CN115606504B - 滇龙胆多倍体培育方法 - Google Patents
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Abstract
滇龙胆多倍体培育方法,涉及滇龙胆多倍体的培育技术。本发明的方法包括外植体的选择与清洁、外植体的消毒、接种、染色体加倍诱导、生根培养、形态鉴定筛选、染色体鉴定步骤;其中,诱导液为不添加琼脂的MS+0.04‑0.08%安磺灵+0.02‑0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO。本发明染色体加倍诱导剂采用二甲戊灵和安磺灵进行复配使用,丛生芽死亡率低于8%,多倍体诱导率高达65%以上,较单一使用秋水仙素的丛生芽死亡率低,多倍体诱导率高。
Description
技术领域
本发明涉及中药材的育种方法,属于中药材及生物技术领域,特别涉及滇龙胆多倍体的培育方法。
背景技术
滇龙胆(Gentiana rigescens Franch.)为龙胆科龙胆属多年生草本植物,以根和根茎,是我国常用大宗药材之一,具有清热燥湿、泻肝胆火的功效。滇龙胆主产于云南。
多倍体普遍存在于自然界中,常见于高等植物中,据资料统计,种子植物中的528属1171种中约有38.71%是多倍体,其中被子植物约50%为多倍体。
多倍体由于具有抗逆性增强、茎叶增粗增厚、可使单株生物量增加或次生代谢产物增加等特性,使得多倍体育种逐渐成为植物育种的重要方向。对于观赏性植物来说,多倍体可能使其更具观赏性,而对于药用植物来说,多倍体可能使其产量增加,亦有可能使其有效成分含量提高。
目前,仅有孙天国等发表的(《东北龙胆多倍体诱导的研究》[J],高师理科学刊,2010,30(2):69-71)以及梁伟发表的(大叶秦艽的组织培养及离体诱导多倍体的研究[D],西安:西北大学,2007。)对龙胆多倍体诱导进行了研究,但还未有滇龙胆多倍体育种的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种滇龙胆多倍体培育方法,使得培育出的滇龙胆更具观赏性,有效成分含量提高,亩产提高。
滇龙胆多倍体培育方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
步骤1,选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体,并进行清洁和消毒;
步骤2,将消毒好的外植体接种于丛生芽诱导培养基中进行诱导;
步骤3,将诱导出的丛生芽,置于诱导液中进行染色体加倍诱导;
步骤4,将经染色体加倍诱导的芽,接种于生根培养基中生根培养;
步骤5,生根培养后进行形态鉴定筛选,筛选出叶片明显增肥变宽,茎明显增粗的生根苗;
步骤6,染色体鉴定,取经筛选的苗的根尖,用染色体染色计数法镜检,筛选出染色体数至少等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体;
步骤3所述的诱导液为不添加琼脂的MS+0.04-0.08%安磺灵+0.02-0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO。
步骤2所述的丛生芽诱导培养基为MS+NAA0.01-0.05mg/L+KT 5.0-10.0mg/L+TDZ0.05-0.15mg/L。
步骤4所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5-1mg/L+IAA0.5-1.0mg/L。
植物多倍体育种中常用的化学诱导剂为秋水仙素,但其为剧毒化学品,购买及使用都极其严格,其药品的管理及使用有一定的安全风险,而本发明的化学诱导剂为二甲戊灵和安磺灵,均为低毒试剂,使用时相对秋水仙素安全,同时由于其主要用途为除草剂,更加容易采购,使用成本较低。
本发明染色体加倍诱导剂采用二甲戊灵和安磺灵进行复配使用,丛生芽死亡率低于8%,多倍体诱导率高达65%以上,较单一使用秋水仙素的丛生芽死亡率低,多倍体诱导率高。
本发明能使滇龙胆药材中核心质量标准的龙胆苦苷含量增加1.2倍左右。使滇龙胆茎明显增粗,叶明显增宽,可使得种植亩产提高约1.4倍以上。可使滇龙胆花色更具观赏价值,同时花期亦可延长15-40天。
附图说明
图1为染色体加倍前后比较图,其中,图1a为染色体加倍后的形态学叶片增肥变宽,图1b为未进行染色体加倍的叶片形态,相对较薄及小。
图2为染色体加倍前后比较图,其中,图2a为染色体加倍后形态学明显增粗,图2b为为未进行染色体加倍的茎形态,相对较细。
图3为多倍体滇龙胆表现出的不同花色及花型。
具体实施方式
实施例1:滇龙胆多倍体培育方法,包括以下步骤:
1、外植体的选择与清洁:
选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体,用肥皂水涮洗至表面无明显尘土,自来水冲淋40min。
2、外植体的消毒:
将清洁完成的外植体,转移至超净工作台内,用75%酒精消毒20s,无菌水冲洗2次,饱和漂白粉溶液消毒30min,无菌水冲洗3次,0.05%升汞溶液消毒10min,无菌水冲洗6次,消毒污染率为17.4%,消毒死亡率为3.6%。
3、接种:
将消毒好的外植体,用无菌纸吸去表面水分,并剪去两端伤口,接种于MS+NAA0.01mg/L+KT 5.0mg/L+TDZ 0.05mg/L的丛生芽诱导培养基中,置于温度为25±2℃,单日照强度为2000-3000lx的白光12h进行光暗交替培养30天,丛生芽诱导率为65.9%。
4、染色体加倍诱导:
将诱导出的丛生芽,剪成单芽,置于MS(不添加琼脂)+0.04%安磺灵+0.02%二甲戊灵+0.5%DMSO(二甲基亚砜)的诱导液中,置于温度为25±2℃,单日照强度为2000-3000lx的白光12h进行光暗交替下静置培养6天,多倍体诱导率为69.3%,诱导后芽死亡率为4.9%。
5、生根培养:
将经染色体加倍诱导的芽,接种于1/2MS+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/L的生根培养基中,置于温度为25±2℃,单日照强度为2000-3000lx的白光12h进行光暗交替下培养30天,生根率为100%。
6、形态鉴定筛选:
筛选出叶片明显增肥变宽,茎明显增粗的生根苗,变异率为86.3%。
7、染色体鉴定:
取经筛选的苗的根尖,用染色体染色计数法镜检,筛选出染色体数至少为4n的生根苗为滇龙胆多倍体,形态变异植株中多倍体率为80.3%。
实施例2:滇龙胆多倍体培育方法,包括以下步骤:
1、外植体的选择与清洁:
选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体,用肥皂水涮洗至表面无明显尘土,自来水冲淋50min。
2、外植体的消毒:
将清洁完成的外植体,转移至超净工作台内,用75%酒精消毒20s,无菌水冲洗2次,饱和漂白粉溶液消毒30min,无菌水冲洗3次,0.05%升汞溶液消毒10min,无菌水冲洗6次,消毒污染率为15.9%,消毒死亡率为3.8%。
3、接种:
将消毒好的外植体,用无菌纸吸去表面水分,并剪去两端伤口,接种于MS+NAA0.05mg/L+KT 10.0mg/L+TDZ 0.15mg/L的丛生芽诱导培养基中,置于温度为25±2℃,单日照强度为2000-3000lx的白光12h进行光暗交替培养30天,丛生芽诱导率为69.1%。
4、染色体加倍诱导:
将诱导出的丛生芽,剪成单芽,置于MS(不添加琼脂)+0.08%安磺灵+0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO(二甲基亚砜)的诱导液中,置于温度为25±2℃,单日照强度为2000-3000lx的白光12h进行光暗交替下静置培养5天,多倍体诱导率为74.9%,诱导后芽死亡率为7.4%。
5、生根培养:
将经染色体加倍诱导的芽,接种于1/2MS+NAA 1mg/L+IAA 1.0mg/L的生根培养基中,置于温度为25±2℃,单日照强度为2000-3000lx的白光12h进行光暗交替下培养20-30天,生根率为100%。
6、形态鉴定筛选:
筛选出叶片明显增肥变宽,茎明显增粗的生根苗,变异率为77.5%。
7、染色体鉴定:
取经筛选的苗的根尖,用染色体染色计数法镜检,筛选出染色体数大于或等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体,形态变异植株中多倍体率为96.6%。
本发明染色体加倍过程中,经诱导出的丛生芽,剪成单芽,以DMSO为辅助剂,采用不同浓度、不同浸泡时间的秋水仙素、安磺灵、二甲戊灵、氟乐灵、甲基胺草磷进行二因素三水平对比试验,具体试验设计如表1。
经上述诱导剂诱导后,将染色体加倍诱导的芽接种于实施例1的生根培养基中,待生根后筛选出叶片明显增肥变宽,茎明显增粗的植株,取根尖进行染色体染色镜检,其结果如下表2。
从表1和表2可以看出,以0.1%的秋水仙素浸泡24、48以及72小时的多倍体诱导率为最高,但其丛生芽的死亡率亦较高,最高可达41.3%,而其他类除草剂,除采用0.1%浓度的氟乐灵浸泡24、48以及72小时的丛生芽死亡率较高外,其余均较低,但单一诱导剂因素使用下来,仍以秋水仙素为最佳,然而采用复配诱导剂后取得了较为显著的效果,具体体现如下。
经诱导出的丛生芽,剪成单芽,以DMSO为辅助剂,采用除秋水仙素外不同种类的诱导剂进行不同浓度的复配试验,浸泡时间为72小时,具体试验设计如下表3。
经上述诱导剂复配诱导后,将染色体加倍诱导的芽接种于实施例1的生根培养基中,待生根后筛选出叶片明显增肥变宽,茎明显增粗的植株,取根尖进行染色体染色镜检,其结果如下表4。
由表3和表4可以看出,甲基草铵膦与其他诱导剂进行复配时,对丛生芽死亡率和多倍体诱导率并没有特别大的影响,而氟乐灵不论多大浓度,与安磺灵或二甲戊灵组合时,虽然多倍体诱导率得到极大的提升,但丛生芽死亡率也随之大幅增加,而仅安磺灵和二甲戊灵进行组合时,能极大幅度的提高多倍体诱导率,同时还能将丛生芽死亡率控制到理想范围内,如FP6及FP8。
在表3中的FP6的基础上,去掉甲基胺草磷,用0.05%安磺灵与0.05%二甲戊灵进行组合,对丛生芽进行浸泡2d、3d、4d、5d、6d、7d试验,结果发现,在5d内,浸泡时间愈长,其多倍体诱导率愈高,5d后,多倍体诱导率不再明显升高,而在7d范围内,浸泡时间对丛生芽死亡率影响不大。
但是,在研究过程中发现,随着浸泡时间的延长,诱导后的丛生芽接种在生根培养基中时,苗开始表现为叶肉黄绿、苗纤弱等缺营养症状,后在染色体加倍诱导时加入添加琼脂的MS时,可完全规避缺素现象的发生。
将实施例1和实施例2的原母本种子育苗后进行栽植,同时将实施例1和实施例2中获得的多倍体苗进行栽植,分别检测龙胆苦苷含量以及测定其亩产量,同时进行观赏性状比较,其结果如下表5。
Claims (2)
1.滇龙胆多倍体培育方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
步骤1,选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体,并进行清洁和消毒;
步骤2,将消毒好的外植体接种于丛生芽诱导培养基中进行诱导;
步骤3,将诱导出的丛生芽,置于诱导液中进行染色体加倍诱导;
步骤4,将经染色体加倍诱导的芽,接种于生根培养基中生根培养;
步骤5,生根培养后进行形态鉴定筛选,筛选出叶片明显增肥变宽,茎明显增粗的生根苗;
步骤6,染色体鉴定,取经筛选的苗的根尖,用染色体染色计数法镜检,筛选出染色体数至少等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体;
步骤3所述的诱导液为不添加琼脂的MS+0.04-0.08%安磺灵+0.02-0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO;
步骤2所述的丛生芽诱导培养基为MS+NAA0.01-0.05mg/L+KT 5.0-10.0mg/L+TDZ0.05-0.15mg/L。
2.如权利要求1所述的滇龙胆多倍体培育方法,其特征在于步骤4所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5-1mg/L+IAA0.5-1.0mg/L。
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