNAAmplification Kit(RT-LAMP)(购自日本荣研公司)。

所述的RT-LAMP引物由一对外引物(H5-F3和H5-B3)，一对内引物(H5-FIP和H5-BIP)和一对环引物(H5-LF和H5-LB)组成；所述外引物对序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；所述引物可按照现有方法制成冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。

在本发明的一个具体实施例中，所述的荧光检测试剂是FluorescentDetection Reagent，购自日本荣研公司。

本发明还提供了所述的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。

本发明的另一目的是提供一种上述检测H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒的使用方法，包括：

1、将下述组分加入到反应管中：

2、将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62.5℃反应1h，80℃作用10min结束反应；

3、检测：

(1)直观检测：反应物中加入1.0μL Fluorescent Detection Reagent染料，即可直接显示结果：阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；

(2)琼脂糖凝胶电泳：用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析：阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。

本研究选用的禽流感血凝素基因(Hemagglutinin，HA)位于病毒粒的囊膜上，由同质的三聚体组成，形成一球状的头部和细长的颈部，是唯一能产生中和抗体的抗原，诱导机体免疫系统产生保护作用，是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。其主要功能是识别宿主细胞膜上的受体，介导毒粒囊膜和细胞囊膜的融合。而且它是变异最大的基因，AIV的抗原性和致病性很大程度上取决于该基因的变异情况。此外HA蛋白分子上个别关键氨基酸位点的突变，尤其是受体结合部位的氨基酸发生替换，就有可能造成毒粒致病性和传播能力的改变。所以它在AIV中具有极重要的意义，是近20年来禽流感工作者研究的热点。

附图说明

图1为不同浓度底物进行RT-LAMP以及RT-PCR的敏感性扩增结果；

图1A为H5-RT-LAMP扩增结果；图1B为H5-RT-PCR扩增结果；1-8所对应的病毒RNA浓度为分别为10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0.1PFU、0.01PFU、0.001PFU；

图2为不同浓度的底物浓度进行RT-LAMP扩增的实时监控图显示结果；

1-8所对应的病毒RNA浓度为分别为10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0.1PFU、0.01PFU、0.001PFU；

图3为用RT-LAMP检测H1～H16亚型禽流感病毒的实时监控图显示结果；

1.MD/HLJ/390/06(H1N1)；2.MD/HLJ/135/06(H2N2)；3.MD/HLJ/90/06(H3N2)；4.MD/HLJ/499/06(H4N6)；

5.DK/AH/1/06(H5N1)；6.MD/HLJ/87/06(H6N1)；7.CK/HeB/1/02(H7N2)；

8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1)；9.CK/HuN/33/08(H9N2)；10.MD/HLJ/108/06(H10N2)；

11.MD/HLJ/80/06(H11N2)；12.A/Duck/A1berta/60/76(H12N5)；13.A/gull/Maryland/704/77(H13N6)；

14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5)；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；

16.A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；

图4为用RT-LAMP检测H1～H16亚型禽流感病毒的特异性试验结果；

5.DK/AH/1/06(H5N1)；6.MD/HLJ/87/06(H6N1)；7.CK/HeB/1/02(H7N2)；

11.MD/HLJ/80/06(H11N2)；12.A/Duck/Alberta/60/76(H12N5)；13.A/gull/Maryland/704/77(H13N6)；

14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5)；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；

16.A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；

图5为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的特异性试验结果；

M：DL2000DNA Marker；1：H5N1；2：鸡新城疫病毒(NDV)；3：鸡传染性支气管炎病毒(IBV)；4：鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)；5：鸡马立克氏病病毒(MDV)；6：鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)；7：鸡传染性贫血病毒(CIAV)；8：鸡白血病病毒(ALV)；

图6为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的实时监控图显示结果。

1：H5N1；2：鸡新城疫病毒(NDV)；3：鸡传染性支气管炎病毒(IBV)；4：鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)；5：鸡马立克氏病病毒(MDV)；6：鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)；7：鸡传染性贫血病毒(CIAV)；8：鸡白血病病毒(ALV)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1 试验材料和方法

1.1毒株和试剂

本试验所用禽流感病毒H1～H16亚型标准参考毒株(购自中国兽医药品监察所)；

H5亚型禽流感病毒(A/Duck/shanghai/35/2002(H5N1))及其鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)购自中国兽医药品监察所。

RNA Amplification Kit(RT-LAMP)和Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司；RNA

Total RNA Isolation系统和Access RT-PCR系统均购自Promega公司。10日龄SPF鸡胚、6周龄SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供，所有SPF鸡都在负压隔离器内饲养。

1.2LAMP引物的设计和合成

分析了流感数据库中H5亚型流感病毒HA基因序列的同源性，找出HA基因保守区，设计了6个引物，分别是外引物(H5-F3(SEQ ID No.1所示)和H5-B3(SEQ ID No.2所示))，内引物(H5-FIP(SEQ ID No.3所示)和H5-BIP(SEQID No.4所示))和环引物(H5-LF(SEQ ID No.5所示)和H5-LB(SEQ ID No.6所示))(表1)。

表1 RT-LAMP引物序列

1.3RNA提取

RNA的提取采用Trizol LS试剂盒(invitrogen公司)。病毒尿囊液或口咽泄殖腔拭子按常规处理后，取样品250ul，加750ul Trizol LS裂解液，混合震荡5分钟(尽量保证裂解后的液体透明)，加200ul氯仿，12000转，4℃离心15分钟，取上清，加500ul异丙醇，室温沉淀10-15分钟，12000转，4℃离心15分钟，弃上清，缓慢加入75％乙醇洗沉淀一次，倒置滤纸吸干管壁余液，真空抽干或37℃烘干，加入无RNA酶的水20ul，-70℃保存备用。

1.4RT-LAMP和RT-PCR的反应体系

H5-RT-LAMP反应总体积为25μL，组成成分如下：Reaction Mix 12.5μL、100p mol H5FIP 0.4μL、100p mol H5 BIP 0.4μL、10p mol H5 F30.5μL、10p mol H5 B3 0.5μL，100p mol H5 LF 0.2μL，100p mol H5 LB 0.2μL，Enzymemix 1μL，加入5.0μL抽提获得的RNA到体系中，加Distilled Water至25μL，置于浊度仪、PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62.5℃反应1h，80℃作用10min结束反应。反应物中加入1.0μL Fluorescent Detection Reagent，即可直接显示结果：

阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；或用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析：阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。

H5-RT-PCR的引物序列为：

H5Up：5’GGAATATGGTAACTGCAACACCA3’；

H5Low：5’AACTGAGTGTTCATTTTGTCAATG 3’；

扩增片段大小为372bp。反应总体积为25μL，组成成分如下：5.0μL 5X反应缓冲液、0.5μL 10M dNTP、1.0μL 15M硫酸镁、0.25μL 20p mol H5Up、0.25μL 20p mol H5Low、0.5μL A MV反转录酶、0.5μL Taq DNA聚合酶、14μL DEPC处理的灭菌双蒸水。加入2.5μL RNA到体系，置于PCR仪反应，循环参数为45℃逆转录45min，94℃预变性2min，94℃30s、52℃45s、68℃45s，35个循环，最后68℃延伸8min。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析(Hongmei，et al，2007)。

1.5敏感性试验

对测定病毒含量的H5亚型标准参考毒株(购自中国兽医药品监察所)(Garten et al，1985)的尿囊液提取核酸，将抽提所得的H5AIV总RNA进行10倍倍比稀释(分别为10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0.1PFU、0.01PFU、0.001PFU)。对上述各浓度RNA用H5-RT-LAMP和H5-RT-PCR方法同时进行检测。

1.6特异性试验

用该H5-RT-LAMP方法分别检测H1～H16亚型禽流感标准参考毒株，检测不同亚型病毒之间是否存在非特异性扩增。检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)等其他7种禽病病原，检测H5-RT-LAMP方法的特异性。H5AIV毒株作为阳性对照。

2 实验结果

2.1RT-LAMP的敏感性结果

由病毒含量为10⁴PFU的H5RNA，进行10倍倍比稀释后用本发明的RT-LAMP检测试剂盒和RT-PCR方法进行平行检测，发现RT-PCR方法可检测10PFU滴度的病毒，RT-LAMP反应的特征性阶梯状条带亮度随浓度减少有渐暗的改变(如图1A所示)，最终病毒在0.1PFU时仍然可以扩增出明显的阶梯状目的条带，即可敏感地检测到0.1PFU的病毒核酸，比常规RT-PCR方法(如图1B所示)敏感100倍，RT-LAMP扩增的实时监控图显示(如图2所示)，随着稀释度的增加，反应曲线的起始点向后逐渐推移，表明该方法对浓度的变化很敏感。

2.2RT-LAMP的特异性结果

为了检测H5-RT-LAMP的引物的特异性，用RT-LAMP检测H1～H16亚型禽流感病毒标准参考毒株，结果表明仅对H5亚型禽流感病毒扩增出特征性阶梯状条带和呈现绿色荧光(如图4所示)。H5-RT-LAMP扩增的实时监控图也显示仅有H5亚型禽流感病毒有扩增曲线，其它亚型病毒则呈阴性结果(如图3所示)。同时对鸡新城疫等其他7种禽病也进行了检测，其他禽病核酸也没有扩增出特征性阶梯状条带和显示出绿色荧光(如图5所示)，H5-RT-LAMP扩增的实时监控图也显示仅有H5亚型禽流感病毒有扩增曲线，其它禽病病毒核酸则呈阴性结果如图6所示)。表明本发明RT-LAMP检测试剂盒能特异性扩增H5亚型禽流感病毒，而不与其它亚型的AIV和其它禽病病毒核酸发生交叉反应。另外，通过对加入环引物的前后进行比较发现，环引物的加入可以大大缩短反应时间，由原来的60min可缩短为30min。

Claims

1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的扩增反应是将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62.5℃反应1h，80℃作用10min结束反应。

4.权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。

5.一种用于H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒，包括ReactionMix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。

6.按照权利要求5所述的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光检测试剂是Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司。

7.权利要求5或6所述的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。