CN112586352A - 一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，解决了现有技术中太白贝母人工种植产业种源供应困难，生产周期长，生产成本高，导致太白贝母人工繁育技术不能大力发展，不能满足市场供应的技术问题。该方法以3‑4年生的太白贝母鳞茎作为外植体，通过外植体表面灭菌、初代培养、增殖培养、诱芽培养、生根培养步骤，最终建立了太白贝母的组培快繁体系。本发明可广泛应用于太白贝母的大棚集约化种植，缩短太白贝母药材的生产周期，降低生产成本，更好的满足了市场需要，还可用来培育脱毒贝母种苗，减少人工高密度种植过程中的病害发生，提高产量，减少农产品投入，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法。
背景技术
川贝母是著名的川产道地药材，药源主要来源于野生资源，市场供需矛盾十分突出，价格逐年攀升，品质最佳的川贝母价格高达3600-4000元/kg，是典型的名贵中药材。太白贝母(Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li)作为川贝母基源植物之一，主要分布于秦巴山区，是该区域的特色珍稀中药资源，是5个川贝母基源物种中唯一适合在海拔2000m左右农区种植发展的川贝母优良品种，具有栽培变异小、产量高、药材商品等级较高(主要为青贝)等特点。但由于现有的太白贝母种源繁育技术效率低，致使太白贝母种源供应困难、生产周期长、生产成本高、品种退化严重，从而使得太白贝母人工种植产业难以大规模发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，以解决现有技术中太白贝母人工种植产业种源供应困难，生产周期长，生产成本高，导致太白贝母人工种植产业发展缓慢，药材无法满足市场需求的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，包括下述步骤：
(1)外植体表面灭菌
选择3-4年生健康无损伤的太白贝母鳞茎，将太白贝母鳞茎外层的鳞瓣掰开并冲洗干净；将冲洗干净的鳞瓣在超净工作台内进行表面灭菌；
(2)初代培养；
将经过步骤(1)处理后的鳞瓣切成绿豆大小的小块，并接种至初代培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养60天；培养温度为20±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养60天后，诱导出无菌鳞球茎；
(3)增殖培养
将步骤(2)所诱导出的无菌鳞球茎切成绿豆大小的小块，并接种至增殖培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养40天；培养温度为20±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养40天后，诱导出无菌鳞球茎；
(4)诱芽培养
将步骤(3)中诱导出的无菌鳞球茎从组织块上分离下来，并接种至诱芽培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养50天；培养温度为20±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养50天后，诱导出无菌芽；
(5)生根培养
将步骤(4)中诱导出的无菌芽接种至生根培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养40天；培养温度为20±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养40天后，得到长出根系的太白贝母组培苗。
进一步的，所述步骤(1)中，表面灭菌具体过程为，先用75％酒精处理10-20s，然后用无菌蒸馏水冲洗2次，随后再用0.1％升汞处理10-15min，最后用无菌蒸馏水冲洗3次。
进一步的，所述步骤(2)中，所述初代培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，
所述激素为NAA和6-BA，或者NAA和ZT，或者2,4-D和ZT；所述激素为NAA和6-BA时，所述NAA的添加量为1.5-3.0mg/L；所述6-BA的添加量为0.5-2.0mg/L；所述激素为NAA和ZT时，所述NAA的添加量为3.0mg/L；所述ZT的添加量为0.5-1.0mg/L；所述激素为2，4-D和ZT时，所述2，4-D的添加量为1.5-3.0mg/L；所述ZT的添加量为0.5-1.0mg/L；
所述蔗糖的添加量为25-35g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L。
进一步的，所述步骤(2)中，所述初代培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；所述激素为NAA和ZT，所述NAA的添加量为3.0mg/L，所述ZT的添加量为1.0mg/L；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
进一步的，所述步骤(3)中，所述增殖培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖、琼脂以及香蕉粉和/或土豆泥；其中，
所述激素为NAA，或者为NAA和ZT，或者为NAA和6-BA；
所述激素为NAA时，所述NAA的添加量为0.5-6mg/L；
所述激素为NAA和ZT时，所述NAA的添加量为0.5-6mg/L,所述ZT的添加量为0.5mg/L；
所述激素为NAA和6-BA时，所述NAA的添加量为0.5-6mg/L,所述6-BA的添加量为0.5mg/L；
所述蔗糖的添加量为20-40g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L；
所述香蕉粉的添加量为20-60g/L；
所述土豆泥的添加量为20-60g/L。
进一步的，所述步骤(3)中，所述增殖培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖、琼脂以及香蕉粉和/或土豆泥；所述激素为NAA和ZT，所述NAA的添加量为1.5mg/L,所述ZT的添加量为0.5mg/L；所述蔗糖的添加量为20g/L；所述土豆泥的添加量为20g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
进一步的，所述步骤(4)中，所述诱芽培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，
所述激素为NAA和6-BA，或者为NAA和ZT；所述激素为NAA和6-BA时，所述NAA的添加量为0.5mg/L，所述6-BA的添加量为0.5-4mg/L；所述激素为NAA和ZT时，所述NAA的添加量为0.5-4mg/L，所述ZT的添加量为0.5-4mg/L；
所述蔗糖的添加量为20-40g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L。
进一步的，所述步骤(4)中，所述诱芽培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；所述激素为NAA和ZT，所述NAA的添加量为0.5mg/L，所述ZT的添加量为2.0mg/L；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
进一步的，所述步骤(5)中，所述生根培养基为1/2MS培养基，且在1/2MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，
所述激素为IBA，或者NAA，或者NAA和IBA；所述激素为IBA时，所述IBA的添加量为0.5-1mg/L；所述激素为NAA时，所述NAA的添加量为0.5-1mg/L；所述激素为NAA和IBA时，所述NAA的添加量为0.5-1mg/L，所述IBA的添加量为0.5-1mg/L；
所述蔗糖的添加量为20-40g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L。
进一步的，所述步骤(5)中，所述生根培养基为1/2MS培养基，且在1/2MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；所述激素为NAA和IBA，所述NAA的添加量为1.0mg/L，所述IBA的添加量为0.5mg/L；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
(1)本发明提供的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，建立了太白贝母组培快繁体系，所生产的太白贝母组培苗个体较大，其下端鳞球茎同生长3年左右的种子苗相当，因此所生产的太白贝母组培苗可以直接当成种子苗应用于种植；而应用本发明提供的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，生产太白贝母组培苗所用的时间为190天，因此可大大缩短在地种植时间，因此可广泛应用于大棚集约化种植，缩短太白贝母药材的生产周期，降低生产成本，更好的满足了市场需要；本发明提供的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，解决了太白贝母人工繁育的技术瓶颈，从而缓解太白贝母人工种植产业种源供应难题，促进太白贝母种植产业在高(中)半山区域发展，对于推进贫困山区脱贫攻坚，带动广大山区农牧民稳步致富具有重要意义；
(2)本发明提供的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，可用来培育脱毒贝母种苗，减少人工高密度种植过程中的病害发生，提高产量，减少农产品投入，降低成本。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一、材料说明：
①下述实施例中使用的太白贝母鳞茎是2016年4月取自重庆市巫溪县西安村在地3-4年生的太白贝母鳞茎，用湿苔藓包裹覆盖后置于4℃条件下保存备用，下述实验中使用的均是保存20天以内的太白贝母鳞茎。
②MS培养基的配方见下表1
表1MS培养基的配方
二、实施例
一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，包括下述步骤：
(1)外植体表面灭菌
A1、选择3-4年生的太白贝母鳞茎，用湿苔藓包裹覆盖后置于4℃条件下保存备用；
A2、在备用的太白贝母鳞茎中选择健康无损伤的太白贝母鳞茎，用自来水将表面泥土冲洗干净，将太白贝母鳞茎外层的鳞瓣掰开并用自来水冲洗15min；将冲洗后的鳞瓣放入经过高温灭菌的培养瓶中，在超净工作台进行表面灭菌；
进行表面灭菌采用的灭菌剂为75％酒精和0.1％升汞，或者为75％酒精和2％次氯酸钠；设置一下以下六组灭菌条件：
①75％酒精浸泡10s，无菌冲洗2次，再用0.1％升汞浸泡5分钟，无菌水冲洗3次；
②75％酒精浸泡10s，无菌冲洗2次，再用0.1％升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗3次；
③75％酒精浸泡10s，无菌冲洗2次，再用0.1％升汞浸泡15分钟，无菌水冲洗3次；
④75％酒精浸泡10s，无菌冲洗2次，再用2％次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗3次；
⑤75％酒精浸泡10s，无菌冲洗2次，再用2％次氯酸钠浸泡20分钟，无菌水冲洗3次；
⑥75％酒精浸泡10s，无菌冲洗2次，再用2％次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水冲洗3次；
灭菌期间，盖上瓶盖并轻轻摇晃，灭菌结束后用无菌滤纸将表面水分吸干，然后将鳞瓣切成约0.5cm3的小方块，最后将切好的鳞瓣小块接种至MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L的培养基中，培养基PH用1N的NaOH调至5.8。每组接种外植体40个，将接种好的外植体置于LED光照培养箱中，培养温度为(20±2)℃，光照时间12h/d，光照强度为2000Lx。培养第10d统计污染情况，第20d统计褐化死亡情况。
A3、结果：
接种培养后第5d，灭菌不彻底的外植体表面与培养基接触点周边开始出现白色的霉菌菌落或灰褐色的黏液状细菌菌斑；第10d左右，部分外植体表面变成灰白色和黑褐色，最后逐渐褐化死亡，实验统计结果见表2。
表2不同灭菌组合对太白贝母外植体灭菌的影响
| 编号 | 灭菌条件 | 污染率 | 死亡率 | 污染率+死亡率 |
| a1 | 75％酒精10s+0.1％升汞5min | 62.50 | 5.00 | 67.50 |
| a2 | 75％酒精10s+0.1％升汞10min | 15.00 | 17.50 | 32.50 |
| a3 | 75％酒精10s+0.1％升汞15min | 13.95 | 34.88 | 48.84 |
| a4 | 75％酒精10s+2％次氯酸钠10min | 72.50 | 7.50 | 80.00 |
| a5 | 75％酒精10s+2％次氯酸钠20min | 30.00 | 17.50 | 47.50 |
| a6 | 75％酒精10s+2％次氯酸钠30min | 22.50 | 37.50 | 60.00 |
从表2可以看出，0.1％升汞和2％次氯酸钠的灭菌效率随灭菌时间的增加而增加。其中0.1％升汞达到最高灭菌效率的时间为15min，污染率可控制在13.95％；2％次氯酸钠达到最高灭菌效率的时间为30min，污染率可控制在22.50％。总体来看，0.1％升汞的灭菌效率要高于2％次氯酸钠。由表1中灭菌后外植体死亡率可以看出，灭菌时间越长，对外植体组织损伤越大，外植体在后期培养过程中的死亡褐化死亡率越高，升汞和次氯酸钠最高灭菌效率时间下的外植体死亡率均在30％以上，远高于同条件下的污染率。因此在实践中需要将外植体污染率和体死亡率作为评判灭菌效果的综合评判指标。从表1中数据可以看出，0.1％升汞的最佳灭菌时间为10min，此时的外植体污染率和死亡率之和可控制在32.50％以内；2％次氯酸钠的最佳灭菌时间为20min，此时的外植体污染率和死亡率之和可控制在47.50％以内。综上，0.1％升汞的表面灭菌效率高于2％次氯酸钠，最佳的灭菌条件为：75％酒精10s+0.1％升汞10min。
A4、筛选：
选择a2组的灭菌方法进行外植体的灭菌，然后进入步骤(2)进行初代培养，在灭菌结束后用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸将鳞瓣表面水分吸干。
(2)初代培养；
B1、将经过步骤(1)处理后的鳞瓣切成绿豆大小的小块(约0.3cm3方块状)，将切好的块状鳞瓣接种至培养基中，每个处理组开展三次生物学重复，每个生物学重复接种鳞瓣30个。将接种好的鳞瓣置于LED光照培养箱中培养，培养温度为(22±2)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000Lx，培养60d后统计结果。
所述培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，所述激素为NAA和6-BA，或者为NAA和ZT，或者为2,4-D和ZT；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L；
下述b1-b10组采用的是a2组灭菌方法获得的鳞瓣；各培养基中激素的添加量如下表3所示：
表3太白贝母初代培养实验中各培养基的激素种类及浓度
| 编号 | NAA，mg/L | 2，4-D，mg/L | 6-BA，mg/L | ZT，mg/L |
| b1 | 0.5 | - | 1.0 | - |
| b2 | 1.5 | - | 1.0 | - |
| b3 | 3.0 | - | 1.0 | - |
| b4 | 3.0 | - | 0.5 | - |
| b5 | 3.0 | - | 2.0 | - |
| b6 | 3.0 | - | - | 0.5 |
| b7 | 3.0 | - | - | 1.0 |
| b8 | - | 0.5 | - | 1.0 |
| b9 | - | 1.5 | - | 1.0 |
| b10 | - | 3.0 | - | 1.0 |
B2、结果
外植体转接培养20d左右，部分外植体切口边缘开始出现膨大及颗粒状隆起，其中少量的外植体表面由白色转变成淡绿色；另有部分外植体表面逐渐变成灰白色、质地逐渐变软，最后逐渐褐化死亡。培养35d后，存活的外植体表面开始形成球状鳞茎，并在切口边缘伴有少量的愈伤组织生长。太白贝母无菌鳞球茎生长缓慢，各处理组均需要至少60d的培养方可形成规则的鳞球茎并达到转接要求。
太白贝母外植体初代培养实验结果见表4。由实验组b1-b3和b8-b10的数据可以看出，NAA和2,4-D浓度的增加能显著提高太白贝母鳞球茎的诱导率和诱导数，其中NAA浓度增加至3.0mg/L时诱导率达到最高42.80％，2,4-D处理组的最高诱导率则仅为25.56％，同时当2,4-D浓度低于0.5mg/L时无法成功诱导出鳞球茎，由此可以看出NAA的诱导效果好于2，4-D。从实验组b3-b7的数据可以看出，6-BA和ZT浓度的增加能小幅度提升鳞球茎的诱导率，而鳞球茎的诱导数量则是随着6-BA和ZT浓度的升高呈现出先升后降的趋势，但各处理组间的鳞球茎诱导率和诱导数并无显著性差异。同时比较诱导率和诱导数，最佳的太白贝母初代培养基为MS+NAA3.0mg/L+ZT1.0mg/L。
表4太白贝母外植体初代培养实验结果
| 编号 | 激素浓度(mg/L) | 诱导率(％) | 球茎诱导数(个) |
| b1 | NAA0.5+6-BA1.0 | 3.33 | 1 |
| b2 | NAA1.5+6-BA1.0 | 15.56±8.39bc | 1.75±0.31ab |
| b3 | NAA3.0+6-BA1.0 | 42.80±5.88a | 2.14±0.4ab |
| b4 | NAA3.0+6-BA0.5 | 36.67±6.67ab | 2.05±0.15ab |
| b5 | NAA3.0+6-BA2.0 | 42.22±11.71a | 1.62±0.38b |
| b6 | NAA3.0+ZT0.5 | 41.69±10.96a | 1.91±0.67ab |
| b7 | NAA3.0+ZT1.0 | 47.78±7.7a | 2.39±0.45a |
| b8 | 2,4-D0.5+ZT1.0 | 0 | 0 |
| b9 | 2,4-D1.5+ZT1.0 | 11.88±3.25c | 1.73±0.57ab |
| b10 | 2,4-D3.0+ZT1.0 | 25.56±3.85b | 1.89±0.47ab |
B3、筛选
选择初代培养基为MS培养基+NAA 3.0mg/L+ZT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L以B1的方法进行初代培养，然后进入步骤(3)进行增殖培养基的筛选；
(3)增殖培养
C1、增殖培养基初步筛选
将步骤(2)进行初代培养后所诱导出的无菌鳞球茎切成绿豆大小的小块(切成约0.3cm3的方块状)，然后将切好的块状鳞球茎接种至不同的增殖培养基中，每组接种鳞球茎块30个，将接种好的材料置于LED光照培养箱中培养，各处理组的激素种类及浓度见表5，培养温度为(22±2)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000Lx，培养40d后统计实验结果。
表5太白贝母鳞球茎增殖培养实验中各培养基的激素种类及浓度
| 编号 | NAA，mg/L | 6-BA，mg/L | ZT，mg/L |
| c1 | 0.5 | 0.5 | - |
| c2 | 1.5 | 0.5 | - |
| c3 | 3.0 | 0.5 | - |
| c4 | 6.0 | 0.5 | - |
| c5 | 0.5 | - | 0.5 |
| c6 | 1.5 | - | 0.5 |
| c7 | 3.0 | - | 0.5 |
| c8 | 6.0 | - | 0.5 |
| c9 | 0.5 | - | - |
| c10 | 1.5 | - | - |
| c11 | 3.0 | - | - |
| c12 | 6.0 | - | - |
C2、增殖培养基优化
以筛选出的最佳增殖培养基(MS+NAA1.5mg/L+ZT0.5mg/L+琼脂7g/L)作为基础培养基，分别配置含有不同浓度碳源，以及添加有不同浓度的香蕉粉、土豆泥的培养基(详情见表6)。然后在超净工作台内，将步骤(2)初代培养后所诱导出的无菌鳞球茎切成绿豆大小的小块(切成约0.3cm3的小方块)，并转接至配好的培养基中，每组接种鳞球茎块30个，将接种好的材料置于LED光照培养箱中，培养温度为(22±2)℃，光照时间12h/d，光强为2000Lx，培养40d后统计实验结果。
表6太白贝母鳞球茎增殖培养基优化实验(g/L)
| 编号 | 蔗糖浓度 | 香蕉粉 | 土豆泥 |
| c1 | 20 | 0 | 0 |
| c2 | 30 | 0 | 0 |
| c3 | 40 | 0 | 0 |
| c4 | 20 | 20 | 0 |
| c5 | 20 | 40 | 0 |
| c6 | 20 | 60 | 0 |
| c7 | 20 | 0 | 20 |
| c8 | 20 | 0 | 40 |
| c9 | 20 | 0 | 60 |
| c10 | 20 | 20 | 20 |
C3、结果
①增殖培养基初步筛选结果
无菌鳞球茎小块增殖培养15d后，鳞球茎小块会略微膨大，并在切口处产生少量愈伤组织。25d后在切口表面出现颗粒状突起，逐步诱导生成新的鳞球茎，部分增殖材料基部膨大形成愈伤组织块，并且在愈伤组织块上形成大量的细小鳞球茎。增殖培养的鳞球茎生长仍然缓慢，需至少40d方可进行下一次转接。鳞茎增殖培养实验数据见表7。
表7太白贝母鳞球茎增殖培养实验结果
| 编号 | 激素浓度mg/L | 增殖诱导率(％) | 增殖系数 | 生长情况 |
| c1 | NAA0.5+6-BA0.5 | 55.00 | 2.66 | 白色、个小 |
| c2 | NAA1.5+6-BA0.5 | 83.33 | 3.60 | 白色或浅绿色，个中等 |
| c3 | NAA3.0+6-BA0.5 | 86.59 | 4.10 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c4 | NAA6.0+6-BA0.5 | 39.51 | 2.56 | 白色或浅绿色，个小 |
| c5 | NAA0.5+ZT0.5 | 65.00 | 3.02 | 白色或浅绿色、个小 |
| c6 | NAA1.5+ZT0.5 | 88.75 | 4.45 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c7 | NAA3.0+ZT0.5 | 71.05 | 3.72 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c8 | NAA6.0+ZT0.5 | 33.75 | 2.07 | 白色或浅绿色，个小 |
| c9 | NAA0.5 | 21.52 | 1.94 | 白色，个小 |
| c10 | NAA1.5 | 43.75 | 2.49 | 白色，个小 |
| c11 | NAA3.0 | 46.34 | 3.79 | 白色，个中等 |
| c12 | NAA6.0 | 37.50 | 2.40 | 白色，个小 |
从表7中数据可以看出，随NAA浓度的升高，太白贝母的增殖诱导率及增殖系数均呈现出先升后降的趋势，其中NAA最佳增殖培养的浓度范围在1.5-3.0mg/L之间。当NAA与6-BA组合进行增殖培养时，NAA的最佳浓度为3.0mg/L；而与ZT组合进行增殖培养时的最佳浓度为1.5mg/L，此时的增殖诱导率和增殖系数均达到最大值；当NAA单独使用时，增殖效果较差。因此太白贝母鳞球茎增殖培养的最佳培养基为MS+NAA1.5 mg/L+ZT0.5 mg/L。
②增殖培养基优化结果
无菌鳞球茎块增殖培养后，添加土豆泥的处理组生长最快，第25d开始诱导形成新的鳞球茎，同时增殖材料切口边缘膨大明显，且出现少量愈伤组织；高浓度蔗糖处理组生长最为缓慢，且鳞球茎个体较其他处理组小。优化实验结果见表8：
表8太白贝母鳞球茎增殖培养优化实验结果
| 编号 | 添加物 | 增殖诱导率 | 增殖系数 | 生长情况 |
| c1 | 蔗糖20 | 88.89 | 4.84 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c2 | 蔗糖30 | 83.33 | 4.59 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c3 | 蔗糖40 | 79.31 | 3.30 | 白色或浅绿色，个小 |
| c4 | 蔗糖20+香蕉粉20 | 86.81 | 4.96 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c5 | 蔗糖20+香蕉粉40 | 83.33 | 4.47 | 白色或浅绿色，个小 |
| c6 | 蔗糖20+香蕉粉60 | 76.14 | 4.49 | 白色或浅绿色，个小 |
| c7 | 蔗糖20+土豆泥20 | 88.89 | 5.71 | 白色或浅绿色，个大 |
| c8 | 蔗糖20+土豆泥40 | 81.82 | 5.25 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c9 | 蔗糖20+土豆泥60 | 75.56 | 4.09 | 白色或浅绿色，个较大 |
| c10 | 蔗糖20+香蕉粉20+土豆泥20 | 76.67 | 3.90 | 白色或浅绿色，个较大 |
从实验数据(表8)可以看出，随着蔗糖溶度的升高，太白贝母的增殖诱导率及增殖系数均随之下降，且鳞球茎生长速度减缓，最终导致所诱导出的鳞球茎个体较小，因此太白贝母组培生产实践中，培养基的蔗糖溶度不宜过高。香蕉粉对于太白贝母鳞球茎增殖诱导率及增殖系数并无促进作用，并且高溶度香蕉粉会对太白贝母鳞球茎的生长产生抑制作用，导致鳞球茎个体较小。低溶度的土豆泥处理组虽然无法提升太白贝母鳞球茎的增殖诱导率，但能够显著提升增殖系数，促进鳞球茎生长。因此经优化后的太白贝母鳞球茎最佳增殖培养基为MS+蔗糖20g/L+土豆泥20g/L+NAA1.5 mg/L+ZT0.5 mg/L。
C4、筛选
选择增殖培养基为MS+蔗糖20g/L+土豆泥20g/L+琼脂7g/L+NAA1.5mg/L+ZT0.5mg/L以C1的方法进行增殖培养，然后进入步骤(4)进行诱芽培养。
(4)诱芽培养
D1、将步骤(3)中诱导出的无菌鳞球茎用镊子和解剖刀将颗粒状的鳞球茎从组织块上分离，分离时注意保持鳞球茎的完整性。将分离所得的颗粒状鳞球茎转接至添加有不同激素的MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基中，各处理组的激素种类及溶度见表9，每组接种鳞球茎30个，最后将接种好的材料置于LED光照培养箱中培养，培养温度为(22±2)℃，光照时间12h/d，光强为2000Lx，培养50天统计实验结果。
表9太白贝母芽诱导实验设计
| 编号 | NAA，mg/L | 6-BA，mg/L | ZT，mg/L |
| d1 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| d2 | 0.5 | 1.0 | 0 |
| d3 | 0.5 | 2.0 | 0 |
| d4 | 0.5 | 4.0 | 0 |
| d5 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| d6 | 0.5 | 0 | 1.0 |
| d7 | 0.5 | 0 | 2.0 |
| d8 | 0.5 | 0 | 4.0 |
| d9 | 1.0 | 0 | 2.0 |
| d10 | 2.0 | 0 | 2.0 |
| d11 | 4.0 | 0 | 2.0 |
D2、结果
诱芽材料转接培养30d后，部分鳞球茎的外层鳞瓣开始长出细长的针状叶片，随后也不逐渐展开，形成披针形细长叶片，鳞球茎几部同时伴随着膨大及鳞球茎增殖现象，同时增殖的球茎继续发育形成新的芽，在鳞球茎外层鳞瓣叶片展开长大后，内层鳞瓣会逐渐裂开。具体实验结果见表10：
表10太白贝母诱芽实验结果
| 编号 | 激素及浓度(mg/L) | 诱导率(％) | 平均芽数(个) |
| d1 | NAA0.5+6-BA0.5 | 14.77 | 1.46 |
| d2 | NAA0.5+6-BA1.0 | 23.33 | 1.81 |
| d3 | NAA0.5+6-BA2.0 | 30.00 | 2.11 |
| d4 | NAA0.5+6-BA4.0 | 30.77 | 1.93 |
| d5 | NAA0.5+ZT0.5 | 23.60 | 1.81 |
| d6 | NAA0.5+ZT1.0 | 61.96 | 2.12 |
| d7 | NAA0.5+ZT2.0 | 67.78 | 2.92 |
| d8 | NAA0.5+ZT4.0 | 46.67 | 2.67 |
| d9 | NAA1.0+ZT2.0 | 63.22 | 2.13 |
| d10 | NAA2.0+ZT2.0 | 48.31 | 2.02 |
| d11 | NAA4.0+ZT2.0 | 45.56 | 1.51 |
从实验数据(表10)可以看出，6-BA处理组中的诱导率随6-BA浓度的升高而升高，平均芽数在6-BA浓度升至4.0mg/L时略有下降。ZT处理组中的诱导率和平均芽数均随ZT浓度的升高呈现出先升后降的趋势，其中当ZT浓度为2.0mg/L时，诱导效果最佳。通过比较d7及d9-d11号实验组的数据可以看出，随着NAA浓度的上升，诱导率及平均芽数均逐渐降低，表面在太白贝母芽诱导过程中，不宜使用高浓度的NAA培养基。通过对上述实验数据的分析，太白贝母芽诱导的最佳诱芽培养基为MS+NAA0.5 mg/L+ZT2.0 mg/L。
D3、筛选
选择诱芽培养基为MS+NAA0.5 mg/L+ZT2.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L以D1的方法进行诱芽培养，然后进入步骤(4)进行生根培养。
(5)生根培养
E1、以步骤(4)中所诱导的无菌芽作为试验材料，在超净工作台内，将生长良好，无褐化、无污染的太白贝母无菌芽自培养瓶中取出置于解剖盘内。然后用镊子和解剖刀将无菌芽连同基部的鳞球茎一起从组织块上分离，分离时注意保持无菌芽的完整性。将分离所得的带有鳞球茎的无菌芽转接至添加有不同激素的1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L生根培养基中，各处理组的激素种类及溶度见表11。每组接种无菌芽30个，最后将接种好的材料置于LED光照培养箱中培养，培养温度为(22±2)℃，光照时间12h/d，光强为2000Lx，培养后40天后统计实验结果。
表11太白贝母生根培养实验设计(单位：mg/L)
| 编号 | IBA | NAA |
| e1 | 0 | 0 |
| e2 | 0.5 | 0 |
| e3 | 1.0 | 0 |
| e4 | 0 | 0.5 |
| e5 | 0.5 | 0.5 |
| e6 | 1.0 | 0.5 |
| e7 | 0 | 1.0 |
| e8 | 0.5 | 1.0 |
| e9 | 1.0 | 1.0 |
E2、结果
具体的实验结果见表12：
表12太白贝母生根培养实验结果
| 编号 | 激素及浓度，mg/L | 诱导率％ | 形态状况 |
| e1 | 0 | 0.00 | - |
| e2 | IBA0.5 | 18.89 | 根短粗 |
| e3 | IBA1.0 | 43.18 | 根较长较粗 |
| e4 | NAA0.5 | 27.78 | 根短粗 |
| e5 | IBA0.5+NAA0.5 | 60.44 | 根较长较粗 |
| e6 | IBA1.0+NAA0.5 | 53.85 | 根细长 |
| e7 | NAA1.0 | 52.22 | 根较长较粗 |
| e8 | IBA0.5+NAA1.0 | 65.17 | 根细长 |
| e9 | IBA1.0+NAA1.0 | 48.89 | 根细短 |
从实验数据(表12)可以看出，IBA和NAA均能诱导出太白贝母的不定根，但二者联合使用效果好于单独使用。当IBA单独使用时，太白贝母不定根的诱导率随IBA浓度的升高而升高，但所诱导出的不定根均比较粗壮，此类根表面光滑，吸收营养能力极差，后期炼苗存活率低。比较实验组e1、e4、e7的数据可以看出，当NAA单独使用时，生根培养率同样随NAA浓度的升高而升高，但诱导出的不定根同样较粗壮，不适于炼苗。当IBA与NAA联合使用时，诱导效果好于二者单独使用，并且所诱导出的不定根较细长，根表面存在小凸起及根毛，吸收营养能力较粗壮根强，适合炼苗。综合考虑诱导率及根形态指标，筛选出太白贝母根诱导的最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L。
E3、筛选
选择生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L(1/2MS是指MS培养基中的大量元素减半)以E1的方法进行生根培养，得到太白贝母组培苗，得到的太白贝母组培苗个体较大，其下端鳞球茎同生长3年左右的种子苗相当，可以直接当成种子苗应用于种植。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）外植体表面灭菌
选择3-4年生健康无损伤的太白贝母鳞茎，将太白贝母鳞茎外层的鳞瓣掰开并冲洗干净；将冲洗干净的鳞瓣在超净工作台内进行表面灭菌；
（2）初代培养；
将经过步骤（1）处理后的鳞瓣切成绿豆大小的小块，并接种至初代培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养60天；培养温度为20±2℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养60天后，诱导出无菌鳞球茎；
（3）增殖培养
将步骤（2）所诱导出的无菌鳞球茎切成绿豆大小的小块，并接种至增殖培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养40天；培养温度为20±2℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养40天后，诱导出无菌鳞球茎；
（4）诱芽培养
将步骤（3）中诱导出的无菌鳞球茎从组织块上分离下来，并接种至诱芽培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养50天；培养温度为20±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养50天后，诱导出无菌芽；
（5）生根培养
将步骤（4）中诱导出的无菌芽接种至生根培养基中，然后置于LED光照培养箱中培养40天；培养温度为20±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1900-2100Lx；培养40天后，得到长出根系的太白贝母组培苗。
2.根据权利要求1所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中，表面灭菌具体过程为，先用75%酒精处理10-20s，然后用无菌蒸馏水冲洗2次，随后再用0.1%升汞处理10-15min，最后用无菌蒸馏水冲洗3次。
3.根据权利要求1所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述初代培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，
所述激素为NAA和6-BA，或者NAA和ZT，或者2,4-D和ZT；所述激素为NAA和6-BA时，所述NAA的添加量为1.5-3.0 mg/L；所述6-BA的添加量为0.5-2.0 mg/L；所述激素为NAA和ZT时，所述NAA的添加量为3.0 mg/L；所述ZT的添加量为0.5-1.0 mg/L；所述激素为2，4-D和ZT时，所述2，4-D的添加量为1.5-3.0 mg/L；所述ZT的添加量为0.5-1.0 mg/L；
所述蔗糖的添加量为25-35g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L。
4.根据权利要求3所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述初代培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；所述激素为NAA和ZT，所述NAA的添加量为3.0 mg/L，所述ZT的添加量为1.0 mg/L；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
5.根据权利要求1所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述增殖培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖、琼脂以及香蕉粉和/或土豆泥；其中，
所述激素为NAA，或者为NAA和ZT，或者为NAA和6-BA；
所述激素为NAA时，所述NAA的添加量为0.5-6 mg/L；
所述激素为NAA和ZT时，所述NAA的添加量为0.5-6 mg/L,所述ZT的添加量为0.5 mg/L；
所述激素为NAA和6-BA时，所述NAA的添加量为0.5-6 mg/L, 所述6-BA的添加量为0.5mg/L；
所述蔗糖的添加量为20-40g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L；
所述香蕉粉的添加量为20-60g/L；
所述土豆泥的添加量为20-60g/L。
6.根据权利要求5所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述增殖培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖、琼脂以及香蕉粉和/或土豆泥；所述激素为NAA和ZT，所述NAA的添加量为1.5 mg/L,所述ZT的添加量为0.5mg/L；所述蔗糖的添加量为20g/L；所述土豆泥的添加量为20g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
7.根据权利要求1所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述诱芽培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，
所述激素为NAA和6-BA，或者为NAA和ZT；所述激素为NAA和6-BA时，所述NAA的添加量为0.5 mg/L，所述6-BA的添加量为0.5-4 mg/L；所述激素为NAA和ZT时，所述NAA的添加量为0.5-4 mg/L，所述ZT的添加量为0.5-4 mg/L；
所述蔗糖的添加量为20-40g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L。
8.根据权利要求7所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述诱芽培养基为MS培养基，且在MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；所述激素为NAA和ZT，所述NAA的添加量为0.5 mg/L，所述ZT的添加量为2.0mg/L；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
9.根据权利要求1所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（5）中，所述生根培养基为1/2MS培养基，且在1/2MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；其中，
所述激素为IBA，或者NAA，或者NAA和IBA；所述激素为IBA时，所述IBA的添加量为0.5-1mg/L；所述激素为NAA时，所述NAA的添加量为0.5-1 mg/L；所述激素为NAA和IBA时，所述NAA的添加量为0.5-1mg/L，所述IBA的添加量为0.5-1mg/L；
所述蔗糖的添加量为20-40g/L；
所述琼脂的添加量为5-10g/L。
10.根据权利要求9所述的以太白贝母鳞茎为外植体的组织培养方法，其特征在于：所述步骤（5）中，所述生根培养基为1/2MS培养基，且在1/2MS培养基中加入了激素、蔗糖和琼脂；所述激素为NAA和IBA，所述NAA的添加量为1.0mg/L，所述IBA的添加量为0.5mg/L；所述蔗糖的添加量为30g/L；所述琼脂的添加量为7g/L。
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| CN117502239A (zh) * | 2023-12-08 | 2024-02-06 | 云南农业大学 | 一种能防止褐化的川贝母组织培养方法及其应用 |
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