CN101709332B - 一种对虾性别探针及其获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中国明对虾性别探针的开发。即利用分子生物学手段筛选用于对虾性别检测的特异性引物，用于对虾的性别检测。具体地，包括用于检测性别的序列筛选、对虾RNA样品的制备、RNA的反转录、PCR检测等。本发明的优点在于利用筛选的雄性个体特有的cDNA序列设计的一对引物，只在雄性个体中具有扩增产物，因此可以在对虾生长发育早期，外观上不能区分性别的情况下，将雌雄个体进行区分。本发明在对虾性别控制中具有重要的应用前景。

Description

一种对虾性别探针及其获取方法

技术领域

本发明涉及一种对虾性别探针的开发，具体地说是利用分子生物学手段，通过PCR扩增，鉴定对虾的性别。属于海洋生物技术和水产养殖技术领域。利用此技术可以在对虾养殖的早期，通过分子生物学的方法有效地鉴定雌雄性别。此技术对于对虾的性控研究和养殖生产均具有重要意义。

背景技术

对虾的养殖在我国的水产养殖业中占有重要地位，近些年来，种质退化、种苗质量下降、病害严重等问题已经严重阻碍了其养殖生产的健康发展。通过生物技术改良种质，培育生长快或抗逆能力强的新品种已成为海水养殖发展的迫切需求。由于对虾性别二态性的存在，对对虾的性别进行控制，培育单性群体，可以有效提高单位面积的养殖产量，在对虾养殖生产中具有广阔的应用前景。因而对虾性别控制研究一直是国际上研究的热点和难点。

区分对虾性别通常的方法是通过外观上观察外部性征来区分对虾性别，然而外观上观察必须等对虾的外部性征完全形成以后才能实现。而在实际工作中，为了研究对虾的性别决定和性别分化机制，需要在更早时期确定性别后才能进行相关研究；另一方面，在对虾性别控制中，及早测定群体的性别比例，选择有利于产量提高的群体进行养殖，最大限度地提高养殖产量。因而寻找合适的检测方法，在对虾的早期鉴别对虾的性别，无论对对虾性别控制研究还是对虾养殖生产均具有重要的意义。

有关对虾性别标记的筛选近几年陆续有一些报道。从斑节对虾的基因组中分离性别相关的标记没有获得成功，而从卵巢和精巢差异表达基因的筛选过程中获得了斑节对虾性别相关的标记(Khamnamtong，B.，Supaporn Thumrungtanakit，S.，Klinbunga，S.，Aoki，T.，Hirono，I and Menasvetal，P.2006.Identification of Sex-specificExpression Markers in the Giant Tiger Shrimp(Penaeus monodon).Journal ofBiochemistry and Molecular Biology，39(1)，37-45.。随后，通过精巢和卵巢EST序列的分析，在斑节对虾获得了一些性别相关的基因(Preechaphol，R.，Leelatanawit，R.，Sittikankeaw1，K.，Klinbunga，S.，Khamnamtong，B.，Puanglarp，N.and Menasveta，P.，2007.Expressed Sequence Tag Analysis for Identification and Characterization ofSex-Related Genes in the Giant Tiger Shrimp Penaeus monodon.Journal of Biochemistryand Molecular Biology，40(4)，501-510)。促雄性腺作为对虾雄性个体特有的腺体，其内特异表达的基因有可能开发为性别相关的标记，基于此，本发明通过筛选促雄性腺特异表达的基因获得了用于中国明对虾性别鉴定的探针。

发明内容

本发明基于对虾促雄性腺是对虾雄性个体独有的内分泌腺这一特点，通过构建消减文库，测序和生物信息学分析，获得了促雄性腺高丰度表达的基因序列。通过在雌雄个体中的对比验证，获得了只在雄性个体中具有特异性扩增产物的引物序列，此引物可以用于中国明对虾的性别鉴定。

本发明的优点在于利用筛选的雄性个体特有的cDNA序列设计的一对引物，只在雄性个体中具有扩增产物，因此可以在对虾生长发育早期，外观上不能区分性别的情况下，将雌雄个体进行区分。本发明在对虾性别控制中具有重要的应用前景。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种对虾性别探针，包括特异性引物，所述的特异性引物为只能在雄性个体中扩增的引物序列，

正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’，反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’。

所述对虾是指中国明对虾。

所述对虾性别探针的获取方法为：

通过构建对虾促雄性腺的抑制性消减文库，根据测序结果设计引物，筛选雄性个体特异表达的cDNA，，通过验证获得只在雄性个体具有特异性扩增的引物，用于对虾的性别鉴定：具体步骤如下：

1)构建对虾成熟雄性个体第五对步足基部(促雄性腺及相关组织)和第四对步足基部的正向抑制性消减文库(PCR-Select cDNA Subtraction Kit，Clontech)，通过测序获得10-12条潜在的促雄性腺高丰度表达的序列，根据序列设计特异性引物4对(第一对正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’，反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’；第二对正向引物：5’-AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3’，反向引物：5’-CATCACGGAGGCATCCATCT-3’；第三对正向引物：5’-CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAACTGCAC-3’；第四对正向引物：5’-CTTCTCGCTGAACGTGATG-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAAGCGCAC-3’)；

2)用于PCR扩增的cDNA样品的制备：取外观上能区分性别的对虾第五对步足基部，记录性别，分别提取每个个体的总RNA；RNA提取按常规方法进行，并反转录成cDNA；

3)利用1)中设计的特异性引物，分别在2)中获得的cDNA中进行PCR扩增，筛选出只在雄性个体中有特异性扩增产物的引物对；

所述的只能在雄性个体中扩增的引物序列为：

正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’

反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’；

其扩增片段大小为539bp，其序列信息为：

TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTCCCAATCCAGCGGAGGAACCGAAGGCCGAGGAGAAGGAGGGAGAGATGAAGGAAGAAGAGAAGAAGGAGGGAGAGTCGAAGGAAAAGGAGACGAAGGAAGAGGAGAAGAAGGAGGGAGAGTCGAAGGAAGAGGAGACGAAGGAAGAAGAGACGAAGGAAGAGGAAAAGAAGGAAGGAGATTCGGAGGAAGAGAAGCAAGAAGATCAGCTTGAGGAAGAGAAGAAGCCAGGGAACACGACGGAAGAAGCCATCGCGGAGGGAAACGCAACGACCACCATGGAGCCATCGCCAAGGAGGGAAACGAAGGTAACCACGACCGCAAGTCCTTCCGACGACCCCAGCACGACCATGGGGCCTTCGCTAGGGAACCCCGGGAGGGAAACCACGACAGCGAAGCCCTCCGAAGATGCCACCACGACACCGGAACCCTCTGAAGATACCAATACCACGACCATAGAGCCGTCGCCTGAGAGATCCAAGAGGGAAGCCACGACGCCGATACCCTCTGACGCCAGCAC；

4)将筛选的引物对在大量个体中进行验证。

本发明有如下优点

1.利用构建促雄性腺相关组织消减文库的方法，筛选雄性个体特异表达的cDNA序列，在此基础上获得在雄性个体中有特异性扩增的引物对。

2.利用筛选的引物对，通过提取对虾第五对步足基部的RNA，并反转录成cDNA后，利用一次PCR扩增就可鉴别对虾的雌雄，方法简单、可行。

3.在对虾生长发育的早期阶段，外观尚不能确定对虾性别的情况下即可使用，以利于相关的研究和生产。

附图说明

图1为Contig16在对虾早期发育阶段不同性别中的表达.其中M(Maker)：DL2000；Female：1-19共19尾个体；Male：1-20共20尾个体.，A.Contig16在对虾早期发育阶段雌性个体中的表达，B.Contig16在对虾早期发育阶段雄性个体中的表达。

具体实施方式

构建对虾成熟雄性个体第五对步足基部和第四对步足基部的正向抑制性消减文库，通过测序获得12条潜在的促雄性腺高丰度表达的序列，根据序列设计特异性引物4对(第一对正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’，反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’；第二对正向引物：5’-AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3’，反向引物：5’-CATCACGGAGGCATCCATCT-3’；第三对正向引物：5’-CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAACTGCAC-3’；第四对正向引物：5’-CTTCTCGCTGAACGTGATG-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAAGCGCAC-3’)；

引物(正向引物：5’-AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3’，反向引物：5’-CATCACGGAGGCATCCATCT-3’)的扩增片段(456)为：AGTGTCCGCAGCAGCAAGATGTTTAAGAAAGAGGCGCTGGTTGTTGCCTGCATGTTGGCCGTCCAGGTTTCATCGCAGCCTCTGGTTGCAGGTAAACCATTCACTTTGGTGAAAAGAGAAATAGGATTCCCCATGGCGGAATTCCTCGATCTGCAGAAAAGAGGTGCGGGAATGCCACGTCCAGATTCCGATTCCAGGCTCATGAAGCGACACGAAGAGGTGCCCCACTTGGAACGCCTCCTCCTTCTGAAAAGGCGTACGCCACGTCTAGAGACCGATTCCGGCATCATGAGGAGACACAGTGGGCCCCCCTCCGTAGGCATGATACCAAAAAGGTCCATGTGGATGGATATCCACGGTCTGGAGACTAGGGATGCAAGCACGCCAAGTCCACAGCCCGAATTCGGTGTCATGCAGGGACAAGCAGGACCATCCGAGATGGATGCCTCCGTGATG

引物(正向引物：5’-CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAACTGCAC-3’)的扩增片段(285)为：CTCCGTAGGAGTTTTGTCCTCAAGCCTCTCTCCGAGAGGCATGACATCCTCGATGAACGTGATGTCTATCCCGCGGAATGCCAAGGTTCTTTCAGCGTGCCTGCCTTGCAAGCGGTGAATGATCTATGTCTTCAATGCGAAAACGTAACTCGGCAGCCCGACACTCTAGCCAATTGCAAGGCAAACTGCTTCAGCAACTCTATCTTCGTCGGTTGTCTCGATGTGCTGGAACTGCCAGAAAGCGAAAAAGCTACGTACAGAGACCATGTGCAGTTGCTGGGTAAG

引物(正向引物：5’-CTTCTCGCTGAACGTGATG-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAAGCGCAC-3’)的扩增片段(240bp)为：CTTCTCGCTGAACGTGATGTCTATCCCTCGGAATGCCAAGGTTCTTTCAGCGTGCCTGCCTTGAAAGCGGTGAATGATCTATGTCTTCAATGCGAAAACGAAACTCGGGATCGCACAACTCTAGGCAAATGCAAGGCAAACTGCTTCAACAACTCTATCTTCGCCGGTTGTCTCGATTTGCTGCAACTGCCAGAAAGCGAAAAAGCTACGTACATAAAGCATGTGCGCTTGCTGGGTAAG

对虾早期发育阶段性别鉴别的具体步骤如下：

1、2008年4月从青岛市即墨对虾养殖场购买中国对虾亲虾，运回中国科学院海洋研究所水族楼实验室进行养殖，对虾排卵后收集受精卵，通过育苗培育获得仔虾后，在实验室养殖获得不同发育时期的幼虾，保存在液氮中。

2、选取外观上能明显区分性别的雌雄个体，分别提取每个个体第5对步足基部的总RNA。RNA提取，利用上海博星生产的Unizol试剂盒，按说明书步骤进行；按下述方式反转录为cDNA(25μl反应体系中含有1μgRNA)：

1)RNA中基因组DNA的消化：在200μl离心管中配制如下反应体系：

RNA                                xμl

RNasin(promega)                    0.5ul

RQ1 RNase-Free DNase(promega)      1ul

5×MLV Buffer                      2.5ul

ddH₂O                              8-x

共计12μl反应体系

在PCR仪中37℃消化30min；

2)在上述反应体系中加入：

Stop Buffer                        1ul

Hexomer(上海生工合成)              1ul

在PCR仪中70℃反应5min后，置冰上2min；

3)在上述反应中加入：

RNasin(promega)                    0.5ul

5×MLV Buffer                      2.5ul

M-MLV(TAKARA)                      1ul

ddH₂O                              6ul

在PCR仪中37℃反应90min反转录得到cDNA；

4)在PCR仪中95℃反应5min后，把反应体系置冰上。-20℃保存备用。

3、根据对虾促雄性腺中高丰度表达基因的部分序列设计特异性引物(第一对正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’，反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’；第二对正向引物：5’-AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3’，反向引物：5’-CATCACGGAGGCATCCATCT-3’；第三对正向引物：5’-CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAACTGCAC-3’；第四对正向引物：5’-CTTCTCGCTGAACGTGATG-3’，反向引物：5’-CTTACCCAGCAAGCGCAC-3’)，分别在雌雄个体第五对步足基部获得的cDNA中进行扩增，并以18s rRNA作为内参，筛选出只在雄性个体中有特异性扩增的一对引物对(正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’；反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’)。其PCR反应体系为25μl，成分为：10×Reaction Buffer，2.5μl；25mM MgCl₂，1.5μl；10mM dNTP，0.5μl；10μM正向引物，0.5μl；10μM反向引物，0.5μl；cDNA，1μl；Taq酶(Promega)，0.25μl；ddH₂O，18.25μl。PCR程序为：94℃4min；94℃40s，59℃40s，72℃40s，35cycles；72℃10min。

4、将体长为6cm左右的39尾幼虾(19雌20雄)，按2中所述方法分别提取RNA，并反转录为cDNA后，按3中PCR程序，将在3中筛选的一对引物分别在提取的不同个体的cDNA中进行PCR扩增，利用1.2％琼脂糖凝胶进行检测，结果表明，在雄性个体中均扩增出明显的条带，而在雌性个体未见扩增(图1)。说明所筛选出的引物对可以用于对虾的性别检测。

对虾

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种对虾性别探针及其获取方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>539

<212>DNA

<213>中国明对虾

<220>

<221>gene

<222>(1)..(539)

<223>

<400>1

ttggttagat cggtgaggag tcccaatcca gcggaggaac cgaaggccga ggagaaggag    60

ggagagatga aggaagaaga gaagaaggag ggagagtcga aggaaaagga gacgaaggaa   120

gaggagaaga aggagggaga gtcgaaggaa gaggagacga aggaagaaga gacgaaggaa   180

gaggaaaaga aggaaggaga ttcggaggaa gagaagcaag aagatcagct tgaggaagag   240

aagaagccag ggaacacgac ggaagaagcc atcgcggagg gaaacgcaac gaccaccatg   300

gagccatcgc caaggaggga aacgaaggta accacgaccg caagtccttc cgacgacccc   360

agcacgacca tggggccttc gctagggaac cccgggaggg aaaccacgac agcgaagccc   420

tccgaagatg ccaccacgac accggaaccc tctgaagata ccaataccac gaccatagag   480

ccgtcgcctg agagatccaa gagggaagcc acgacgccga taccctctga cgccagcac    539

<210>2

<211>456

<212>DNA

<213>中国明对虾

<220>

对虾

<221>gene

<222>(1)..(456)

<223>

<400>2

agtgtccgca gcagcaagat gtttaagaaa gaggcgctgg ttgttgcctg catgttggcc     60

gtccaggttt catcgcagcc tctggttgca ggtaaaccat tcactttggt gaaaagagaa    120

ataggattcc ccatggcgga attcctcgat ctgcagaaaa gaggtgcggg aatgccacgt    180

ccagattccg attccaggct catgaagcga cacgaagagg tgccccactt ggaacgcctc    240

ctccttctga aaaggcgtac gccacgtcta gagaccgatt ccggcatcat gaggagacac    300

agtgggcccc cctccgtagg catgatacca aaaaggtcca tgtggatgga tatccacggt    360

ctggagacta gggatgcaag cacgccaagt ccacagcccg aattcggtgt catgcaggga    420

caagcaggac catccgagat ggatgcctcc gtgatg                              456

<210>3

<211>285

<212>DNA

<213>中国明对虾

<220>

<221>gene

<222>(1)..(285)

<223>

<400>3

ctccgtagga gttttgtcct caagcctctc tccgagaggc atgacatcct cgatgaacgt     60

gatgtctatc ccgcggaatg ccaaggttct ttcagcgtgc ctgccttgca agcggtgaat    120

gatctatgtc ttcaatgcga aaacgtaact cggcagcccg acactctagc caattgcaag    180

gcaaactgct tcagcaactc tatcttcgtc ggttgtctcg atgtgctgga actgccagaa    240

agcgaaaaag ctacgtacag agaccatgtg cagttgctgg gtaag                    285

<210>4

<211>240

<212>DNA

<213>中国明对虾

<220>

<221>gene

<222>(1)..(240)

对虾

<223>

<400>4

cttctcgctg aacgtgatgt ctatccctcg gaatgccaag gttctttcag cgtgcctgcc     60

ttgaaagcgg tgaatgatct atgtcttcaa tgcgaaaacg aaactcggga tcgcacaact    120

ctaggcaaat gcaaggcaaa ctgcttcaac aactctatct tcgccggttg tctcgatttg    180

ctgcaactgc cagaaagcga aaaagctacg tacataaagc atgtgcgctt gctgggtaag    240

Claims (2)

1.一种区别对虾性别的特异性引物，其特征在于：

所述的特异性引物为只能在雄性个体中扩增的引物序列，

正向引物：5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’，反向引物：5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’。

2.按照权利要求1所述的区别对虾性别的特异性引物，其特征在于：所述对虾是指中国明对虾。