CN103451142A - 高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。所述重组菌是在大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。实验证明，利用本发明所提供的重组菌进行液体发酵后的发酵液中，超氧化物歧化酶酶活可达11000—11857U/mL,是对照菌的近1.6倍。本发明在超氧化物歧化酶的工业化生产及食品应用方面具有重要意义。

Description

高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）广泛存在于各类生物体中，是机体内超氧阴离子自由基的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。因此，SOD在抗衰老以及预防肿瘤和抗炎等方面起着重要的生理作用，受到国内外医药日用化工，食品及生化界的极大关注。SOD在食品工业主要应用四方面：1）作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到各种食品中；2）制成多种剂型的SOD或复合型食品；3）用作食品的天然抗氧化剂；4）以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妆品中可起到防晒，防止脂褐素的形成，防治皮肤病以及防治瘢痕形成等作用。

我国自上世纪八十年代以来，对SOD的应用研究主要侧重于动植物SOD的提取和纯化，国内产品大部分是从动物血液中制备的，但由于原材料有限及卫生安全性等原因，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险加大，这种方法慢慢的被淘汰。利用基因工程是广开SOD酶源，降低成本和获得具有天然活性的SOD有效途径。

大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)品系被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，国内已有用于食品生产许可的事例（如用大肠杆菌K12生产凝乳酶）。因此选用此系列菌株，能够保证食品安全性。

目前，还没有利用大肠杆菌K-12品系高产超氧化物歧化酶的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。

本发明所提供的重组菌，是在大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点（即NheI和PstI酶切位点间）插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。

在上述重组菌中，所述超氧化物歧化酶具体可为序列表序列1所示蛋白。

在上述重组菌中，所述超氧化物歧化酶编码基因可为序列表序列2所示基因。

所述重组菌具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD，已于2013年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7934。

本发明保护上述任一所述重组菌在生产超氧化物歧化酶中的应用。

本发明还提供了一种生产超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤：

将上述任一所述重组菌进行液体发酵，得到所述超氧化物歧化酶；

所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：

1）将所述重组菌接种至发酵培养基中,获得初始发酵体系；

2）将所述初始发酵体系于30—37℃（如30、33或37℃）条件下搅拌培养至发酵液中菌体OD₆₀₀值为40—45（如40、42或45）；

3）向发酵液中加入L-阿拉伯糖，于28—30℃（如28、29或30℃）条件下搅拌培养；

所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：葡萄糖10—20g/L（如10、15或20g/L）,(NH₄)₂HPO₄4—8g/L（如4、6或8g/L）,KH₂PO₄13—13.3g/L（如13或13.3g/L）,MgSO₄0.59—1.2g/L（如0.59、0.9或1.2g/L）,柠檬酸1.7—2.0g/L（如1.7或2.0g/L）,FeSO₄54.67—109.35mg/L（如54.67、85或109.35mg/L）,ZnSO₄10.22—11.5mg/L（如10.22或11.5mg/L）,CuSO₄3.2—6.4mg/L（如3.2、5.0或6.4mg/L）,MnSO₄3.2—5.4mg/L（如3.2、4.3或5.4mg/L）,Na₂B₄O₇0.8—1.22mg/L（如0.8、1.0或1.22mg/L）,CaCl₂10—13.66mg/L（如10、12或13.66mg/L）,(NH₄)₆MO₇O₂₄0.5—1mg/L（如0.5、0.75或1mg/L）；

所述发酵培养基的pH值为6.8—7.0（如6.8、6.9或7.0）。

在上述方法中，步骤3）中所述加入按每升所述发酵液中加入终浓度为1—2g/L的所述L-阿拉伯糖进行。

在上述方法中，步骤2）中的所述培养包括在发酵液中的葡萄糖耗尽时，向所述发酵液中按200—250mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；

步骤3）中的所述培养包括向所述发酵液中按300—500mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；

所述补料培养基的溶剂为水，溶质及其在所述补料培养基中的终浓度分别为：葡萄糖600—800g/L（如600、700或800g/L）,MgSO₄7.3—9.73g/L（如7.3、8.3或9.73g/L）,FeSO₄109.4—218.8mg/L（如109.4、169或218.8mg/L）,ZnSO₄20.44—25mg/L（如20.44、23或25mg/L）,CuSO₄6.4—12.8mg/L（如6.4、9.0或12.8mg/L）,MnSO₄6.3—10.8mg/L（如6.3、8.4或10.8mg/L）,Na₂B₄O₇1.6—2.4mg/L（如1.6、2.0或2.4mg/L）,CaCl₂20—30.2mg/L（如20、25或30.2mg/L）,(NH₄)₆MO₇O₂₄1—2mg/L（如1、1.5或2mg/L）；

所述补料培养基的pH为6.8—7.0（如6.8、6.9或7.0）。

在上述方法中，步骤3）中所述培养的时间为6、7或8小时（如6、7或8小时）；

和/或，步骤1）所述初始发酵体系中菌体的OD₆₀₀值为1.3—1.5。

在上述方法中，所述液体发酵的发酵液中溶氧量为20%—30%体积百分浓度，pH值为6.8—7.0。

在上述方法中，步骤1）所述接种是通过将含有所述重组菌的种子液按照1:（9—19）（如1:9、1:14或1:19）的体积比接种至所述发酵培养基中实现；

所述含有所述重组菌的种子液是将所述重组菌用如下种子培养基振荡培养制备得到的：溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：蛋白胨10—16g/L（如10、13或16g/L）,酵母膏5—10g/L（如5、8或10g/L）,氯化钠5—10g/L（如5、8或10g/L）,所述种子培养基的pH为6.8—7.0（如6.8、6.9或7.0）。

上述过程中，发酵过程的初始培养基的体积一般在10-50升，具体的如20升或30升等。

实验证明，将超氧化物歧化酶的编码基因连入原核表达载体pBAD/HisA的NheI和PstI位点间获得重组质粒导入大肠杆菌K-12表达菌株BW25113中获得的重组菌BW-pBAD-SOD，进行液体发酵后的发酵液中，超氧化物歧化酶酶活可达11000—11857U/mL,是对照菌（超氧化物歧化酶酶活6900—7100U/mL）的近1.6倍。本发明在超氧化物歧化酶的工业化生产及食品应用方面具有重要意义。

附图说明

图1为重组菌发酵液的SDS-PAGE检测结果。泳道1为分子量标准，从上至下依次为116KDa、66.2KDa、45KDa、35KDa、25KDa、18.4KDa、12.4KDa,泳道2为重组菌BL21-SOD（对照菌）的发酵液的检测结果,泳道3为重组菌BW-pBAD-SOD的发酵液的检测结果。目的蛋白预测分子量为23kDa。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。

下述实施例中超氧化物歧化酶酶活检测的方法如下：

超氧化物歧化酶1个标准酶活（U）的定义为：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的蛋白量。

配制如下试剂：

A液：称取6.019g三羟甲基氨基甲烷（Tris）加入1L水中，加入0.5mol/L的EDTA·Na₂溶液2ml，调pH至8.2，备用。

B液：量取约30ml的蒸馏水，依次加入50μl浓盐酸，0.283g邻笨三酚（焦性没食子酸），最后定容至50ml。

蒸馏水：二重石英蒸馏水。

0.5mol/L的EDTA·Na₂溶液：称取93.06g EDTA·Na₂，加入400ml蒸馏水中，调pH至8.0，最后定容至500ml。

将A液作为空白调零的溶液，25℃，于10ml离心管中加入4.5ml A液，再量取10μl B液加入含有4.5ml A液的10ml离心管中，轻轻混匀，快速放入紫外-可见分光光度计中，开始计时，并读取开始计时的OD_325nm值A₁，每隔30秒记录一个数值，依次为A₂、A₃、A₄和A₅，计时2分钟，并记录2分钟时的OD_325nm值A₅，计算自氧化值△A=(A₅-A₁)/2；

25℃，于10ml离心管中加入4.5ml A液，再依次量取10μl的待测溶液和B液加入含有4.5ml A液的10ml离心管中，轻轻混匀，快速放入紫外-可见分光光度计中，开始计时，并读取开始计时的OD_325nm值A₁’，每隔30秒记录一个数值，依次为A₂’、A₃’、A₄’和A₅’，计时2分钟，并记录2分钟时的OD_325nm值A₅’，计算待测溶液中的超氧化物歧化酶抑制邻苯三酚自氧化速率△A’=(A₅’-A₁’)/2；

按照如下公式计算待测溶液中超氧化物歧化酶（SOD）的活力（U/mL）：

上述公式中，V为待测溶液体积，单位为mL；D为待测溶液的稀释倍数；4.5为反应液总体积，单位为mL。

实施例1、高产超氧化物歧化酶的重组菌

一、高产超氧化物歧化酶的重组菌的获得

1、目的基因的获得

人工合成如下DNA片段：在序列表序列1所示超氧化物歧化酶的序列表序列2所示编码基因两端分别添加NheI和PstI酶切识别序列的DNA片段。

2、重组表达载体的构建

将步骤1的DNA片段用NheI和PstI双酶切，与经过NheI和PstI双酶切的原核表达载体pBAD/HisA（购自Invitrogen，产品目录号为V430-01）的载体骨架片段连接，得到重组质粒pBAD-SOD，经测序证实，重组质粒pBAD-SOD为在载体pBAD/HisA多克隆位点处的NheI和PstI位点间连入序列表序列2所示DNA片段。

3、重组菌的获得

将重组质粒pBAD-SOD转化至大肠杆菌K-12表达菌株BW25113（购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司，产品目录号为OEC5042），用含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基进行筛选培养，将获得的抗性单菌落记为重组菌BW-pBAD-SOD。经质粒提取及酶切和测序证实，重组菌BW-pBAD-SOD中导入了重组质粒pBAD-SOD。

取一株重组菌BW-pBAD-SOD，名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD，已于2013年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7934。

以下实验中所使用的重组菌BW-pBAD-SOD均为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD CGMCC No.7934。

二、对照菌的制备

1、目的基因的获得

人工合成如下DNA片段：在序列表序列1所示超氧化物歧化酶的序列表序列2所示编码基因两端分别添加EcoR I和Xho I酶切识别序列的DNA片段。

2、重组表达载体的构建

将步骤1的DNA片段用EcoR I和Xho I双酶切，与经过EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-28a(+)（购自Novagen，产品目录号为VYN0168）的载体骨架片段连接，得到重组质粒pET-SOD，经测序证实，重组质粒pET-SOD为在载体pET-28a(+)多克隆位点处的EcoR I和Xho I位点间连入序列表序列2所示DNA片段。

3、重组菌的获得

将重组质粒pET-SOD转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株BL21(DE3)（购自北京全式金生物科技有限责任公司，产品目录号为CD601），用含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基进行筛选培养，将获得的抗性单菌落记为重组菌BL21-pET-SOD。经质粒提取及酶切和测序证实，重组菌BL21-pET-SOD中导入了重组质粒pET-SOD。

以重组菌BL21-pET-SOD（以下简称BL21-SOD）作为对照菌进行以下操作。

三、超氧化物歧化酶的表达检测

1、挑取BW-pBAD-SOD单菌落接入含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于100ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至发酵液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8，向发酵体系中加入终浓度为1g/L的L-阿拉伯糖，30℃条件下继续培养6-8小时，获得重组菌BW-pBAD-SOD的发酵液。

2、挑取对照菌的单菌落接入含有硫酸卡那霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于100ml含有硫酸卡那霉素（100μg/ml）的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至发酵液的OD₆₀₀值达到0.6-0.8，向发酵体系中加入终浓度为1g/L的乳糖，30℃条件下继续培养6-8小时，获得对照菌的发酵液。

3、将步骤2和3获得的发酵液分别按照如下方法进行检测：

将发酵液2260g离心15分钟，收集菌体；用PBS缓冲液（50mM，pH7.0）重悬菌体，超声波破碎（为间歇超声,每超声处理2s，停3s，超声处理的总时间为30min，功率162.5W）后，2260g离心25min,收集上清液，即为含有超氧化物歧化酶的粗酶液，将粗酶液放入70℃水浴处理10min进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示；检测粗酶液的OD₆₀₀和超氧化物歧化酶活性，结果如表1所示。

表1、重组菌粗酶液的OD₆₀₀和超氧化物歧化酶活性结果

图1和表1的结果表明，重组菌BW-pBAD-SOD表达的超氧化物歧化酶量明显高于对照菌。

实施例2、利用重组菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法

一、培养基的制备

1、种子培养基

溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：蛋白胨16g/L,酵母膏10g/L和氯化钠5g/L,所述种子培养基的pH为7.0。

2、发酵培养基

溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：葡萄糖10g/L,(NH₄)₂HPO₄8g/L,KH₂PO₄13.3g/L,MgSO₄0.59g/L,柠檬酸1.7g/L,FeSO₄54.67mg/L,ZnSO₄11.5mg/L,CuSO₄6.4mg/L,MnSO₄3.2mg/L,Na₂B₄O₇1.22mg/L,CaCl₂13.66mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄1mg/L；所述发酵培养基的pH为7.0。

3、补料培养基

溶剂为水，溶质及其在终浓度分别为：葡萄糖600g/L,MgSO₄7.3g/L,FeSO₄109.4mg/L,ZnSO₄25mg/L,CuSO₄12.8mg/L,MnSO₄6.3mg/L,Na₂B₄O₇2.4mg/L,CaCl₂30.2mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄2mg/L；所述补料培养基的pH为7.0。

二、重组菌BW-pBAD-SOD发酵生产超氧化物歧化酶

1、种子液的制备

取重组菌BW-pBAD-SOD活化后用种子培养基（含氨苄青霉素100mg/L）于37℃、200转/分钟下震荡培养12小时，获得OD₆₀₀为2.8—3.2的种子液。

2、发酵培养

取步骤1获得的种子液，按照1:19的比例接种于含氨苄青霉素100mg/L的发酵培养基中（保兴Biotech-30JS 30L发酵罐，装20L发酵培养基），获得菌体OD₆₀₀为1.3的初始发酵体系，37℃搅拌培养至发酵液中的葡萄糖耗尽时，按250mL/h的速率均速流加补料培养基，培养至发酵液中菌体OD₆₀₀为40时，将发酵培养温度降至30℃，加入终浓度为1g/L的L-阿拉伯糖进行诱导培养，并将补料培养基流加速度调至500mL/h，培养6小时，测定发酵液中超氧化物歧化酶活性。

培养过程中用2.7M氨水和1M盐酸使发酵液的pH维持在6.8—7.0，通过调整搅拌速度550—650转/分钟和通气量为1.2—1.5m³/h使溶氧量在20%—30%。

3、超氧化物歧化酶的检测

收集步骤2最终的发酵液，2260g离心15分钟，收集菌体；用PBS缓冲液（pH7.0，50mM）的重悬菌体，超声波破碎（为间歇超声,每超声处理2s，停3s，超声处理的总时间为30min，功率162.5W）后，2260g离心25min,收集上清液，即为含有超氧化物歧化酶的粗酶液，将粗酶液放入70℃水浴处理10min，检测粗酶液的OD₆₀₀和超氧化物歧化酶活性。

二、对照菌发酵生产超氧化物歧化酶

按照步骤一中的1—3的方法进行，不同之处在于：将重组菌BW-pBAD-SOD替换为对照菌；将氨苄青霉素替换为硫酸卡那霉素；将L-阿拉伯糖替换为乳糖。

三、结果

如表2所示。

表2、发酵液中菌体的OD₆₀₀和超氧化物歧化酶活性结果

实施例3、利用重组菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法

一、培养基的制备

1、种子培养基

溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,氯化钠10g/L,所述种子培养基的pH为6.8。

2、发酵培养基

溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：葡萄糖20g/L,(NH₄)₂HPO₄4g/L,KH₂PO₄13g/L,MgSO₄1.2g/L,柠檬酸2.0g/L,FeSO₄109.35mg/L,ZnSO₄10.22mg/L,CuSO₄3.2mg/L,MnSO₄5.4mg/L,Na₂B₄O₇0.8mg/L,CaCl₂10mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄0.5mg/L；所述发酵培养基的pH为6.8。

3、补料培养基

溶剂为水，溶质及其在终浓度分别为：葡萄糖800g/L,MgSO₄9.73g/L,FeSO₄218.8mg/L,ZnSO₄20.44mg/L,CuSO₄6.4mg/L,MnSO₄10.8mg/L,Na₂B₄O₇1.6mg/L,CaCl₂20mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄1mg/L；所述补料培养基的pH为6.8。

二、重组菌BW-pBAD-SOD的发酵生产超氧化物歧化酶

1、种子液的制备

取重组菌BW-pBAD-SOD活化后用种子培养基（含氨苄青霉素100mg/L）于37℃、200转/分钟震荡培养12小时，获得OD₆₀₀为2.8—3.2的种子液。

2、发酵培养

取步骤1获得的种子液，按照1:9的比例接种于含氨苄青霉素100mg/L的发酵培养基中（保兴Biotech-30JS30L发酵罐，装20L发酵培养基），获得菌体OD₆₀₀为1.5的初始发酵体系，30℃搅拌培养至葡萄糖耗尽时，按200mL/h的速率均速流加补料培养基，培养至发酵液中菌体OD₆₀₀为45时，将发酵液温度降至28℃，加入终浓度为2g/L的L-阿拉伯糖进行诱导培养，并将补料培养基流加速度调至300mL/h，培养7小时，测定发酵液中超氧化物歧化酶活性。

培养过程中用2.7M氨水和1M盐酸使发酵液的pH维持在6.8—7.0，通过调整搅拌速度550—650转/分钟和通气量为1.0—1.5m³/h使溶氧量在20%—30%。

二、对照菌的发酵生产超氧化物歧化酶

按照步骤一中的1和2的方法进行，不同之处在于：将重组菌BW-pBAD-SOD替换为对照菌；将氨苄青霉素替换为硫酸卡那霉素；将L-阿拉伯糖替换为乳糖。

三、结果

如表3所示。

表3、发酵液中菌体的OD₆₀₀和超氧化物歧化酶活性结果

实施例4、利用重组菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法

一、培养基的制备

1、种子培养基

溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：蛋白胨13g/L,酵母膏8g/L,氯化钠8g/L,所述种子培养基的pH为6.9。

2、发酵培养基

溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：葡萄糖15g/L,(NH₄)₂HPO₄6g/L,KH₂PO₄13.3g/L,MgSO₄0.9g/L,柠檬酸1.7g/L,FeSO₄85mg/L,ZnSO₄11.5mg/L,CuSO₄5.0mg/L,MnSO₄4.3mg/L,Na₂B₄O₇1.0mg/L,CaCl₂12mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄0.75mg/L；所述发酵培养基的pH为6.9。

3、补料培养基

溶剂为水，溶质及其在终浓度分别为：葡萄糖700g/L,MgSO₄8.3g/L,FeSO₄169mg/L,ZnSO₄23mg/L,CuSO₄9.0mg/L,MnSO₄8.4mg/L,Na₂B₄O₇2.0mg/L,CaCl₂25mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄1.5mg/L；所述补料培养基的pH为6.9。

二、重组菌BW-pBAD-SOD的发酵生产超氧化物歧化酶

1、种子液的制备

取重组菌BW-pBAD-SOD活化后用种子培养基（含氨苄青霉素100mg/L）于37℃、200转/分钟下震荡培养12小时，获得OD₆₀₀为2.8—3.3的种子液。

2、发酵培养

取步骤1获得的种子液，按照1:14的比例接种于含氨苄青霉素100mg/L的发酵培养基中（保兴Biotech-30JS30L发酵罐，装20L发酵培养基），获得菌体OD₆₀₀为1.4的初始发酵体系，33℃搅拌培养至葡萄糖耗尽时，按225mL/h的速率均速流加补料培养基，培养至发酵液中菌体OD₆₀₀为42.5时，将发酵液温度降至29℃，加入终浓度为1.5g/L的L-阿拉伯糖进行诱导培养，并将补料培养基流加速度调至400mL/h，培养8小时，测定发酵液中超氧化物歧化酶活性。

培养过程中用2.7M氨水和1M盐酸使发酵液的pH维持在6.8—7.0，通过调整搅拌速度550—650转/分钟和通气量为1.2—1.5m³/h使溶氧量在20%—30%。

二、对照菌的发酵生产超氧化物歧化酶

按照步骤一中的1和2的方法进行，不同之处在于：将重组菌BW-pBAD-SOD替换为对照菌；将氨苄青霉素替换为硫酸卡那霉素；将L-阿拉伯糖替换为乳糖。

三、结果

如表4所示。

表4、发酵液中菌体的OD₆₀₀和超氧化物歧化酶活性结果

Claims (10)

1.一种重组菌，是在大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述超氧化物歧化酶为序列表序列1所示蛋白。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述超氧化物歧化酶编码基因为序列表序列2所示基因。

4.根据权利要求1—3中任一所述重组菌，其特征在于：所述重组菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7934的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD。

5.权利要求1—4中任一所述重组菌在生产超氧化物歧化酶中的应用。

6.一种生产超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤：

将权利要求1—4中任一所述重组菌进行液体发酵，得到所述超氧化物歧化酶；

所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：

1）将所述重组菌接种至发酵培养基中,获得初始发酵体系；

2）将所述初始发酵体系于30—37℃条件下搅拌培养至发酵液中菌体OD600值为40—45；

3）向发酵液中加入L-阿拉伯糖，于28—30℃条件下搅拌培养；

所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：葡萄糖10—20g/L,(NH₄)₂HPO₄4—8g/L,KH₂PO₄13—13.3g/L,MgSO₄0.59—1.2g/L,柠檬酸1.7—2.0g/L,FeSO₄54.67—109.35mg/L,ZnSO₄10.22—11.5mg/L,CuSO₄3.2—6.4mg/L,MnSO₄3.2—5.4mg/L,Na₂B₄O₇0.8—1.22mg/L,CaCl₂10—13.66mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄0.5—1mg/L；

所述发酵培养基的pH值为6.8—7.0。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述加入按每升所述发酵液中加入终浓度为1—2g/L的所述L-阿拉伯糖进行。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤2）中的所述培养包括在发酵液中的葡萄糖耗尽时，向所述发酵液中按200—250mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；

步骤3）中的所述培养包括向所述发酵液中按300—500mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；

所述补料培养基的溶剂为水，溶质及其在所述补料培养基中的终浓度分别为：葡萄糖600—800g/L,MgSO₄7.3—9.73g/L,FeSO₄109.4—218.8/L,ZnSO₄20.44—25mg/L,CuSO₄6.4—12.8mg/L,MnSO₄6.3—10.8mg/L,Na₂B₄O₇1.6—2.4mg/L,CaCl₂20—30.2mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄1—2mg/L；所述补料培养基的pH为6.8—7.0。

9.根据权利要求6—8中任一所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述培养的时间为6—8小时；

步骤1）所述初始发酵体系中菌体的OD₆₀₀值为1.3—1.5。

10.根据权利要求6—9中任一所述的方法，其特征在于：

步骤1）所述接种是通过将含有所述重组菌的种子液按照1:（9—19）的体积比接种至所述发酵培养基中实现；

所述含有所述重组菌的种子液是将所述重组菌用如下种子培养基振荡培养制备得到的：溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：蛋白胨10—16g/L,酵母膏5—10g/L,氯化钠5—10g/L,所述种子培养基的pH为6.8—7.0。

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