KR100848602B1 - 무산소 배양을 이용한 형질전환 식물세포 배양에서 장기간재조합 단백질 대량생산 방법 - Google Patents

무산소 배양을 이용한 형질전환 식물세포 배양에서 장기간재조합 단백질 대량생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환 식물세포 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 질소기체 등을 사용하여 배지 내의 산소농도를 무산소 상태로 유지하여 배양함으로써 재조합 단백질의 생산량을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 RAmy3D 프로모터를 사용하는 벼 현탁세포의 무산소 배양을 통해 재조합 단백질 생산방법을 확립하여 저비용 고효율로 유용한 재조합 단백질을 장기간 대량생산할 수 있다.
무산소 배양, 벼 세포, RAmy3D 프로모터, 형질전환 식물세포 배양

Description

무산소 배양을 이용한 형질전환 식물세포 배양에서 장기간 재조합 단백질 대량생산 방법{Method for mass production of recombinant protein in transgenic plants under anoxic condition for long term}
도 1은 무산소 배양 장치를 나타낸 도면이고,
도 2는 무산소 배양시, 건조된 세포중량(Dry cell weight) 그래프이고,
도 3은 무산소 배양시, 상대세포생존도(Relative cell viability) 그래프이고,
도 4는 무산소 배양시, 재조합 단백질 생산량 그래프이고,
도 5는 무산소 배양시, 30 mM의 최소 당 농도가 첨가된 건조된 세포중량 그래프 및 상대세포생존도 그래프이고,
도 6은 무산소 배양시, 30 mM의 최소 당 농도가 첨가된 재조합 단백질 생산량 그래프이다.
도 7은 hCTLA4Ig 발현 벡터의 개열지도이다.
본 발명은 형질전환 식물세포 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 질소기체 등을 사용하여 배지 내의 산소농도를 무산소 상태로 유지하여 배양함으로써 재조합 단백질의 생산량을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
기존 재조합 단백질은 미생물, 동물세포배양을 통해 생산되었으나, 현재 식물체와 식물세포 배양을 통한 연구와 산업화가 활발히 진행 중에 있다. 그 장점으로는 저비용 고효율 생산, 간단한 분리정제과정, 미생물에 비해 동물과 유사한 단백질생성 후 수식(post translation modification), 동물 바이러스나 독소 등의 무감염 등이 있다(Larrick, J. W. and W. T. David, Curr. Opin. Biotechnol. 12: 411-418, 2001).
최근 형질전환 식물세포 배양을 이용한 외래단백질 생산에 벼, 담배, 애기 장대 등이 주로 이용되고 있으며, RAmy3D 프로모터를 이용해 재조합 단백질인 G-CSF, GM-CSF, SA, AAT, INF-gamma, hCTLA4Ig 등이 당고갈 의해 유도적으로 생산되고 있다(Hellwig, S., ET AL., Nat. Biotechnol. 22: 1415-1422, 2004). 지금까지, 재조합 단백질 생산공정 개선을 위해서 고효율 발현벡터의 이용, 대체탄소원 사용, 삼투압 조절제 첨가, 단백질 안정제 사용, 고농도 배양, 배지 교환식 배양 등 다양한 방법 등이 적용되고 있다.
벼 세포의 현탁배양에서 배지내로 분비되는 총 단백질의 20~40%는 벼 알파 아밀라아제 유전자집단인 RAmy3D와 RAmy3E이며, 이 두 가지 유전자는 배지내 당 농도 에 따라 발현양의 현저한 차이를 나타낸다. 특히 RAmy3D는 배지내 당이 고갈되었을 때 발현양이 165배 증가되며, 이와 반대로 배지 내 수크로조, 글루코즈, 프락토즈, 갈락토즈 같은 당이 존재할 시 RAmy3D 유전자의 발현이 억제된다고 알려져 있다. 이러한 유도프로모터를 이용하면 당이 존재하는 생장배지에서의 고농도 세포배양 단계와, 당 고갈된 생산배지에서의 생산 유도단계로 이루어지는 2단계 배양이 가능하다(James, E. A. and J. M. Lee, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 72: 127-156, 2001). 그러나, 생산을 위한 배지 내의 당 고갈은 에너지원 공급을 차단하여 세포생존도를 감소시키고, 삼투압의 변화로 인한 세포사멸 현상을 야기한다. 또한 세포가 터지면서 단백질분해제 등이 배지 내로 많이 분비되어 목적 단백질을 분해함으로써 결국 재조합 단백질의 생산성이 감소되는 문제를 유발한다.
벼는 무산소 저항 식물체(anoxia-tolerant plant)로, 이는 산화환원(redox) 상태를 유지할 수 있어 무산소 조건하에서도 견딜 수 있다고 알려져 있다(Mocquot. B. et al., Plant Physiol. 68: 636-640, 1981). 무산소 조건이 되면 세포는 대사적인 변화를 가지게 된다. 즉 세포내 pH 감소, 지질의 과산화(lipid peroxidation), NADH 과량화(excess of NADH) 등이 발생한다. 벼는 산화환원 상태인 NADH/NAD+ 비율을 유지하여 무산소 조건에서 세포생존도를 장기간 지속할 수 있다.
벼 식물체는 무산소 조건이 되면 GA-regulated RAmy1A의 발현양이 낮아져 전분분해 속도가 감소되어, 결국에는 세포내 당 농도가 일시적으로 떨어지게 된다. 이러한 저농도의 당은 RAmy3D 프로모터를 강하게 자극한다. 최근 RAmy3D-GUS 발현 연구에서는 RAmy3D의 발현이 무산소조건에서 100 mM 글루코즈 첨가시에도 70% 정도만 저해 받는다고 보고되었다. 일반적으로 RAmy3D 프로모터는 무산소 조건하에 당을 인지하는 정도가 유산소 조건하보다 낮다라고 알려져 있다. 상기 내용을 통해 기초대사만이 가능할 수 있도록 최소 당을 첨가하면 세포생존도를 유지하고 RAmy3D 프로모터 발현에 영향을 주지 않으면서 생산량을 높일 수 있다. 이는 생산기간과 생산량을 높일 수 있는 유가식 배양으로의 적용을 가능케 한다.
현재까지 무산소 조건을 유지하면서 벼 세포를 현탁배양한 연구와 특허가 전무한 실정이다. 본 발명은 무산소 조건하에 당 고갈에 따른 세포죽음을 막기 위해 RAmy3D 프로모터의 발현이 저해되지 않는 최소 당농도를 첨가하여 세포생존도를 향상시키고, 장기간 배양이 가능하게 하여 재조합 단백질의 생산량을 극대화하고자 한다.
본 발명은 형질전환 식물세포 배양에서 무산소 배양을 이용하여 당 고갈 후 발현되는 재조합 단백질의 생산성을 증대시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 배양한 형질전환 식물체에 무산소 조 건을 가하여 당 고갈을 유도함으로써 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 배양한 형질전환 식물체에 무산소 조건을 가하여 당 고갈을 유도함과 동시에 최소 농도의 당을 첨가하여 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 1) RAmy3D 프로모터에 작동가능하도록 연결된 목적 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환 식물체, 조직 또는 세포를 제작하는 단계;
2) 상기 식물체, 조직 또는 세포를 일반 식물세포 배지에서 배양하는 단계; 및
3) 단계 2에서 배양한 식물체, 조직 또는 세포에 산소공급을 차단하여 당 고갈을 유도함으로써 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법을 제공한다.
RAmy3D 프로모터는 당 고갈에 의해 강하게 발현되고 무산소 조건하에서는 당이 고갈되므로 본 발명자들은 무산소 조건을 가하여 당 고갈을 유도한 후 목적 단백질의 생산시기 동안 건조된 세포중량을 기존 배양과 비교하였다. 그 결과, 기존배양과 무산소 배양에서 세포가 목적 단백질의 발현시기 동안 당 고갈에 의해 세포 사멸이 급속하게 일어났음을 관찰하였으나 무산소 배양이 기존배양 보다 세포가 급속히 사멸되거나 배양에 부정적이지 않았다(도 2 참조).
상기와 같은 조건에서, 무산소 배양에서의 상대 세포생존도를 기존배양과 비교한 결과, 기존 배양에서는 세포가 거의 죽어있었으나 무산소 배양에서는 기존배양보다, 80배 이상의 상대 세포생존도를 유지할 수 있었다(도 3 참조).
상기와 같은 조건에서 재조합단백질인 hCTLA4Ig의 생산량을 기존배양과 무산소배양에서 비교한 결과, 두 배양에서 목적단백질의 최대생산량은 무산소배양과 기존배양이 차이가 없었으며, 최대생산 시점은 무산소배양의 경우 기존배양 보다 이틀 앞당겨지는 결과를 보였다(도 4 참조).
단백질 생산 유도 이전, 형질전환 식물체 배양용 일반 식물세포 배지는 AA, MS, N6, WHITE 또는 SH 등이 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 무산소 배양에 이용가능한 형질전환 식물체는 무산소 조건에 저항성을 갖는 식물체이고, 바람직하게는 벼 또는 옥수수이다.
또한, 본 발명은
1) RAmy3D 프로모터에 작동가능하도록 연결된 목적 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체, 조직 또는 세포를 제작하는 단계;
2) 상기 식물체, 조직 또는 세포를 일반 식물세포 배지에서 배양하는 단계; 및
3) 단계 2에서 배양한 식물체, 조직 또는 세포에 산소 공급을 차단하여 당 고갈을 유도함과 동시에 최소 농도의 당을 첨가하여 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기와 같은 무산소 배양시, 30 mM의 최소 당 농도를 첨가하였다. 그 결과, 건조된 세포 중량은, 당이 첨가되지 않은 경우에 비해 30 mM의 최소 당을 첨가한 경우 3 배 정도 세포 중량을 유지하였다. 상대세포생존도는, 당이 첨가되지 않은 경우, 세포가 거의 사멸되었으며, 최소 당이 첨가된 경우, 배양 30일째까지 64% 이상 상대 세포생존도를 유지하였다(도 5 참조).
상기와 같은 조건에서 목적 단백질의 생산량을 30 mM의 최소 당이 첨가된 경우와 첨가되지 않은 경우를 비교하였다. 그 결과, 최소 당이 첨가되지 않은 경우보다 30 mM의 최소 당농도가 첨가된 경우, 최대 생산량은 1.96배 이상 증대된 결과를 보였다(도 6 참조).
따라서 30 mM의 최소 당을 첨가하여 세포사멸을 억제하였고, 장기간 동안 목적 단백질을 효율적으로 생산할 수 있었음을 확인하였다.
상기 무산소 조건에 0~100 mM의 수크로즈, 글루코즈, 프룩토즈 등을 재조합 단백질 발현에 영향을 미치지 않는 최소 당 농도를 이용할 수 있고 바람직하게는 10 ~50 mM의 글루코즈를 배지에 첨가할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.
<실시예 1> 형질전환 식물체 제작 및 배양
<1-1> 형질전환된 벼 제작
세포주는 hCTLA4Ig를 생산하도록 형질전환된(전북대학교, 보령제약) Oryza sativa L. cv. Dongjin의 현탁세포(전북대학교, 보령제약)를 사용하였다. 여기에는 벼의 아밀라제 유전자군인 RAmy3D 유도 프로모터를 particle-bombardment 방법(Lee, S. J. et al., Protein Expres. Purif. 51: 293-302, 2007)을 이용하여 벡터에 삽입시켜 형질전환하였고, 상기 프로모터는 수크로스가 고갈된 상태에서 작동된다.
<1-2> 형질전환 세포 배양
상기에서 제작한 형질전환 세포주 3g/L를 30g/L 수크로스를 첨가한 AA 배지(시그마 알드리치, 미국)에서 배양하였다. 배지의 pH는 5.8로 맞춘 뒤 500 mL 얼렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 분주하여 가압증기 멸균하였다. 현탁 배양은 120 rpm, 암 조건으로 유지하였으며 7일 간격으로 계대 배양을 수행하였다.
생장배지에서 7일동안 배양 한 세포를 여과한 후, 생산배지로 접종하여 재조합 단백질 생산을 유도하였다.
<실시예 2> 무산소 배양시, 건조세포중량, 세포생존도 및 재조합 단백질 생산량 확인
본 발명자들은 목적 단백질의 생산(유도)시기 동안(당을 배제한 이후 단계), 무산소 조건하의 건조된 세포중량을 기존 배양과 비교하였다.
구체적으로, 식물세포 배양시 에어레이션(aeration)이 필수적이다. 일반적인 경우 필터-멸균된 컴프레서를 통해 공급된 공기는 스파저(sparger)에 의해 배양액 내로 공급된다. 반면에, 무산소 배양조건에서는 필터-멸균된 질소가스를 스파저를 통해 공급하여 배양액 내를 무산소 상태로 유지하였다.
RAmy3D 프로모터는 당 고갈에 의해 강하게 발현되기 때문에, 배양배지인 AA 배지(Sigma-Aldrich, USA)에 당을 제거해야 목적 단백질이 발현된다. 벼에서 무산소 조건하에서는 당이 고갈되므로 무산소 조건을 가하여 당 고갈을 유도하였다. 기존배양(대조군으로 당을 제거한 AA 배지에 Aeration(통기) 공급한 조건)과 무산소 배양에서 세포가 목적 단백질의 발현시기 동안 당 고갈에 의해 세포 사멸이 급속하게 일어났음을 관찰하였다. 초기접종 농도가 9.5 g/L인 것을 고려한다면, 10일째까지 측정된 건조된 세포중량은 기존배양인 경우, 3 g/L 이고 무산소 배양인 경우 4 g/L로 유지되었다. 따라서, 무산소 배양이 기존배양 보다 세포가 급속히 사멸되거나 배양에 부정적이지 않았다(도 2).
상기와 같은 조건에서, 무산소 배양에서의 상대 세포생존도를 기존배양과 비교하였다(세포 생체량 0.1g의 세포에 1.5% TTC(triphenyl tetrazolium. 기존 배양에서는 6일째 급격히 상대세포생존도가 1%로 낮아져, 세포가 거의 죽어있음을 관찰하였다. 무산소 배양에서는 6일째에는 82%였고, 8일째에는 23%까지 유지하였다. 6일째 상대 세포생존도를 비교하면, 무산소 배양이 기존배양보다, 80배 이상의 상 대 세포생존도를 유지할 수 있음을 관찰하였다(도 3).
상기와 같은 조건에서 재조합단백질인 hCTLA4Ig의 생산량을 기존배양과 무산소배양에서 비교하였다. 무산소배양에서는 2일째부터 생산량이 증가하여 4일째 최대생산량인 10.8 mg/L까지 생산하였음을 관찰하였다. 기존배양에서는 2일째, 4일째까지 생산량이 증가하다 6일째 최대생산량인 11.9 mg/L까지 생산함을 측정하였다. 두 배양에서 목적단백질의 최대생산량은 무산소배양과 기존배양이 차이가 없었으며, 최대생산 시점은 무산소배양의 경우 기존배양 보다 이틀 앞당겨지는 결과를 보였다(도 4 참조).
<실시예 3> 무산소 배양시, 30 mM의 최소 당 농도 첨가 후 건조세포중량 확인
무산소 배양시, 글루코스 30 mM의 최소 당 농도를 첨가하였다. 건조된 세포 중량(A)은, 당이 첨가되지 않은 경우, 20일째 2.6 g/L였고, 30 mM의 최소 당을 첨가한 경우, 서서히 감소하여 20일째 6.6 g/L를 유지하였고 30일째에도 4 g/L로 유지될 수 있음을 관찰하였다. 상대세포생존도(B)는, 당이 첨가되지 않은 경우, 16일째에는 이미 12%로 세포가 거의 사멸되었으며, 최소 당이 첨가된 경우, 배양 30일째까지 64% 이상 상대 세포생존도를 유지하였다(도 5).
단, 24일째 이후 세포생존도의 증가는 사멸된 세포나 세포파쇄(cell lysis) 등에 의해 세포내부의 당이 일시적으로 배지내로 방출되어, 살아있는 세포가 이를 흡수한 것으로 사료된다.
상기와 같은 조건에서 목적 단백질의 생산량을 30 mM의 최소 당이 첨가된 경 우와 첨가되지 않은 경우를 비교하였다. 최소 당이 첨가되지 않은 경우, 18일째 최대 생산량이 14.4 mg/L 였고 그 후 생산량이 감소하였다, 그러나 30 mM의 최소 당농도가 첨가된 경우, 16일째 이후로도 목적 단백질을 계속 생산하였다. 28일째까지 최대 생산량은 28.5 mg/L로 최소 당을 첨가하지 않았을 때보다 1.96배 이상 증대된 결과를 보였다(도 6).
따라서 30 mM의 최소 당을 첨가하여 세포사멸을 억제하였고, 더욱이 RAmy3D 프로모터의 발현을 억제하지 않으면서 장기간 동안 목적 단백질을 효율적으로 생산할 수 있었음을 확인하였다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 무산소 배양시스템은 형질전환 벼 세포배양에서 장기간 배양, 세포생존도 향상, 단백질분해제 억제를 가능케 하여 재조합 단백질의 생산성을 현저히 극대화시킨다. 이를 통해 형질전환 식물세포 배양에서 재조합 단백질의 대량 생산시 저비용, 쉬운조작, 무오염, 고효율 생산이 가능하여 산업화를 용이하게 한다.

Claims (9)

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  5. 1) RAmy3D 프로모터에 작동가능하도록 연결된 목적 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체, 조직 또는 세포를 제작하는 단계;
    2) 상기 식물체, 조직 또는 세포를 일반 식물세포 배지에서 배양하는 단계; 및
    3) 단계 2에서 배양한 식물체, 조직 또는 세포에 산소 공급을 차단하여 당 고갈을 유도함과 동시에 10~50 mM 농도의 당을 첨가하여 재조합 단백질의 생산을 유도하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 배양에서 무산소 배양을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법.
  6. 제 5항에 있어서, 단계 3의 당은 수크로즈, 글루코즈, 프럭토즈 또는 갈락토즈인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 일반 식물세포 배지는 AA(Amino acid) 배지, MS(Murashige & Skoog), N6, WHITE 또는 SH(Schenk & Hiderbrandt)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 단계 3의 형질전환 식물체는 무산소 조건에 저항성을 갖는 식물체인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 식물체는 벼 또는 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
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KR1020070020588A KR100848602B1 (ko) 2007-02-28 2007-02-28 무산소 배양을 이용한 형질전환 식물세포 배양에서 장기간재조합 단백질 대량생산 방법

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KR101105722B1 (ko) * 2009-05-28 2012-01-17 인하대학교 산학협력단 형질전환 식물세포에서의 장기 보존 방법

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KR20020080190A (ko) * 2001-04-12 2002-10-23 학교법인연세대학교 저산소-반응성 프로모터, 그를 이용한 목적 유전자의 대량발현 방법 및 이 방법에 의해 목적 유전자에 선택적으로ｒｎａ 간섭을 유도하는 방법

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