CN101238791A - 一种提高无核葡萄育种效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高无核葡萄育种效率的方法，它是将一种植物生长抑制剂类物质矮壮素，或细胞分裂素类物质6－BA溶解配制成的药剂，在花前10～20天喷施到花穗上，在花后40～50天摘取葡萄果粒，取出胚珠进行胚挽救，使用本发明的胚发育率无核白由0～4.4％提高至8.3～11.9％；森田尼无核由0.5～2.5％提高到1.8～21.9％；火焰无核由7.1～17.1％提高到14.1～25.4％。本发明通过提高这些无核葡萄胚发育率，增加了杂交后代成苗的基数，从而能得到更多的杂交后代，提高育种效率，扩大了可用于无核葡萄杂交育种的亲本选择范围，加速无核品种的选育进程。

Description

一种提高无核葡萄育种效率的方法
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，涉及用外源植物生长调节物质和调控植物生殖器官胚的生长发育进程，并和胚挽救技术相结合，以促进在杂交授粉后，获得更多杂交后代，提高无核葡萄育种效率的方法。
背景技术
无核葡萄因食用方便，在鲜食和制干方面都深受消费者的欢迎，但是现有的无核葡萄品种多属欧亚品种群，该类品种风味品质较好，但是抗病性差，在许多葡萄产区生长季需要施用很多农药。在当今，农产品安全性问题日益受到关注，而且生活水平不断提高的消费者对各种不同风味特点的无核葡萄品种需求愈见旺盛。因此选育优质、大粒、抗病的无核葡萄，已成为葡萄育种者的重要目标。
无核葡萄根据其授粉受精结实特性，可分为单性结实(Parthenocarpy)和假单性结实(Pseudo-parthenocarpy)两种类型。单性结实类型的子房不经授粉受精就可发育成果实，但品种类型在杂交授粉后不能将该特性遗传给后代，因此在杂交选育没有利用价值。而假单性结实类型又叫种子败育型(Stenospermocarpy)，其子房需要正常的授粉受精，在果实发育过程中胚乳和胚中途停止发育，在浆果中留下种子痕迹，我们常见的无核葡萄如无核白、森田尼无核、火焰无核都属于这种类型。
20世纪80年代之前的无核葡萄品种中，70％左右是通过用有核品种(有无核倾向的)作母本，无核品种作父本杂交获得的。但这样杂交后代中出现无核植株比率很低，只有0％～15％。如果采用种子败育型的无核葡萄品种之间进行杂交，后代无核植株比例将会大为提高。而以无核葡萄品种为母本进行杂交的前提，必须能够促进幼胚发育，得到杂种植株或能萌发成植株的杂交种子。1982年Ramming等首次报道利用无核葡萄胚珠，在胚败育前取出离体培养，使胚在离体条件下继续发育，即胚挽救技术，获得了2株无核葡萄实生苗[1]。其后Cain等[2]，Emershad等[3]，Spiegile-Roy等[4]，Gray等[5]分别报道了葡萄胚的胚珠内培养，并培育出无核植株。我国学者在21世纪90年代开始，利用葡萄胚挽救技术进行无核葡萄新品种的选育，已获得可喜成果[6]。现在该技术已在世界各地的无核葡萄育种中得到广泛的应用。
胚挽救技术是在常规的杂交育种基础上，将已授粉受精的胚珠在无菌条件下取出，进行离体培养，促进胚在胚珠内继续发育，再经过转换几次培养基，最终使胚萌发成苗，获得杂交植株。不同杂交品种的胚在胚珠内的发育率差异很大，除了与父本品种基因型有关外，最主要是由母本基因型决定的。目前，无核葡萄胚挽救技术中，发育胚的萌发率和成苗率一般都能达到70％以上，影响胚挽救效率的主要因素是胚珠在离体培养后，其内部胚的发育率不高，而且不同品种胚发育率差异很大，在0～69.6％之间。因此，要完善胚挽救技术，虽然胚珠离体培养的条件要进一步研究，但母本基因型的影响是考虑的首要因素。
无核白(Thompson Seedless)、森田尼无核(又叫无核白鸡心，CentennialSeedless)和火焰无核(Flame Seedless)是在生产中常见的优良无核品种。它们的合子胚在发育过程的初期，即分裂到几十个细胞时就开始败育，所以浆果成熟时种痕都非常小，食用时几乎感觉不到。因此它们的胚珠在离体培养后胚的自然发育率也很低，且易受环境条件和父本的影响，一般无核白为1.9～4.4％，森田尼无核为0～2.5％，火焰无核为为7.1～16.5％，都属于自然胚发育率低的无核品种类型。虽然它们的优点显著，例如可溶性固形物含量高、肉脆、丰产、果粒和果穗外观好，但由于在胚挽救中极低的胚发育率，在杂交中以它们作母本，获得的杂交后代数量极少，很难在少量的杂交后代中选出综合优良性状的株系，导致浪费大量人力物力，因此限制了该品种在杂交育种中的使用。
在20世纪70年代无核葡萄胚挽救技术产生之前，有育种家利用植物生长调节剂促进假单性结实的无核葡萄胚发育，阻止无核葡萄胚的早期败育，形成具有生活力或发芽力的种子，以弥补无法用无核品种作母本进行杂交的缺陷，从而简化育种程序，提高无核葡萄育种效率[7]。育种家受赤霉素(GA)诱导有核葡萄无籽化技术的启发，用某些与赤霉素作用相反的乙稀利、激动素、生长抑制剂类物质等诱导雌性发育，在一些品种上直接获得了有发芽率的种子[8]。但是用无核葡萄有籽化技术获得的杂交后代的数量比率还很有限，离应用于杂交育种的实践还相差甚远。
引用出处：
[1]Ramming D.W，Emershad R.L.In-ovule embryo culture of seeded and seedlessVitis viniferal(Abst.)[J].Hortscience，1982，17(3)：487.
[2]Cain D.W.，Emershad R.L.，Tarailo R.E.In ovule embryo culture and Seedlingdevelopment of seeded and seedless grape(vitis vinifera L)[J].vitis，1983，22：9-14.
[3]Emershad R.L.，Ramming D.W.In-ovulo embryo culture of Vitis viniferaL.cv.“Thompson seedless”[J].Amer.J.Bot.，1984，71(6)：873-877.
[4]Spiegle-Roy P.，Sahar P N，Baron J.et al.In vitro culture and plant formationfrom grape cultivars with abortive ovules and seeds[J].J.Amer.Soc.Hort.Sci.，1985，110：109-112.
[5]Gray D.J.，Fisher L.C.，Mortensen.J.A.Comparison of methodlogies for inovuloembryo rescue of seedless grapes[J].Hortscience，1987，22：1334-1335.
[6]蒋爱丽，李世诚，金佩芳，杨天仪，骆军.胚培无核葡萄新品种——沪培1号的选育[J].果树学报，2007，24(3)：402-403.
[7]Ledbetter C.A.，shonnard C.B.Improved seed development and germination ofstenosermic grapes by plant growth regulators[J].Journal of Horticultural Science，1990，65(3)：269-274.
[8]Bordelon B.P.，Moore J.N.Promoting stenospermic grape seed trace development andgermination with plant growth regulators[J].J.Amer.Hort.Sci.，1994，119(4)：719-726.
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷与不足，本发明的目的在于提供一种用外源植物生长调节物质调控植物生殖器官胚的生长发育进程，并和胚挽救技术相结合，以促进在杂交授粉后，获得更多杂交后代，提高无核葡萄育种效率的方法。
实现上述发明目的的技术方案是一种提高无核葡萄育种效率的方法，具体包括下列步骤：
1)对胚发育率较低的无核品种，在开花前10～20天，气温在15～28℃，小穗已经分开，但小穗中的小花仍挤在一起的葡萄花穗上喷施50～500mg.L-1的生长抑制剂类物矮壮素(CCC，Chlormequat，2-氯乙基三甲基氯化铵，分子式：C5H13NCL2)溶液或者10～100mg.L-1细胞分裂素类物质6-BA(6-Benzylaminopurine，6-卞氨基嘌呤，分子式：C12H11N5)溶液，喷至药剂浸润全部花穗；
2)在开花期经常规的授粉受精，在花后40～50天，摘取幼果放入容器中，用自来水冲洗数次后，加入75％乙醇浸润30秒，无菌水冲洗一次，加入2.5％次氯酸钠浸泡5～10分钟，进行表面灭菌，无菌水冲洗2～3次；
3)在无菌条件下剖开果粒取出胚珠，接种到ER或改良ER培养基中；暗培养两个月后无菌剖开胚珠，在胚珠的喙部，发现有白色胚的，即为已发育的胚；
4)将胚取出转接到WP+BA 0.2萌发培养基中，一周后即可萌发，再转到1/2MS+IBA 0.1成苗培养基中成苗，就得到完整的无核葡萄杂交胚挽救试管苗，将杂交胚挽救试管苗进行继代扩繁，用试管苗进行炼苗移栽，成活后定植大田，即得到无核葡萄杂交植株。
所述的ER培养基是：大量元素为：Ca(NO3)2.4H2O 600mg.L-1，KNO3 160mg.L-1，KCl 65mg.L-1，NH4NO3 360mg.L-1，MgSO4.7H2O 750mg.L-1，NaSO4 200mg.L-1，NaH2PO4.H2O 19mg.L-1。微量元素为：MnSO4.H2O 3.0mg.L-1，H3BO3 0.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O 0.5mg.L-1，CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1，NaMoO4.2H2O 0.025mg.L-1。铁盐为：柠檬酸铁10.0mg.L-1。有机物为：肌醇50.0mg.L-1，甘氨酸3.0mg.L-1，盐酸硫胺素0.25mg.L-1，盐酸吡哆醇0.25mg.L-1，泛酸钙0.25mg.L-1，水解酪蛋白50.0mg.L-1。附加物质：半胱氨酸1.21mg.L-1，蔗糖60,000mg.L-1，活性炭3,000mg.L-1。PH 6.0。
所述的改良ER培养基是：大量元素为：KNO3 762.6mg.L-1，NH4NO3 293.6mg.L-1，MgSO4.7H2O 1254.6mg.L-1，NaH2PO4.2H2O 780.0mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O236.0mg.L-1。其它部分同ER培养基。
所述的萌发培养基是：大量元素为：NH4NO3 400mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O 556mg.L-1，K2SO4 990mg.L-1，KH2PO4 170mg.L-1，MgSO4 370mg.L-1，CaCl2.2H2O 96mg.L-1。微量元素为：MnSO4.H2O 22.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1，H3BO36.2mg.L-1，Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.25mg.L-1。铁盐：Na2.EDTA37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1。有机物为：肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，盐酸硫胺素1.0mg.L-1，盐酸吡哆醇0.5mg.L-1，烟酸0.5mg.L-1。附加物质：蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,500mg.L-1，BA 0.2mg.L-1。PH 6.0。
所述的成苗培养基是：大量元素为：KNO3 950mg.L-1，NH4NO3 825mg.L-1，MgSO4.7H2O 185mg.L-1，KH2PO4 85mg.L-1，CaCl2.2H2O 220mg.L-1。微量元素为：MnSO4.4H2O 22.3mg.L-1，ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1，H3BO3 6.2mg.L-1，KI 0.83mg.L-1，Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1，CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1。铁盐：Na2.EDTA 37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1。有机物为：肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，盐酸硫胺素0.4mg.L-1，盐酸吡哆醇0.5mg.L-1，烟酸0.5mg.L-1。附加物质：蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,000mg.L-1，IBA 0.1mg.L-1。PH 6.0。
所述的无核品种是无核白葡萄、森田尼无核葡萄、火焰无核葡萄。
所述的矮壮素溶液是按下列方法配制：首先配制矮壮素1000mg.L-1母液，称取1g矮壮素，用100ml左右的蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，即为1000mg.L-1母液，室温保存，近期使用；当配制50mg.L-1的矮壮素溶液时，用量筒量取50ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为50mg.L-1的矮壮素溶液；配制500mg.L-1的矮壮素溶液时，用量筒量取500ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为500mg.L-1的矮壮素溶液；要配制50和500mg.L-1之间的浓度，方法类似。
所述的6-BA溶液是按下列方法配制：首先配制6-BA 1000mg.L-1母液，称取1g 6-BA，用50～100ml的稀盐酸溶解，逐渐加入蒸馏水，边加边搅拌，以防产生沉淀，用蒸馏水定容至1000ml，并用NaOH调PH值到7.0左右，即为1000mg.L-1母液，室温保存，近期使用；配制10mg.L-1的6-BA溶液时，用量筒量取10ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为10mg.L-1的6-BA溶液；配制100mg.L-1的6-BA溶液时，用量筒量取100ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为100mg.L-1的6-BA溶液；要配制10和100mg.L-1之间的浓度，方法类似。
胚珠在ER或改良ER培养基中培养条件为：温度25±3℃，空气湿度40～60％。
胚在WP+BA 0.2萌发培养基中培养条件为：光照强度3000Lux，光周期12小时，温度25±3℃，空气湿度40～60％。
本发明能在胚挽救的基础上明显增加无核白、森田尼无核、火焰无核葡萄的胚发育率，即提高了影响胚挽救效率的主要决定因素——不同基因型的胚发育率，从而在源头上提高了无核葡萄胚挽救效率。通过提高这些无核葡萄胚发育率，能增加后继成苗的基数，从而得到更多的杂交植株后代，避免具综合优良形状的后代株系夭折在早期合子胚的阶段，最终提高育种效率，扩大了无核葡萄杂交育种的亲本选择范围，加速无核品种的选育进程。
具体实施方式
下面结合发明人给的具体实施例来进一步说明本发明的操作方法及其有益效果。
在实施本发明所述的一种提高无核葡萄育种效率的方法中，具体涉及以下培养基：
所述的ER培养基是：大量元素为：Ca(NO3)2.4H2O 600mg.L-1，KNO3 160mg.L-1，KCl 65mg.L-1，NH4NO3 360mg.L-1，MgSO4.7H2O 750mg.L-1，NaSO4 200mg.L-1，NaH2PO4.H2O 19mg.L-1。微量元素为：MnSO4.H2O 3.0mg.L-1，H3BO3 0.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O 0.5mg.L-1，CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1，NaMoO4.2H2O 0.025mg.L-1。铁盐为：柠檬酸铁10.0mg.L-1。有机物为：肌醇50.0mg.L-1，甘氨酸3.0mg.L-1，盐酸硫胺素0.25mg.L-1，盐酸吡哆醇0.25mg.L-1，泛酸钙0.25mg.L-1，水解酪蛋白50.0mg.L-1。附加物质：半胱氨酸1.21mg.L-1，蔗糖60,000mg.L-1，活性炭3,000mg.L-1。PH 6.0。
所述的改良ER培养基是：大量元素为：KNO3 762.6mg.L-1，NH4NO3 293.6mg.L-1，MgSO4.7H2O 1254.6mg.L-1，NaH2PO4.2H2O 780.0mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O236.0mg.L-1。其它部分同ER培养基。
所述的萌发培养基是：大量元素为：NH4NO3 400mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O 556mg.L-1，K2SO4 990mg.L-1，KH2PO4 170mg.L-1，MgSO4 370mg.L-1，CaCl2.2H2O 96mg.L-1。微量元素为：MnSO4.H2O 22.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1，H3BO36.2mg.L-1，Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.25mg.L-1。铁盐：Na2.EDTA37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1。有机物为：肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，盐酸硫胺素1.0mg.L-1，盐酸吡哆醇0.5mg.L-1，烟酸0.5mg.L-1。附加物质：蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,500mg.L-1，BA 0.2mg.L-1。PH 6.0。
所述的成苗培养基是：大量元素为：KNO3 950mg.L-1，NH4NO3 825mg.L-1，MgSO4.7H2O 185mg.L-1，KH2PO4 85mg.L-1，CaCl2.2H2O 220mg.L-1。微量元素为：MnSO4.4H2O 22.3mg.L-1，ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1，H3BO3 6.2mg.L-1，KI 0.83mg.L-1，Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1，CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1。铁盐：Na2.EDTA 37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1。有机物为：肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，盐酸硫胺素0.4mg.L-1，盐酸吡哆醇0.5mg.L-1，烟酸0.5mg.L-1。附加物质：蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,000mg.L-1，IBA 0.1mg.L-1。PH 6.0。
实施例1矮壮素溶液的制备
矮壮素先溶解配制成1000mg.L-1母液：称取1g矮壮素(购自上海稼丰园艺用品有限公司，纯度98％)，用100ml左右的蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，即为1000mg.L-1母液，室温保存，近期使用。当配制50mg.L-1的矮壮素溶液时，用量筒量取50ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为50mg.L-1的矮壮素溶液。
配制500mg.L-1的矮壮素溶液时，用量筒量取500ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为500mg.L-1的矮壮素溶液；要配制50和500mg.L-1之间的浓度，方法类似。
实施例2 6-BA溶液的制备
6-BA同样先配制成1000mg.L-1母液：称取1g 6-BA(上海化学试剂公司出品，纯度99.6％)，用50～100ml的稀盐酸溶解，逐渐加入蒸馏水，边加边搅拌，以防产生沉淀，用蒸馏水定容至1000ml，并用NaOH调PH值到7.0左右，即为1000mg.L-1母液，室温保存，近期使用。配制10mg.L-1的6-BA溶液时，用量筒量取10ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为10mg.L-1的6-BA溶液。
配制100mg.L-1的6-BA溶液时，用量筒量取100ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为100mg.L-1的6-BA溶液；要配制10和100mg.L-1之间的浓度，方法类似。
实施例3
在无核白开花前10～20天时，选择气温在15～28℃、无风、无雨的早晨或下午，用手持压力喷壶喷施矮壮素100mg.L-1于小穗已经分开，但小穗中的小花仍挤在一起的葡萄花穗，喷至药剂浸润全部花穗。花穗前部用塑料板挡隔，以防药剂接触到其它枝叶花序。在开花期进行常规的去雄杂交授粉。40～50天后，摘取幼果放入广口瓶，用自来水冲洗数次后，加入75％乙醇浸润30秒，无菌水冲洗一次，加入2.5％次氯酸钠浸泡5分钟，进行表面灭菌，无菌水冲洗2次。在无菌条件下剖开果粒取出胚珠，接种到改良ER固液双层培养基中，进行暗培养，培养室温度25±3℃，空气湿度40～60％。两个月后，在解剖镜下，无菌剖开胚珠，在胚珠的喙部，发现有白色胚的，即为已发育的胚。花前用矮壮素或6-BA处理的有发育胚的胚珠比率明显增多。将胚取出，转接到WP+BA 0.2萌发培养基中，培养条件为：光照强度3000Lux，光周期12小时，温度25±3℃，空气湿度40～60％。一周后即可萌发，再转到1/2MS+IBA0.1成苗培养基中成苗，在相同培养基中继代扩繁(培养条件同萌发培养)后，炼苗移栽，成活后定植大田，即得到杂交植株。
实施例4
森田尼无核开花前10～20天时，选择气温在15～28℃、无风、无雨的早晨或下午，用手持压力喷壶喷施矮壮素500mg.L-1于小穗已经分开，但小穗中的小花仍挤在一起的葡萄花穗，喷至药剂浸润全部花穗。花穗前部用塑料板挡隔，以防药剂接触到其它枝叶花序。在开花期进行常规的去雄杂交授粉。40～50天后，摘取幼果放入广口瓶，用自来水冲洗数次后，加入75％乙醇浸润30秒，无菌水冲洗一次，加入2.5％次氯酸钠浸泡5～10分钟，进行表面灭菌，无菌水冲洗3次。在无菌条件下剖开果粒取出胚珠，接种到ER培养基中，进行暗培养，培养室温度25±3℃，空气湿度40～60％。两个月后，在解剖镜下，无菌剖开胚珠，在胚珠的喙部，发现有白色胚的，即为已发育的胚。花前用矮壮素或6-BA处理的有发育胚的胚珠比率明显增多。将胚小心取出，转接到WP+BA 0.2萌发培养基中，培养条件为：光照强度3000Lux，光周期12小时，温度25±3℃，空气湿度40～60％。一周后即可萌发，再转到1/2MS+IBA 0.1成苗培养基中成苗，在相同培养基中继代扩繁(培养条件同萌发培养)后，炼苗移栽，成活后定植大田，即得到杂交植株。
实施例5
火焰无核开花前10～20天时，选择气温在15～28℃、无风、无雨的早晨或下午，用手持压力喷壶喷施6-BA 10mg.L-1于小穗已经分开但小穗中的小花仍挤在一起的葡萄花穗，喷至药剂浸润全部花穗。花穗前部用塑料板挡隔，以防药剂接触到其它枝叶花序。在开花期进行常规的去雄杂交授粉。40～50天后，摘取幼果放广口瓶，用自来水冲洗数次后，加入75％乙醇浸润30秒，无菌水冲洗一次，加入2.5％次氯酸钠浸泡5～10分钟，进行表面灭菌，无菌水冲洗2次。在无菌条件下剖开果粒取出胚珠，接种到ER培养基中，进行暗培养，培养室温度25±3℃，空气湿度40～60％。两个月后，在解剖镜下，无菌剖开胚珠，在胚珠的喙部，发现有白色胚的，即为已发育的胚。将胚取出，转接到WP+BA 0.2萌发培养基中，培养条件为：光照强度3000Lux，光周期12小时，温度25±3℃，空气湿度40～60％。一周后即可萌发，再转到1/2MS+IBA 0.1成苗培养基中成苗，在相同培养基中继代扩繁(培养条件同萌发培养)后，炼苗移栽，成活后定植大田，即得到杂交植株。
实施例6
在无核白开花前10～20天时，选择气温在15～28℃、无风、无雨的早晨或下午，用手持压力喷壶喷施6-BA 100mg.L-1于小穗已经分开，但小穗中的小花仍挤在一起的葡萄花穗，喷至药剂浸润全部花穗。花穗前部用塑料板挡隔，以防药剂接触到其它枝叶花序。在开花期进行常规的去雄杂交授粉。40～50天后，摘取幼果放入广口瓶，用自来水冲洗数次后，加入75％乙醇浸润30秒，无菌水冲洗一次，加入2.5％次氯酸钠浸泡5～10分钟，进行表面灭菌，无菌水冲洗2～3次。在无菌条件下剖开果粒取出胚珠，改良ER培养基中。暗培养两个月后，在解剖镜下，无菌剖开胚珠，在胚珠的喙部，发现有白色胚的，即为已发育的胚。将胚取出，转接到WP+BA 0.2萌发培养基中，培养条件为：光照强度3000Lux，光周期12小时，温度25±3℃，空气湿度40～60％。一周后即可萌发，再转到1/2MS+IBA 0.1成苗培养基中成苗，在相同培养基中继代扩繁(培养条件同萌发培养)后，炼苗移栽，成活后定植大田，即得到杂交植株。
实施例7
以下是采用本发明的方法和采用常规的方法做对比，来进一步说明本发明提高无核葡萄育种效率的方法的有益效果，具体结果见表1。
                表1不同药剂对各品种胚发育率的影响
  品种   药剂   浓度(mg.L-1)   胚发育率(％)   对照胚发育率(％)
  无核白   矮壮素   100～500   8.3～8.8   0～4.4
  无核白   6-BA   10～100   6.0～11.9   0～4.4
  森田尼无核   矮壮素   50～500   1.8～21.9   0.5～2.5
  火焰无核   6-BA   10～100   14.1～25.4   7.1～17.1
本发明通过提高这些无核葡萄胚发育率，增加了杂交后代成苗的基数，从而能得到更多的杂交后代，提高育种效率，扩大了可用于无核葡萄杂交育种的亲本选择范围，加速无核品种的选育进程。

Claims (6)

1.一种提高无核葡萄育种效率的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)对胚发育率较低的无核品种，在开花前10～20天，气温在15～28℃，小穗已经分开，但小穗中的小花仍挤在一起的葡萄花穗上喷施50～500mg.L-1的生长抑制剂类物质矮壮素溶液或者10～100mg.L-1细胞分裂素类物质6-BA溶液，喷至药剂浸润全部花穗；
2)在开花期经常规的授粉受精，在花后40～50天，摘取幼果放入容器中，用自来水冲洗3～5次后，加入75％乙醇浸润30秒，无菌水冲洗一次，加入2.5％次氯酸钠浸泡5～10分钟，进行表面灭菌，无菌水冲洗2～3次；
3)在无菌条件下剖开果粒取出胚珠，接种到ER或改良ER培养基中，暗培养两个月后无菌剖开胚珠，在胚珠的喙部，发现有白色胚的，即为已发育的胚；
4)将胚取出转接到WP+BA 0.2萌发培养基中，一周后即可萌发，再转到1/2MS+IBA 0.1成苗培养基中成苗，就得到完整的无核葡萄杂交胚挽救试管苗，将杂交胚挽救试管苗进行继代扩繁，用试管苗进行炼苗移栽，成活后定植大田，即得到无核葡萄杂交植株；
所述的ER培养基是：大量元素为：Ca(NO3)2.4H2O 600mg.L-1，KNO3 160mg.L-1，KCl 65mg.L-1，NH4NO3 360mg.L-1，MgSO4.7H2O 750mg.L-1，NaSO4 200mg.L-1，NaH2PO4.H2O 19mg.L-1；微量元素为：MnSO4.H2O 3.0mg.L-1，H3BO3 0.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O 0.5mg.L-1，CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1，NaMoO4.2H2O 0.025mg.L-1；铁盐为：柠檬酸铁10.0mg.L-1；有机物为：肌醇50.0mg.L-1，甘氨酸3.0mg.L-1，盐酸硫胺素0.25mg.L-1，盐酸吡哆醇0.25mg.L-1，泛酸钙0.25mg.L-1，水解酪蛋白50.0mg.L-1；附加物质：半胱氨酸1.21mg.L-1，蔗糖60,000mg.L-1，活性炭3,000mg.L-1，PH值为6.0；
所述的改良ER培养基是：大量元素为：KNO3 762.6mg.L-1，NH4NO3 293.6mg.L-1，MgSO4.7H2O 1254.6mg.L-1，NaH2PO4.2H2O 780.0mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O236.0mg.L-1；其它部分同ER培养基；
所述的萌发培养基是：大量元素为：NH4NO3 400mg.L-1，Ca(NO3)2.4H2O 556mg.L-1，K2SO4 990mg.L-1，KH2PO4 170mg.L-1，MgSO4 370mg.L-1，CaCl2.2H2O 96mg.L-1；微量元素为：MnSO4.H2O 22.5mg.L-1，ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1，H3BO36.2mg.L-1，Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.25mg.L-1；铁盐：Na2.EDTA37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1。有机物为：肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，盐酸硫胺素1.0mg.L-1，盐酸吡哆醇0.5mg.L-1，烟酸0.5mg.L-1；附加物质：蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,500mg.L-1，BA 0.2mg.L-1，PH值为6.0；
所述的成苗培养基是：大量元素为：KNO3 950mg.L-1，NH4NO3 825mg.L-1，MgSO4.7H2O 185mg.L-1，KH2PO4 85mg.L-1，CaCl2.2H2O 220mg.L-1；微量元素为：MnSO4.4H2O 22.3mg.L-1，ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1，H3BO3 6.2mg.L-1，KI 0.83mg.L-1，Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1，CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1，CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1；铁盐：Na2.EDTA 37.3mg.L-1，FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1；有机物为：肌醇100.0mg.L-1，甘氨酸2.0mg.L-1，盐酸硫胺素0.4mg.L-1，盐酸吡哆醇0.5mg.L-1，烟酸0.5mg.L-1；附加物质：蔗糖20,000mg.L-1，活性炭1,000mg.L-1，IBA 0.1mg.L-1，PH值为6.0。
2.根据权利要求1所述的提高无核葡萄育种效率的方法，其特征在于，所述的无核品种是无核白葡萄、森田尼无核葡萄、火焰无核葡萄。
3.根据权利要求1所述的提高无核葡萄育种效率的方法，其特征在于，所述的矮壮素溶液是按下列方法配制：先配制1000mg.L-1矮壮素母液，称取1g矮壮素，用100ml左右的蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，即为1000mg.L-1母液，室温保存，近期使用；当配制50mg.L-1的矮壮素溶液时，用量筒量取50ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为50mg.L-1的矮壮素溶液。
4.根据权利要求1所述的提高无核葡萄育种效率的方法，其特征在于，所述的6-BA溶液是按下列方法配制：先配制1000mg.L-16-BA母液，称取1g6-BA，用50～100ml的稀盐酸溶解，逐渐加入蒸馏水，边加边搅拌，以防产生沉淀，用蒸馏水定容至1000ml，并用NaOH调PH值到7.0左右，即为1000mg.L-1母液，室温保存，近期使用；配制10mg.L-1的6-BA溶液时，用量筒量取10ml母液，定容至1000ml，再加入1ml的吐温-20，即0.1％浓度，混匀，即为10mg.L-1的6-BA溶液。
5.根据权利要求1所述的提高无核葡萄育种效率的方法，其特征在于，胚珠在ER或改良ER培养基中培养条件为：温度25±3℃，空气湿度40～60％。
6.根据权利要求1所述的提高无核葡萄育种效率的方法，其特征在于，胚在WP+BA 0.2萌发培养基中培养条件为：光照强度3000Lux，光周期12小时，温度25±3℃，空气湿度40～60％。
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