CN103959958B

CN103959958B - 一种扁穗牛鞭草人工种子的制作方法

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Publication number: CN103959958B
Application number: CN201410216045.2A
Authority: CN
Inventors: 杨春华; 刘刚; 陈菲; 李达旭; 陈灵鸷; 刘琳; 张建; 孙飞达
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: CN103959958A

Abstract

本发明公开了一种能够提高人工种子发芽率的扁穗牛鞭草人工种子制作方法。该制作方法采用扁穗牛鞭草的茎节进行制作，首先将其清洗干净后并进行消毒处理，然后制备半凝胶状态的人工胚乳，将穗牛鞭草茎节放入人工胚乳中，然后采用滴管吸取人工胚乳和茎节的混合物，每次吸取一个茎节，然后将吸取的混合物滴入CaCl₂溶液中进行离子交换处理，经过一定时间后，茎节的表面结成硬壳形成胶囊，将其取出后采用无菌去离子水冲洗干净即可得到扁穗牛鞭草的人工种子，采用上述方法制得的扁穗牛鞭草人工种子发芽率较高，繁殖速度快、成活率较高，而且制作材料易于获得，整个制作过程简单、受季节影响小、成本低廉。适合在植物人工种子生产技术领域推广运用。

Description

一种扁穗牛鞭草人工种子的制作方法

技术领域

本发明属于植物人工种子生产技术领域，具体涉及一种扁穗牛鞭草人工种子的制作方法。

背景技术

种子是所有种子植物所特有的有性繁殖器官。种子的结构一般是由胚、胚乳和种皮3部分组成。从来源上讲，自然界中正常的植物种子分为2类：一类是植物经过受精作用后由胚珠发育形成；另一类是植物不经过受精作用由不定胚直接发育形成。然而，随着生产发展和人们生活水平的提高，只靠年生产量有限的种子或无性繁殖器官进行生产繁殖已不能满足需求。因此，寻找一种可周年进行生产繁殖的替代方法势在必行，于是随着植物组织细胞培养的发展，人工种子应运而生。

人工种子是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织(芽、愈伤组织、胚状体等)包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的，在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。人工种子本质上属于无性繁殖，与天然种子相比，具有以下优点：(1)可对一些自然条件下不结实或种子很昂贵的植物进行繁殖；(2)可人为控制作物生长发育和抗性；(3)固定杂种优势；(4)可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。

扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa(Linn.f.)R.Br)是禾本科牛鞭草属多年生草本植物，茎细软，饲草品质好，牲畜喜食，既可放牧利用，也可晒制干草。此外，牛鞭草根系发达，草丛厚密，覆盖面大，也是良好的水土保持植物。扁穗牛鞭草的种植既可以满足生态环境建设的需要，更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。扁穗牛鞭草具有许多优良的生物学特性，包括：适应性广、抗逆性强、青绿利用期长、生命力强，繁殖快，耐粗放管理，种植一次可利用多年。

然而，扁穗牛鞭草虽然花期很长，小花也多，但花粉活力低，自然结实率非常低，即使偶有结实，发芽率也几乎为零，有性繁殖选育新品种难度非常大。因此，建立扁穗牛鞭草再生体系及人工种子，成为扁穗牛鞭草优异性状保存与扩繁、新品种选育、优质种苗规模化生产的重要繁殖手段之一。迄今为止，关于扁穗牛鞭草无性繁殖技术的报道较少，大都是采用通用的无性繁殖的方法进行繁殖，其制作的扁穗牛鞭草人工种子发芽率较低，不能满足生态环境建设的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高人工种子发芽率的扁穗牛鞭草人工种子制作方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，包括以下步骤：

A、采集扁穗牛鞭草的茎节，清洗干净后并进行消毒处理；

B、制备半凝胶状态的人工胚乳；

C、将经过消毒处理的扁穗牛鞭草茎节放入人工胚乳中，然后采用滴管吸取人工胚乳和茎节的混合物，每次吸取一个茎节，然后将吸取的混合物滴入CaCl₂溶液中进行离子交换处理，经过一定时间后，茎节的表面结成硬壳形成胶囊，将其取出后采用无菌去离子水冲洗干净即可得到扁穗牛鞭草的人工种子；

D、将步骤C得到人工种子放入密封的容器内贮藏一段时间。

进一步的是，在步骤A中，对清洗干净的扁穗牛鞭草茎节进行消毒处理的方式如下所述：首先，将清洗干净的扁穗牛鞭草茎节放入超净工作台，紫外线消毒25min后，用75％酒精表面消毒30s，接着用浓度为0.1％的HgCl₂溶液杀菌8min，所述HgCl₂溶液中添加有吐温，最后用无菌水漂洗4～5次并用无菌滤纸吸去茎节表面的水分。

进一步的是，在步骤B中，所述半凝胶状态的人工胚乳由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基溶液，所述溶质包括海藻酸钠和活性炭，所述半凝胶状态的人工胚乳中海藻酸钠的质量体积比为2～4％，所述活性炭的质量体积比为0.5％。

进一步的是，所述MS培养基溶液包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇，各组分的含量如下所述：KNO₃为1900mg/L，NH₄NO₃为1650mg/L，MgSO4·7H₂O为370mg/L，KH₂PO₄为170mg/L，CaCl₂·2H₂O为440mg/L，MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L，H₃BO₃为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO₄·2H₂O为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L，Na₂-EDTA为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。

进一步的是，所述海藻酸钠的质量体积比为3％。

进一步的是，所述溶质还包括激素NAA、激素GA₃和细胞分裂素6-BA，所述半凝胶状态的人工胚乳中激素NAA的含量为0～0.3mg/L，激素GA₃的含量为0～0.1mg/L，细胞分裂素6-BA的含量为0～3mg/L。

进一步的是，所述半凝胶状态的人工胚乳中激素NAA的含量为0.2mg/L，激素GA₃的含量为0.1mg/L，细胞分裂素6-BA的含量为1mg/L。

进一步的是，所述溶质还包括多菌灵和青霉素，所述半凝胶状态的人工胚乳中多菌灵的质量体积比为0.2％，所述青霉素的含量为0.02mg/L。

进一步的是，在步骤C中，所使用的CaCl₂溶液的浓度为2％，进行离子交换处理的时间为20min。

进一步的是，在步骤D中，所述人工种子贮藏在4℃的环境中，贮藏时间为30d～60d。

本发明的有益效果在于：本发明所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法采用扁穗牛鞭草的茎节进行制作，首先将其清洗干净后并进行消毒处理，然后制备半凝胶状态的人工胚乳，将经过消毒处理的穗牛鞭草茎节放入人工胚乳中，然后采用滴管吸取人工胚乳和茎节的混合物，每次吸取一个茎节，然后将吸取的混合物滴入CaCl₂溶液中进行离子交换处理，经过一定时间后，茎节的表面结成硬壳形成胶囊，将其取出后采用无菌去离子水冲洗干净即可得到扁穗牛鞭草的人工种子，采用上述方法制得的扁穗牛鞭草人工种子发芽率较高，繁殖速度快、成活率较高，而且制作材料易于获得，整个制作过程简单、受季节影响小、成本低廉。

具体实施方式

本发明所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，具体包括以下步骤：

A、采集扁穗牛鞭草的茎节，清洗干净后并进行消毒处理；

B、制备半凝胶状态的人工胚乳；

C、将经过消毒处理的扁穗牛鞭草茎节放入人工胚乳中，并且使穗牛鞭草茎节均匀的悬浮在人工胚乳中，然后采用滴管吸取人工胚乳和茎节的混合物，每次吸取一个茎节，然后将吸取的混合物滴入CaCl₂溶液中进行离子交换处理，经过一定时间后，茎节的表面结成硬壳形成胶囊，将其取出后采用无菌去离子水冲洗干净即可得到扁穗牛鞭草的人工种子；

D、将步骤C得到人工种子放入密封的容器内贮藏一段时间。

采用上述方法制得的扁穗牛鞭草人工种子发芽率较高，繁殖速度快、成活率较高，而且制作材料易于获得，整个制作过程简单、受季节影响小、成本低廉。

在上述扁穗牛鞭草人工种子的制作方法过程中，在步骤A中，对于清洗干净的扁穗牛鞭草茎节的消毒处理可以采用现有的各种消毒方法，为了保证消毒效果，同时不会对扁穗牛鞭草茎节造成损伤，采用如下所述的优选方式进行消毒：首先，将清洗干净的扁穗牛鞭草茎节放入超净工作台，紫外线消毒25min后，用75％酒精表面消毒30s，接着用浓度为0.1％的HgCl₂溶液杀菌8min，所述HgCl₂溶液中添加有吐温，最后用无菌水漂洗4～5次并用无菌滤纸吸去茎节表面的水分。

在步骤B中，所述半凝胶状态的人工胚乳由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基溶液，所述溶质包括海藻酸钠和活性炭，所述半凝胶状态的人工胚乳中海藻酸钠的质量体积比为2～4％，所述活性炭的质量体积比为0.5％。

所述MS培养基溶液可以现有的各种配方，为了使制成的扁穗牛鞭草人工种子更容易萌发，所述MS培养基溶液包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇，各组分的含量如下所述：KNO₃为1900mg/L，NH₄NO₃为1650mg/L，MgSO4·7H₂O为370mg/L，KH₂PO₄为170mg/L，CaCl₂·2H₂O为440mg/L，MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L，H₃BO₃为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO₄·2H₂O为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L，Na₂-EDTA为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。这种配方是专门针对扁穗牛鞭草配置的，更加适宜扁穗牛鞭草人工种子的萌发。

实施例一：

该实施例中，所述半凝胶状态的人工胚乳的溶剂为MS培养基溶液，所述活性炭的质量体积比为0.5％，海藻酸钠的质量体积比为2％、3％、4％，采用完全随机试验设计，共3个处理，每个处理组制作20粒人工种子，将每个处理组制作好的20个人工种子放置在铺有湿滤纸的培养皿中，置于能人工控制温度光强等环境条件的的光照培养室中培养，光照强度为2000lx，12h/d，温度25℃，自播种之日起15d后统计人工种子特征和萌发率，如表1所示：

表1

注：萌发率的统计方式：将人工种子置于铺有湿滤纸的培养皿中培养15d以后统计，萌发标准以幼芽突破人工种皮5mm为准。

实验结果由表1可见，低浓度的海藻酸钠制成的人工种子出现包被不完整，较软，易粘连的现象，培养后营养物质极易泄漏；高浓度的海藻酸钠制作的人工种子则颗粒不均匀，边缘不整齐，硬度大，微黄无弹性；而3％的海藻酸钠制成的人工种子颗粒均匀，呈球形，软硬适中，透明有弹性，培养后营养物质也不易泄漏，因此，所述半凝胶状态的人工胚乳中海藻酸钠的质量体积比优选为3％。由表1可得出，由MS培养基、0.5％活性炭和3％海藻酸钠制成的半凝胶状态的人工胚乳制得的人工种子，种子萌发率为56.67％，种子发芽率较高。

为了进一步提高人工种子的萌发率，所述半凝胶状态的人工胚乳的溶质还包括激素NAA、激素GA₃和细胞分裂素6-BA，所述半凝胶状态的人工胚乳中激素NAA的含量为0～0.3mg/L，激素GA₃的含量为0～0.1mg/L，细胞分裂素6-BA的含量为0～3mg/L。所述6-BA是6-苄基氨基嘌呤的简称，可以促进细胞分裂；所述NAA是萘乙酸的简称，可以促进生根；所述GA₃是赤霉素的简称，可以促进促发芽、生长。

实施例二：

该实施例中，所述半凝胶状态的人工胚乳的溶剂为MS培养基溶液，所述活性炭的质量体积比为0.5％，海藻酸钠的质量体积比为3％，NAA的含量为0、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L，激素GA₃的含量为0、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L，细胞分裂素6-BA的含量为0、1mg/L、2mg/L、3mg/L，采用完全随机试验设计，共16个处理，每个处理组制作20粒人工种子，将每个处理组制作好的20个人工种子放置在铺有湿滤纸的培养皿中，置于能人工控制温度光强等环境条件的的光照培养室中培养，光照强度为2000lx，12h/d，温度25℃，自播种之日起15d后统计人工种子特征和萌发率，如表2所示：

表2

实验结果由表2可知，低浓度内的6-BA与GA₃对人工种子萌发均有促进作用，而高浓度NAA则会抑制人工种子的萌发。因此低浓度NAA与6-BA和GA₃配合使用对扁穗牛鞭草人工种子萌发有显著作用，由表2可知，由MS培养基、0.5％活性炭、3％海藻酸钠、0.2mg/LNAA、0.1mg/L激素GA₃、1mg/L细胞分裂素6-BA制成的半凝胶状态的人工胚乳制得的人工种子，种子萌发率可达91.67％，种子发芽率进一步提高。

为了进一步提高人工种子的萌发率，所述溶质还包括作为防腐剂、固化剂的多菌灵和青霉素，所述半凝胶状态的人工胚乳中多菌灵的质量体积比为0.2％，所述青霉素的含量为0.02mg/L，经试验研究发现，由MS培养基、0.5％活性炭、3％海藻酸钠、0.2mg/LNAA、0.1mg/L激素GA₃、1mg/L细胞分裂素6-BA、0.2％多菌灵、0.02mg/L青霉素制成的半凝胶状态的人工胚乳制得的人工种子，种子萌发率可达96.67％，种子发芽率进一步提高，而且种子的同步效果较好，不易污染。

另外，在步骤C中，为了使离子交换的效果达到最好，所使用的CaCl₂溶液的浓度优选为2％，进行离子交换处理的时间为20min。

再者，为了使制得的扁穗牛鞭草人工种子能够长时间的保存，同时不会对种子的萌发率造成影响，在步骤D中，所述人工种子贮藏在4℃的环境中，贮藏时间为30d～60d。

Claims

1.一种扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，其特征在于包括以下步骤：

A、采集扁穗牛鞭草的茎节，清洗干净后并进行消毒处理；

B、制备半凝胶状态的人工胚乳，所述半凝胶状态的人工胚乳由溶剂和溶质组成，所述溶剂为MS培养基溶液，所述溶质包括海藻酸钠、活性炭、激素NAA、激素GA₃和细胞分裂素6-BA，所述半凝胶状态的人工胚乳中海藻酸钠的质量体积比为3％，所述活性炭的质量体积比为0.5％，所述半凝胶状态的人工胚乳中激素NAA的含量为0.2mg/L，激素GA₃的含量为0.1mg/L，细胞分裂素6-BA的含量为1mg/L；

D、将步骤C得到人工种子放入密封的容器内贮藏30d～60d。

2.如权利要求1所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，其特征在于：在步骤A中，对清洗干净的扁穗牛鞭草茎节进行消毒处理的方式如下所述：首先，将清洗干净的扁穗牛鞭草茎节放入超净工作台，紫外线消毒25min后，用75％酒精表面消毒30s，接着用浓度为0.1％的HgCl₂溶液杀菌8min，所述HgCl₂溶液中添加有吐温，最后用无菌水漂洗4～5次并用无菌滤纸吸去茎节表面的水分。

3.如权利要求2所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，其特征在于：所述MS培养基溶液包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇，各组分的含量如下所述：KNO₃为1900mg/L，NH₄NO₃为1650mg/L，MgSO4·7H₂O为370mg/L，KH₂PO₄为170mg/L，CaCl_2·2H₂O为440mg/L，MnSO₄·4H₂O为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O为8.6mg/L，H₃BO₃为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO₄·2H₂O为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.025mg/L，Na₂-EDTA为37.3mg/L，FeSO₄·4H₂O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。

4.如权利要求3所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，其特征在于：所述溶质还包括多菌灵和青霉素，所述半凝胶状态的人工胚乳中多菌灵的质量体积比为0.2％，所述青霉素的含量为0.02mg/L。

5.如权利要求1所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，其特征在于：在步骤C中，所使用的CaCl₂溶液的浓度为2％，进行离子交换处理的时间为20min。

6.如权利要求1所述的扁穗牛鞭草人工种子的制作方法，其特征在于：在步骤D中，所述人工种子贮藏在4℃的环境中，贮藏时间为30d～60d。