CN116496996A - 一种重组大肠杆菌生产sod的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其包括如下步骤：S1菌株筛选：将构建的表达SOD的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶表达量筛选，得到的菌株进行高压发酵菌株筛选；S2种子活化：将S1筛选的菌株进行一级种子活化和二级种子活化；S3分批补料发酵：在灭菌后的基础培养基中接种S2获得的种子菌，进行分批发酵、一次补料发酵、诱导二次补料发酵获得，发明所提供的工艺，通过筛选、活化和发酵的条件设计，可以运用到了不同的表达菌株中，最终缩短的分批补料的发酵周期（17~19h），且提高了表达量（18~22g/L），最终比酶活可以达到20000U/mg。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺。
背景技术
超氧化物歧化酶，英文名为Superoxide Dismutase,简称：SOD。超氧化物歧化酶是自由基(O2-)清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基(O2-)，而自由基(O2-)具有细胞毒性，能使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症、肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老，因此在抗衰老、抗氧化、抗疲劳、调节体内自由基紊乱等方面均有应用。
目前，SOD的来源分别由动物提取、植物提取和微生物重组表达，动物提取存在一定的安全隐患，植物提取过程较为复杂且活性相对有限，微生物重组表达可以有效解决这两个问题，而且成本相对较低，过程简单且可控。现有的微生物表达多为部分基因替换修改后在再进行表达，例如CN112725295A公开了一种重组型超氧化物歧化酶(简称重组型SOD)及编码所述重组型SOD的基因和相关的表达载体、转基因细胞系和宿主菌，该重组型SOD经试验检验，具有极好的热稳定性、极好的酸碱耐受性和较好的常用防腐剂耐受性。CN111235121A涉及一种高稳定型的超氧化物歧化酶高效表达载体，还涉及上述的载体的构建以及应用，制备的载体所表达出来的蛋白稳定性高；工程菌表达产量大。而在不改变原始氨基酸排序的前提下，通过发酵工艺进行SOD的表达，其表达速度和酶活并不太理想。
有鉴于此，需要提供一种新的发酵工艺，在不改变原始氨基酸排序的前提下，即可获得理想表达速度和酶活性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，以提高SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和酶活性，缩短发酵周期，节约生产成本。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其包括如下步骤：
S1菌株筛选：将构建的表达SOD的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶表达量筛选，得到的菌株进行高压发酵菌株筛选；
S2种子活化：将S1筛选的菌株进行一级种子活化和二级种子活化；
S3分批补料发酵：在灭菌后的基础培养基中接种S2获得的种子菌，进行分批发酵、一次补料发酵、诱导二次补料发酵获得。
作为本发明的一些优选实施方案，所述基础培养基的配方如下：
所述S3中一次补料发酵中所用的补料1的配方如下：
| 药品 | 用量 |
| 蛋白胨 | 50～100g/L |
| 酵母粉 | 50～100g/L |
| 葡萄糖 | 50～100g/L |
| 甘油 | 100～150g/L |
| 硫酸镁 | 10～20g/L |
| 硫酸钠 | 10～15g/L |
| 微量元素 | 0.5～1.0mL/L |
所述S3中二次补料发酵中所用的补料2的配方如下：
| 药品 | 用量 |
| 甘油 | 200～300g/L |
| 硫酸铵 | 20～30g/L |
| 硫酸铜 | 10～20g/L |
| 硫酸钠 | 10～15g/L |
| 微量元素 | 0.5～1.0mL/L |
作为本发明的一些优选实施方案，所述S3中分批发酵条件为：在灭菌后的基础培养基中以3～5％接种量接种，35～37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制20％～40％。
作为本发明的一些优选实施方案，所述S3中一次补料发酵条件为：发酵4～6h待溶氧快速升高至60％时进行补料1补料，罐温35～37℃，罐压0.05～0.15Mpa进行补料发酵，溶氧控制30％～50％。
作为本发明的一些优选实施方案，所述S3中诱导二次补料发酵条件为；当补料发酵值OD600值为40～100时添加IPTG进行诱导发酵，罐温为25～28℃，罐压0.1～0.15Mpa，溶氧控制40％～60％，更换补料1为补料2。
作为本发明的一些优选实施方案，所述S1中摇瓶发酵为在180～220rpm，35～37℃于LB培养基中培养10～15h，接种于基础培养基的摇瓶中，培养2～6h后添加诱导剂进行诱导12～15h，筛选表达量高的菌株；所述高压发酵为将筛选的菌株接种到发酵罐中，控制罐压在0.05～0.15MPa之间，溶氧30％～60％之间，发酵4～6h，补加补料1，再发酵10h，得到菌株进行卡那抗性平板筛选。
作为本发明的一些优选实施方案，所述S2中种子活化为将-80℃保藏的SOD的大肠杆菌接种于LB培养基中进行一级种子活化；一级种子活化条件为180～220rpm，35～37℃培养10～15h；活化后的一级种子进行二级活化，二级种子活化180～220rpm，35～37℃培养3～5h。
作为本发明的一些优选实施方案，所述微量元素的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 氯化铁 | 0.6～0.8 |
| 硫酸锰 | 0.7～0.9 |
| 硫酸镁 | 1.9～2.1 |
| 氯化钴 | 0.03～0.05 |
| 硫酸锌 | 2.8～3.2 |
| 硼酸 | 0.09～0.11 |
| 硫酸钙 | 0.01～0.03 |
| 硫酸铵 | 9～11 |
| 氯化铜 | 1.4～1.6 |
。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明工艺将分批补料发酵分为三个阶段进行控制，对补料、溶氧、发酵温度、发酵压力进行了更为严格的控制精确的方法，特别是在诱导阶段采用25～28℃罐温、0.12～0.15Mpa罐压、40％～60％溶氧的工艺进行控制，并进行二次补料，获得了较高的表达量和比酶活。
本发明所提供的工艺，通过筛选、活化和发酵的条件设计，使得本工艺可以运用到了不同的表达菌株中，最终缩短的分批补料的发酵周期(17～19h)，且提高了表达量(18～22g/L)，最终比酶活可以达到20000U/mg。
本发明所提供的工艺，重复性高，工业应用性强，为SOD的规模性生产提供切实可靠的依据。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例1中的发酵过程控制图；
图2是本发明实施例1中的SDS-PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD1表示破菌后的蛋白泳道；
图3是本发明实施例2中的发酵过程控制图；
图4是本发明实施例2中的SDS-PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD2表示破菌后的蛋白泳道。
图5是本发明对比例1中的发酵过程控制图；
图6是本发明对比例1中的SDS-PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD2表示破菌后的蛋白泳道。
图7是本发明对比例2中的发酵过程控制图；
图8是本发明对比例2中的SDS-PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD2表示破菌后的蛋白泳道。
图9是本发明对比例3中的发酵过程控制图；
图10是本发明对比例3中的SDS-PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD表示破菌后的蛋白泳道。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
如无特别说明，本实施方式部分所使用的设备为常规设备，所用的试剂均为常规试剂，均可以商购取得，所用的操作方法均记载在本领域教科书籍中。
实施例1
培养基和补料的准备：
基础培养基的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 30 |
| 酵母粉 | 10 |
| 葡萄糖 | 20 |
| 磷酸氢二钾 | 20 |
| 磷酸二氢钾 | 6 |
| 硫酸铵 | 4 |
| 硫酸镁 | 3 |
| 硫酸钠 | 2 |
| 硫酸亚铁 | 0.1 |
微量元素1.0mL/L。
补料1的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 100 |
| 酵母粉 | 50 |
| 葡萄糖 | 100 |
| 甘油 | 100 |
| 硫酸镁 | 20 |
| 硫酸钠 | 10 |
微量元素0.5mL/L。
补料2的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 甘油 | 300 |
| 硫酸铵 | 30 |
| 硫酸铜 | 20 |
| 硫酸钠 | 15 |
微量元素0.5mL/L。
微量元素的配方如下：
发酵工艺步骤如下：
S1：菌株筛选
1.1高表达量菌株筛选：把构建好的大肠杆菌BL21(DE3)-SOD 1接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中，37℃，220rpm摇床培养12h，以5％接种量接种于200mL基础培养基摇瓶中培养2h，添加IPTG进行诱导，诱导培养14h，测定表达量，保藏表达量高的菌株1株。
1.2高压发酵菌株筛选：将1.1保存的菌株接种到5L发酵罐中，初始控制罐压在0.05MPa，溶氧30％，发酵4h；补加补料1，罐压在2h内提升至0.15MPa，溶氧逐渐提升至60％发酵10h。发酵后的菌株进行卡那抗性平板筛选带有目的蛋白的菌株。
S2：种子活化
-80℃保藏的BL21(DE3)-SOD 1以1‰接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中进行一级种子活化；活化条件为220rpm，37℃培养12h，接种于200mL基础培养基摇瓶中进行二级活化，220rpm，37℃培养5h。
S3：分批补料发酵
在灭菌后的基础培养基中以5％接种量接种，35℃，罐压0.05Mpa进行分批发酵，溶氧控制20％，发酵5h溶氧快速升高至60％时，进行补料1补料，罐温35℃，2h内罐压逐渐提升至0.15Mpa进行补料发酵，溶氧逐渐提升至50％。发酵7h，当补料发酵值OD600值为40时添加1.0mM/L的IPTG进行诱导发酵，罐温为25℃，罐压0.1Mpa，溶氧控制60％，更换补料1为补料2，发酵结束OD值达到152，菌体湿重210g/L，SOD表达量可达18g/L，比酶活19983U/mg。
实施例2
培养基和补料的准备：
基础培养基的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 10 |
| 酵母粉 | 30 |
| 葡萄糖 | 10 |
| 磷酸氢二钾 | 10 |
| 磷酸二氢钾 | 3 |
| 硫酸铵 | 2 |
| 硫酸镁 | 1 |
| 硫酸钠 | 2 |
| 硫酸亚铁 | 0.2 |
微量元素2.0mL/L。
补料1的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 50 |
| 酵母粉 | 100 |
| 葡萄糖 | 50 |
| 甘油 | 150 |
| 硫酸镁 | 10 |
| 硫酸钠 | 15 |
微量元素1.0mL/L。
补料2的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 甘油 | 200 |
| 硫酸铵 | 20 |
| 硫酸铜 | 10 |
| 硫酸钠 | 10 |
微量元素1.0mL/L。
微量元素的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 氯化铁 | 0.7 |
| 硫酸锰 | 0.8 |
| 硫酸镁 | 2.0 |
| 氯化钴 | 0.04 |
| 硫酸锌 | 3.0 |
| 硼酸 | 0.1 |
| 硫酸钙 | 0.02 |
| 硫酸铵 | 10 |
| 氯化铜 | 1.5 |
发酵工艺步骤如下：
S1：菌株筛选
1.1高表达量菌株筛选：把构建好的大肠杆菌BL21(DE3)-SOD 2接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中，37℃，220rpm摇床培养12h，以5％接种量接种于200mL基础培养基摇瓶中培养6h，添加IPTG进行诱导，诱导培养10h，测定表达量，保藏表达量高的菌株1株。
1.2高压发酵菌株筛选：将1保存的菌株接种到5L发酵罐中，初始控制罐压在0.05MPa，溶氧30％，发酵6h；补加补料1，罐压在2h内提升至0.12MPa，溶氧逐渐提升至60％再发酵12h。发酵后的菌株进行卡那抗性平板筛选带有目的蛋白的菌株。
S2：种子活化
-80℃保藏的BL21(DE3)-SOD 2以1‰接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中进行一级种子活化；活化条件为220rpm，37℃培养14h，接种于200mL基础培养基摇瓶中进行二级活化，220rpm，37℃培养3h。
S3：分批补料发酵
在灭菌后的基础培养基中以5％接种量接种，37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制25％，待发酵5h溶氧快速升高至60％时进行补料1补料，罐温35℃，2h内罐压逐渐提升至0.1Mpa进行补料发酵，溶氧逐渐提升至50％。当补料发酵值OD600值为100时(发酵13h)添加1.0mM/L的IPTG进行诱导发酵，罐温为28℃，罐压0.12Mpa，溶氧控制50％，更换补料1为补料2，发酵结束OD值达到180，菌体湿重260g/L，SOD表达量可达22g/L，比酶活17231U/mg。发酵过程和表达量结果见图3和图4。
对比例1
培养基和补料的准备：
基础培养基的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 10 |
| 酵母粉 | 30 |
| 葡萄糖 | 10 |
| 磷酸氢二钾 | 10 |
| 磷酸二氢钾 | 3 |
| 硫酸铵 | 2 |
| 硫酸镁 | 1 |
| 硫酸钠 | 2 |
| 硫酸亚铁 | 0.2 |
微量元素2.0mL/L。
补料1的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 50 |
| 酵母粉 | 100 |
| 葡萄糖 | 50 |
| 甘油 | 150 |
| 硫酸镁 | 1.0 |
| 硫酸钠 | 1.5 |
微量元素1.0mL/L。
补料2的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 甘油 | 200 |
| 硫酸铵 | 20 |
| 硫酸铜 | 10 |
| 硫酸钠 | 10 |
微量元素1.0mL/L。
微量元素的配方如下：
发酵工艺步骤如下：
S1：菌株筛选
1.1高表达量菌株筛选：把构建好的大肠杆菌BL21(DE3)-SOD 2接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中，37℃，220rpm摇床培养12h，以5％接种量接种于200mL基础培养基摇瓶中培养6h，添加IPTG进行诱导，诱导培养10h，测定表达量，保藏表达量高的菌株1株。
1.2高压发酵菌株筛选：将1.1保存的菌株接种到5L发酵罐中，初始控制罐压在0.05MPa，溶氧30％，发酵6h；补加补料1，罐压在2h内提升至0.12MPa，溶氧逐渐提升至60％再发酵12h。发酵后的菌株进行卡那抗性平板筛选带有目的蛋白的菌株。
S2：种子活化
-80℃保藏的BL21(DE3)-SOD 2以1‰接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中进行一级种子活化；活化条件为220rpm，37℃培养14h，接种于200mL基础培养基摇瓶中进行二级活化，220rpm，37℃培养3h。
S3：分批补料发酵
在灭菌后的基础培养基中以5％接种量接种，37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制25％，待溶氧快速升高至60％时(发酵6h)进行补料2补料，罐温35℃，2h内罐压逐渐提升至0.1Mpa进行补料发酵，溶氧逐渐提升至50％。当补料发酵值OD600值为100时(发酵15h)添加1.0mM/L的IPTG进行诱导发酵，罐温为28℃，罐压0.12Mpa，溶氧控制50％，发酵结束OD值达到121，菌体湿重173g/L，SOD表达量可达17g/L，比酶活14490U/mg。发酵过程和表达量结果见图5和图6。
对比例2
培养基和补料的准备：
基础培养基的配方如下：
微量元素2.0mL/L。
补料1的配方如下：
| 药品 | 用量(％) |
| 蛋白胨 | 50 |
| 酵母粉 | 100 |
| 葡萄糖 | 50 |
| 甘油 | 150 |
| 硫酸镁 | 10 |
| 硫酸钠 | 15 |
微量元素1.0mL/L。
补料2的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 甘油 | 200 |
| 硫酸铵 | 20 |
| 硫酸铜 | 10 |
| 硫酸钠 | 10 |
微量元素1.0mL/L。
微量元素的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 氯化铁 | 0.7 |
| 硫酸锰 | 0.8 |
| 硫酸镁 | 2.0 |
| 氯化钴 | 0.04 |
| 硫酸锌 | 3.0 |
| 硼酸 | 0.1 |
| 硫酸钙 | 0.02 |
| 硫酸铵 | 10 |
| 氯化铜 | 1.5 |
发酵工艺步骤如下：
S1：菌株筛选
1.1高表达量菌株筛选：把构建好的大肠杆菌BL21(DE3)-SOD 2接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中，37℃，220rpm摇床培养12h，以5％接种量接种于200mL基础培养基摇瓶中培养6h，添加IPTG进行诱导，诱导培养10h，测定表达量，保藏表达量高的菌株1～2株。
1.2高压发酵菌株筛选：将1保存的菌株接种到5L发酵罐中，初始控制罐压在0.05MPa，溶氧30％之，发酵6h；补加补料1，罐压在2h内提升至0.12MPa，溶氧逐渐提升至60％再发酵12h。发酵后的菌株进行卡那抗性平板筛选带有目的蛋白的菌株。
S2：种子活化
-80℃保藏的BL21(DE3)-SOD 2以1‰接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中进行一级种子活化；活化条件为220rpm，37℃培养14h，接种于200mL基础培养基摇瓶中进行二级活化，220rpm，37℃培养3h。
S3：分批补料发酵
在灭菌后的基础培养基中以5％接种量接种，37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制25％，待溶氧快速升高至60％时(发酵5h)进行补料1补料，罐温35℃，2h内罐压逐渐提升至0.1Mpa进行补料发酵，溶氧逐渐提升至50％。当补料发酵值OD600值为100时(发酵14h)添加1.0mM/L的IPTG进行诱导发酵，罐温为28℃，罐压0.12Mpa，溶氧控制50％，发酵结束OD值达到192，菌体湿重233g/L，SOD表达量可达13g/L，比酶活11329U/mg。发酵过程和表达量结果见图7和图8。
对比例3
培养基和补料的准备：
基础培养基的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 10 |
| 酵母粉 | 30 |
| 葡萄糖 | 10 |
| 磷酸氢二钾 | 10 |
| 磷酸二氢钾 | 3 |
| 硫酸铵 | 2 |
| 硫酸镁 | 1 |
| 硫酸钠 | 1 |
| 硫酸亚铁 | 0.2 |
微量元素2.0mL/L。
补料1的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨 | 50 |
| 酵母粉 | 100 |
| 葡萄糖 | 50 |
| 甘油 | 150 |
| 硫酸镁 | 10 |
| 硫酸钠 | 15 |
微量元素1.0mL/L。
补料2的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 甘油 | 200 |
| 硫酸铵 | 20 |
| 硫酸铜 | 10 |
| 硫酸钠 | 10 |
微量元素1.0mL/L。
微量元素的配方如下：
| 药品 | 用量(g/L) |
| 氯化铁 | 0.7 |
| 硫酸锰 | 0.8 |
| 硫酸镁 | 2.0 |
| 氯化钴 | 0.04 |
| 硫酸锌 | 3.0 |
| 硼酸 | 0.1 |
| 硫酸钙 | 0.02 |
| 硫酸铵 | 10 |
| 氯化铜 | 1.5 |
发酵工艺步骤如下：
S1：菌株筛选
1.1高表达量菌株筛选：把构建好的大肠杆菌BL21(DE3)-SOD 2接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中，37℃，220rpm摇床培养12h，以5％接种量接种于200mL基础培养基摇瓶中培养6h，添加IPTG进行诱导，诱导培养10h，测定表达量，保藏表达量高的菌株1株。
1.2高压发酵菌株筛选：将1.1保存的菌株接种到5L发酵罐中，初始控制罐压在0.05MPa，溶氧30％，发酵6h；补加补料1，罐压在2h内提升至0.12MPa，溶氧逐渐提升至60％再发酵12h。发酵后的菌株进行卡那抗性平板筛选带有目的蛋白的菌株。
S2：种子活化
-80℃保藏的BL21(DE3)-SOD 2以1‰接种于含有卡那霉素的LB试管(15mL)中进行一级种子活化；活化条件为220rpm，37℃培养14h，接种于200mL基础培养基摇瓶中进行二级活化，220rpm，37℃培养3h。
S3：分批补料发酵
在灭菌后的基础培养基中以5％接种量接种，37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制40％，待溶氧快速升高至60％时(发酵5h)进行补料1补料，罐温37℃，2h内罐压逐渐提升至0.1Mpa进行补料发酵，溶氧逐渐提升至50％。当补料发酵值OD600值为80时(发酵15h)添加0.5mM/L的IPTG进行诱导发酵，罐温为28℃，罐压0.05Mpa，溶氧控制40％，更换补料1为补料2，发酵结束OD值达到145，菌体湿重182g/L，SOD表达量可达10g/L，比酶活7253U/mg。发酵过程和表达量结果见图9和图10。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域技术人员依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，其包括如下步骤：
S1菌株筛选：将构建的表达SOD的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶表达量筛选，得到的菌株进行高压发酵菌株筛选；
S2种子活化：将S1筛选的菌株进行一级种子活化和二级种子活化；
S3分批补料发酵：在灭菌后的基础培养基中接种S2获得的种子菌，进行分批发酵、一次补料发酵、诱导二次补料发酵获得。
2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述基础培养基的配方如下：
所述S3中一次补料发酵中所用的补料1的配方如下：
所述S3中二次补料发酵中所用的补料2的配方如下：
3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S3中分批发酵条件为：在灭菌后的基础培养基中以3～5％接种量接种，35～37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制20％～40％。
4.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S3中一次补料发酵条件为：发酵4～6h待溶氧快速升高至60％时进行补料1补料，罐温35～37℃，罐压0.05～0.15Mpa进行补料发酵，溶氧控制30％～50％。
5.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S3中诱导二次补料发酵条件为；当补料发酵值OD600值为40～100时添加IPTG进行诱导发酵，罐温为25～28℃，罐压0.1～0.15Mpa，溶氧控制40％～60％，更换补料1为补料2。
6.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S1中摇瓶发酵为在180～220rpm，35～37℃于LB培养基中培养10～15h，接种于基础培养基的摇瓶中，培养2～6h后添加诱导剂进行诱导12～15h，筛选表达量高的菌株；所述高压发酵为将筛选的菌株接种到发酵罐中，控制罐压在0.05～0.15MPa之间，溶氧30％～60％之间，发酵4～6h，补加补料1，再发酵10h，得到菌株进行卡那抗性平板筛选。
7.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S2中种子活化为将-80℃保藏的SOD的大肠杆菌接种于LB培养基中进行一级种子活化；一级种子活化条件为180～220rpm，35～37℃培养10～15h；活化后的一级种子进行二级活化，二级种子活化180～220rpm，35～37℃培养3～5h。
8.根据权利要求2所述的基础培养基配方、一次补料和二次补料素数的微量元素，所述微量元素的配方如下：
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| CN101275144A (zh) * | 2008-03-13 | 2008-10-01 | 浙江清华长三角研究院 | 重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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