JP3861170B2

JP3861170B2 - リンホシスチス病抵抗性のヒラメの識別方法

Info

Publication number: JP3861170B2
Application number: JP2002249317A
Authority: JP
Inventors: 信明岡本; 一展小林; 加菜子藤; 理長谷川
Original assignee: Kanagawa Prefecture; Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Kanagawa Prefecture; Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2002-08-28
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2022-08-28
Also published as: JP2004081155A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別する方法に関し、より詳細には、ヒラメの養殖において、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別して、リンホシスチス病による経済損失を回避する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リンホシスチス病は、イリドウイルス科に属するＤＮＡウイルスの一種であるリンホシスチスウイルスによりひきおこされる病気で、ヒラメの他、スズキ、マダイ、ブリなどに見られる宿主域の広い病気であり、世界的に蔓延している（「魚病学概論」恒星社厚生閣p38-39 (1996)、佐野徳夫著「魚病学」文永堂 p152-154 (1980)、水産の研究8巻5号(42)103-111(1989)等）。
リンホシスチスウイルスに感染・発症したヒラメは、体表に腫瘍様の患部（一つ一つの細胞の巨大化とその集塊化による形成物）を形成するため、商品価値を失い、またこの病患部が口付近に形成されると摂餌量が低下し、死にいたることもある。
ウイルス病であるリンホシスチス病は投薬による治療が困難であるため、リンホシスチス病が発生した場合の被害軽減策としては、一般的に罹病魚を除去し、健康魚への感染を防ぐなどの方法がとられている。しかし、リンホシスチス病の罹病率は５０％以上に及ぶこともしばしば発生しており、罹病魚の除去は根本的な解決にはなっていない。
このような状況のもとで、リンホシスチス病の対処法を早期に確立することが望まれていた。
【０００３】
一方、ヒラメなどの価値ある魚資源の養殖を効果的に行うために、遺伝形質を早期に知ることは重要であり、そのために本発明者らはヒラメについて多型性を示すマイクロサテライトマーカーを２０種取り出すことに成功した（Fisheries Science 2001; 67: 358-360）。しかし、この段階では、各マーカーがどのような価値のある情報をもたらすものであるかということは未だ分かっていなかった。
【０００４】
また、本発明者らは、ＤＮＡマーカーによるヒラメの遺伝子連鎖地図を作成した（M.M.Coimbra、東京水産大学博士学位論文（２００１）；Aquaculture 62089 (2002) in press）。しかし、そこにはリンホシスチス病抵抗性遺伝子やその他の形質に関する情報は示されてはいなかった。
なお、リンホシスチス病抵抗性遺伝子については、本発明者らがその存在を予測し、確認したものであるが、その遺伝子の分離や塩基配列の決定などは未だなされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定のマーカーを用いてリンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別する方法を提供することを目的とする。
リンホシスチス病抵抗性のヒラメであるかどうかはその外観からは識別することはできない。従って、特定のマーカーにより予めリンホシスチス病抵抗性のヒラメを選択することができれば、リンホシスチス病を予防することが可能になり、ヒラメの養殖においてリンホシスチス病による経済的損失を回避することが可能になる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、長期に亙ってヒラメの養殖を行っており、リンホシスチス病に抵抗性のあるヒラメを選抜飼育してきた。その結果、本発明者らは、リンホシスチス病抵抗性に遺伝性があるかもしれないという予測を立てた。そのため、選抜飼育してきたリンホシスチス病に抵抗性のある系統と抵抗性のない系統のヒラメを交配し、更に戻し交配によりリンホシスチス病抵抗性に遺伝性があることを確認した。この結果、リンホシスチス病抵抗性遺伝子の存在を確信するに至った。
【０００７】
このような発見と、発明者らが既に見出していたヒラメについて多型性を示すマイクロサテライトマーカー（Fisheries Science 2001; 67: 358-360）の中にリンホシスチス病抵抗性遺伝子を特定することができるものがあることを見出し、更に、その結果を発明者らが既に見出していたヒラメの遺伝子連鎖地図（M.M.Coimbra、東京水産大学博士学位論文（２００１）；Aquaculture 62089 (2002) in press）と照らし合わせると、このヒラメ遺伝子連鎖地図の遺伝子連鎖群１５にその遺伝子が存在することが分かり、本発明を完成させるに至った。
本発明のプライマーを用いてヒラメのゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応することにより、そのＰＣＲ産物から、リンホシスチス病抵抗性遺伝子を有するヒラメのみを識別することが出来るものと考えられる。従って、識別されたヒラメは遺伝的にリンホシスチス病抵抗性を示すものと考えられる。
【０００８】
即ち、本発明は、下記（１）の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ヒラメのゲノムＤＮＡについてＰＣＲ反応を行うこと、及びこのＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１０１ｂｐのバンドがあることを確認することから成る、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別する方法である。
（１）5'- ATCAGACTCATCAGGACCTCCTGCT-3' （配列番号１）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'- CAAAAGTTTTACAGAGCAACAGCGC-3 （配列番号２）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
【０００９】
また、本発明は、下記（２）の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ヒラメのゲノムＤＮＡについてＰＣＲ反応を行うこと、及びこのＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１３０ｂｐのバンドがあることを確認することから成る、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別する方法である。
（２）5'-GAGAGACAGAAGGTCGTCAACGGTA-3' （配列番号３）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-ACAAAGACCACGATGCAAAGTGAC-3' （配列番号４）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
【００１１】
更に、本発明は、下記（１）又は（２）のいずれかの１組のオリゴヌクレオチドから成る、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別するためのＰＣＲ用プライマーである。
（１）5'- ATCAGACTCATCAGGACCTCCTGCT-3' （配列番号１）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'- CAAAAGTTTTACAGAGCAACAGCGC-3' （配列番号２）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
【００１２】
（２）5'-GAGAGACAGAAGGTCGTCAACGGTA-3' （配列番号３）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-ACAAAGACCACGATGCAAAGTGAC-3' （配列番号４）の３’側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
【００１３】
【発明の実施の形態】
リンホシスチス病を未然に防ぐため、本発明の方法を利用することにより、リンホシスチス病抵抗性のヒラメの生産が可能になる。
（１）個体別にリンホシスチス抵抗性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行い、抵抗性個体のみを選別飼育する。
（２）リンホシスチス病抵抗性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行い、抵抗性の親魚を選抜し、その子孫にリンホシスチス病抵抗性を付与する。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
飼育例１
発明者らは長期に亙ってヒラメを選抜飼育してきた。リンホシスチス病に抵抗性の系統をＫＰ−Ｂ、リンホシスチス病に抵抗性でない系統をＫＰ−Ａと名付けた。
神奈川県水産総合研究所において、実験まで紫外線殺菌した海水を使用して隔離飼育したＫＰ−Ａ系魚とＫＰ−Ｂ系魚の１年魚を５００Ｌ水槽にそれぞれ１００尾ずつ合計２００尾収容し、リンホシスチスウイルスが常在する自然海水下で混合飼育実験を４年間にわたり繰り返し行った。
混合飼育におけるＫＰ−ＡとＫＰ−Ｂの識別は、市販の液体蛍光マーカー（ノースウエスト・マリン・テクノロジー社、ＶＩＥ標識埋め込みシステム）を魚の皮下に注入し、識別した。
リンホシスチス病発病海域では、その海水を利用していれば、自然に感染し、発病する。本実験を行った神奈川県水産総合研究所近辺海域はリンホシスチスウイルスが常在する海域であり、単にここで飼育していれば全て感染する。なお、感染を防ぐためには、紫外線殺菌した海水を使用した隔離飼育が必要である。
【００１５】
混合飼育実験の結果、表１に示すように、ＫＰ−Ｂ系統のヒラメはリンホシスチス病を全く発症せず、ＫＰ−Ａ系統のみが発症した。
【表１】

リンホシスチス病を発病したヒラメの一例を図１に示す。リンホシスチス病を発病すると、この病気特有の腫瘍様病患部が見られる。この腫瘍様病患部は、小さなものは米粒程度、大きなものは直径が３ｃｍにも成る。リンホシスチスウイルスが感染した一つの細胞はリンホシスチス細胞と呼ばれる一つの肥大化した特徴的な細胞となり（０．２−０．５mmに達する）、それが集塊をなして、腫瘍様の塊になって見える。
【００１６】
飼育例２
リンホシスチス病に抵抗性の系統（ＫＰ−Ｂ）の雌と非抵抗性の雄を交配し、得られたＦ１（リンホシスチス病抵抗性）の雌を父親のＫＰ−Ａとの間で戻し交配してその子孫を得た。得られた子孫は神奈川県水産総合研究所において紫外線殺菌した海水を使用して、１年間隔離飼育し、その後、そのうち１３９尾を５００ｍｌ水槽に収容して、リンホシスチスウイルスが常在する自然海水で３ヶ月間飼育試験を行った。この飼育試験の結果、リンホシスチス病を発症した魚は７７尾、リンホシスチス病を発症しなかった魚は６２尾であった。この結果はリンホシスチス病抵抗性に遺伝性があることを示している。
【００１７】
実施例１
飼育例２でリンホシスチス病を発病しなかったヒラメ（非発症魚）と、リンホシスチス病を発病したヒラメ（発症魚）の全数について、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、このＰＣＲ産物を６％アクリルアミドゲル電気泳動にて、その遺伝子型多型を確認した。
【００１８】
まず、ヒラメからのＤＮＡ抽出は以下の手順で行った。
ヒラメの尾部血管等からシリンジと注射針を用いて採血した。血液５０μlに、A-solution（0.25M sucrose、10mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl₂ 、1% Triton-X）２００μlを加え、ボルテックスに30秒かけた。その後、遠心分離（20℃，1000rpm，1分）し、上澄みを捨てた。これにバッファー（10mM Tris-HCl(pH7.4)、50mM NaCl、50mM EDTA(pH8.5)、1% SDS）800μlとプロテナーゼK3.5μｌを加え、３７℃のインキュベーターで一晩反応させた。これに２M Tris-HClでｐH調整をおこなったフェノールを８００μｌ加え、２０分転倒混和させた。これを遠心分離（20℃,12000rpm,10分）し、上清を別のチューブに移した。この操作を再度繰り返した。これにPCI（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、20分転倒混和させた。これを遠心分離（20℃,12000rpm,10分）し、上清を別のチューブに移した。この操作を再度繰り返した。これにクロロホルムを加え、20分転倒混和させ、遠心分離（20℃,12000rpm,10分）し、上清を別のチューブに移した。チューブにこれと99．5%エタノールとを等量加え，ボルテックスし、遠心分離（4℃，15000rpm，15分）した。上清を捨て、ペレットに70%エタノールを２００μｌ加えた。これを遠心分離（4℃，12000rpm，10分）し、上清を捨て、チューブのフタを開けたまま、30分程乾燥させ、ＤＮＡを得た。このＤＮＡをTE（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）100〜200μｌに溶解し、4℃で保存した。
【００１９】
次に、下記の１組のプライマーを合成した。
Ｆ : 5’- ATCAGACTCATCAGGACCTCCTGCT-3’ （配列番号１）
Ｒ : 5’- CAAAAGTTTTACAGAGCAACAGCGC-3 （配列番号２）
このプライマーを用いたPCR反応組成（1サンプル分）を表２に示し、ＲプライマーのＲＩ標識用液組成（４９サンプル分）を表３に示す。
【表２】

【００２０】
【表３】

【００２１】
これを用いて、下記PCR条件で反応を行った。
【表４】

【００２２】
得られたＰＣＲ産物を６％アクリルアミドゲルで泳動した。泳動後、ゲルを濾紙に貼り付け乾燥させ、濾紙をイメージングプレートに焼き付け、Bio-image Analyzerで現像した。
その結果、リンホシスチス病を発病しなかったヒラメ（非発症魚）の８７％で１０１ｂｐのバンドが観察され、リンホシスチス病を発病したヒラメ（発症魚）の２２％でこのバンドが観察された。その結果の一部を図２に示す。
図２の左の３レーンに示すように、F1♀がP♀(リンホシスチス病抵抗性を示した個体)から受け継いでいるのはNo.3のバンド(101bp)であり、このF1♀をP♂(リンホシスチス病を発症したが生き残った個体)に戻し交配すると、その子孫は、No.3のバンド(101bp)をもつ個体と持たない個体にわかれる。
【００２３】
また、このバンドが観察された魚の数を表５にまとめる。
【表５】

【００２４】
もしこのバンドがリンホシスチス病抵抗性と無関係ならば、このバンドはリンホシスチス病発症魚とリンホシスチス病非発症魚とに等分に認められる筈である。得られたバンドとリンホシスチス病抵抗性との連鎖関係の確かさは、Lod Score （Kenneth F. Manly, et al., Map Manager QT, Roswell Park Cancer Institute (2000)）で示すことができ、本結果は表５より、Lod Score = 14.1 (= 24log(24/139) + (139-24)log(1-24/139) + 139log2)、即ち、１／１０^１４．１の確率でしかこのような連鎖関係は起こり得ないほど、このバンドとリンホシスチス病抵抗性の間の連鎖関係が確かなものであることを示している。
即ち、本実施例のプライマーを用いたＰＣＲ産物のNo.3のバンド(101bp)を有するものは、リンホシスチス病抵抗性の個体であると判別できる。このバンドは、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別するための特有マーカーであるといえる。
【００２５】
実施例２
下記１組のプライマーを合成し、これを用いて実施例１と同様の操作を行った。
F: 5’-GAGAGACAGAAGGTCGTCAACGGTA-3’ （配列番号３）
R: 5’-ACAAAGACCACGATGCAAAGTGAC-3’ （配列番号４）
その結果、表５に示すように、リンホシスチス病を発病しなかったヒラメ（非発症魚）の８９％で１３０ｂｐのバンドが観察され、リンホシスチス病を発病したヒラメ（発症魚）の２２％でこのバンドが観察された。その結果の一部を図３に示す。
図３の左の３レーンに示すように、F1♀がP♀(リンホシスチス病抵抗性を示した個体)から受け継いでいるのはNo.1のバンド(130bp)であり、このF1♀をP♂(リンホシスチス病を発症したが生き残った個体)に戻し交配すると、その子孫は、No.1のバンド(130bp)をもつ個体と持たない個体にわかれる。
【００２６】
もしこのバンドがリンホシスチス病抵抗性と無関係ならば、このバンドはリンホシスチス病発症魚とリンホシスチス病非発症魚とに等分に認められる筈である。得られたバンドとリンホシスチス病抵抗性との連鎖関係の確かさは、Lod Scoreで示すことができ、本結果は表５より、Lod Score = 14.8 (= 23log(23/139) + (139-23)log(1-23/139) + 139log2)、即ち、１／１０^１４．８の確率でしかこのような連鎖関係は起こり得ないほど、このバンドとリンホシスチス病抵抗性の間の連鎖関係が確かなものであることを示している。
即ち、本実施例のプライマーを用いたＰＣＲ産物のNo.1のバンド(130bp)を有するものは、リンホシスチス病抵抗性の個体であると判別できる。このバンドは、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別するための特有マーカーであるといえる。
【００２９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science and Technology Agency
<120> リンホシスチス病抵抗性の異体類及びその識別方法
<130> PS02-1198
<160> 4
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
atcagactca tcaggacctc ctgct 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
caaaagtttt acagagcaac agcgc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
gagagacaga aggtcgtcaa cggta 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
acaaagacca cgatgcaaag tgac 24
【図面の簡単な説明】
【図１】リンホシスチス病を発病したヒラメの一例を示す図である。
【図２】リンホシスチス病を発病しなかったヒラメ（非発症魚）とリンホシスチス病を発病したヒラメ（発症魚）について、配列番号１と２に示す配列のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル泳動を示す図である。図の上にはゲル泳動の生データを示し、図の下にその模式図を示す。
【図３】リンホシスチス病を発病しなかったヒラメ（非発症魚）とリンホシスチス病を発病したヒラメ（発症魚）について、配列番号３と４に示す配列のプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル泳動を示す図である。図の上にはゲル泳動の生データを示し、図の下にその模式図を示す。

Claims

下記（１）の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ヒラメのゲノムＤＮＡについてＰＣＲ反応を行うこと、及びこのＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１０１ｂｐのバンドがあることを確認することから成る、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別する方法。
（１）5'- ATCAGACTCATCAGGACCTCCTGCT-3' （配列番号１）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'- CAAAAGTTTTACAGAGCAACAGCGC-3' （配列番号２）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
下記（２）の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ヒラメのゲノムＤＮＡについてＰＣＲ反応を行うこと、及びこのＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１３０ｂｐのバンドがあることを確認することから成る、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別する方法。
（２）5'-GAGAGACAGAAGGTCGTCAACGGTA-3' （配列番号３）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-ACAAAGACCACGATGCAAAGTGAC-3' （配列番号４）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
下記（１）又は（２）のいずれかの１組のオリゴヌクレオチドから成る、リンホシスチス病抵抗性のヒラメを識別するためのＰＣＲ用プライマー。
（１）5'- ATCAGACTCATCAGGACCTCCTGCT-3' （配列番号１）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'- CAAAAGTTTTACAGAGCAACAGCGC-3' （配列番号２）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
（２）5'-GAGAGACAGAAGGTCGTCAACGGTA-3' （配列番号３）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-ACAAAGACCACGATGCAAAGTGAC-3' （配列番号４）の３’側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド