CN109122313A - 一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基及方法 - Google Patents

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CN109122313A CN201810871940.6A CN201810871940A CN109122313A CN 109122313 A CN109122313 A CN 109122313A CN 201810871940 A CN201810871940 A CN 201810871940A CN 109122313 A CN109122313 A CN 109122313A
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Abstract

本发明公开了一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基及方法，属于植物生物技术领域。所述使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成。本发明还公开了一种利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，包括如下步骤：步骤1：无菌播种及原球茎诱导培养；步骤2：原球茎增殖和丛生芽诱导培养；步骤3：丛生芽生根壮苗培养；步骤4：移栽驯化。本发明提高了移栽成活率，快速获得大量翅萼石斛的种苗，克服了常规分株繁殖慢以及自然繁殖难等问题。

Description

一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基及方法
技术领域
本发明涉及一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基及方法，属于植物生物技术领域。
背景技术
翅萼石斛(Dendrobium cariniferum)是一种喜阴凉的多年生兰科石斛(Dendrobium)草本植物，产自云南南部至西南部，生于海拔1100-1700米的山地林中树干上。翅萼石斛具有较高的观赏价值，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，具有橘子香气味，也是杂交育种的重要亲本之一。此外，翅萼石斛还具有较高的经济价值，其含有34种化合物，为烷烃类和脂类。
然而，翅萼石斛并没有被中国药典收载，但民间常作为石斛药用品种广泛使用，特别是云南等西南地区，常用作药用石斛利用，致使目前野生资源数量剧减。众所周知，石斛类兰花传统分株繁殖种苗速度很慢，不能满足市场需求，近年来，研究人员开展了石斛属多个种的组培快繁种苗的技术，可以利用茎尖或茎段为外植体研究了组培快繁技术，也有研究无菌播种快繁种苗的技术。但是，石斛属是兰科第二大属，有1500多个野生种，而翅萼石斛(Dendrobium formosum)等黑毛组植物，因叶片和叶鞘被黑色毛而难彻底消毒，目前没有利用茎尖或茎段进行成功诱导不定芽的报道，也未见无菌播种快繁研究的报道。
鉴于此，有必要提供一种新的翅萼石斛种苗的繁殖方法，以解决现有技术的弊端。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基。本发明的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，种子萌发和原球茎诱导培养基可以极大促进种子萌发和原球茎生长，原球茎增殖和丛生芽诱导培养基可以极大促进原球茎增殖和丛生芽生长，生根壮苗培养基可以极大促进生根壮苗。三种培养基相互作用，极大地提高了原球茎增殖倍数及诱导丛生芽产生，非常适合由翅萼石斛种子繁殖成苗。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，
所述种子萌发和原球茎诱导培养基由MS基本培养基、0.5-2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成；
所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基由MS基本培养基、1.0-4.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和100g/L的马铃薯泥组成；
所述生根壮苗培养基由MS基本培养基、1.0-4.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、100g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成。
本发明的原理说明：
MS，即MS培养基，是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。
MS主要包含以下成分：(1)NH4NO31650mg/L、(2)KNO31900mg/L、(3)CaCl2·2H2O440mg/L、(4)MgSO4·7H2O 370mg/L、(5)KH2PO4170mg/L、(6)Na2-EDTA 37.3mg/L、(7)FeSO4·7H2O 27.8mg/L、(8)MnSO4·4H2O 22.3mg/L、(9)ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、(10)H3BO36.2mg/L、(11)KI 0.83mg/L、(12)Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、(13)CuSO4·5H2O 0.025mg/L、(14)CoCl2·6H2O 0.025mg/L、(15)盐酸硫胺素VB10.1mg/L、(16)烟酸0.5mg/L、(17)肌醇100mg/L、(18)甘氨酸2mg/L、(19)盐酸吡哆醇VB60.5mg/L。
6-BA，即6-(N-苄基)氨基嘌呤，又称为6-苄基氨基嘌呤。是第一个人工合成的细胞分裂素。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。
NAA，即1-萘乙酸。易溶于有机溶剂，是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用语生产商用促根粉或促根剂，被广泛应用于植物插扦繁殖中。
KT，即6-糠氨基嘌呤、激动素，是一种嘌呤类的天然植物内源激素，也是人类发现的第一个细胞分裂素。主要促进细胞分裂，提高产量，促进卵髓细胞和植物细胞的分裂。它不仅为幼胚的生长和发育不可缺少，而且对某些植物的单性生殖、刺激果实与谷粒的长大、防止衰老等都有明显效果。
本发明的种子萌发和原球茎诱导培养基中，MS为基础培养基，6-BA和NAA促进种子的萌发的植物激素。本发明的种子萌发和原球茎诱导培养基可以极大促进种子萌发和原球茎生长。
本发明的原球茎增殖和丛生芽诱导培养基中，MS为基础培养基，6-BA和NAA促进原球茎增殖和丛生芽的生长，香蕉泥促进壮苗生根。本发明的原球茎增殖和丛生芽诱导培养基可以极大促进原球茎增殖和丛生芽生长。
本发明的生根壮苗培养基中，MS为基础培养基，6-BA和KT促进丛生芽的生长，NAA促进丛生芽的生根，香蕉泥促进壮苗生根，活性炭吸附生长中产生的有害物质以及壮苗生根。本发明的生根壮苗培养基可以极大促进生根壮苗。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述种子萌发和原球茎诱导培养基、所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及所述生根壮苗培养基的pH值均为5.8。
采用上述进一步的有益效果是：上述培养基的pH值适合种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基和生根壮苗培养基。
上述三种培养基的pH值的调节，采用上海三爱思pH精密试纸检测酸碱度，用盐酸或者氢氧化钠调节pH。pH值超过5.8用盐酸调节，pH低于5.8用氢氧化钠调节。
本发明的目的之二，是提供一种利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法。本发明以翅萼石斛经无菌播种获得的原球茎为材料，包括种子播前处理、种子萌发和原球茎诱导培养、原球茎增殖和丛生芽诱导培养、丛生芽生根壮苗培养以及移栽驯化步骤。采用本发明方法繁殖翅萼石斛种苗，可在短期内获得大量优良种苗，增殖系数高达6.4倍，克服了以茎段为外植体浪费材料及增殖系数较低的弊端；移栽成活率高达76.7％，具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，包括如下步骤：
步骤1：无菌播种及原球茎诱导培养
将成熟未开裂的翅萼石斛蒴果消毒后，取出种子，均匀播种于种子萌发和原球茎诱导培养基中，先进行暗培养，待种子转绿后再进行光培养，待种子萌发后，得到原球茎；
步骤2：原球茎增殖和丛生芽诱导培养
将步骤1得到的原球茎，均匀转接到原球茎增殖和丛生芽诱导培养基中，进行光培养，待原球茎增殖后，诱导得到丛生芽；
步骤3：丛生芽生根壮苗培养
当步骤2得到的丛生芽长出2-3片叶子、高2-3cm时，均匀转接到生根壮苗培养基中，进行光培养，得到生根试管苗；
步骤4：移栽驯化
于春季3-4月，将步骤3得到的生根试管苗，炼苗15-30d天后，洗净根部，移栽到移栽基质中，再置于塑料大棚中，浇水、保湿至成苗、出圃，即得到翅萼石斛种苗。
本发明的繁殖方法简单，操作容易，能在较短时间内获得大量翅萼石斛种苗，对翅萼石斛种质资源保护和可持续利用具有重要意义，应用前景非常广阔，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述翅萼石斛蒴果采自广西植物研究所兰花种质圃，为当年人工自交授粉结实的成熟未开裂蒴果。
进一步，步骤1中，所述消毒的具体步骤为：先用洗洁精清洗翅萼石斛蒴果的表面，再用自来水冲洗至少30min，然后用75％(v/v)酒精浸泡1min，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1％的升汞浸泡15-30min，然后用无菌水冲洗至少5次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述消毒方法，消毒灭菌的效果好。
进一步，步骤1中，所述暗培养的温度为25±2℃，时间为20-30d。
进一步，步骤2中，所述原球茎的接种量为每个培养瓶接种150-200个原球茎，所述培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL原球茎增殖和丛生芽诱导培养基。
进一步，步骤3中，所述丛生芽的接种量为每个培养瓶接种15-20个丛生芽，所述培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL生根壮苗培养基。
进一步，步骤1、步骤2和步骤3中，所述光培养的温度均为25±2℃，光照强度均为1500-2000lux，光周期均为12h/d，光照时间分别为30-50d、45-60d和80-120d。
进一步，步骤4中，所述炼苗的条件为：以散光为主，光照强度为3000-4000lux,温度为15-25℃，湿度为70-80％。
进一步，步骤4中，所述移栽基质经甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒处理，所述移栽基质为水苔。
采用上述进一步的有益效果是：移栽基质经消毒处理后，不含有毒、有害物质。此外，上述栽培基质的移栽成活率均超过76.7％，且长势很好。
进一步，步骤4中，所述塑料大棚在夏季用70％遮阳网进行遮阴。
本发明的有益效果：
(1)本发明的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，种子萌发和原球茎诱导培养基可以极大促进种子萌发和原球茎生长，原球茎增殖和丛生芽诱导培养基可以极大促进原球茎增殖和丛生芽生长，生根壮苗培养基可以极大促进生根壮苗。本发明的三种培养基相互作用，极大地提高了原球茎增殖倍数及诱导丛生芽产生，非常适合由翅萼石斛种子繁殖成苗。
(2)本发明建立了一种利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，以翅萼石斛经无菌播种获得的原球茎为材料，包括种子播前处理、种子萌发和原球茎诱导培养、原球茎增殖和丛生芽诱导培养、丛生芽生根壮苗培养以及移栽驯化步骤。采用本发明方法繁殖翅萼石斛种苗，可在短期内获得大量优良种苗，增殖系数高达6.4个，克服了以茎段为外植体浪费材料及增殖系数较低的弊端；移栽成活率高达76.7％，具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点。
(3)本发明的繁殖方法简单，操作容易，能在较短时间内获得大量翅萼石斛种苗，对翅萼石斛种质资源保护和可持续利用具有重要意义，应用前景非常广阔，适合规模化推广应用。
附图说明
图1为本发明的实施例2原球茎接种到原球茎增殖和丛生芽诱导培养基60d后的原球茎增殖情况。
图2为本发明的实施例2丛生芽接种到生根壮苗培养基90d后的原球茎增殖情况。
图3为本发明的实施例2生根苗移栽60d后的生长情况。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，
所述种子萌发和原球茎诱导培养基由MS基本培养基、1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成；
所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基由MS基本培养基、1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和100g/L的马铃薯泥组成；
所述生根壮苗培养基由MS基本培养基、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、100g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成。
本实施例的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，包括如下步骤：
步骤1：无菌播种及原球茎诱导培养
在广西植物研究所兰花种质圃，采摘当年人工自交授粉结实的成熟未开裂的翅萼石斛蒴果，采用如下方法进行消毒：先用洗洁精清洗翅萼石斛蒴果的表面，再用自来水冲洗30min，然后用75％(v/v)酒精浸泡1min，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1％的升汞浸泡15min，然后用无菌水冲洗至少5次。
取出种子，均匀播种于种子萌发和原球茎诱导培养基中，先于温度为25±2℃，进行暗培养20d，待种子转绿后，再于温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光周期为12h/d，进行光培养50d，种子萌发后，进而得到原球茎。
步骤2：原球茎增殖和丛生芽诱导培养
将步骤1得到的诱导的原球茎，均匀转接到原球茎增殖和丛生芽诱导培养基中，每个培养瓶接种150个原球茎，培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL原球茎增殖和丛生芽诱导培养基。于温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光周期为12h/d，进行光培养60d，原球茎增殖后，诱导得到丛生芽。
步骤3：丛生芽生根壮苗培养
当步骤2得到的丛生芽长出2-3片叶子、高2-3cm时，均匀转接到生根壮苗培养基中，每个培养瓶接种15个丛生芽，培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL生根壮苗培养基。于温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光周期为12h/d，进行光培养120d，得到生根试管苗。
步骤4：移栽驯化
于春季3-4月，将步骤3得到的生根试管苗置于炼苗室，炼苗室以散光为主，光照强度为3000lux,温度为15℃，湿度为70％，带瓶炼苗15d天后，洗净根部，移栽到经甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒处理的移栽基质中，移栽基质为水苔，再置于塑料大棚中，塑料大棚在夏季用70％遮阳网进行遮阴，浇水、保湿至成苗、出圃，即得到翅萼石斛种苗。
实施例2
本实施例的使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，
所述种子萌发和原球茎诱导培养基由MS基本培养基、0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成，pH值为5.8；
所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基由MS基本培养基、2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和100g/L的香蕉泥组成，pH值为5.8；
所述生根壮苗培养基由MS基本培养基、2.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、100g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成，pH值为5.8。
本实施例的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，包括如下步骤：
步骤1：无菌播种及原球茎诱导培养
在广西植物研究所兰花种质圃，采摘当年人工自交授粉结实的成熟未开裂的翅萼石斛蒴果，采用如下方法进行消毒：先用洗洁精清洗翅萼石斛蒴果的表面，再用自来水冲洗40min，然后用75％(v/v)酒精浸泡1min，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1％的升汞浸泡20min，然后用无菌水冲洗至少5次。
取出种子，均匀播种于种子萌发和原球茎诱导培养基中，先于温度为25±2℃，进行暗培养25d，待种子转绿后，再于温度为25±2℃，光照强度为1800lux，光周期为12h/d，进行光培养40d，待种子萌发后，进而得到原球茎。
步骤2：原球茎增殖和丛生芽诱导培养
将步骤1得到的诱导的原球茎，均匀转接到原球茎增殖和丛生芽诱导培养基中，每个培养瓶接种150个原球茎，培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL原球茎增殖和丛生芽诱导培养基。于温度为25±2℃，光照强度为1800lux，光周期为12h/d，进行光培养45d，待原球茎增殖后，诱导得到丛生芽。原球茎增殖系数达到6.4个，丛生芽表现好，颜色深绿，苗壮(如图1所示)。
步骤3：丛生芽生根壮苗培养
当步骤2得到的丛生芽长出2-3片叶子、高2-3cm时，均匀转接到生根壮苗培养基中，每个培养瓶接种15个丛生芽，培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL生根壮苗培养基。于温度为25±2℃，光照强度为1800lux，光周期为12h/d，进行光培养90d，得到生根试管苗。生根试管苗生长表现越来越好，叶片呈深绿色，100％生根，根系9.5cm，株高平均8.7cm(如图2所示)。
步骤4：移栽驯化
于春季3-4月，将步骤3得到的生根试管苗置于炼苗室，炼苗室以散光为主，光照强度为3500lux,温度为20℃，湿度为75％，带瓶炼苗25d天后，洗净根部，移栽到经甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒处理的移栽基质中，移栽基质为水苔，再置于塑料大棚中，塑料大棚在夏季用70％遮阳网进行遮阴，浇水、保湿至成苗、出圃，即得到翅萼石斛种苗。成活率达到76.7％，且长势很好(如图3所示)。
实施例3
本实施例的使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，
所述种子萌发和原球茎诱导培养基由MS基本培养基、2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成；
所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基由MS基本培养基、4.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和100g/L的马铃薯泥组成；
所述生根壮苗培养基由MS基本培养基、4.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、100g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成。
本实施例的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，包括如下步骤：
步骤1：无菌播种及原球茎诱导培养
在广西植物研究所兰花种质圃，采摘当年人工自交授粉结实的成熟未开裂的翅萼石斛蒴果，采用如下方法进行消毒：先用洗洁精清洗翅萼石斛蒴果的表面，再用自来水冲洗50min，然后用75％(v/v)酒精浸泡1min，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1％的升汞浸泡30min，然后用无菌水冲洗至少5次。
取出种子，均匀播种于种子萌发和原球茎诱导培养基中，先于温度为25±2℃，进行暗培养30d，待种子转绿后，再于温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光周期为12h/d，进行光培养30d，待种子萌发后，进而得到原球茎。
步骤2：原球茎增殖和丛生芽诱导培养
将步骤1得到的诱导的原球茎，均匀转接到原球茎增殖和丛生芽诱导培养基中，每个培养瓶接种200个原球茎，培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL原球茎增殖和丛生芽诱导培养基。于温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光周期为12h/d，进行光培养45d，待原球茎增殖后，诱导得到丛生芽。原球茎增殖系数达到8.2个，丛生芽表现好，颜色深绿，苗壮。
步骤3：丛生芽生根壮苗培养
当步骤2得到的丛生芽长出2-3片叶子、高2-3cm时，均匀转接到生根壮苗培养基中，每个培养瓶接种20个丛生芽，培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL生根壮苗培养基。于温度为25±2℃，光照强度为2000lux，光周期为12h/d，进行光培养80d，得到生根试管苗。
步骤4：移栽驯化
于春季3-4月，将步骤3得到的生根试管苗置于炼苗室，炼苗室以散光为主，光照强度为3500lux,温度为20℃，湿度为75％，带瓶炼苗25d天后，洗净根部，移栽到经甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒处理的移栽基质中，移栽基质为水苔，再置于塑料大棚中，塑料大棚在夏季用70％遮阳网进行遮阴，浇水、保湿至成苗、出圃，即得到翅萼石斛种苗。
对比试验1
本对比试验1跟实施例2不同的是，种子萌发和原球茎诱导培养基由MS基本培养基、4.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成，pH值为5.8。其余都相同。
本对比试验1的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，同实施例2。本对比试验1的步骤1中，得到的原球茎超过50％死亡。
由此可见，本发明的种子萌发和原球茎诱导培养基可以极大促进种子萌发和原球茎生长。
对比试验2
本对比试验2跟实施例2不同的是，原球茎增殖和丛生芽诱导培养基由MS基本培养基、1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和100g/L的马铃薯汁组成，pH值为5.8。其余都相同。
本对比试验2的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，同实施例2。本对比试验2的步骤2中，原球茎增殖系数为5.8，但丛生芽生长慢。
由此可见，本发明的原球茎增殖和丛生芽诱导培养基可以极大促进原球茎增殖和丛生芽生长。
对比试验3
本对比试验3跟实施例2不同的是，原球茎增殖和丛生芽诱导由MS基本培养基、3.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成，pH值为5.8。其余都相同。
本对比试验3的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，同实施例2。本对比试验3的步骤2中，原球茎增殖系数虽高达7.6，但是丛生芽诱导情况较差，生长相对较慢，表现一般，颜色淡黄，苗弱，有黄化现象。
由此可见，本发明的种子萌发和原球茎诱导培养基可以极大促进种子萌发和原球茎生长。
对比试验4
本对比试验4跟实施例2不同的是，生根壮苗培养基由1/2MS基本培养基、0.8mg/L的NAA、200g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成，pH为5.8。其余都相同。
本对比试验4的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，同实施例2。本对比试验4的步骤3中，得到生根试管苗。生根试管苗生长较差，矮小，虽然100％生根，但根系相对较短，平均只有6.8cm，株高只有5.7cm。
对比试验5
本对比试验5跟实施例2不同的是，生根壮苗培养基由MS基本培养基、2.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.2mg/L的NAA、100g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成，pH为5.8。其余都相同。
本对比试验5的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，同实施例2。本对比试验5的步骤3中，得到生根试管苗。生根试管苗丛生芽较多，生根率75.0％，且根系少。
由此可见，本发明的生根壮苗培养基可以极大促进生根壮苗。
由对比试验1-对比试验5可知，本发明的种子萌发和原球茎诱导培养基可以极大促进种子萌发和原球茎生长，原球茎增殖和丛生芽诱导培养基可以极大促进原球茎增殖和丛生芽生长，生根壮苗培养基可以极大促进生根壮苗。三种培养基相互作用，极大地提高了原球茎增殖倍数及诱导丛生芽产生，非常适合由翅萼石斛种子繁殖成苗。
对比试验6
本对比试验5跟实施例2不同的是，移栽驯化时间为6-7月份。其余都相同。
本对比试验5的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的移栽驯化方法，同实施例2。本对比试验5的步骤4中，得到移栽驯化苗。移栽成活率只有15％，且生长较差，矮小，抗病差。
由此可见，本发明采用春季3-4月进行进行移栽驯化，可以提高移栽成活率，具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点。
对比试验7
本对比试验7跟实施例2不同的是，移栽驯化时间为12月-次年1月份。其余都相同。
本对比试验7的利用上述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的移栽驯化方法，同实施例2。本对比试验7的步骤4中，得到移栽驯化苗。移栽成活率只有36.7％，且生长较差，矮小，假鳞茎增殖能力差。
由此可见，本发明采用春季3-4月进行进行移栽驯化，可以提高移栽成活率，具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，其特征在于，由种子萌发和原球茎诱导培养基、原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及生根壮苗培养基组成，其中，
所述种子萌发和原球茎诱导培养基由MS基本培养基、0.5-2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和20g/L的蔗糖组成；
所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基由MS基本培养基、1.0-4.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和100g/L的马铃薯泥组成；
所述生根壮苗培养基由MS基本培养基、1.0-4.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、100g/L的香蕉泥、30g/L的蔗糖和1.0g/L的活性炭组成。
2.根据权利要求1所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的培养基，其特征在于，所述种子萌发和原球茎诱导培养基、所述原球茎增殖和丛生芽诱导培养基以及所述生根壮苗培养基的pH值均为5.8。
3.一种利用权利要求1或2所述培养基使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：无菌播种及原球茎诱导培养
将成熟未开裂的翅萼石斛蒴果消毒后，取出种子，均匀播种于种子萌发和原球茎诱导培养基中，先进行暗培养，待种子转绿后再进行光培养，待种子萌发后，得到原球茎；
步骤2：原球茎增殖和丛生芽诱导培养
将步骤1得到的原球茎，均匀转接到原球茎增殖和丛生芽诱导培养基中，进行光培养，待原球茎增殖后，诱导得到丛生芽；
步骤3：丛生芽生根壮苗培养
当步骤2得到的丛生芽长出2-3片叶子、高2-3cm时，均匀转接到生根壮苗培养基中，进行光培养，得到生根试管苗；
步骤4：移栽驯化
于春季3-4月，将步骤3得到的生根试管苗，炼苗15-30d天后，洗净根部，移栽到移栽基质中，再置于塑料大棚中，浇水、保湿至成苗、出圃，即得到翅萼石斛种苗。
4.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤1中，所述翅萼石斛蒴果采自广西植物研究所兰花种质圃，为当年人工自交授粉结实的成熟未开裂蒴果。
5.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤1中，所述消毒的具体步骤为：先用洗洁精清洗翅萼石斛蒴果的表面，再用自来水冲洗至少30min，然后用75％v/v酒精浸泡1min，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1％的升汞浸泡15-30min，然后用无菌水冲洗至少5次；所述暗培养的温度为25±2℃，时间为20-30d。
6.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤2中，所述原球茎的接种量为每个培养瓶接种150-200个原球茎，所述培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL原球茎增殖和丛生芽诱导培养基。
7.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤3中，所述丛生芽的接种量为每个培养瓶接种15-20个丛生芽，所述培养瓶的容量为630mL，每个培养瓶中放有100mL生根壮苗培养基。
8.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤1、步骤2和步骤3中，所述光培养的温度均为25±2℃，光照强度均为1500-2000lux，光周期均为12h/d，光照时间分别为30-50d、45-60d和80-120d。
9.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤4中，所述炼苗的条件为：以散光为主，光照强度为3000-4000lux,温度为15-25℃，湿度为70-80％；所述移栽基质经甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒处理，所述移栽基质为水苔。
10.根据权利要求3所述的一种使翅萼石斛种子快速繁殖成苗的方法，其特征在于，步骤4中，所述塑料大棚在夏季用70％遮阳网进行遮阴。
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