CN107513517A - 重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法 - Google Patents

重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其包括：将构建好的重组分泌型大肠杆菌进行原始菌种保存；筛选高表达菌种；将筛选得到的高表达菌种进行工作菌种保存；将工作菌种进行活化；转接摇瓶扩大培养；接种发酵罐进行高密度发酵。通过调节罐压、通气量、搅拌速度、补料速度控制溶氧条件；根据溶氧、pH值等变化调节补料培养基的流加速度；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度，调节菌体生长速度，降温发酵至结束。本发明具有表达目的蛋白的概率高、大幅降低外来菌种进入而导致菌种异常的风险、生长密度大、发酵周期短、操作简单且低成本的优点。

Description

重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法。
背景技术
蛋白分泌表达是指重组异源蛋白通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。重组蛋白分泌表达的优势在于胞周质或胞外分泌表达过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N-末端，如果含甲硫氨酸可能会降低产物的可溶性和稳定性，大肠杆菌的胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化环境，有利于二硫键的正确形成，并增强巯基蛋白的正确折叠，使活性蛋白质的产量得到提高，蛋白分泌性表达，减少了对宿主菌的毒性和代谢负担，使宿主菌适应性增加，且周质空间和胞外培养基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的纯化。
大肠杆菌具有结构简单、遗传背景清晰、生产周期短、生长条件清楚等优点。随着基因工程技术和大规模发酵培养技术的发展，重组大肠杆菌越来越多地应用到重组蛋白药物、氨基酸、酶制剂等产品的大规模生产中。重组分泌型大肠杆菌表达系统与传统胞内表达系统相比有很大优势。但由于重组分泌型大肠杆菌稳定性较差，长期传代培养容易发生菌种退化，活力降低，导致生产中产品产量和质量降低。传统的发酵方法和补料方法，无法使菌体生长到高密度，限制了产品产量的提升。因此，研发重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法具有重大的意义。
在中国发明专利申请公开说明书CN104293668A中公开了一种重组大肠杆菌高密度发酵的方法，采用三级菌种保藏方法保藏构建后的重组大肠杆菌，并经过活化、摇瓶培养、种子罐培养后转入发酵罐进行通气搅拌发酵罐培养，在发酵罐培养过程中通过提高搅拌转速及空气流量来保证溶解氧水平，并根据pH的变化调整补料速度，当菌体生长至一定阶段后加入诱导剂，并降温发酵至结束。这种方法采用了三级菌种保藏方法，一定程度上提升了有效保藏期，降低了发酵过程中由于菌种退化出现生产异常现象的概率，但所用菌种表达目的蛋白的概率仍然取决于构建后的重组大肠杆菌，且保藏方法复杂，涉及到无菌条件下的分装和真空冷冻干燥等工艺，对操作人员和设备的要求高，成本高，而且提升了因外来菌种的进入而导致菌种异常的风险。此外，优化了发酵、补料培养基及补料方法，一定程度上改善了菌体快速生长代谢所需营养条件及外部环境，提高了放罐时菌体含量及产物产量，但仍需进一步优化高密度发酵工艺，提升细菌生长密度，缩短发酵周期，提升产品产量和质量。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种表达目的蛋白的概率高、大幅降低外来菌种进入而导致菌种异常的风险、生长密度大、发酵周期短、操作简单且低成本的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，提出一种重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，包括下列步骤：
将构建好的重组分泌型大肠杆菌进行原始菌种保存；筛选高表达菌种；将所述筛选得到的高表达菌种进行工作菌种保存；将所述工作菌种进行活化；转接摇瓶扩大培养；接种发酵罐进行高密度发酵；所述接种发酵罐进行高密度发酵包括下列步骤：通过调节罐压、通气量、搅拌速度、补料速度控制溶氧条件；根据溶氧、pH值等变化调节补料培养基的流加速度；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度，调节菌体生长速度，降温发酵至结束。
作为优选，所述接种发酵罐进行高密度发酵包括下列步骤：将上罐种子液按1:50比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件包括：转速200-400转/分，通气量20-40升/分，罐压0.005-0.015MPa，pH6.8-7.2，温度35-39℃；当细菌密度增加，溶氧逐渐降低，提高转速，通气量，罐压等条件，调节补料培养基流加速度，保持溶氧不低于20%；所述发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.2-0.4%，磷酸二氢钠0.05-0.15%，氯化钾0.1-0.2%，葡萄糖0.06-0.1%，柠檬酸三钠0.05-0.15%，硫酸铵0.4-0.6%，酵母粉0.1-0.3%，蛋白胨0.3-0.5%，硫酸镁0.2-0.4%，微量元素0.05-0.15%；所述补料培养基包括：葡萄糖30-70%，酵母粉0.5-1.5%，蛋白胨1-5%。
作为优选，所述初始培养条件包括：转速300转/分，通气量30升/分，罐压0.01MPa，pH7.0，温度37℃。
作为优选，所述发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.3%，磷酸二氢钠0.1%，氯化钾0.15%，葡萄糖0.08%，柠檬酸三钠0.1%，硫酸铵0.5%，酵母粉0.2%，蛋白胨0.4%，硫酸镁0.3%，微量元素0.1%；所述补料培养基包括：葡萄糖50%，酵母粉1%，蛋白胨3%。
作为优选，所述原始菌种保存包括下列步骤：将构建好的重组分泌型大肠杆菌以1%的比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃、转速为200转/分的恒温空气摇床培养4-12小时，检测OD600值在2.0-3.0之间，取样染色镜检确认无杂菌污染后，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
作为优选，所述筛选高表达菌种包括下列步骤：将构建好的重组分泌型大肠杆菌按1:10接种于含抗生素的液体筛选培养基；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.04-0.08%、蛋白胨0.10-0.14%、氯化钠0.10-0.14%、硫酸镁0.02-0.06%、氯化钾0.3-0.4%、2-8mM Tris；所述液体筛选培养基用稀盐酸调节pH至7.0-7.2；在35-39℃的恒温空气摇床培养8-24小时后，测量菌液OD600并做镜检，摇瓶取样做全菌和裂解液电泳，根据电泳结果评定表达结果最好的菌株作为工作菌种。
作为优选，所述液体筛选培养基的体积为50ml；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.06%、蛋白胨0.12%、氯化钠0.12%、硫酸镁0.04%、氯化钾0.34%、5mM Tris；所述恒温空气摇床培养时的转速为200转/分。
作为优选，所述工作菌种保存包括下列步骤：将原始菌种划线接种于含抗生素的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养4-12小时，检测OD600值在2.0-3.0之间，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
作为优选，所述工作菌种进行活化包括下列步骤：将筛选出的工作菌种按1:250比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，制得工作种子液；所述LB液体培养基包括：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，所述LB液体培养基的pH为6.8-7.4。
作为优选，所述扩大培养包括下列步骤：将工作种子液按1:100接种于1500ml 摇瓶液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养2-8小时，检测OD600值在2.0-3.0之间，制得上罐种子液；所述摇瓶液体培养基包括蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；所述摇瓶液体培养基的pH为6.8-7.4。
本发明具有以下有益效果：
1、在接种发酵罐进行高密度发酵过程中，通过调节罐压、通气量、搅拌速度、补料速度控制溶氧条件，优化了溶氧条件的控制方法；根据溶氧、pH值等变化调节补料培养基的流加速度，优化了调节补料培养基流加速度的依据；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度，调节菌体生长速度，优化了调节菌体生长速度的方法。优化了基础培养基、补料培养基和补料方法，保证了菌体快速生长所需的营养条件和培养条件，大大提高了细菌生长密度，缩短发酵周期，提升了产品产量和质量。
2、从原始菌种中先筛选出高表达菌种作为工作菌种，再进行进一步的操作，而不是直接将原始菌种作为工作菌种，大大提升了表达目的蛋白的概率。
3、在原始菌种保存、筛选高表达菌种、工作菌种保存、工作菌种进行活化步骤中所采用的LB液体培养基中均含有抗生素，大幅降低外来菌种进入而导致菌种异常的风险。
4、将构建好的重组分泌型大肠杆菌先进行原始菌种保存，再筛选出高表达菌种作为工作菌种保存，从工作菌种出发，经过活化、扩大培养，最后接种发酵罐进行高密度发酵，大大提高了保存菌种的稳定性，减少了菌种传代退化，使得发酵批间重复性得到提高。
附图说明
图1是本发明实施例1的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法的流程图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，包括下列步骤：
（1）将构建好的重组分泌型大肠杆菌进行原始菌种保存。将构建好的重组分泌型大肠杆菌以1%的比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃、转速为200转/分的恒温空气摇床培养8小时，检测OD600值为2.5，取样染色镜检确认无杂菌污染后，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
（2）筛选高表达菌种。将构建好的重组分泌型大肠杆菌按1:10接种于含抗生素的50ml液体筛选培养基；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.06%、蛋白胨0.12%、氯化钠0.12%、硫酸镁0.04%、氯化钾0.34%、5mM Tris；所述液体筛选培养基用稀盐酸调节pH至7.1；在37℃的转速为200转/分的恒温空气摇床培养16小时后，测量菌液OD600并做镜检，摇瓶取样做全菌和裂解液电泳，根据电泳结果评定表达结果最好的菌株作为工作菌种。从原始菌种中先筛选出高表达菌种作为工作菌种，再进行进一步的操作，而不是直接将原始菌种作为工作菌种，大大提升了表达目的蛋白的概率。
（3）将所述筛选得到的高表达菌种进行工作菌种保存。将原始菌种划线接种于含抗生素的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养8小时，检测OD600值在2.5之间，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
（4）将所述工作菌种进行活化。将筛选出的工作菌种按1:250比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，制得工作种子液；所述LB液体培养基包括：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，所述LB液体培养基的pH为7.1。
在原始菌种保存、筛选高表达菌种、工作菌种保存、工作菌种进行活化步骤中所采用的LB液体培养基中均含有抗生素，大幅降低外来菌种进入而导致菌种异常的风险。
（5）转接摇瓶扩大培养。将工作种子液按1:100接种于1500ml 摇瓶液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养5小时，检测OD600值为2.5，制得上罐种子液；所述摇瓶液体培养基包括蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；所述摇瓶液体培养基的pH为7.1。
（6）接种发酵罐进行高密度发酵。将上罐种子液按1:50比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件为：转速300转/分，通气量30升/分，罐压0.01MPa，pH7.0，温度37℃。当细菌密度增加，溶氧逐渐降低，提高转速，通气量，罐压等条件，调节补料培养基流加速度，保持溶氧不低于20%；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度调节菌体生长速度，降温至发酵结束；所述的发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.3%，磷酸二氢钠0.1%，氯化钾0.15%，葡萄糖0.08%，柠檬酸三钠0.1%，硫酸铵0.5%，酵母粉0.2%，蛋白胨0.4%，硫酸镁0.3%，微量元素0.1%；所述补料培养基包括：葡萄糖50%，酵母粉1%，蛋白胨3%。在接种发酵罐进行高密度发酵过程中，通过调节罐压、通气量、搅拌速度、补料速度控制溶氧条件，优化了溶氧条件的控制方法；根据溶氧、pH值等变化调节补料培养基的流加速度，优化了调节补料培养基流加速度的依据；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度，调节菌体生长速度，优化了调节菌体生长速度的方法。优化了基础培养基、补料培养基和补料方法，保证了菌体快速生长所需的营养条件和培养条件，大大提高了细菌生长密度，缩短发酵周期，提升了产品产量和质量。
将构建好的重组分泌型大肠杆菌先进行原始菌种保存，再筛选出高表达菌种作为工作菌种保存，从工作菌种出发，经过活化、扩大培养，最后接种发酵罐进行高密度发酵，大大提高了保存菌种的稳定性，减少了菌种传代退化，使得发酵批间重复性得到提高。
实施例2
重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，包括下列步骤：
（1）将构建好的重组分泌型大肠杆菌进行原始菌种保存。将构建好的重组分泌型大肠杆菌以1%的比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃、转速为200转/分的恒温空气摇床培养4小时，检测OD600值为2.0，取样染色镜检确认无杂菌污染后，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
（2）筛选高表达菌种。将构建好的重组分泌型大肠杆菌按1:10接种于含抗生素的50ml液体筛选培养基；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.04%、蛋白胨0.10%、氯化钠0.10%、硫酸镁0.02%、氯化钾0.3%、2mM Tris；所述液体筛选培养基用稀盐酸调节pH至7.0；在35℃的转速为200转/分的恒温空气摇床培养8小时后，测量菌液OD600并做镜检，摇瓶取样做全菌和裂解液电泳，根据电泳结果评定表达结果最好的菌株作为工作菌种。
（3）将所述筛选得到的高表达菌种进行工作菌种保存。将原始菌种划线接种于含抗生素的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养4小时，检测OD600值为2.0，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
（4）将所述工作菌种进行活化。将筛选出的工作菌种按1:250比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，制得工作种子液；所述LB液体培养基包括：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，所述LB液体培养基的pH为6.8。
（5）转接摇瓶扩大培养。将工作种子液按1:100接种于1500ml 摇瓶液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养2小时，检测OD600值为2.0，制得上罐种子液；所述摇瓶液体培养基包括蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；所述摇瓶液体培养基的pH为6.8。
（6）接种发酵罐进行高密度发酵。将上罐种子液按1:50比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件为：转速200转/分，通气量20升/分，罐压0.005MPa，pH6.8，温度35℃。当细菌密度增加，溶氧逐渐降低，提高转速，通气量，罐压等条件，调节补料培养基流加速度，保持溶氧不低于20%；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度调节菌体生长速度，降温至发酵结束；所述的发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钠0.05%，氯化钾0.1%，葡萄糖0.06%，柠檬酸三钠0.05%，硫酸铵0.4%，酵母粉0.1%，蛋白胨0.3%，硫酸镁0.2%，微量元素0.05%；所述补料培养基包括：葡萄糖30%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%。
实施例3
重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，包括下列步骤：
（1）将构建好的重组分泌型大肠杆菌进行原始菌种保存。将构建好的重组分泌型大肠杆菌以1%的比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃、转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，检测OD600值为3.0，取样染色镜检确认无杂菌污染后，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
（2）筛选高表达菌种。将构建好的重组分泌型大肠杆菌按1:10接种于含抗生素的50ml液体筛选培养基；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.08%、蛋白胨0.14%、氯化钠0.14%、硫酸镁0.06%、氯化钾0.4%、8mM Tris；所述液体筛选培养基用稀盐酸调节pH至7.2；在39℃的转速为200转/分的恒温空气摇床培养24小时后，测量菌液OD600并做镜检，摇瓶取样做全菌和裂解液电泳，根据电泳结果评定表达结果最好的菌株作为工作菌种。
（3）将所述筛选得到的高表达菌种进行工作菌种保存。将原始菌种划线接种于含抗生素的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，检测OD600值为3.0，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
（4）将所述工作菌种进行活化。将筛选出的工作菌种按1:250比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，制得工作种子液；所述LB液体培养基包括：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，所述LB液体培养基的pH为7.4。
（5）转接摇瓶扩大培养。将工作种子液按1:100接种于1500ml 摇瓶液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养8小时，检测OD600值在3.0之间，制得上罐种子液；所述摇瓶液体培养基包括蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；所述摇瓶液体培养基的pH为7.4。
（6）接种发酵罐进行高密度发酵。将上罐种子液按1:50比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件为：转速400转/分，通气量40升/分，罐压0.015MPa，pH7.2，温度39℃。当细菌密度增加，溶氧逐渐降低，提高转速，通气量，罐压等条件，调节补料培养基流加速度，保持溶氧不低于20%；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度调节菌体生长速度，降温至发酵结束；所述的发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.4%，磷酸二氢钠0.15%，氯化钾0.2%，葡萄糖0.1%，柠檬酸三钠0.15%，硫酸铵0.6%，酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.4%，微量元素0.15%；所述补料培养基包括：葡萄糖70%，酵母粉1.5%，蛋白胨5%。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于包括下列步骤：
将构建好的重组分泌型大肠杆菌进行原始菌种保存；
筛选高表达菌种；
将所述筛选得到的高表达菌种进行工作菌种保存；
将所述工作菌种进行活化；
转接摇瓶扩大培养；
接种发酵罐进行高密度发酵；所述接种发酵罐进行高密度发酵包括下列步骤：通过调节罐压、通气量、搅拌速度、补料速度控制溶氧条件；根据溶氧、pH值等变化调节补料培养基的流加速度；待菌体达到高密度后，通过控制补料培养基的流加速度，调节菌体生长速度，降温发酵至结束。
2.根据权利要求1所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于所述接种发酵罐进行高密度发酵包括下列步骤：
将上罐种子液按1:50比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件包括：转速200-400转/分，通气量20-40升/分，罐压0.005-0.015MPa，pH6.8-7.2，温度35-39℃；当细菌密度增加，溶氧逐渐降低，提高转速，通气量，罐压等条件，调节补料培养基流加速度，保持溶氧不低于20%；所述发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.2-0.4%，磷酸二氢钠0.05-0.15%，氯化钾0.1-0.2%，葡萄糖0.06-0.1%，柠檬酸三钠0.05-0.15%，硫酸铵0.4-0.6%，酵母粉0.1-0.3%，蛋白胨0.3-0.5%，硫酸镁0.2-0.4%，微量元素0.05-0.15%；所述补料培养基包括：葡萄糖30-70%，酵母粉0.5-1.5%，蛋白胨1-5%。
3.根据权利要求2所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于所述初始培养条件包括：
转速300转/分，通气量30升/分，罐压0.01MPa，pH7.0，温度37℃。
4.根据权利要求2所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于：
所述发酵基础培养基包括：磷酸氢二钾0.3%，磷酸二氢钠0.1%，氯化钾0.15%，葡萄糖0.08%，柠檬酸三钠0.1%，硫酸铵0.5%，酵母粉0.2%，蛋白胨0.4%，硫酸镁0.3%，微量元素0.1%；
所述补料培养基包括：葡萄糖50%，酵母粉1%，蛋白胨3%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述原始菌种保存包括下列步骤：
将构建好的重组分泌型大肠杆菌以1%的比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃、转速为200转/分的恒温空气摇床培养4-12小时，检测OD600值在2.0-3.0之间，取样染色镜检确认无杂菌污染后，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于所述筛选高表达菌种包括下列步骤：
将构建好的重组分泌型大肠杆菌按1:10接种于含抗生素的液体筛选培养基；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.04-0.08%、蛋白胨0.10-0.14%、氯化钠0.10-0.14%、硫酸镁0.02-0.06%、氯化钾0.3-0.4%、2-8mM Tris；所述液体筛选培养基用稀盐酸调节pH至7.0-7.2；
在35-39℃的恒温空气摇床培养8-24小时后，测量菌液OD600并做镜检，摇瓶取样做全菌和裂解液电泳，根据电泳结果评定表达结果最好的菌株作为工作菌种。
7.根据权利要求6所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于：
所述液体筛选培养基的体积为50ml；所述液体筛选培养基包括：酵母粉0.06%、蛋白胨0.12%、氯化钠0.12%、硫酸镁0.04%、氯化钾0.34%、5mM Tris；
所述恒温空气摇床培养时的转速为200转/分。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述工作菌种保存包括下列步骤：
将原始菌种划线接种于含抗生素的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养4-12小时，检测OD600值在2.0-3.0之间，取菌液和30%甘油按1:1比例混匀后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于所述工作菌种进行活化包括下列步骤：
将筛选出的工作菌种按1:250比例接种于含抗生素的50ml LB液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养12小时，制得工作种子液；所述LB液体培养基包括：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，所述LB液体培养基的pH为6.8-7.4。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的重组分泌型大肠杆菌高密度发酵方法，其特征在于所述扩大培养包括下列步骤：
将工作种子液按1:100接种于1500ml 摇瓶液体培养基，在37℃，转速为200转/分的恒温空气摇床培养2-8小时，检测OD600值在2.0-3.0之间，制得上罐种子液；所述摇瓶液体培养基包括蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；所述摇瓶液体培养基的pH为6.8-7.4。
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