CN114134237A - 鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的srap分子标记及其应用 - Google Patents

鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的srap分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的SRAP分子标记及其应用，属于水产杂交品种选育技术领域。本发明利用特异性引物对Me6/Em5可以在大口黑鲈美国北方亚种中扩增出一条长度约为800bp的特异性条带，而优鲈3号中不存在相应条带。这表明该特异性条带可以作为SRAP分子标记较为准确、快捷地区分出大口黑鲈美国北方亚种与大口黑鲈优鲈3号，且具有操作简便，检测结果准确可靠，对鱼头伤害小的特点。

Description

鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的SRAP分子标记 及其应用
技术领域
本发明属于水产杂交品种选育技术领域，具体涉及鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的SRAP分子标记及其应用。
背景技术
大口黑鲈可以称为我国的第五大家鱼，其肉质鲜美细嫩，无肌间剌，外形美观，深受消费者欢迎。据最新发布的《中国渔业统计年鉴2020》显示，2019年我国大口黑鲈产量达47.78万吨。从2014年至2019年，中国淡水鲈鱼的养殖产量逐年呈上升趋势，占淡水养殖总产量的比重从2014年的1.35％上升至2019年的1.88％。目前，我国仅有两个大口黑鲈新品种“优鲈1号”与“优鲈3号”，这些新品种虽然解决了大口黑鲈生长与食性问题，但是苗种质量与病害问题一直无法突破。
序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)是一种基于简单PCR的分子标记技术，它利用独特的正反引物设计，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增,因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。与其它分子标记相比，SRAP标记设计引物简单，结果稳定可靠、重复性好、多态性高，具有成本低、适用性强的特点。2020年，我们从美国引进了大口黑鲈北方亚种原种。通过将大口黑鲈北方亚种原种与优鲈3号进行杂交，繁育的杂交F1大口黑鲈具有生长快，苗种成活率高，抗逆和抗病性强等特点，拥有很好地推广与养殖前景。在配对繁育前，北方亚种原种与优鲈3号能够通过腹部的形状进行简单区分。然而，一旦繁育结束，两亲本将难以直接区分开。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的SRAP分子标记及其应用，具有简单准确鉴别特点，能有效避免不同品种大口黑鲈混养后引起的种质混乱问题。
本发明提供了一种用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的SRAP分子标记，采用Me6/Em5引物对扩增得到；
所述Me6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述Em5的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了一种用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的检测试剂盒，包括所述SRAP分子标记中所述Me6/Em5引物对。
优选的，所述试剂盒包括PCR扩增用试剂。
优选的，所述试剂盒还包括大口黑鲈美国北方亚种扩增片段标准品和/或优鲈3号扩增片段标准品。
优选的，所述大口黑鲈美国北方亚种扩增片段标准品包括长度为1000bp的DNA片段1、长度为800bp的DNA片段2和长度为750bp的DNA片段3。
优选的，所述优鲈3号扩增片段标准品包括长度为1000bp的DNA片段4和长度为750bp的DNA片段5。
本发明提供了所述SRAP分子标记或所述检测试剂盒在鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号中的应用。
本发明提供了一种基于SRAP分子标记鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)以步骤1)中所述基因组DNA为模板，用所述SRAP分子标记中Me6/Em5引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)分析步骤2)中PCR扩增产物在750～1000bp范围内DNA片段的组成，当出现3个条带时判断为大口黑鲈美国北方亚种，当出现2个条带时判断为大口黑鲈优鲈3号。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增的反应体系为30μL：
Figure BDA0003442259300000021
Figure BDA0003442259300000022
优选的，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序如下：
Figure BDA0003442259300000031
Figure BDA0003442259300000032
本发明提供的用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的SRAP分子标记，采用Me6/Em5引物对扩增得到；所述Me6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述Em5的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明分别以大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的基因组DNA为模板，对64对引物扩增特异性进行分析，Me6/Em5引物对能够扩增得到鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的特异性序列，而其他引物对无法明显区分两种大口黑鲈群体。可见本发明提供的SRAP分子标记能够准确鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号。
本发明提供了一种基于SRAP分子标记鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的方法。利用特异性引物对Me6/Em5可以在美国北方亚种的基因组DNA中在750～1000bp范围内扩增出一条长度约800bp的特异性条带，而优鲈3号中并未扩增到相应条带。以长度约800bp的特异性条带作为SRAP分子标记可以较为准确、快捷地区分出美国北方亚种与优鲈3号大口黑鲈。同时，只要选取少量尾鳍作为实验样本，对鱼体的损伤较小。
附图说明
图1为利用不同SRAP引物鉴定两种大口黑鲈群体，其中图1A为引物Me6/Em5组合鉴别结果；图1B为引物Me3/Em1组合鉴别结果；图1C为引物Me1/Em4组合鉴别结果；
图2为利用特异性引物Me6/Em5组合鉴定两种大口黑鲈群体。
具体实施方式
本发明提供了一种用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的SRAP分子标记，采用Me6/Em5引物对扩增得到；所述Me6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(TGAGTCCAAACCGGACT)所示；所述Em5的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(GACTGCGTACGAATTGTA)。
本发明对Me6/Em5引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。所述扩增的模板包括大口黑鲈美国北方亚种和/或优鲈3号的基因组DNA。本发明对大口黑鲈美国北方亚种、优鲈3号的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的大口黑鲈美国北方亚种、优鲈3号即可。所述SRAP分子标记在两种大口黑鲈中存在差异性条带，大口黑鲈美国北方亚种存在一条长度约800bp的差异性条带，而在大口黑鲈优鲈3号中并不存在该差异条带。
本发明提供了一种用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的检测试剂盒，包括所述SRAP分子标记中所述Me6/Em5引物对。
在本发明中，所述试剂盒优选包括PCR扩增用试剂，例如10×buffer、dNTP、γ-Taq酶等。所述试剂盒还包括大口黑鲈美国北方亚种扩增片段标准品和/或优鲈3号扩增片段标准品。所述大口黑鲈美国北方亚种扩增片段标准品优选包括长度约为1000bp的DNA片段1、长度约为800bp的DNA片段2和长度约为750bp的DNA片段3。所述优鲈3号扩增片段标准品优选包括长度为1000bp的DNA片段4和长度为750bp的DNA片段5(根据图1A中电泳图的方框中条带估测)。
本发明提供了所述SRAP分子标记或所述检测试剂盒在鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号中的应用。
本发明提供了一种基于SRAP分子标记鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)以步骤1)中所述基因组DNA为模板，用所述SRAP分子标记中Me6/Em5引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)分析步骤2)中PCR扩增产物在750～1000bp范围内DNA片段的组成，当出现3个条带时判断为大口黑鲈美国北方亚种，当出现2个条带时判断为大口黑鲈优鲈3号。
本发明对提取待检测样本的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取动物基因组DNA的方法即可。在本发明实施例中，采用酚氯仿方法提取基因组DNA。本发明只要选取少量尾鳍作为实验样本，对鱼体的损伤较小。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为30μL：
Figure BDA0003442259300000051
所述PCR扩增的反应程序优选如下：
Figure BDA0003442259300000052
Figure BDA0003442259300000053
在本发明中，分析步骤2)中PCR扩增产物在750～1000bp范围内DNA片段的组成的方法包括电泳法、测序法等。结果表明，两种大口黑鲈群体在750-1000bp位置存在明显的差异条带，美国北方亚种存在一条特异条带。采用此方法实现鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的目的。
下面结合实施例对本发明提供的鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的SRAP分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的SRAP分子标记的筛选方法
一、美国北方亚种与优鲈3号尾鳍的选取。分别选取美国北方亚种与优鲈3号尾鳍样品各30个，分别放入液氮中保存备用。
二、基因组DNA的提取。分别取二种大口黑鲈尾鳍样本各30个/组，采用酚氯仿方法提取尾鳍基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA的OD260和OD280的比值处于1.65到1.85之间，浓度在750ng～1200ng/L之间，说明提取的DNA较为理想，并将其稀释为50ng/uL，-80℃保存备用。
三、引物筛选。设计正向引物8个，反向引物8个，共64对SRAP引物。
Figure BDA0003442259300000061
每个样本取10μL DNA溶液混合构成美国北方亚种与优鲈3号的样本池。以64对SRAP引物分别对二个DNA池进行PCR扩增。SRAP反应体系与扩增条件：
Figure BDA0003442259300000071
PCR反应条件：
Figure BDA0003442259300000072
根据BSA池是否出现明显差异条带，筛选1对最合适引物。根据图1，使用引物Me6/Em5组合，两种大口黑鲈群体在750～1000bp位置存在明显的差异条带，美国北方亚种存在一条特异条带(图1A)。然而，其他组合的引物对无法明显区分两种大口黑鲈群体(图1B和图1C)。
实施例2
SRAP分子标记的验证
采用实施例1记载的方法对样本提取DNA。根据筛选出的二个DNA池扩增出现差异基因片段的SRAP引物对Me6/Em5组合和建立的大口黑鲈SRAP反应体系与程序分别对两种大口黑鲈群体的30个试验样本进行扩增，将反应产物通过3％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选扩增产生的特异条带。
由图2可见，美国北方亚种与优鲈3号大口黑鲈相比，利用特异性引物Me6/Em5组合可以在750～1000bp处扩增出一条特异性条带。通过此方法可以较为准确、快捷地区分出美国北方亚种与优鲈3号大口黑鲈。同时，只要选取少量尾鳍作为实验样本，对鱼体的损伤较小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京宁渔种业研究院有限公司
中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
金澄福生物科技（苏州）有限公司
<120> 鉴定大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号亲本的SRAP分子标记及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagtccaaa ccggact 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactgcgtac gaattgta 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgagtccaaa ccggatt 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgagtccaaa ccggatc 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgagtccaaa ccggata 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgagtccaaa ccggatg 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgagtccaaa ccggaca 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgagtccaaa ccggacc 17
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagtccaaa ccggacg 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gactgcgtac gaattgca 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gactgcgtac gaattgct 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gactgcgtac gaattgcg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gactgcgtac gaattgcc 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gactgcgtac gaattgtt 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gactgcgtac gaattgtc 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gactgcgtac gaattgtg 18

Claims (10)

1.一种用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的SRAP分子标记，其特征在于，采用Me6/Em5引物对扩增得到；
所述Me6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述Em5的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种用于鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述SRAP分子标记中所述Me6/Em5引物对。
3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增用试剂。
4.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括大口黑鲈美国北方亚种扩增片段标准品和/或优鲈3号扩增片段标准品。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述大口黑鲈美国北方亚种扩增片段标准品包括长度为1000bp的DNA片段1、长度为800bp的DNA片段2和长度为750bp的DNA片段3。
6.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述优鲈3号扩增片段标准品包括长度为1000bp的DNA片段4和长度为750bp的DNA片段5。
7.权利要求1所述SRAP分子标记或权利要求2～6任意一项所述检测试剂盒在鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号中的应用。
8.一种基于SRAP分子标记鉴别大口黑鲈美国北方亚种和优鲈3号的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)以步骤1)中所述基因组DNA为模板，用权利要求1所述SRAP分子标记中Me6/Em5引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)分析步骤2)中PCR扩增产物在750～1000bp范围内DNA片段的组成，当出现3个条带时判断为大口黑鲈美国北方亚种，当出现2个条带时判断为大口黑鲈优鲈3号。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的反应体系为30μL：
Figure FDA0003442259290000011
Figure FDA0003442259290000012
Figure FDA0003442259290000021
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序如下：
Figure FDA0003442259290000022
Figure FDA0003442259290000023
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