CN101275144A - 重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺 - Google Patents

重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺 Download PDF

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Abstract

一种重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，所述的构建方法包括：以嗜热菌中编码SOD的基因为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD，然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建；所述的发酵工艺：发酵过程经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物——SOD；本发酵方法可以实现SOD的高效表达，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上；它具有SOD有良好热稳定性与耐热性，表达产物占全菌蛋白的60％以上，且全部为可溶性蛋白，避免了包含体复性过程的种种麻烦；纯化工艺简单，产率高，成本低廉，终产物SOD的纯度高、活力高、稳定性强等特点。

Description

重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺
技术领域
本发明涉及的是一种重组耐高温超氧化物岐化酶的工程菌构建方法及高密度发酵和纯化工艺，属于基因工程制药技术领域。
背景技术
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase，以下简称SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶；根据其所结合金属离子的不同依次命名为Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是氧自由基的高效清除剂，同时具有抗肿瘤，抗疲劳，抗病及抗衰老等作用；该酶在食品、化妆品和医药等领域中都有重要应用。
目前，主要是通过从动物血液或植物组织中提取的方法获得SOD，因此SOD的产量在很大程度上受原材料的限制。许多研究者也曾对通过基因工程方法生产SOD进行了很多的探索，但现有方法仍存在如下问题：1)重组表达的SOD多是以无活性的包涵体形式存在，必须在纯化过程中增加变性和复性等步骤，因此，难以保证SOD的收率；2)所产SOD存在着活力低，热耐受性差，容易失活等问题，需要进行化学修饰后才能使用；3)重组表达量比较低，一般在20-40％的水平。
发明内容
本发明的目的是针对国内现有技术存在的不足，而提供一种能表达耐热超氧化物岐化酶的工程菌构建方法及高密度发酵和纯化工艺。
本发明所述的超氧化物岐化酶的工程菌构建方法，它包括：以嗜热菌中编码SOD的基因为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD。然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建。
所述的克隆载体和表达载体用的是同一种质粒-pET28a；用BL21(DE3)作为表达菌株。
本发明克隆了一种嗜热菌的SOD基因序列，并且成功构建了高效表达菌株。本发明涉及的SOD工程菌的构建及其表达方法，与现有技术相比具有以下优点：(1)克隆获得的SOD基因包含了SOD的整个结构基因。(2)构建得到的SOD工程菌表达产生的SOD具有良好热稳定性与耐热性。(3)表达产物占全菌蛋白的60％以上，且全部为可溶性蛋白，避免了包含体复性过程的种种麻烦。
本发明所述的超氧化物岐化酶工程菌的高密度发酵工艺：发酵过程经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物-SOD。本发酵方法可以实现SOD的高效表达，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上。
作为本发明的一种改进：发酵基本培养基按照如下表1进行配制；
表1高密度发酵基本培养基
  营养   终浓度
  胰蛋白胨   10g/L
  酵母提取物   10g/L
  NaCl   10g/L
  葡萄糖   20g/L
  K2HPO4   2g/L
  MgSO4·7H2O   0.25g/L
  (NH4)2SO4   5g/L
  Kana   50mg/L
作为本发明的一种改进：发酵用补料培养基按照如下表2进行配制，补料间隔为4-5h。
表2高密度发酵补料培养基
 成份   补料量   补料频率
 葡萄糖   80g   5h
 (NH4)2SO4   20g   5h
 K2HPO4   8g   5h
作为本发明的一种改进：发酵条件为溶氧30％、温度30℃、pH7.0、转速在200rpm到800rpm之间根据溶氧自动调节。
作为本发明的一种改进：发酵进行5-6小时，OD600为25-28时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM。
本发明所述的高密度发酵产物——超氧化物岐化酶的分离纯化工艺：它包括收集发酵产物，经ATS高压匀浆机将细胞破碎，使胞内酶完全释放出来得到粗酶液；然后将粗酶液经80℃水浴2-3小时，离心后上清为初分级产物；将初分级产物在70-80％的乙醇中沉淀，沉淀经干燥、重溶解、透析、浓缩、干燥后得到SOD纯品。
作为本发明的一种改进：发酵产物经ATS高压匀浆机破碎的工作压力为750-800bar；
作为本发明的一种改进：热纯化的条件是80℃水浴2-3小时；
作为本发明的一种改进：SOD在乙醇中沉淀的乙醇终浓度为70％～80％；
本发明涉及的SOD发酵产物的分离纯化工艺具有以下优点：(1)整个过程采用物理方法，避免了化学试剂的污染；(2)纯化工艺简单，产率高，成本低廉；(3)终产物SOD的纯度高、活力高、耐热性强、半衰期长。
本发明是一种关于超氧化物岐化酶(SOD)表达菌株的构建、高密度发酵以及分离纯化的工艺方法。我们克隆了嗜热菌的SOD序列，构建出表达耐热SOD的质粒pSOD，并且利用工程菌将其表达，得到耐热SOD蛋白。之后，通过对其高密度发酵条件的研究，建立起高密度发酵SOD的工艺流程。发酵产物经过高压破碎-热纯化-乙醇沉淀-透析等方法得到高纯度、高活力、高稳定性的SOD。
本发明构建的SOD工程菌能够进行高效表达，表达量可占菌体蛋白的60％以上。并且具有极高的耐热性，能够耐90℃高温而不丧失活力。纯化后的SOD可以达到电泳纯级别，比活力达6000～9000U每毫克蛋白。
附图说明
图1是表达菌株摇瓶诱导后总蛋白在12.5％SDS-PAGE电泳图谱；
图2是表达菌株高密度发酵后菌体总蛋白在12.5％SDS-PAGE电泳图谱；
图3是SOD纯化后12.5％SDS-PAGE电泳图谱；
具体实施方式
本发明所述的超氧化物岐化酶的工程菌构建方法，它包括：以嗜热菌的SOD基因为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD。然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建。
作为本发明的一种改进：克隆载体和表达载体用的是同一种质粒-pET28a；
作为本发明的一种改进：用BL21(DE3)作为表达菌株。
本发明所述的超氧化物岐化酶工程菌的高密度发酵工艺：发酵过程经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物-SOD。本发酵方法可以实现SOD的高效表达，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上。
作为本发明的一种改进：发酵基本培养基按照如下表3进行配制；
表3高密度发酵基本培养基
 营养   终浓度
 胰蛋白胨   10g/L
 酵母提取物   10g/L
 NaCl   10g/L
 葡萄糖   20g/L
 K2HPO4   2g/L
 MgSO4·7H2O   0.25g/L
 (NH4)2SO4   5g/L
 Kana   50mg/L
作为本发明的一种改进：发酵用补料培养基按照如下表4进行配制，补料间隔为4-5h。
表4高密度发酵补料培养基
  成份   补料量   补料频率
  葡萄糖   80g   5h
  (NH4)2SO4   20g   5h
  K2HPO4   8g   5h
作为本发明的一种改进：发酵条件为溶氧30％、温度30℃、pH7.0、转速在200rpm到800rpm之间根据溶氧自动调节。
作为本发明的一种改进：发酵进行5-6小时，OD600为25-28时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM。
本发明所述的高密度发酵产物——超氧化物岐化酶的分离纯化工艺：它包括收集发酵产物，经ATS高压匀浆机将细胞破碎，使胞内酶完全释放出来得到粗酶液；然后将粗酶液经80℃水浴2小时，离心后上清为初分级产物；将初分级产物在60％的乙醇中沉淀，沉淀经干燥、重溶解、透析、浓缩、干燥后得到SOD纯品。
作为本发明的一种改进：发酵产物经ATS高压匀浆机破碎的工作压力为750-800bar；
作为本发明的一种改进：热纯化的条件是80℃水浴2-3小时；
作为本发明的一种改进：SOD在乙醇中沉淀的乙醇浓度为70-80％；
以下通过实例对本发明作进一步的描述：
实施例1、SOD工程菌的构建及诱导表达
(1)PCR扩增耐热SOD基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD。然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建。
(2)LB培养基中加入卡那霉素至终浓度为30mg/L，接种SOD工程菌单菌落，37℃振荡培养2小时，加入0.5mM IPTG，继续在30℃条件下培养8小时；
(3)离心收集菌体并重悬于500ml裂解缓冲液中；裂解缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0。
(4)用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，功率设定为400W，工作时间1.5S，间歇时间1.5S，工作总时间30min；离心(20000g，10min)后收集上清和沉淀，分别进行12.5％SDS-PAGE电泳分析，结果见图1。
电泳结果表明，SOD工程菌诱导表达SOD最适宜条件如下：先在37℃条件下培养2小时，加入0.5mmol IPTG后在30℃条件下继续培养8小时，外源蛋白SOD获得高水平表达，目的蛋白占菌体总蛋白的60％以上，且全部以可溶性蛋白存在于细胞裂解液上清中。
实施例2、SOD工程菌的高密度发酵
(1)发酵罐基本培养基成份按表2所示，补料成份按表3所示；
(2)一级种子培养：20ml LB液体培养基中接种甘油菌5ul，kana终浓度50mg/L，37℃，220rpm，培养10h；
(3)二级种子培养：将上一步培养好的菌液转移至200mlLB液体培养基，kana终浓度50mg/L，37℃，220rpm，培养4h；
(4)上罐发酵：将上一步培养的200ml二级种子菌液接种到容积为6.6L的发酵罐中。发酵条件为：溶氧30％、温度30℃、pH7.0、转速在200rpm到800rpm之间根据溶氧自动调节；
(5)发酵进行5-6小时，OD600约为25-28时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM。发酵进行20h左右，待菌体不在产酸并且耗氧持续减少时停止发酵，离心收集菌体。
实施例3：SOD工程菌高密度发酵产物的电泳检测
菌体在300W超声波下超声破碎后，8000g离心20min，分别将菌体破碎之后的上清和沉淀进行12.5％的SDS-PAGE电泳，结果如图2。图中的标号说明分别为1-诱导前裂菌上清；2-诱导5小时裂菌上清；3-诱导10小时裂菌上清；4-诱导14小时裂菌上清；5-诱导前裂菌沉淀；6-诱导5小时裂菌沉淀；7-诱导10小时裂菌沉淀；8-诱导14小时裂菌沉淀；9-发酵液上清；10-Marker(14400-97000).
结果显示，诱导前无SOD目的蛋白产生，诱导之后SOD蛋白全部以可溶性蛋白的形式出现。
实施例4：SOD工程菌收菌后的破碎及SOD的纯化
(1)将离心后的菌体，称12g，溶于200ml Buffer A(10mMTris-HCl，pH8.0)，加溶菌酶至终浓度50mg/L，室温震荡30min；
(2)ATS高压匀浆机破碎，破碎压力为800bar；
(3)80℃水浴加热2h；
(4)待冷却至室温后12000g，4℃，离心30min；
(5)收集上清，调pH＝6.92；
(6)缓缓加入4℃预冷的95％的乙醇，并不断搅拌V乙醇∶V酶上清＝2∶1；
(7)4℃静置30min后，12000g，4℃，离心30min；
(8)弃上清，沉淀在40℃烘箱中烘干多余的乙醇；
(9)用Buffer A重溶解乙醇沉淀后透析过夜；
(10)透析之后的产物分装干燥、制成成品。
(11)蛋白质纯度检测：12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对最终产品进行电泳分析，结果如图3所示，本方法纯化的SOD已达到电泳纯的级别。
实施例5：纯化SOD的测活
以Marklund的邻苯三酚自氧化法测定纯化蛋白的酶活力：
测活的工作Buffer为pH8.0的10mM的Tris-HCl，底物为邻苯三酚，定义在1ml体系内SOD抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时所需的酶量为一个活力单位。结果表明，纯化的SOD的最终比活力为6000～9000U/mg。

Claims (9)

1. 一种重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，它包括：以嗜热菌中编码SOD的基因为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD，然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建。
2. 根据权利要求1所述的重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其特征在于所述的双酶切位点是EcoR I和Sal I。
3. 根据权利要求1所述的重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其特征在于所述的克隆载体和表达载体用的是同一种质粒-pET28a；用BL21(DE3)作为表达菌株。
4. 一种重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，该发酵工艺至少包括：经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物-SOD，且该发酵工艺可以实现SOD的高效表达，使目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上。
5. 根据权利要求4所述的重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其特征在于发酵基本培养基按照如下表5进行配制；发酵用补料培养基按照如下表6进行配制，补料间隔为4-5h。
表5高密度发酵基本培养基
  营养   终浓度   胰蛋白胨   10g/L   酵母提取物   10g/L   NaCl   10g/L   葡萄糖   20g/L   K2HPO4   2g/L   MgSO4·7H2O   0.25g/L   (NH4)2SO4   5g/L   Kana   50mg/L
表6高密度发酵补料培养基
 成份   补料量   补料频率  葡萄糖   80g   5h  (NH4)2SO4   20g   5h  K2HPO4   8g   5h
。
6. 根据权利要求4或5所述的重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其特征在于所述的发酵条件为溶氧30％、温度30℃、pH7.0、转速在200rpm到800rpm之间根据溶氧自动调节。
7. 根据权利要求6所述的重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其特征在于所述的发酵进行5-6小时，OD600为25-28时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM。
8. 一种重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，它包括收集发酵产物，经ATS高压匀浆机将细胞破碎，使胞内酶完全释放出来得到粗酶液；然后将粗酶液经80℃水浴2小时，离心后上清为初分级产物；将初分级产物在60％的乙醇中沉淀，沉淀经干燥、重溶解、透析、浓缩、干燥后得到SOD纯品。
9. 根据权利要求8所述的重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其特征在于所述的发酵产物经ATS高压匀浆机破碎的工作压力为750-800bar；热纯化的条件是80℃水浴2小时；SOD在乙醇中沉淀的乙醇浓度为65％。
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