CN110521605A - 一种中药毛瑞香的组培快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种中药毛瑞香的组培快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取毛瑞香的外植体、外植体诱导培养、增殖培养、生根培养和移栽；所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：B5培养基、1.5～2.5mg/L KT、0.5～1.0mg/LGA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、100～500mg/L PVP、10～20ml/L椰子汁，pH为5.6～5.9。本发明选择毛瑞香带节茎段为外植体，经诱导培养、增殖培养、生根培养以及移栽等步骤，其诱导率达到了90％以上，成活率达到了90％以上，实现了毛瑞香的组培快繁，从而实现了本发明的目的。

Description

一种中药毛瑞香的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种中药毛瑞香的组培快繁方法。
背景技术
毛瑞香(Daphne odora Thunb.var.atrocaulis Rehd.)，又名山瑞香、紫茎瑞香,为瑞香科瑞香属植物,为我国特有的药用植物,分布于江苏、安徽、浙江、江西、台湾、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州等地,茎皮及根入药,可供药用,具有活血消肿和利咽之功效,主治跌打损伤,咽喉炎等症。
从公开发表的文献来看，对毛瑞香的研究主要集中在化学成分、生药鉴别及质量标准制定等方面，对毛瑞香繁育技术研究极少，也未有毛瑞香组培快繁专利的申请。因此有必要建立毛瑞香的组培快繁体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药毛瑞香的组培快繁方法，选择毛瑞香带节茎段为外植体，经诱导培养、增殖培养、生根培养以及移栽步骤，其外植体诱导率达到了90％以上，移栽成活率达到了90％以上，实现了毛瑞香的组培快繁，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案为：一种中药毛瑞香的组培快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取毛瑞香的外植体、外植体诱导培养、增殖培养、生根培养和移栽；
所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：B5培养基、1.5～2.5mg/LKT(激动素)、0.5～1.0mg/L GA(赤酶素)、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、100～500mg/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮)，10～20ml/L椰子汁，pH为5.6～5.9。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，所述的外植体诱导培养操作的方法为：将采集得到的作为外植体的毛瑞香消毒后剪切成2.0～2.5cm的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养50～60天即可诱导形成不定芽。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，所述的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：B5培养基、1.5～2mg/L ZT(玉米素)、0.2～0.4mg/L GA(赤酶素)、10～20mg/L CH(水解酪蛋白)、25～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、50～100mg/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、10～20ml/L椰子汁，pH为5.6～5.9。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，所述的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养得到的不定芽切成长1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养40～50天即可实现不定芽的增殖。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：1/2MS培养基、0.5～1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、10～20mg/L CH(水解酪蛋白)、15～25g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、10～20ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，所述的生根培养操作的方法为：从增殖培养得到增殖后的不定芽的基部切取2.0～3.0cm不定芽并接种到生根培养基中培养40～50天即能实现试管苗的生根。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，所述的移栽操作的具体方法为：将经生根培养操作得到的根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:2的腐殖土与河沙混合基质中栽培成苗即得毛瑞香种苗。
在上述的中药毛瑞香的组培快繁方法中，增殖培养操作、生根培养操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为14～16小时/天。
本发明的有益效果：
1.本发明选择野生毛瑞香新生茎段为外植体，通过筛选和优化不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养等过程的培养基配方和培养条件，经诱导、继代、生根以及移栽等步骤，实现了毛瑞香的快速繁殖。
2.本发明具有诱导率高、繁殖系数高、种苗品质好、成本低等特点，可直接用于毛瑞香的繁育和保护，对于毛瑞香的遗传改良、种质资源保护和开发利用具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体采集：在广西防城港市野外选取生长健壮、无明显病害的毛瑞香植株中上部、光照充足的带节茎段为外植体，采集后保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：将步骤(1)采集回实验室的外植体用自来水下冲洗8小时，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒30秒钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.5％的次氯酸钠溶液中消毒25分钟，无菌水冲洗10次后用无菌滤纸吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养50天即可诱导形成不定芽，诱导率达94％。所述的诱导培养基为：B5培养基+2.5mg/L KT+1mg/L GA+30g/L蔗糖+4g/L琼脂+500mg/L PVP+20ml/L椰子汁，pH为5.6。
(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养40天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到5.2倍。所述的增殖培养基为：B5培养基+2mg/L ZT+0.4mg/L GA+20mg/L CH+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+100mg/L PVP+20ml/L椰子汁,pH为5.6。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培40天即能实现试管苗的生根，生根率达到95.8％。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+1.0mg/L 6-BA+20mg/L CH+25g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+20ml/L椰子汁，pH为5.4。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:2的腐殖土与河沙混合基质中栽培成苗即得毛瑞香种苗，移栽30天后成活率达到95％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：在广西玉林市野外选取生长健壮、无明显病害的毛瑞香植株中上部、光照充足的带节茎段为外植体，采集后保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：将步骤(1)采集回实验室的外植体置于自来水下冲洗4小时，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒25秒钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.5％的次氯酸钠溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养55天即可诱导形成不定芽，诱导率达到93％。所述的诱导培养基为：B5培养基+2mg/L KT+0.8mg/L GA+30g/L蔗糖+4g/L琼脂+300mg/L PVP+15ml/L椰子汁，pH为5.7。
(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养45天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到4.8倍。所述的增殖培养基为：B5培养基+1.8mg/L ZT+0.3mg/L GA+15mg/L CH+28g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+80mg/L PVP+15ml/L椰子汁，pH为5.7。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养45天即能实现试管苗的生根，生根率达到93.0％以上。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+0.8mg/L 6-BA+15mg/L CH+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+15ml/L椰子汁，pH为5.6。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:2的腐殖土与河沙混合基质中栽培成苗即得毛瑞香种苗，移栽30天成活率达到93％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为27℃，光照强度为2800lx，光照时间为15小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：在广西梧州市野外选取生长健壮、无明显病害的毛瑞香植株中上部、光照充足的带节茎段为外植体，采集后保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：将步骤(1)采集回实验室的外植体置于自来水下冲洗4小时，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒20秒钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.5％的次氯酸钠溶液中消毒18分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养60天即可诱导形成不定芽，诱导率达到90％。所述的诱导培养基为：B5培养基+1.5mg/L KT+0.5mg/L GA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+100mg/L PVP+10ml/L椰子汁,pH为5.9。
(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养50天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到4.6倍。所述的增殖培养基为：B5培养基+1.5mg/L ZT+0.2mg/L GA+10mg/L CH+25g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+50mg/L PVP+10ml/L椰子汁,pH为5.9。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养50天即能实现试管苗的生根，生根达到90％以上。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/L 6-BA+10mg/L CH+15g/L蔗糖+3g/L琼脂+10ml/L椰子汁,pH为5.8。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:2的腐殖土与河沙混合基质中栽培成苗即得毛瑞香种苗，移栽30天后成活率达90％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2500lx，光照时间为14小时/天。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：包括依次进行的如下步骤：获取毛瑞香的外植体、外植体诱导培养、增殖培养、生根培养和移栽；
所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：B5培养基、1.5～2.5mg/L KT、0.5～1.0mg/L GA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、100～500mg/L PVP、10～20ml/L椰子汁，pH为5.6～5.9。
2.根据权利要求1所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述的外植体诱导培养操作的方法为：将采集得到的作为外植体的毛瑞香消毒后剪切成2.0～2.5cm的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养50～60天即可诱导形成不定芽。
3.根据权利要求1所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：B5培养基、1.5～2mg/L ZT、0.2～0.4mg/L GA、10～20mg/LCH、25～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、50～100mg/L PVP、10～20ml/L椰子汁，pH为5.6～5.9。
4.根据权利要求3所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养得到的不定芽切成长1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养40～50天即可实现不定芽的增殖。
5.根据权利要求1所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：1/2MS培养基、0.5～1.0mg/L6-BA、10～20mg/L CH、15～25g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、10～20ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。
6.根据权利要求5所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述的生根培养操作的方法为：从增殖培养得到增殖后的不定芽的基部切取2.0～3.0cm不定芽并接种到生根培养基中培养40～50天即能实现试管苗的生根。
7.根据权利要求1所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述的移栽操作的具体方法为：将经生根培养操作得到的根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:2的腐殖土与河沙混合基质中栽培成苗即得毛瑞香种苗。
8.根据权利要求1-7任一所述的中药毛瑞香的组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养操作、生根培养操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为14～16小时/天。
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