CN104611272B - 一种诱变少动鞘脂单孢菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱变少动鞘脂单孢菌，属于冷结胶制备领域，该诱变少动鞘脂单孢菌(Sphingomonas Paucimobilis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.10341；保藏日期为2015年01月12日。本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌，其以少动鞘脂单孢菌为出发菌株，通过两次诱变而获得能够稳定传代的诱变少动鞘脂单孢菌。该诱变少动鞘脂单孢菌能够稳定传代，将其发酵培养后，其产胶率可达16.25g/L，比没有经过诱变的少动鞘脂单孢菌的产胶率提升了25％以上。
Description
技术领域
本发明涉及冷结胶制备领域，具体而言，涉及一种诱变少动鞘脂单孢菌及其制备方法和应用。
背景技术
结冷胶作为目前国际上性能最为优越的微生物多糖之一，具有动植物多糖不具备的优良品质，其安全无毒、理化性质独特、生产周期短、不受气候和地理环境条件的限制，已广泛用于食品、医药、化工、农业、陶瓷、石油等20多个行业。
在食品工业中，结冷胶可作为优良胶凝剂，形成的凝胶透明度高，爽脆适度，风味释放性好。另外，结冷胶与其它食品胶有良好相容性，通过调节混合比例可达到不同食品品质要求。此外，结冷胶可与其它食品胶良好配伍，使食品能获得最佳感官、质构和稳定性。结冷胶凝胶特性与卡拉胶、琼脂等相似，但其在使用量、透明度、热可逆性、风味释放、酸稳定性等方面明显更优越。
结冷胶于1978年由美国斯比·凯可(CP.Kelco)公司首次发现，并于1988年被日本政府批准作为食品添加剂使用，1992年更是获得了FDA安全认证，1994年被欧共体正式列入食品安全代码表中，1996年我国也批准其作为食品添加剂使用。
作为一种新型的食品添加剂，目前结冷胶年需求增长率在30％以上，具有极高的商业利润和市场前景。但是，目前在结冷胶的大规模工业化生产中仍存在一些问题，其中在结冷胶的生产中，随着产胶菌株传代次数的增加，菌种会产生极其明显的退化，导致产胶率降低，并且最终产品指标也难以提高，严重限制了结冷胶的生产应用及发展；因此，寻找一种改良的产胶菌株以提高产胶率和以及产胶指标是人们亟需解决的一个技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种诱变少动鞘脂单孢菌，所述的诱变少动鞘脂单孢菌具有传代稳定、产胶率高的技术效果。本发明的第二目的在与提供一种诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法；通过该方法可实现稳定高产诱变少动鞘脂单孢菌的制备，且该方法操作简单，易于实现。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种诱变少动鞘脂单孢菌，该诱变少动鞘脂单孢菌的分类命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编为：100101；保藏编号为CGMCC No.10341；保藏日期为2015年01月12日。
本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌，其以少动鞘脂单孢菌为出发菌株，通过两次诱变而获得能够稳定传代的诱变少动鞘脂单孢菌。该诱变少动鞘脂单孢菌能够稳定传代，将其发酵培养(接种量为10％)后，其产胶率可达16.25g/L，比相同条件下，没有经过诱变的少动鞘脂单孢菌的产胶率提升了25％以上。
本发明提供的诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法，包括以下步骤：
1)、将少动鞘脂单孢菌(Sphingomonas Paucimobilis)菌株活化后接种到液体培养基中振荡培养，得到培养后菌液；
2)、将所述培养后菌液离心，得到菌体；并将所述菌体以等体积的生理盐水制成菌悬液；
3)、将所述菌悬液利用10-15瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射60-80秒，得到一次诱变菌液；
4)、将所述一次诱变菌液加入到体积分数为1.5-2.5％的DES溶液中，摇床震荡培养35-45分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
5)、将所述二次诱变菌液接种到琼脂培养基进行培养，并筛选菌落，得到诱变少动鞘脂单孢菌。
本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法，首先将少动鞘脂单孢菌活化后利用等体积的生理盐水制成菌悬液；在进行第一次诱变的过程中，将菌悬液利用10-15瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射60-80秒；紫外线辐射可以使少动鞘脂单孢菌DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚体，进而阻碍双链的解开，因而影响了DNA的复制和转录。另外，嘧啶二聚体的形成，还会减弱双键间氢键的作用，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基正常配对；进一步的，将一次诱变菌液利用DES溶液诱变时，由于硫酸二乙酯(DES)是一种单功能烷化剂，其活性烷基易取代少动鞘脂单孢菌DNA分子中活泼的氢原子，并直接与DNA分子上的碱基及磷酸部分起烷化反应，进而使得菌株的DNA在复制时，导致碱基配对错误而引起突变，最后通过琼脂培养基培养筛选，挑取菌落大，有光泽，且菌落饱满的单菌落，从而得到诱变少动鞘脂单孢菌。该诱变方法操作方便、所需设备简单、诱变频率高且不易回复突变。
可选的，在步骤1)中：在所述活化的过程中，培养温度为28-32℃，培养时间为22-26小时。
可选的，在步骤1)中：所述振荡培养的过程中，培养温度为28-32℃，培养时间为16-20小时，摇床的转速为180-220转/分钟。
可选的，在步骤2)中：所述离心的转速为3800-4200转/分钟，离心时间为18-22分钟。
可选的，在步骤4)中：所加入的一次诱变菌液与所述DES溶液的体积比为(0.4-0.8)：100。
可选的，在步骤4)中：所述硫代硫酸钠溶液的质量浓度为22-27％。
可选的，在步骤5)中，所述培养的时间为28h～48h，温度为29-31℃。
可选的，在步骤5)中，所述琼脂培养基中含有氨苄青霉素。
所述的诱变少动鞘脂单孢菌在生产冷结胶中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌，其传代稳定，具有更高的产胶率，而且所产的结冷胶其粘度大，克服了现有技术中少动鞘脂单孢菌传代数次后出现菌种退化进而导致产胶指标下降且产胶率不高的缺陷。
(2)、本发明提供的诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法采用紫外诱变加化学诱变两种诱变方式制得制得诱变菌株，该两种诱变方式操作简单，所需的设备简易；而且诱变率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提供的诱变少动鞘脂单孢菌的制备流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
请参考图1，本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法包括以下步骤：
步骤101：将少动鞘脂单孢菌(Sphingomonas Paucimobilis)菌株活化后接种到液体培养基中振荡培养，得到培养后菌液；
将少动鞘脂单孢菌活化后，接种到液体培养基中进行培养，保证菌种能够大量增殖，为后续的诱变做好准备。
步骤102：将所述培养后菌液离心，得到菌体；并将所述菌体以等体积的生理盐水制成菌悬液；
利用液体培养基培养后的菌液，通过离心的方式收集菌体，再将该菌体利用等体积的生理盐水制成菌悬液，生理盐水作为微生物的保护剂，通过稳定渗透压的作用防止菌体细胞破裂，使得菌体免受损伤。
步骤103：将所述菌悬液利用10-15瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射60-80秒，得到一次诱变菌液；
在一次诱变的过程中，需要控制紫外等的功率以及照射时间和距离；如果照射时间太长，或者菌悬液与紫外灯的距离过近，则会造成菌种致死率上升；如果照射时间太短，且紫外灯与菌悬液的距离太大，则会使得诱变效果不理想；因此，在本发明中，同时控制紫外灯的功率、照射时间以及照射距离；进而实现最佳的诱变效果。
步骤104：将所述一次诱变菌液加入到体积分数为1.5-2.5％的DES溶液中，摇床震荡培养35-45分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
一次诱变结束后，将一次诱变菌液加入到体积分数为1.5-2.5％的DES溶液，DES溶液作为烷化剂，其活性烷基会取代菌体DNA分子中活泼的氢原子，直接与菌体DNA分子上的碱基及磷酸部分起烷化反应，在菌体进行DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，从而得到二次诱变菌液。
需要指出的是，在该步骤中，体积分数为1.5-2.5％的DES溶液，其配置方法为：取DES置于无菌试管中，加入少量乙醇使其溶解，再加入适量pH7.0的磷酸缓冲液，以得到体积分数为1.5-2.5％的DES溶液。
步骤105：将所述二次诱变菌液接种到琼脂培养基进行培养，并筛选菌落，得到诱变少动鞘脂单孢菌。
二次诱变菌液直接接种到琼脂培养基上进行培养，待其长出菌落后进行筛选，挑取菌落大，有光泽且菌落饱满的单菌落，该菌则为诱变少动鞘脂单孢菌。
另外，该诱变少动鞘脂单孢菌其菌苔呈黄色，较厚，表面湿润，进一步培养后颜色加深，表面干燥。
在应用时，将其接种到摇床培养，然后再接种到种子液中进行发酵培养，发酵产物经过提取，烘干即可获得结冷胶。
本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法，首先将少动鞘脂单孢菌活化后利用等体积的生理盐水制成菌悬液；在进行第一次诱变的过程中，将菌悬液利用10-15瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射60-80秒；紫外线辐射可以使少动鞘脂单孢菌DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚体，进而阻碍双链的解开，因而影响了DNA的复制和转录。另外，嘧啶二聚体的形成，还会减弱双键间氢键的作用，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基正常配对。
进一步的，将一次诱变菌液利用DES溶液诱变时，由于硫酸二乙酯(DES)是一种单功能烷化剂，其活性烷基易取代少动鞘脂单孢菌DNA分子中活泼的氢原子，并直接与DNA分子上的碱基及磷酸部分起烷化反应，进而使得菌株的DNA在复制时，导致碱基配对错误而引起突变，最后通过琼脂培养基培养筛选，挑取菌落大，有光泽，且菌落饱满的单菌落，从而得到诱变少动鞘脂单孢菌。该诱变方法操作方便、所需设备简单、诱变频率高且不易回复突变。
接下来，结合以上的内容，对本发明的诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法举出了以下具体的实施例：
实施例1
S11：将少动鞘脂单孢菌(Sphingomonas Paucimobilis)菌株转接活化斜面并于30℃恒温培养24小时，再转接至液体培养基，于30℃，200转/分钟的转速下培养18小时，得到培养后菌液；
S12：将所述培养后菌液4000转/分钟离心20分钟，得到菌体；并将所述菌体加入等体积的生理盐水，制成菌悬液；
S13：将所述菌悬液利用15瓦且与菌悬液相距20厘米的紫外灯照射60秒，得到一次诱变菌液；
S14：将所述一次诱变菌液加入到体积分数为2％的DES溶液中，摇床震荡培养40分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
其中，在该步骤中，在将一次诱变菌液加入到DES溶液的过程中，一次诱变菌液和DES溶液的体积比为0.4:100。硫代硫酸钠溶液的质量浓度为25％。
S15：将所述二次诱变菌液接种到含有氨苄青霉素的琼脂培养基于30℃培养40小时，并筛选菌落，得到诱变少动鞘脂单孢菌。
实施例2
S21：将少动鞘脂单孢菌(Sphingomonas Paucimobilis)菌株转接活化斜面并于30℃恒温培养24小时，再转接至液体培养基，于30℃，200转/分钟的转速下培养18小时，得到培养后菌液；
S22：将所述培养后菌液4000转/分钟离心20分钟，得到菌体；并将所述菌体加入等体积的生理盐水，制成菌悬液；
S23：将所述菌悬液利用15瓦且与菌悬液相距25厘米的紫外灯照射70秒，得到一次诱变菌液；
S24：将所述一次诱变菌液加入到体积分数为2％的DES溶液中，摇床震荡培养40分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
其中，在该步骤中，在将一次诱变菌液加入到DES溶液的过程中，一次诱变菌液和DES溶液的体积比为0.6:100。硫代硫酸钠溶液的质量浓度为25％。
S25：将所述二次诱变菌液接种到含有氨苄青霉素的琼脂培养基于30℃培养40小时，并筛选菌落，得到诱变少动鞘脂单孢菌。
实施例3
S31：将少动鞘脂单孢菌(Sphingomonas Paucimobilis)菌株转接活化斜面并于30℃恒温培养24小时，再转接至液体培养基，于30℃，200转/分钟的转速下培养18小时，得到培养后菌液；
S32：将所述培养后菌液4000转/分钟离心20分钟，得到菌体；并将所述菌体加入等体积的生理盐水，制成菌悬液；
S33：将所述菌悬液利用15瓦且与菌悬液相距25厘米的紫外灯照射70秒，得到一次诱变菌液；
S34：将所述一次诱变菌液加入到体积分数为2％的DES溶液中，摇床震荡培养40分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
其中，在该步骤中，在将一次诱变菌液加入到DES溶液的过程中，一次诱变菌液和DES溶液的体积比为0.6:100。硫代硫酸钠溶液的质量浓度为25％。
S35：将所述二次诱变菌液接种到含有氨苄青霉素的琼脂培养基于30℃培养40小时，并筛选菌落，得到诱变少动鞘脂单孢菌。
应用例
结冷胶为细菌细胞壁外的荚膜多糖，氨苄青霉素能够抑制细菌细胞壁组分肽聚糖的合成，从而抑制细菌的生长与繁殖，因此对氨苄青霉素有抗性的菌落，其细胞壁结构有变化，有助于胞外荚膜的形成。因此高氨苄青霉素抗性菌株合成结冷胶的能力也相对较高。
在具体应用的过程中，把经过诱变的二次诱变菌液涂布到含有氨苄青霉素(在培养基中的浓度为100mg/L)的无菌琼脂平板培养基上，后在恒温培养箱内30±1℃恒温培养28h～48h，挑出个大、有光泽、菌落饱满的单菌落，为了获得能够稳定遗传的菌株，可对该单菌落进行多次摇瓶复筛。
将实施例1-3得到的抗性突变株(连续传代8次以上)分别接到种子培养基中，置摇床上于28℃、220转/分钟培养24h，以10％接种量接种发酵培养72h。发酵产物经提取，烘干称重测定结冷胶产胶量。
此外，在相同的培养条件下，以原始的少动鞘脂单孢菌作为对照进行发酵产胶，产胶率请参考表1：
表1本发明各实施例提供的诱变少动鞘脂单孢菌的产胶率
| 项目 | 产胶率(g/L) | 发酵液粘度(cP) |
| 实施例1 | 16.3 | 9800 |
| 实施例2 | 16.17 | 9600 |
| 实施例3 | 16.28 | 9800 |
| 对照组 | 13 | 7500 |
由此可见，少动鞘脂单孢菌菌株在紫外线照射的同时配以硫酸二乙脂药物诱变和氨苄青霉素的协同作用下，可明显的提高冷结胶的产率。紫外线照射加药物协同作用影响了细胞的正常生理代谢过程，使得正常情况下不能在氨苄青霉素平板上生长的细菌，在代谢过程改变的前提下提高了抗氨苄青霉素的特性，提高了所产胶的指标，同时也提高了结冷胶的产胶水平，且使发酵液粘度增大。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (2)
1.一种诱变少动鞘脂单孢菌，其特征在于，该诱变少动鞘脂单孢菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.10341；保藏日期为2015年01月12日。
2.权利要求1所述的诱变少动鞘脂单孢菌在生产结冷胶中的应用。
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