CN104798498B - 一种杉木人工种子的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种杉木人工种子的制备方法，包括如下步骤：(1)以杉木组织培养中茎段增殖的芽作为繁殖体，增芽培养基为MS+IBA0.3+6‑BA0.4+VC0.2+糖30g+琼脂6.0g+Ac0.5g。(2)在种子包埋基质为CaCl₂1.5％+海藻酸钠1％+琼脂+络合时间5min，络合后用蒸馏水清洗，包埋基质中添加0.5％的琼脂，并将表面水吸干，密封放在4°冰箱中。本发明材料来源易获得，操作简便，与试管苗相比，体积小，运输及保存方便，成本低廉，为推广应用杉木人工种子提供了基础。

Description

一种杉木人工种子的制备方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种杉木人工种子的制备方法。

背景技术

杉木(Cunninghamia Lanceolata)为裸子植物，属杉科，杉木属，乔木，高达30米以上，胸径可达3米，是我国特有的速生商品材树种，生长快，木材纹理通直，结构均匀，不翘不裂。材质轻韧，强度适中。广泛用于建筑、家具、器具、造船等各方面。在杉木繁育方面，随着快繁技术的不断发展，不少学者开始关注杉木优良无性系的快繁技术，对不同杉木优良无性系的组织培养、诱导发芽、生根、移栽期及移栽后的培育管理等环节进行了对比试验，，如今基本解决了一般的繁殖技术问题，但组培苗的繁殖数量还不能满足生产的需求。

人工种子技术在快速繁殖优良品种、固定杂种优势、简化育种程序及与基因工程、脱病毒技术等其他生物技术相结合等方面具有广泛的应用前景。目前已进行人工种子试验的农作物有胡萝卜、苜蓿、芹菜、小麦、玉米、水稻、甘薯、柑桔、莴苣等，有的农作物人工种子的萌率和生根率可以达到80％以上。有关林木人工种子的研制的报道较少，柯善强等(1989)报道以试管短枝为材料制作直杆桉、桑树、杨树做为人工种子的探索，这些研究为新的林木繁育方法提供了一些技术参考。

一直以来人工种皮都是人工种子研究的主要热点之一。种皮成份组成、及保存技术是保证人种子萌发的重要因素。海藻酸钠、明胶、果胶酸钠、琼脂刺胶等可作为内种皮，其中海藻酸钠无毒害，具有生物活性，胶囊强度较好、成本较低，制作工艺简单，而被广泛采用，但它亦存在不少缺点，诸如保水性差、水溶性成份及助剂易渗漏、在空气中易失水干燥、干燥到一定程度后不能再吸水回胀而不利于人工种子贮藏和发芽、机械强度差以及胶球粘连等。另外，海藻酸钠包被的人工种子经低温储藏后，易在表面形成坚硬的外壳而妨碍了人工种子的萌发。如何更好的保存制作成的人工种子是一个重要问题。目前，液体石蜡作为经济、无毒稳定的液体物质，常被用来储藏细菌、真菌和植物愈伤组织，把人工种子放在液体石蜡中，保存时间可达6个月以上。但李修庆等(1990)发现胡萝卜人工种子在液体石蜡中短时间保存(1个月)能较正常的生长，但时间一长(79d)，人工种子苗的生长则明显变差；并发现液体石蜡对幼苗的呼吸和光合作用有一定的阻碍作用。

人工种子充分利用了快繁技术的优势，在农林业的良种快繁、栽培等方面具有很大的开发利用价值。目前将人工种子技术应用于杉木无性繁殖尚未见有报导。探索杉木人工种子的制备条件，可为开发新的杉木良种繁殖方式、育种途径及推广应用提供技术参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杉木人工种子的制作方法，探索杉木人工种子的制备条件，为开发新的杉木良种繁殖方式、育种途径及推广应用提供技术参考。

本发明的技术方案是：一种杉木人工种子的制备方法，采用杉木继代苗茎段杉木人工种子繁殖材料，包埋于以海藻酸钠为基本成份的基质中，具体操作步骤为：

(1)杉木外植体的灭菌处理：在连续三天晴天后采集杉木嫩枝，将枝条的叶子剪掉，剪成长3～5cm的短枝，浸泡在加有洗衣粉的清水中,用软毛刷轻轻刷洗后，转至烧杯内，盖上一层细纱网，用自来水充分冲洗3小时后，用于接种；

(2)繁殖材料的脱毒处理：取健壮的杉木短枝数段，于烧杯中用75％酒精冲洗枝条30秒，取出用无菌水洗3次，再用加入吐温的1‰的升汞冲洗6分钟，取出用无菌水冲洗5次，每瓶接种1～3个茎段，接种后盖好瓶盖，将已接入茎段的培养瓶，培养在25℃培养室中；

(3)杉木组培苗的继代培养：切取1～2cm的无菌苗，接种于继代培养基中，继代培养基为MS基本培养基中加入6－BA0.4mg/L,IBA0.3mg/L,Vc0.2mg/L,Ac0.5g,白糖40g,琼脂6.0g，继代苗培养50天；

(4)包埋成分的灭菌处理：海藻酸钠采用紫外灯照射20min消毒；CaCl₂溶液经过高压灭菌处理；

(5)人工种子胶囊成分的筛选：以不同配比和用量的凝胶剂海藻酸钠、MS培养基、激素、糖、防腐剂成分组成凝胶系统作为繁殖体包埋基质，以CaCl₂作络合剂，对包埋材料进行固化，形成种皮胶囊；

(6)人工种子制作过程：以步骤(5)得到的种皮胶囊为繁殖体包埋基质，将长0.5-1cm的幼芽繁殖材料侵入其中，10min后用吸管吸入繁殖体，并在一定高度下滴入络合剂CaCl₂溶液中，对包埋材料进行固化，待人工种子完全成形后取出，用蒸馏水冲洗3次,放置在无菌培养基上。

与现有技术相比，本发明的突出优点在于：

材料来源易获得，操作简便，与试管苗相比，体积小，运输及保存方便，成本低廉，有利于减少驯化移栽过程；与天然种子繁殖方式比，可以不受季节和种子大小年限制。

附图说明

图1为实施例1杉木人工种子胶囊的制作效果图。

图2为实施例2杉木人工种子基质加入琼脂后保水与定型效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

实施例1

本发明所述的杉木人工种子胶囊的制作方法，包括以下步骤：

(1)切取0.5-1cm的杉木组培继代苗茎段作为杉木人种子的繁殖材料。

(2)采用紫外灯照射20min消毒海藻酸钠基质成份，CaCl₂溶液经过高压灭菌处理。

(3)人工种子胶囊成分的筛选：以不同配比和用量的凝胶剂海藻酸钠、络合剂CaCl₂对包埋材料进行固化，形成种皮胶囊。

(4)人工种子制作过程：以海藻酸钠作为包埋基质，将0.5-1cm长的幼芽繁殖材料侵入其中，10min后用吸管吸入繁殖体，并在一定高度下滴入络合剂CaCl₂溶液中，对包埋材料进行固化，待人工种子完全成形后取出。

利用CaCl₂作为络合剂使海藻酸钠发生离子交换并形成海藻酸钙胶囊。繁殖体被悬浮于海藻酸钠水溶液中，滴入CaCl₂溶液中后发生离子交换，在表面结成硬壳，形成胶囊。形成胶囊的效果可以通过控制海藻酸钠的浓度和发生离子交换的时间来实现。

从表1看出，海藻酸钠浓度与氯化钙浓度低，络合时间短时，得出的人工种子胶囊基本不能成形，或者成形后质感较软，容易受外界压力而变形；当海藻酸钠浓度增大，氯化钙浓度增大或者络合时间变长，胶囊成形较好，质感软硬适中。8％海藻酸钠+10％CaCl₂+络合时间5min的效果比较好，络合时间快，成形好。杉木人工种子胶囊制作效果见图1所示。

表1海藻酸钠与CaCl₂的用量、络合时间比较

实施例2

本发明所述的杉木人工种子的保水和定型处理，包括以下步骤：

(1)切取0.5-1cm的杉木组培继代苗茎段作为杉木人种子的繁殖材料。

(2)向海藻酸钠基质成份中加入6％的琼脂，采用紫外灯照射20min消毒，CaCl₂溶液经过高压灭菌处理。

(3)采用正交设计方法，对氯化钙、海藻酸钠、是否加琼脂、络合时间进行组合试验，分析杉木人工种子的保水和定型效果。

(4)人工种子制作过程：以海藻酸钠作为包埋基质，将0.5-1cm长的幼芽繁殖材料侵入其中，10min后用吸管吸入繁殖体，并在一定高度下滴入络合剂CaCl₂溶液中，对包埋材料进行固化，待人工种子完全成形后取出。

在实施例1的试验过程中发现，在不加任何保水剂和定型剂的情况下，制作出的杉木人工种子很快因为失水褐化或变形，因此，本实施例中采用正交试验设计方法，在种子络合时加入有一定保水性和定型作用的琼脂，以期达到一定的保水、定型效果。通过定期观察与称量，6天后种子失水情况和外部特征表现如表2所示。1.5％CaCl₂+0.8％海藻酸钠+琼脂+15min络合时间得到的人工种子外部特征柔软，褐化较少，且失水率最低。杉木人工种子的保水及定型效果见图2所示。

表2加入琼脂后种子失水率及外部特征比较

Claims (1)

1.一种杉木人工种子的制备方法，其特征在于，采用杉木继代苗茎段杉木人工种子繁殖材料，包埋于以海藻酸钠为基本成份的基质中，具体操作步骤为：

(1)杉木外植体的灭菌处理：在连续三天晴天后采集杉木嫩枝，将枝条的叶子剪掉，剪成长3～5cm的短枝，浸泡在加有洗衣粉的清水中,用软毛刷轻轻刷洗后，转至烧杯内，盖上一层细纱网，用自来水充分冲洗3小时后，用于接种；

(2)繁殖材料的脱毒处理：取健壮的杉木短枝数段，于烧杯中用75％酒精冲洗枝条30秒，取出用无菌水洗3次，再用加入吐温的1‰的升汞冲洗6分钟，取出用无菌水冲洗5次，每瓶接种1～3个茎段，接种后盖好瓶盖，将已接入茎段的培养瓶，培养在25℃培养室中；

(3)杉木组培苗的继代培养：切取1～2cm的无菌苗，接种于继代培养基中，继代培养基为MS基本培养基中加入6－BA0.4mg/L,IBA0.3mg/L,Vc0.2mg/L,Ac0.5g,白糖40g,琼脂6.0g，继代苗培养50天；

(4)包埋成分的灭菌处理：海藻酸钠采用紫外灯照射20min消毒；CaCl₂溶液经过高压灭菌处理；

(5)人工种子胶囊成分的筛选：以不同配比和用量的凝胶剂海藻酸钠、MS培养基、激素、糖、防腐剂成分组成凝胶系统作为繁殖体包埋基质，以CaCl₂作络合剂，对包埋材料进行固化，形成种皮胶囊；具体为：1.5％CaCl₂+0.8％海藻酸钠+琼脂+15min络合时间，

(6)人工种子制作过程：以步骤(5)得到的种皮胶囊为繁殖体包埋基质，将长0.5-1cm的幼芽繁殖材料侵入其中，10min后用吸管吸入繁殖体，并在一定高度下滴入络合剂CaCl₂溶液中，对包埋材料进行固化，待人工种子完全成形后取出，用蒸馏水冲洗3次,放置在无菌培养基上。